JPS61100199A - ペルオキシダーゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はぜルオキシダーゼの測定方法に関する。

従来の技術 ペルオキシダーゼの測定は種々の技術分野で重要である
。しかも近年特にペルオキシダーゼの標識酵素としての
使用の増大が、従来用いられていた放射免疫測定（ＲＩ
Ａ）を相当程度追出した所謂酵素免疫測定の領域で極め
て重要になった。へブテン、抗原及び抗体の酵素免疫測
定は極めて鋭敏な方法であり、従ってまた同方法はこの
際使用される標識酵素の測定の精度に対して高い要求が
ある。この領域でペルオキシダーゼを標識酵素として極
めて頻繁に使用する場合、酵素活性の測定は固定時間法
（ｆｉｘｅｄ−ｔｉｍｅ−Ｍｅｔｈｏａ　）に従って吸
光度測定によって行りれる。この方法は、イルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）が過酸化物の存在で適当な色原体を発色
下に酸化し、この際発色速度がＰＯＤの活性及び量に相
応するという原理に基いている。固定時間法の場合、基
質を加えた後の限定された反応時間（大抵６０〜６０分
）後に生じた色が空値に対して測定される。発色反応は
この時点では一般にまだ終っていないので、すべて標準
及び試料に関して同じ恒温保持時間が保たれるように保
証されなければならない。このことは、基質の添加及び
吸光度の測定か、個々の試験管の間で一般に１０〜１５
秒の正確に定められた間隔で行われなければならないこ
とを必要とする。処理を困難にするこの欠点は反応停止
剤を使用すると回避することができる。

米国特許第４２３４６８０号明細書からは、上記の点に
関しては停止剤としてアルカリメタ重亜硫酸を使用する
ことがすでに公知である。

しかしこの薬剤は、酸化反応で形成された色に還元剤と
して作用して、脱色下に還元するという欠点を有する。

これは特に、ＰＯＤ測定の領域で色原体として適当な２
．２′−アジノージ〔−３−ｘｆ）ｖ　−ベンゾチアゾ
リン−スルホン酸−〇 （６）〕の塩、通常ジアンモニウム塩（ＡＦ’！’８　
）（短時間内に退色が起る）の場合に該当する。

他のＰＯＤ反応停止剤はホルムアルデヒドである。しか
しこの場合も同１様に該薬剤を加えた発色溶液の安定性
は不十分である。さらにホルムアルデヒドの臭気汚染及
び健康に対す憂慮もある。

また他の公知のＰＯＤ停止制はシュウ酸である。

しかしこの薬剤は測定の精度を低下させる結果を招（。

これは特に、酵素免疫測定のために抗体の被覆された固
体（例えばチューブ又は球）を使用し、一般に壁に結合
されたＰＯＤを、固相からの液相の分離後に常法で測定
する場合に該当する。しかしシュウ酸を加える場合には
、固相に結合されたこのようなタンパク質が溶離されか
つ／又は変性される可能性がある。

また他の公知の停止剤はアジ化ナトリウムである。この
場合にも退色の危険がある。さらに重金属塩と関係する
爆発の危険がある。

最後に停止剤として、菓ニアルキル硫酸エステル又はＦ
デシル水素硫酸エステルのような界面活性剤が提案され
た。しかし界面活性剤は発色を完全に止めることはでき
ない。

発明の解決しようとする問題点 従って本発明は、公知の前記停止剤の欠点を除去するこ
と及び発色の停止を予め選定した特足の時点で可能にし
、即効的であって、停止剤を加える時点で存在する色の
変化が後で起らないペルオキシダーゼの測定方法を創作
するという課題を基礎とする。

問題点を解決するだめの手段 前記課題は本発明により、過酸化物及び色原体を加えか
っ色原体の酸化の際に生じた色を反応速度論的に測定し
、この際発色を、限定された時間後に停止剤を加えて停
止させることによってペルオキシダーゼを測定する方法
において、停止剤としてカタラーゼを加えることを特徴
とする前記方法によって解決される。

本発明による方法は、発色に対する即時的停止効果を有
するが、しかしこの発色が爾後変化されず、その結果生
じた色の測定停止後の数時間以内の任意の時点で行うこ
とができる。

