JPS6089756A - 生物学的サンプル中のヘモグロビン量の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は生物学的検体（たとえば糞便、尿または胃液）
中のヘモグロビンの特別な定量試験および該試験を行な
うための方法に関する。これはヘム（ヘミン）、すなわ
ち蛋白質（グロビン）と結合してヘモグロビンを形成す
る天然色素の一定の”ｋ　異な性質に基づくものである
。ヘム自体は“ポルフィリン″と呼ばれる一群の赤色色
素の鉄錯体である。適切な波長の光を照射すると、ポル
フィリンは赤色の螢光を発するがヘムは発しない。更に
詳Ｘ（１１には、本発明は非螢光性へム部分から鉄な除
くことによりこれを螢光性ポルフィリンに変換させ、そ
して変換したポルフィリンの螢光を測定することによっ
て生物学的材料中のヘモグロビンのヘム色素部分の濃度
を定量する方法および試験に関する。この試験は特に、
糞便および胃液、尿のような生物学的材料に応用できる
。

糞便のような生物学的材料中の多量のヘモグロビンの存
在を検出する様々な高速予検試験法が現在利用されてい
る。これらの試験法は腸性腫瘍の一次子検試験として医
療専門家により使用されている。このような試験法は陽
性腫瘍の一次試験のためにアメリカ合衆国において毎年
１００万Å以上の人々について行なわれているものと推
定されている。これらの試験方法は定量的データをもた
らさないという事実、および試験結果の誤りは人的にも
また財政的にも極めて金がかかりすぎるという事実、更
に、現在利用されている試験方法は著しく高い不正な陽
性結果と不正な陰性結果をもたらすという事実にもかか
わらず、代りの試験方法がないので、この試験方法ワ今
でも使用されつづけている。

現在利用されている、糞便中のヘモグロビンの予４０試
験法はヘモグロビンのペルオキシダーゼ様（プソイドペ
ルオキシダーゼ）活性に基づく間接試験方法である。こ
れらの試験方法では、無色の白血球色素（たとえばグア
ヤク）がヘモグロビンの存在下で、適当なペルオキシダ
ーゼの添加につれて着色してくる。しかし、この試験方
法にはいくつかの限界がある。まず、第１に、非特異性
といったような様々な要因のため、ならびに、一般的に
反応性が鉄、アスコルビン酸、またハヘモクロビン分子
中の変質部所のような材料によって附害または悪影響を
受けろという事実のために、著しく高い誤った陽性結果
および誤つぇ陰性結果が得られろ。第２に、商業的に利
用されている試験方法の判定は、その結果が単に“陽性
″あるいは“陰性″としてしが報告されないので、しば
しば混乱づ−ろ。異なった試験の固有の感度差に加えて
試験の感度は糞便検体中の液体含量により大幅に変化°
Ｖる。提出されろ試験検体中に３まれる免便量は１０以
上の要因によっても変化す石。これらの要因ならびに前
記の非特異性および着色性の判定に粘けろ個人差などは
全て、これらの試験法の有用性を制限する。これらの制
限（でもかかわらず白血球色素に基づく、潜血検定は、
現在定量分析が不可能な数少ない臨床および診断薬によ
る非定量試験の一つとなっている。

１８４４〜１９６０年来、鉄を種々の酸その他の特殊な
処理による作用させて除くことによりヘムなポリフィリ
ンに定量的に変換することにつき数種の報文が配達して
いる。これらの方法のほとんどすべては血液、または血
液から単離されたヘモグロビン色素であるヘミンの利用
に基づくものであった。これらおよびこれらに襲似の方
法は、種々の仙のヘム蛋白質（たとえば年トクロームま
たはミオグロビン）からポルフィリンを製造するために
も用いられた。しかしこれらの方法は、定量的測定と関
連して用いろことを示しておらず、示唆してもいない。

さらにこれらＱ）いずれもヘノ・化合物υ、として糞便
、尿または胃液を用いること、あるいは上記の方法にお
いてこれらを定量的に測定することについては触れてい
ない。

この一般的な研究を組織中のヘモグロビンその仙のヘム
化合物の定量的１什定に利用することはＦｌｕｏｒｏｍ
ｅｔｒｉｃ　Ｍｉｃｒｏｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　
ｏｆｌｌｅｍｅ　Ｐｒｏｔｅｉｒ＋＋（Ａｒａｌ、　Ｃ
ｈｅｍ、　＋　３７　：　１１２４−１１２６．１９６
５）という標題の論文ＣＧ、　Ｒ。

Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　）に始まった。彼は１００’Ｃまた
は１２０’Ｃに加熱された飽和蓚酸水溶液を使用するこ
とによってヘムをポルフィリンに変換し、つづいて生成
したポルフィリンの螢光強度を測定した。

しかし、この方法では、きわめて低水準の砲度でシカヘ
モグロビン量の定量はできなかった。ヘモグロビン約０
８マイクログラム／ｍ１ｔ（蓚酸溶液）を越える〃°餐
度では比較的わずかな付加螢光が生じろにすぎず、従っ
てこの方法はこれよりも高いヘモグロビンＣ度では全（
無効であると報告されている。糞便検体のあるものはＭ
ｏｒｒｉｓｏｎがアッセ１°可住であろ・−と・？３忍
めた最犬儂度のｉｏｏ、ｏｏ。

倍以上を含有する可能性があるので、このように多量の
ヘモグロビンを含有する糞便はＭｏｒｒｉｓｏｎ法（ζ
より鎗酸中で加熱する前に数千倍に希釈しなければなら
なかった。このような過大な希釈は大量の予検試験には
適さない。

きわめて重要な仙の要素は、胃賜管（主として大腸）内
でヘモグロビンのヘムなポリフィリンに変換する特定の
腸内、ｌ１ｌＢ　ｔｒｉ　（い）っゆる”嫌気性に、ζ
”であると思われる）の存在である。このような変換の
程度は個体毎に異なるが、先ぎに行われている非定量的
な研究、および本発明に従って行われた研究は、腸内に
あるヘモグロビンの主要部分が若干の個体においてこの
様式でポルフィリンに変えられろ可能性のあることを示
唆している。これらのポルフィリンは現在の糞便中の血
液の試験に用いられている白血球色素のいずれとも反応
しないので、この細菌による作用が従来の白捕球色素試
験に１■して認められた不正の陰性反応の主留な原因で
あった可能性は十分ある。

従って、当分野では誤った正量および誤った電量の発生
率がゼロかあるいは著しく低く、しかも、大量の予検目
的に容易に使用できるような、糞便、尿または胃液のよ
うな生物学的材料中のヘモグロビン量を測定するための
正確な定量試験法がめられている。

本発明の方法は誤った正量ならびに誤った魚骨結果を示
さず、また、大量の予検用途に特に適する化物学的材料
中のヘモグロビンに対するｑｌ、異的かつ定量的試験に
関す−ろ。本発明に関連する試験法は（１）生物学的検
体の全プロトヘム含量も含めてヘモグロビンのようなヘ
ム化合物および腸内細菌によりポルフィリンに変換され
た部分について特異的である；（２）験体中に存在する
他の物質特に、隻便、胃液または尿中に存在する仙の物
質の干渉妨害を全くうけない；（３）感度が極めて高い
；（４）試験溶液１ｍｌ！あたり０．０２マイクログラ
ム未満の泉Ｉ隻から試験溶液１ｍ１３　ｊ、’ｒ）たり
１５００マイクログラムより高い濃度の７５０［１０倍
より高いヘモグロビン６度範囲にわたって定量分析でき
ろ；ｔ６よび（５）糞便、尿または胃ｔダ中に存在する
可能性があり、白血球染色試験にｊｔｌｊ、　ＩＦ／７
響を及ぼすことが知られていイ）鉄、アスコルビン酸、
　塩Ｎ’ｌ　、アスピリン、シメチジンまたはアルコー
ルのような化合物によって悪影＃ｆをうけないことが示
された。

本発明の特定的な方法によれば、非イ゛１ン光性ヘモグ
ロビン（ヘム）は、試１険されろ全てのヘモグロビン濃
度において螢光性ポルフィリンに定量的（・こ変換され
ろ。この変換は、検体中のへ）・１１′合物が有効量の
変換反応混合物と結合した場合ににころ。

好ましい方法ではこの変換反応？ｌＶＸ金物は比１ｌｊ
Ｑ的低いｐ　Ｉ−１ｋ有し、かつ鉄分子なヘム化合物か
ら除くのに適した還元能を有′１″ろ。好ましい方法で
は副反応を最小限度に抑えるために遊削基スキャベンジ
ャ−も添加し、変換反応の速度を増′ずために系を加熱
する。この変拗ののちヘノ、出来ボルフ・イリンを梢製
し、ポルフィリン濃度を螢光量測定により決定し、この
濃度を標準と比較して検体中のヘモグロビン量を決定す
る。

螢光検体中のヘモグロビンの普通の量（細菌によりポル
フィリンに変換された部分も含む）は、牛肉または豚肉
などの“赤″肉を３　”ｉ　７ｉ；　１−食↓１１を摂
っている個体において通常糞便１ｇ−当たりヘモグロビ
ン約０２〜１．ｏ〃ｔｇ（２ｏｏ〜１０００マイクログ
ラム）の範囲にあシ）と思われろ。一方この独の肉を毎
日１４ポンドまで含む食事の場合、糞便中のヘモグロビ
ンｉはヘモグロビン２また＋−ｚ　３　ｍ９／　ｆ！−
（糞便）にまで増加する可能性がある。ヘモグロビ７２
Ｄ　Ｏｍｇ（２００，０００マイクログラム）７ｇ−（
糞便）以上に及、ｑ商い水準は、著し、・出血を伴う場
合に認められた。糞便検体の調製（変換反応混合物の添
加を含む）に際しては、これをほぼ２５０倍に希釈し、
従って希釈された試験検体中の普通のヘモグロビン濃度
はヘモグロビン約１〜１０マイクログラム／ｍ、１３（
食事による）の荏四に、駆り、高い水準はヘモグロビン
１０００マイクロゲノム７’ｔｒ＋ｌｔ（またはそれ壌
土）となる可能性がある。希釈されていない尿の場合、
普通のヘモグロビン量ハヘモグロビン約０．１マイクロ
グラム／　ｍｌｔであると思われ、これは尿１マイクロ
リットル中約６個の赤血球に相当てろ。高い水準は尿お
よび１〜ンにンξメ父方にホ５いてヘモグロビン数千マ
イクログラム／ｍｅ　（底体）にも及ぶと推定されろ。

尿については試験検体のπＪ・１製中にろ倍希釈され、
胃液（（つい−（＝・、′：、２０倍希釈さ］］、た場
合、可能性のあるヘモグロビン濃度は希釈δれた検体１
ｍｇ当たり０．１マイクログラム以下から数百マイクロ
グラムのヘモグロビンに及ぶ。

変換反応混合物は、満足すべき作用を示すためには、可
能性のあるヘモグロビン縮度範囲全体にわたって実質的
にすべてのまたは再現性のホ・ろ量もしくは部分のヘモ
グロビンをポルフィリンに変換するものでなければなら
ない。糞便、尿または胃液を扱う場合、この濃度は希釈
の程度に応じてヘモグロビン１マイクログラム／、ｑｔ
ｅ　（浴液）以下のぎわめて低い水準からヘモグロビン
１０００マイ、クログラム／ｍ１３（希釈液）（または
それ以上）程度の高さまで変化する可能性がある。満足
すべき混合物であれば、ヘモグロビン１）＝ＨＣｊを変
拗されたポルフィリンの螢光量に対してプロツトシた場
合直線または直線的曲線となるであろう。好ましい混合
物は蓚酸などの置元辣と懺酸第１鉄（ＦｅＳＯ４）など
の還元塩の絹合せである。この組合せを変換反応混合物
として用いると、ヘモグロビン濃度と変換したボルフ≧
リンの螢光量との間に実質上面線内な関係が得られろ。