本発明による方法は、ＰＯＤの測定の範囲で使用できる
すべての色原体にとって適当である。

適当な色原体の代表例は、２　、２’−アジノージフェ
ニレンジアミン、ｐ−フェニレンシアミン、ｍ−７ミノ
サリチル酸、シアニジシン、ｐ−アミノ安息香酸、アニ
リン、４−アミノアンチピリン等である。これらの色原
体はＰＯＤの測定の範囲においては当業者にとって周知
であり、ここで詳説する必要はない。有利にはＡＢＴＰ
が使用される。同様に０−フェニレンシアミン及び４−
７ミノアンチピリンも好ましい。

本発明による方法で加えるカタラーゼの量目体は重要で
はない。しかしこの号は可能なＰＯＤ活性に対しては過
剰に存在しなければならない。

酵素免疫測定の領域ではＰＯＤの使用量は既知であり、
この量の一部のみが測定されなければならない。他方Ｐ
ＯＤの測定の場合には簡単な予備試験によってＰＯＤの
オーダーを測定し、次にカタラーゼ過剰を達成するため
に必要な量が容易に確定されうる。一般には１測定液当
り５０〜１０００Ｕのカタラーゼの債が適当であるが、
特定の場合にはより少量のカタラーゼでも十分であるし
あるいはより大きい添加量も有利である。

本発明による方法は特に、測定すべきＰＯＤが免疫学的
又は化学的に結合された形で存在する場合に適当である
。例えば、これは抗体、抗体片、抗原、グロブリンフラ
クション等に例えば化学的に結合された共役結合体の形
でＰＯＤを使用する場合である。同様に本発明による方
法は、ＰＯＤがそれ自体で又はＰＯＤに化学的に結合さ
れた配位子（固相に結合されていてもよい）を介して免
疫学的に固定されて存在する場合に好適である。前記の
ようなＰＯＤ測定の態様の場合には停止剤に対する要求
が特に重要である。それというのもＰＯＤの結合相手に
対する停止剤の作用が容易に測定結果の粗悪化を生じる
可能性があるからである。本発明がましてや溶解された
遊離ＰＯＤの測定の場合に適していることはもちろんで
ある。

本発明による方法の場合生じた色の測定は、測定精度に
対する不利な影響なしにカタラーゼの添加仮数時間以内
に実施することができる。

これは著しい測定の容易化を意味しかつ種々の測定誤差
の可能性を除去する。

次に本発明を実施例により詳述する。

実施例 例　　１ ■ （Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）の酵素
試験液　ＴＳＨ（Ｂｅ８ｔ、　−Ｎｒ、　７３６０８２
　）を使用する。この試験液は、抗体−ＰＯｐ共役結合
体（免疫試験の間にプラスチック製試験管の管壁に結合
される）の形で化学的に結合されたＰＯＤ、色原体とし
てのＡＢＴＳ■及び過酸化物として過硼酸ナトリウムを
含有する、 試験は製造者の作業規定に従ってＴＳＨ件準（５０μＵ
／ｍｌ）を用いて実施する。被検血清試料を試験管でｐ
ｉ−１６，９Ｃ燐酸緩衝液）で６０分恒温保持し、次に
抗体−ＰＯＤ共役結合体を加えて６０分恒温保持する、
次に燐酸塩−クエン酸塩■ 緩衝液（ｐ）Ｉ　４．４　）中の過硼酸塩及びＡＢＴＳ
　　’ｉ加える。

発色反応： は６０分後に下記の停止試薬０．１−の添加によって停
止される。

停止試薬の組成： カタラーゼ　　　　２５０　Ｕ／ｍＪ クエン酸塩緩衝液（ｐＨ５．５）　５０　ｍｒｎｏ１／
１トリトｙ　（Ｔｒｉｔｏｎ　）　Ｘ　４０５　（非イ
オン性界面活性剤）２重量％ 次に溶液の吸光度を４０５　ｎｍで３時間に亘り６０分
ごとに測定する。この際次の吸光度〔（溶液の供給（ｔ
−０、吸光度−１０１１を基準とする〕が得られる。