しかし蓚酸およびＦｅＳＯ４以外の混合物も可能な範囲
のヘモグロビン製団において（・まヘモグロビンをポル
フィリンに変換するであろう。これら仙の混合物は、実
質的にすべてのまたは再現性のある量もしくン主部分の
ヘモグロビンがポルフィリンに変換されろならば、本発
明における変換反応混合物として満足すべき作用を示す
であろう。これが行われた時点でヘモグロビン量は変換
されたポルフィリン量を測定し、これを標準と比較する
ことによって算出できる。希釈係数が前記のものと同様
である場合、好ましい変換反応混合物はヘモグロビン濃
度少なくとも約４０マイクログラム／ｍ１３、好ま（７
くは数白マイクログラム／ｍｅ（希釈検体）において実
質的にすべてのまたは再現性のあろ量もしくは部分のヘ
モグロビンをポルフィリンに変えろものでなげればなら
ない二 糞便、尿および胃液はヘモグロビンからＤｉ４されたポ
ルフィリンに関連しない螢光を有する。適切な条件下で
は、この利（の“非特異的”螢光（正ハ、残存ヘムの有
意量をポルフィ１）：／に変ｒσＱｔ：’：Ｓことなく
変換試薬によって認められろ仙の螢光性物質を存続させ
る第２の試薬中で別個に、かつ精製することなく測定さ
れるであろう。１．５　Ｒ，（クエン酸を用いるとほぼ
この条件に近づく。これが推奨されろ条件下でポルフィ
リンに変えるヘモグロビンへムは０．２係以下であろう
。理想的状態では、クエン酸試桑により得た値をヘム変
換試薬により得た総量から引けば、変換反応混合物によ
ってヘモグロビンから形成されたポルノ・「リンに特異
的に由来する値が得られろ。

上記のクエン酸６空試験″の採用は特定の用途には有用
であることが認められたが、糞便に応用する場合はその
価値が′Ｉｉ！Ｉ限されろ。主な理由は成人の胃腸管に
入るヘムの約２０〜７０％は特定の腸内細菌によりポル
フィリンに変換されろことである。従ってクエン酸“空
試験″で得た値を引いたものは、せいぜい紮便中の残存
ヘノ・濃度を示すにすぎず、腸管に入ったヘモグロビン
ヘム全量ヲ示すものではない。さらに糞便中にし・デし
ば存白二する非特異的化合物（たとえばクロロフィル）
　＋ｒ’ｒ。

変換試薬中とクエン酸中とで等しし・螢光を発したいつ
これらの条件下では残存ヘムにつ（・てすら信頼すべき
“空試験″ではない。最後に若干の検体においては、ヘ
ム関連イ１シ光が総初期螢光の１係よりも１１まろかに
少なく、従って計算誤差が許容できないほど大きい可能
性がある。従って好まジアジ・方法では、ヘモグロビン
から誘導されたポルフィリン（腸内細菌によるもの、お
よび外部から刺へされた・１ヒ学的変４力によるもの双
方）を螢光測定の前に仙の妨害螢光から分離する。これ
は適切な精製または抽出操作により行うことができ・ｂ
ｏこのような操作で（ｉクエン酸試桑は０空試験″とし
てではなく、ヘムから腸内細菌の活動により誘導された
ボッ・／゛フイリン特異的供給源として含まれろ。

従って、本発明の目的は試験検体中のヘモグロビン量ヲ
特異的に、かつ定量的に測定する改良された試験法を提
供することである。

本発明の別の目的はヘモグロビンのへ１１部分をポルフ
ィリンに変換し、そして、その螢光な迎１定することに
よって試験検体中のヘモグロビン量を特異的に、かつ、
定量的に測定するだめの改良された方法を提供すること
である。

本発明の仙の目的は生物学的試験検体中のヘモグロビン
量を特異的に、かつ、定量的に測定するための、大量の
一次子検試験に特に適した、改良された試験法を提供す
ることである。

本発明の更に別の目的は糞便、尿または胃液のよう）、
ｓ−／４Ｆ、ｑ：η学的材料の試験！、二５を体中のヘ
モグロビン量を、試検体中に存在しえる可能性のある全
てのヘモグロビン濃度範囲にわたって、特異的に、かつ
、定量的に測定するための改良された方法を提供ｆるこ
とである。

本発明の更に別の目的は、可能性のあるすべてのヘモグ
ロビン濃度範囲にわたって実質的にすべてのまたは再現
性のある量もしくは部分のヘモグロビン化ポルフィリン
に変換するのに有効な変換反応混合物を用いろ、糞便、
尿または胃液検体中のヘモグロビン量を特異的に、かつ
定量的に測定するための改良された方法を提供すること
である。

本発明の更に別の目的は、糞便、尿または胃液中の、腸
内細菌によろヘムの変換に関与するヘモグロビンに関す
る定量試験法を提供することであり、これに（まヘム由
来ポルフィリンを単離する操作が合わせ含まれる。

本発明の別の目的は、遊離基その仙の化学物質による有
害な副反応を最小限定に抑えた、試験検体中のヘモグロ
ビン量を定量的に測定するための改良された方法を提供
することである。

本発明の前記のおよびその他の目的は図面、好ましく、
・方法および添付の請求範囲を参照することによって明
らかとなろう。

第１図は蓚酸および様々の量の硫酸第１鉄よりなる変換
反応混合物に関するヘモグロビン濃度に対して螢光強度
をプロットしたグラフである。

第２図は神々の変換反応混合物に関するヘモグロビン濃
度に対してイ１′７光強度をプロットしたグラフである
。

本発明の好ましい方法を用いろ定量試験法は基本的な四
方性工程を含む。第１工程はヘモグロビン量が定量試験
される生物学的物質の試験検体を調製することを含む。

第２工程は試験検体中のヘモグロビンの非螢光性ヘム部
分を螢光性ポルフィリンに定量的に変換することを含む
。第６エ程は非特異的螢光および妨害化合物を除くため
に精製することを含む。第４工程は定量的に保持された
、ヘモグロビン由来のポルフィリンの螢光を測定し、そ
して、これを既知のヘモグロビン濃度の対照用標準と比
較することを含む。糞便（尿または胃液でなく）に適用
した場合、第２工程は、ヘムなポルフィリンに変換する
ことなく腸内細菌によりヘムから誘導されたポルフィリ
ンな存続させろ第２の試桑をも含む。

試験サンプルの調製は、ヘモグロビン量を測定すべき生
物学的物質の試験検体を採集し混合し、そして、重量ま
たは容量を測定する工程を含む。

本発明の方法は様々な沖類の生物学的物質に応用できる
ように企図されているが、この方法は糞便、尿および胃
液検体について特に応用可能である。

従って、好ましい方法の説明は糞便検体について行なう
。試験量の糞便検体を最初に採集し、そして好ましくは
使用に供されるまで一１５℃の凍結状態で貯蔵する。

本発明の第２工程は試験検体中のヘモグロビンの＼ム部
分を定量的にポルフィリンに変換することを含む。これ
には試験検体を適宜な変換反応混合物と混合し、これを
加熱する副工程が含まれる。

これは好ましくは有害な副反応を減少させ、または除く
ための遊１ｉ！ｉｆ基スキャベンジャ−を添加する副工
程をも含む。

糞便検体を変換反応混合物と混合する副工程は、適切な
量（すなわち８．０　ｍｇ’）の試験検体を適切な容量
（−ｊなわち２．　Ｏｍｌ　）の変換反応混合物と混合
して、ヘモグロビンの非螢光性ヘム部分を螢光性ポルフ
ィリンに変換することを含む。多種の変換反応混合物か
ヘムなポルフィリンに定量的に変？ｈ才ろために有効で
あると思われるが、この棟の変換反応混合物は採用され
ろ希釈水準において予想サレ７．）　！Ｄ１々の−・モ
グロビン濃度についてこの変換を達成するのに十分な還
元能を有しなければならない。従って受容できる特異的
な変換反応混合物は一部は試験検体が希釈された程度に
依存する。

好ましい方法の場合のように糞便検体８．Ｏｎ・ｇを変
換反応混合物２．　Ｑ　ｍｌ、と合わせろ場合、糞便検
体（従ってこれに含まれるヘモグロビン）は約２５０倍
に希釈されろであろう。希釈係数は変換反応混合物の量
（ｒｎ／４）　（２，０ｍｇ）を糞便検体の量（１）（
０，００８ｆｉ’）で割ることにより決定されろ。

２５０倍希釈の糞便検体については、正常なヘモグロビ
ン量ハヘモグロビン約１〜１０マイクログラム／ｍ１．
（希釈検体）であろう。変換反応混合物として受容でき
るものであるためには、この種の混合物は好ましくはヘ
モグロビン濃度範囲全体にわたって実質的にすべてのま
たは再現性のある量モジ＜は部分のヘモグロビンをポル
フィリンに変換しなげればならない。これには正常より
も約４倍高いヘモグロビン水準を有する個体のヘモグロ
ビン濃度も含まれろであろう。従って上記の２５０倍希
釈に関して受容できろ変換反応混合物は、少なくとも−
＼モグロピン約４０マイクログラム／酌（希釈検体）の
ヘモグロビン水準までヘモグロビンの実質的にすべてま
たは再現性のある量もしくは部分をポルフィリンに変換
するのに十分な還元能を有するものであろう。

糞便検体を大幅に゛、孕釈づ澤と、変換反応混合物が有
効でなければならないヘモグロビン濃度水準は低下する
であろう。これにより他の変換反応混合物を使用できろ
可能性が生じろでおろう。すなワチ、４０マイクログラ
ム／　ｍｌの濃度のヘモグロビンを実質的にすべてまた
は再現性のある量もしく、′！、部分を変換するのには
不十分な還元能を有するがこれよりも低いヘモグロビン
水準では十分な還元能？もつものである。たとえば糞便
検体を１０００倍に希釈すると、変換反応混合物は約１
０マイクログラム／　ｍ１３のヘモグロビン濃度まで有
効であればよいであろう。このように変換反応混合物が
頁便検体に対して有効であるべきヘモグロビン濃度水準
は希釈の水準と反比例する。希釈水準すｌよりち変換反
応混合物の量（ｍｅ　）を糞便検体の量ヅ）で割ること
により決定される希釈係数がわかっていれば、変換反応
混合物が有効でなげればならないヘモグロビン濃度水準
（マ・ｆクログラム／ｒ、Ｌｌ）　（正常な場合の約４
倍のヘモグロビン水準）はｉ　ｏ、ｏ　ｏ　ｏを希釈係
数で割ることにより決定できろ。変換反応混合物は、有
効であるためには問題となる濃度範囲全体にわたって、
ヘモグロビンの実質的にすべてまたは再現性のある量も
しくは部分をポルフィリンに変えるのに十分な還元能を
有しなければならない。

ある変換反応混合物が、込？、）ヘモグロビンｒＡ度範
囲全体にわたって有効であるか否かを判定する一方法は
、ヘモグロビン叔度を変換し六二ポルフィリンの螢光水
準に対してプロットすることである。

得られた曲線が問題となっている濃度範囲全体にわたっ
て実質上直線的でおるならば、その変換反応混合物はこ
れらの濃度において有効であろう。

蓚酸およびＦｅ５Ｏ９からなる好ましい変換反応混合物
は、少なくとも約１０００マイクログラム／ｍｌのヘモ
グロビン濃度まではヘモグロビン濃度と変換されたポル
フィリン濃度の間に実質上直線的な関係を示す。従って
この水準では実質的にすべてのヘモグロビンがポルフィ
リンに変換される。これは第１図に最も良く示される。

これは蓚酸と種々の量のＦｅ５０．　との混合物である
数種の変換反応混合物について、ヘモグロビン濃度を螢
光量に対してプロットしたグラフからなる。このグラフ
を作成するために用いたデータは、蓚酸および種々の量
（０１〜３チ）の硫酸第１鉄を添加した希釈血液検体を
加熱することにより得られた。図示されるように、棹４
の郊：の価酸第１鉄と組合わせたＦＪｌ＆は少なくとも
１．　［１００マイクログラム／　ｍｌの水準までは希
釈血液中のヘムな変換させるのに適している。他方、蓚
酸単独では約１０〜１５マイクログラム／ｍ６の水準ま
たはそれ以下で非直線性を示し始めろ。省ｒつて、蓚酸
単独で変換反応混合物として十分な還元能をもつために
は、糞便検体を著しく希釈しなければならないであろう
（少なくとも約１．ｏｏｏ倍程度）。