表　　　１ 例　　２ 停止 市販のＣＥＡ　−ＫＩＡ試験液（ＡＢＢＯＴＴ　Ｂｅ５
ｔ、　Ｎｒ。

５８６３２４　）を用いる。この試薬は、免疫反応の間
にプラスチック球に結合される抗体−ＰＯＤ共役結合体
として化学的に結合され九ＰＯＤ及び基質として０−フ
ェニレンジアミンを含有する。

試験は、製造者の作業規定に従い２つのＣＥＡ試料（ｃ
ＥＡ＠度１及び５　ｎｔｒ／ｍｌ　）を用いて実施する
。　ＰＯＤ及びＨ２Ｏ２による０−７二二レンジアミン
の酸化（発色）は３０分後に例１による停止試薬（但し
水で１＝２０の割合で希釈された）２ＷＩＩを添加して
停止される。ｌ試料（濃度の増大に関して番号を付す）
について２次の吸光度が得られる。吸光度はそれぞれ４
０５　ｎｍで測定しかつ停止時点ｔ−Ｑを基準にした。

表　　　２ 例　　３ カタラーゼ及びホルムアルデヒドの停止効果の比較 例１による試薬を用いる。比較のために、例１の停止試
薬の代りに水性ホルムアルデヒド溶液＜２５ｍＭ％）を
使用する。発色反応の停止はそれぞれの停止試薬０．２
ｒｎｌを用いて行う。この場合には４０５　ｎｍで次の
吸光度が測定される（停止時点ｔ−Ｑを基準とする） 表　　　３ ホルムアルデヒドを停止試薬とする 例１による停止試薬 警 例　　４ 例１と同様にして試験を実施するが、例１記載の停止試
薬の代りに水性シュウ酸溶液（７重量％）０．２−を加
える。カタラーゼを用いる比較試験は例１に従って行う
。シュウ酸の停止効果は次の表４から判る。

表　　　４ 停止試薬としてカタラーゼ及びシュウ酸を含む１０種の
被検液に関して４０５　ｎｍで溶液の吸光度を測定した
（停止時点ｔ−０）。結果は次の表５に示す： 表　　　５ 表から、停止試薬としてシュウ酸を用いる測定精度は明
らかに低下していることが判る。

例　　５ （壁に結合されなかったＰＯＤ共役結合体）清液１：チ
ロキシンーＰＯＤ共役結合体活性：　０．６　ＭＵ／ｙ
ｄ、燐酸緩衝液（４０ｍＭ）中に溶解 溶液２：燐酸塩−クエン酸緩衝液１００　ｍｍｏｌ／１
Ｈ２０２３ｍｍｏｌ／　Ｉ ＡＢＴ８■１．６ｍｍｏ工／ｌ 浴液３：酢酸塩緩衝液５０　ｍｍｏｌ／Ａｒカタラーゼ
　２５ＣＩＵ／ｍｊ トリトンＸ−４０５２％ 溶液２　１ｍに溶液１８μｊを加える。

発色反応： は６０分後に溶液３１００μｌを加えて停止された。吸
光度を４０５　ｎｍで即時（’１’−（）分）及び６０
分後に測定した、結果は表６に示す：表　　　６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、過酸化物及び色原体を加えかつ色原体の酸化の際に
   生じた色を測定し、この際発色を一定時間後に停止剤を
   加えて停止することによつてペルオキシダーゼを測定す
   る方法において、停止剤としてカタラーゼを加えること
   を特徴とする前記方法。 ２、免疫学的又は化学的に結合されたペルオキシダーゼ
   を測定する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、色原体として２，２′−アジノ−ジ−〔３−エチル
   −ベンゾチアゾリン−スルホン酸−（６）〕の塩又はｏ
   −フェニレンジアミンを使用する特許請求の範囲第１項
   又は第２項記載の方法。 ４、カタラーゼを、非イオン性湿潤剤を含有するｐＨ５
   〜７の緩衝溶液の形で加える特許請求の範囲第１項から
   第３項までのいづれか１項記載の方法。 ５、過酸化物として過硼酸ナトリウムを加える特許請求
   の範囲第１項から第４項までのいづれか１項記載の方法
   。