好ましい変換反応混合物は蓚酸２．５ＭおよびＦ　ｅ　
８０４ｏ、　０９　Ｍを含有する。この混合物には遊離
基スキャベンジャ−として作用する尿酸００５Ｍおよび
マンニトール０．１Ｍも含まれる。これらの付加成分の
添加についてはのちにさらに詳述する。変換反応に際し
て鉄が非螢光性ヘム分子から除かれ、近紫外線で照射し
た際螢光を発する鉄不含の螢光性プロトポルフィリンお
よび仙のポルフィリンが得られる。この酸溶液における
最大；δ′？光強度は約４００〜４０６　ｎｍの波長で
照射（励起）することにより生じろ。存在する個々のポ
ルフィリンはわずか１・亡異なろ励起および放出の１電
太値を有するので、幅広い（±２０ｎｍ）のスリットヲ
用いる。生成したポルフィリン混合物は、約５５０〜５
５５　ｎｍまたは５９５〜６００ｎｍの波長の緑色光ま
たは黄色光で照射した場合にも、よりわずかではあるが
螢光を発する。プロトポルフィリンのほかに有意量のへ
マドポルフィリンおよびモノビニル−モノヒドロキシエ
チル中間体異性体と思われるものも、蓚酸：値酸第１鉄
との反応中にヘムから生成する。同様な螢光特性を有す
る仙のポルフィリン数種も腸内細菌によりヘムから生成
する。

蓚酸：硫酸第１鉄の系が好ましいが、仙の系も作動する
であろう。これに関して、他の有効と思われろ変換反応
混合物数種について変換試駆を行った。これらの変換試
験のそれぞれにおいて、ヘモグロビン０．７１　ｍｌ／
／　Ｐ　（Ｒ便）を含有する正常な糞便材料の一部に既
知の量のヘモグロビン（匍液）を添加して、７種の既知
濃度のヘモグロビンを含有する糞便検体を騙１製した。

次いで上記７種の糞便検体それぞれのダブル圧ついて本
発明の定量試験を実施する際に、それぞれ１０抽の有効
と思われる変換反応混合物を使用した。各試験において
、仇便検体８０■を変換反応混合物２．３　ｍ１３と合
わぜた。次いで検体ヲ那騰浴（１００℃）中で２０分間
加熱し、検体の−８・Ｌ（につき下記の３工程の抽出操
作を行った。各検体につき螢光分析を行った。ダブルの
分析につき平均値を表わしている結果を衣１に示す。こ
れらの混合物のうち４種によ＋Ｂぢだ結果ケ第２図にも
示す。この図には添加したヘモグロビンの儂ｍ：　Ｙ　
’Ｊｌ光量に対してプロットした。

表１および第２１ソ１に示しｔこ結果により示されろよ
うに試験した変換反応混合物のうちあるものは、％　Ｉ
ＣＲイヘモグロビンＩ７Ｘ！ｒ隻において仙よりも大量
にヘムなポルフィリンに変換した。たとえば蓚酸：Ｆｅ
５０　（−１ｌ＝６）および蓚酸：ＦｅＳＯ４：尿酸；
マンニトール（＋４）は、この試験系で考慮されたヘモ
グロビン濃度の全領域にわたって最高水準の変換率を示
した。従ってこれらの変換反応混合物が好ましい。仙の
系は比較的低いヘモグロビン濃度においては比較的良好
な変換率を示すが、比較的高い濃度水準では変換率がよ
り劣る。たとえば上記２種の糸のな−、か（（、蓚酸単
独（＋１）、（＆’６’Ｊｔ　：　５ｎＣ１（：ｌＩ：
２　）、蓚酸：Ｈ３Ｐ０２（４Ｉ＝５）、およびアスコ
ルビン酸：■］３ＰＯ６（＋７）は低濃度では比較的良
好な変換率を示す。しかし蓚酸単独（＋１　）による変
１ソｉ率は約１５マイクログラム／ｍｅ（試薬）以上の
ヘモグロビン濃度において低下し始め、一方修酸：５ｎ
Ｃ４２（＋２）による変換率は約７５〜１００マイクロ
グラム／　ｍ１４で低下し始め、アスコルビンＨ：ｌ−
１３ＰＯ，（＋７　）の場合は約２０〜６０マイクログ
ラム／ｍ／！で低下し始めろ。蓚酸：　Ｈ３Ｐ０２（＝
ｌＩ＝　５　）系は、一般にヘモグロビンＩＮ度範囲全
体にわたって低い螢光水準を示すが、なお一般に直線関
係にある。従ってこれら４種の系（−１１＝１．＋２．
＋５および＋７）は変換反応混合物として有効であろう
。ただし＋１、＋２および≠７はそれぞれ約１５．７５
〜１００および２０〜６０マイクログラム／ｍｅまでの
ヘモグロビン濃度について有効であろう（実質的に直線
）。表１の仙の系（クエン酸を除く）はずべてのヘモグ
ロビン濃度において比較的低い螢光収量を示すが、それ
にもかかわらずヘモグロビン濃度とソ；シ光量の間にな
お若干の関連性を示す。これらのいずれかが有効となる
ためには検体を著しく希釈しなければならないでホ１ろ
う。クエン酸系はきわめて低い変換率を示すので、本発
明方法におけろ変換反応混合物として用いろことはでき
ない。

上記の蓚酸：硫酸第１鉄の好ましい系以外の系は、これ
らが適切な濃度で実質的にすべてのまたは再現性のある
量もしくは部分のヘムなポルフィリンに変換するならば
、種々の程度に受容できるであろう。しかしあるもの、
たとえば＋１、＋２．４Ｉ＝５および≠７は検体をさら
に希釈することによりいっそう良好に作用し、これによ
り適切な濃度水準が低下する。一般に特定の試薬による
変換率が大きいほど、その試桑ハ本発明方法においてい
つ太う受容されるで、１Ｒろう。どの試薬な使、用する
かを判定する際には、安全性も普通は重要な役割を有す
る。たとえばＩ■３ＰＯ２、Ｈ２ＳＯ４およびｌ−ＩＣ
４などの試薬は変換反応混合物の一部として受容できろ
作用を示すが、これら（ま好ましい蓚酸：　Ｆ　ｅ　Ｓ
　Ｏ４系を用いる場合よりも作業に際しより有害である
。しかし実質的にすべてのまたは再現性のある量も（−
りは部分のへ〕−を採用されろ条件下で（すなわち加熱
の程度および時間、検体の希釈、後記の遊離基スキャベ
ンジャ−の使用により有害な副反応が制御または除去さ
れる程度）ポルフィリンに変換できる還元剤を−Ｌいず
れも受容できるで、・・、ろう。

変換試薬がヘム分子から鉄を除去して螢光性ポルフィリ
ンを遊離させろ程度および速度、従ってその有効性は、
主として以下の２種の化学的要素の絹合せに依存するで
あろ・う。（１）試薬系の還元能および（２）試薬系の
酸度またはｐＨ０蓚酸単独は比較的低いヘモグロビン濃
度においては変換試薬として有効となるのに十分な還元
節および十分に低いｐ　Ｈを有するが、仙の還元酸たと
えばアスコルビン酸は望ましい程度に低いｐＨを得ろた
めてはより強い酸の添加を必要とする。

リン酸、蟻酸、硫酸、塩酸および酒石酸はｐＨが十分に
低いが、これらは還元塩および／または仙の還元性化合
物を添加することにより補足されなければならない。本
発明による変換反応混合物として適切に作用するために
は、２５°Ｃにおけるこの種の混合物のｐＨは２以下、
好ましくは約１．６以下でなければならない。

前記のように系の還元能を増すために硫酸第１鉄（Ｆ　
ｅ　Ｓ　Ｏ４）を蓚酸その他の棟々の還元部と組合わせ
ろ。Ｆ、Ｒ／／の仙の還元塩および他の化合物も有効で
あろう。たとえば各種の第１鉄塩、第１マンガン塩、第
１錫塩、第１コバルト塩およびニッケル塩、たとえば１
ｉ（酸第１鉄、硫酸第１マンガン（ＭｎＳＯ）、塩化第
１　ｅ５）ｒ　（Ｓ　ｎ　Ｃｔ　２　）　、塩化ニソケ
ル（ＮＩＣｔ２）、塩化コバルト（Ｃｏ　Ｃｔ２　）お
よびジチオスレイトールは変換反応系の還元能を改良す
る作用を示すであろう。次亜リン酸（■−Ｉ３ＰＯ２）
およびオルト亜リン酸（Ｈ３ＰＯ３）も系の還元能を増
すのに有効で、ｌ＋）ることが示された。

仙の要素もヘムからポルフィリンへの変換、および生成
するポルフィリンの種類に影響を当える可能性がある。

たとえばヘムなポルフィリンに変換する反応は室幅１１
でもある程度進行するであろうが、反応の速度および程
度は加熱によって改良されろであろう。オートクレーブ
（１１０℃、９０分）、浮腫水浴もしくは熱水浴（８０
〜１０　〔１’Ｃｌ２Ｏ分またはそＪｌ、　ｐＪ上）、
および電子オープン（数分またはそれ以下）を含む各種
の熱源が用いｃ−、れる。すべてが本発明方法と組合わ
せて用いるために受答できることが認められた。ただし
約１００°Ｃに加熱することが簡便でありかつ好ましい
系におけろ螢光収率が改良されろという利点をもつ。加
熱の温度および時間は変換速度のみでなく生成するポル
ノ・イリンの組成にも影響を力える。

温度が高すぎろ場合は、有害な副反応のため若干のポル
フィリンが分解する可箭件がある。これは遊（、！ｉ（
基“スキャベンジャ−°”たとえば尿酸およびマンニト
ールの使用によりある程度抑えろことができるが、温度
は普通は１２０°Ｃを越えろべきで　′ない。温度は好
ましくは約９０〜１１０℃とすべきである。

必要な反応時間（・ま変換試薬の７ｉ１１’１度および
熱沖の種類に依存するであろう。変換も糞便中よりは希
釈血液中の方が速やかであり、一部１ま少なくとも試験
検体の完全な混和に関連性があると思われろ。

広範な温度および滞゛留時間を採用しうるが、温度およ
び滞留時１１１は実質的にすべての、または再現性のあ
る部分のヘムをポルフィリンに変換するのに有効なもの
でなければならない。好ましい方法では、糸を約１００
℃の温度に２０分間加熱する。

回収されろ最終ポルフィリンの量は、ヘムに変化させ、
もしくは分解するいわゆる６遊隨基″を含む反応性生成
物の生成によっても著しく影響され、またこれよりもλ
す［ハ゛は低いが生成するポルフィリンによっても影響
される。これらの作用は、系の特定の（ヒ学成分によっ
て、または試験検体の成分によって影響される。この種
の遊離基の生成は、蓚酸およびＦｃ５Ｏ６という好まし
い変換試薬の１易合のように第１鉄イオンを含む系にお
いては周知である（”フェントン反応パ）。変換反応混
合物にこれらの各独遊離基と速やかに反応してこ陽′シ
らを糸から取り除く作用を示す成分を添加することによ
って、ヘムまた（′よ変換したポルフィリンの分１【１
イまたは変化が最小限度に抑えられ、試験の粘度が改良
されろ。いわゆる遊離基１スキャベンジャ−′”数種を
試験し、いずれが加熱または変換試−膓の変換成分に、
Ｌろ処理に伴う可能性のある有害なｒｉｉｌ１反応から
へｌ・およびポルフィリンを最も良好に保獲するかを判
定した。試験したもののうち尿ｒ１１６よびマンニトー
ルが竜良の結果を与えた。

好ましい方法においては、尿酸０．０５Ｍおよびマンニ
トール０１１Ｍを用いる。

一般に試験検体中のヘム分子から鉄を除去するのに十分
に酸性であり（約２以下のｐＨ）かつ十分な還元能を有
する系はいずれも本発明による変換試薬として作用しう
る。ある系はヘムな螢光性ポルフィリンに変換する効率
および再現性がより太きいという理由で仙の系よりも優
れて１ｔまいろが、主骨の（好ましくは約５０％以上）
および杓現性のある部分のヘムをポルフィリンに変換す
る試薬はいずれも本発明方法により試験検体中のヘモグ
ロビン水準を定量的に濱１１定するために使用できると
とを留意すべきである。

試験検体を変換試薬と混合し、加熱したのち、得られた
混合物につき抽出または情！！！操作を行ってヘモグロ
ビンから誘導されたポルフィリンヲ単離、精製すること
が好ましい。上記で得た混合物中には、好ましい方法に
おいて採用されろ螢光会釉によりまたは吸光１り祈によ
りポルフィリン量を測定する際に、ヘモグロビンから誘
導されたポルフィリン水準を正確に測定する可能性に影
響を与えろと思われる不純物故稗が存在する。これらの
妨害成分を除去することが望ましい。これには天然のポ
ルフィリン、クロロフィル、および変換したポルフィリ
ンの波長と一致する螢光波長をもつ仙の神々の物質が含
まれろ。

好マしい方法においては、ヘモグロビンのヘム部分の変
換のみに由来するポルフィリンを単離、精製する方法は
一般的な抽出および精製の６王程を伴う。これについて
は本発明者らの出願中の米国特許出願第４１８．２８２
号明細書（１９８２年９月１６日出１ｆｉｆ（’）によ
り詳細に記述されている。第１工程には混合物を溶剤と
共に振とうすることが含まれろ。これｂ＝１、最終的測
定が望まれているポルノ・イリン（すなわちヘモグロビ
ン由来のポルフィリン）を抽出しうろ有機溶剤、たとえ
ば少量の氷雪１：酸を含有ずろ酢酸エチルである。好ま
しい自動化された方法においては、酢酸エチル：酢酸試
薬の代わりにイソブチルアルコール、ジイソプロピルベ
ンゼンおよび酢酸（それぞれ６：４：１の比）を用いる
。

精製操作の第２−［稈は、天然のポルフィリンたとえば
コブロポルフイリンを含む不純物を抽出するための水性
溶剤の添加を伴う。詳細には、この工程には酢酸エチル
抽出液にｎ−プチルアルコールケ添加すること、および
これをアルカリ水溶液と共に振とうすることが含まれろ
。好ましい自動化法においては、工程１で得た。ヒ清を
直接にアルカリ水溶液と共に振とうずろ。

次いで第６の抽出工程を行ってヘモグロビン由来のポル
フィリンを抽出すると、赤色螢光性のクロロフィルおよ
び他の“脂溶性″物勿が残存する。

この第ろ工８は、ポルフィリンを酢酸エチル：ブチルア
ルコール（またはイソブチルアルコール：ジイソプロピ
ルベンゼン）相から２Ｍリン酸および氷酢酸（９：１）
混合物により抽出することを（１）う。

本発明の如４−シい方法の最終工程は、試験検体中の変
換されたポルフィリン量を測定することである。これＫ
は好ましくは変換したポルフィリンの螢光量を既知の方
法で測定したのち同様にして調製した既知濃度の（変換
した）ヘモグロビンま、＃：゛：、ｃンア７メトヘモグ
ロビンを含む標準と比較する螢光測定法を採用する。実
質的にすべてのヘムを再現性のある状態でポルフィリン
に変換する変換試薬を用いろ場合、試験検体中の前駆体
ヘム（従ってヘモグロビン）の濃度は直接に算出できろ
。

好ましい実施態様の記載は極めて特別なものであるが、
その精神からはずれることなく本発明の方法および装置
に対して様々な変更および修正がなし７えろものと思わ
れる。従って、本発明の範囲は好ましい実施態様による
よりはむしろ、添伺の請求の範囲によってかきとられる
。

【図面の簡単な説明】

第１図は蓚酸および神々の量の倹酸第１鉄よりなる変（
１力反応混合物に関するヘモグロビン濃度に対して螢光
強度をプロットしたグラフである。 第２図は神々の変換反応混合物に関するヘモグロビン濃
度に対して螢光強度をプロットしたグラフである。 特許出願人　ザ・リージエンツ・オプ・ザ・ユニバーシ
ティ・オプ・ミネソタ （外ろ名） 昭和埒年　’４９ミ１願第　Ｉ　Ｆ、７ノ　号’ｉ、　
Ｖ”５）２７＋”＞Ｋンフ鶴寸のへｔツ゛１り　ヒ／子
つ・カニ　ゴニ　ヌ　ニチ、 ６、補正をする者 事件との関係　出　願　人 住所 り、　５　ソー爲／／　フ１ブ　寸゛　ユーノ、−、ア
イフｔｙ’ミネ／夕 ４、代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｍ　糞便、尿または胃液中のヘモグロビン量の定量測定
   方法であって、該方法は 前記話便、尿または胃液の試験検体を調製する工程； 前記試験検体を、酸性であり、かつ前記試験検体中の実
   質的にすべてのまたは再現性のカ・る部分のヘモグロビ
   ンをポルフィリンに変換するのに十分な還元能をもつ変
   換試薬と化合させろことによって、前記試験検体中のヘ
   モグロビンをポルフィリンに変換させる工程；ならびに 前記試験検体中のポルフィリンの量を測定する工程； からなることを特徴とする前記の定量方法。 （２）試験検体を調製する工程および該試験検体中ノヘ
   モグロビンをポルフィリンに変換する工程が、該試験検
   体を希釈して希釈液を調製することな含み、該希釈液が
   変換試薬および他の希釈成分の容積（ｍｌ）を該試験検
   体の重量（ｆＡで割ることにより決定される希釈係数を
   有する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （３）変換試薬が、少なくとも１０，０００を希釈係数
   で割ることにより定められる適切なヘモグロビン濃度水
   準（溶液ｉ　ｍｌ当たりのヘモグロビンのマイクログラ
   ム）まで、該試験検体中の実質的にすべてのまたは再現
   性のある部分のヘモグロビンをポルフィリンに変換する
   のに十分な還元能を有する特許請求の範囲第２項に記載
   の方法。 （４）　変換試薬が２以下のｐＨを有する特許請求の範
   囲第６項に記載の方法。 （５１変換試薬が 蓚酸、アスコルビン酸、蟻酸、硫酸、塩酸、リン酸、次
   亜リン酸およびオルト亜すン醒よりなる群から選ばれろ
   化合物１種または２種以上からなる酸成分；ならびに 第１鉄塩、＠１マンガン塩、第１錫塩、第１コバルト塩
   およびニッケル塩、ジチオスレイトール、蓚酸、アスコ
   ルビン酸、次亜リン酸ならびにオルト亜リン酸よりなる
   群から選ばれる化合物１種または２種以上からなる還元
   成分； の組合せを含む特許請求の範囲第４項に記載の方法。 （６）変換試薬が少な（とも前記の適切なヘモグロビン
   濃度水準まで、ヘモグロビン濃度と変換されたポルフィ
   リンの螢光水準との実質上直線的な関係を与えろのに十
   分な還元能を有する特許請求の範囲第６項に記載の方法
   。 （７）試験検体を調製する工程および該試験検体中ノヘ
   モグロビンをポルフィリンに変換する工程が、該試験検
   体を希釈し７て希釈ｉを調製することを含む特許請求の
   範囲第１項に記載の方法。 （８）変換試薬が少なくとも希釈液１１ｕｇ当たりヘモ
   グロビン約４０マ・ｆクログラムまでの濃度水準におい
   て、該試験検体中の実質的にすべての−または再現性の
   ある部分のヘモグロビンをポルフィリンに変換するのに
   十分な還元能な有する特許請求（９）変換試薬は、ポル
   フィリンへのヘモグロビン変換が少なくとも希釈液１ｍ
   当たりヘモグロビン約４０マイクログラムの濃度水準ま
   で実質上直線的となるものである特許請求の範囲第８項
   に記載の方法。 （１α　変換試薬が、正常なヘモグロビン水準をもつヒ
   トから得た試験検体の希釈液中に予想されろヘモグロビ
   ン濃度水準の少なくとも約４倍までの６度水準において
   、該試験検体中の実質的にすべてのまたは再現性のある
   部分のヘモグロビンをポルフィリンに変換するのに十分
   な還元能を有する特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ０１）変換したポルフィリンを不純物から実質的に単１
   １１することを含む特許請求の範囲第１項に記載の方法
   。 ０４　ヘモグロビンからポルフィリンへの変換に際して
   生成した遊離基と反応する第２の試薬を添加することを
   含む特許請求の範囲第１項に記載の方法。 １ｊ３）第２の試薬が尿酸およびマンニトールを含む特
   許請求の範囲第１２項記載の方法。 （１優　糞便中のヘモグロビン量の定量測定方法であっ
   て、該方法は 前記糞便の試験検体を調製する工程； 前記試験検体を、酸性であり、かつ前記試劇検体中の実
   質的にすべてのまたは再現性のある部分のヘモグロビン
   をポルフィリンに変換するのに＋５分な還元能をもつ変
   換試薬と化合させることによって前記試験検体中のヘモ
   グロビンをポルフィリンに変換させる工程；ならびに 前記試験検体中のポルフィリンの量を画定する工程； からなることを特徴とする前記の定量方法。 （１５）試験検体を調製する工程および該試験検体中ノ
   ヘモグロビンをポルフィリンに変換する工程が、該糞便
   試験検体を希釈して希釈液を調製することを含み、該希
   釈液が変換試薬および他の希釈成分の容積（酎）を該試
   験検体の重量僚）で割ることにより決定される希釈係数
   を有する特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 （ｔｔｉ　変換試薬が、少なくとも１０，０００を希釈
   係数で割ることにより定められる適切なヘモグロビン濃
   度水準（溶液１Ｎ当たりのヘモグロビンのマイクログラ
   ム）まで、該試験検体中の実質的にすべてのまたは再現
   性のある部分のヘモグロビンをポルフィリンに変換する
   のに十分な還元能を有する特許請求の範囲第１５項に記
   載の方法。 （１７）変換試薬が２以下のｐＨを有する特許請求の範
   囲第１５項に記載の方法。 （ｌ榎　変換試薬が 蓚酸、アスコルビン酸、蟻酸、硫酸、塩酸、リン酸、次
   亜リン酸およびオルト亜リン酸よりなる群から選ばれる
   化合物１種または２種以上からなる酸成分；ならびに 第１鉄塩、第１マンガン塩、第１錫塩、第１コバルト塩
   およびニッケル塩、ジチオスレイトール、蓚酸、アスコ
   ルビン酸、次亜リン酸ならびにオルト亜リン酸よりなる
   群から選ばれろ化合物１押まプこは２種以上からなる還
   元成分； の組合せを含む瞥許請求の範囲第１７項に記載の方法。 （１９）変換試薬が 蓚酸、アスコルビン陣、蟻酸、硫酸、塩酸、リン酸、次
   亜リン酸およびオルト亜リン酸よりなる群から選ばれろ
   化合物１種または２種以上からなる酸成分；ならびに 第１鉄塩、第１マンガン塩、第１錫塩、第１コバルト塩
   およびニッケル塩、ジチオスレイトール、蓚酸、アスコ
   ルビン酸、次亜リン酸ならびにオル毒 トリン酸よりなる群から選ばれろ化合物１種または２種
   以上からなる還元成分； の組合せを富む特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 （２０変換試薬が２以上のｐＨを有する特許請求の範囲
   第１４項に記載の方法。 （２１）試験検体を調製する工程および該試、験検体中
   のヘモグロビンをポルフィリンに変換する工程（２湧変
   換試桑は、ポルフィリンへのヘモグロビン変換が少なく
   とも希釈液ｉ　ｍ１３肖たりヘモグロビン約４０マイク
   ログラムの濃度水準まで実質上直線的となるものである
   特許請求の範囲第２１項に記載の方法。 （２３）変換試薬が少なくとも希釈液１ｍｅ当たりヘモ
   グロビン約４０マイクログラムまでの６度水準において
   、該試験検体中の実質的にすべてのまたは再現性のある
   部分のヘモグロビンをポリフィリンに変換するのに十分
   な還元能な有する特許請求の範囲第２１項に記載の方法
   。 （２４）変換試薬が、正常なヘモグロビン水準をもつヒ
   トから得た試験検体′ｒ希釈液中に予想されろヘモグロ
   ビン濃度水準の少なくとも約４倍までの濃度水準におい
   て、該試験検体中の実質的にすべてのまたは再現性のあ
   る部分のヘモグロビンをポルフィリンに変換するのに十
   分な還元能を有する特許請求の範囲第２１項に記載の方
   法。 （２５）約８０〜１２０°Ｃの温度に加熱することを含
   む特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （２６）約８０〜１２０℃の温度に加熱することを含む
   特許請求の範囲第１４項に記載の方法。 （２７）　ポルフィリンにを螢光分析により測定する特
   許請求の範囲第１項に記載の方法。 （２８）　ポルフィリン量を螢光分析により測定する特
   許請求の範囲第１４項に記載の方法。