JPS608738B2 - 細胞の螢光偏光度測定装置 - Google Patents

細胞の螢光偏光度測定装置

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JPS608738B2
JPS608738B2 JP57078237A JP7823782A JPS608738B2 JP S608738 B2 JPS608738 B2 JP S608738B2 JP 57078237 A JP57078237 A JP 57078237A JP 7823782 A JP7823782 A JP 7823782A JP S608738 B2 JPS608738 B2 JP S608738B2
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勝己 高見
千秋 真保
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6445Measuring fluorescence polarisation

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  • Health & Medical Sciences (AREA)
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  • General Physics & Mathematics (AREA)
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  • Pathology (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞、特にリンパ球の蟹光偏光度を額8定する
装置に関するものである。
リンパ球の免疫反応を蟹光偏光度によって検出し、健診
断を行なう方法は既に知られている(最新医学、Vo1
32、No.4 1977、P789)。
しかし、上記文献中で用いられている蟹光偏光度測定方
法は試料セルに1び個位のIJンパ球を入れて、その平
均値としての偏光度を求めているに過ぎない。しかるに
、免疫反応で偏光度が変るのは、全リンパ球の中の約4
0〜50%程度が限定であって、平均値を求めることは
徒らに信号成分を殺してしまってS/N比を低下させる
ことにしかならない。このため、リンパ球の前処理条件
、あるいは偏光度の測定条件の設定が難しく、名人芸的
手続きが要求される。この問題を解決する手段として、
第1図に示したように、リンパ球30をノズル31から
ピストン32によって流出させ、外側からリンパ球30
の流出速度より遠い水流33を与えて、リンパ球30を
一列に揃えてリンパ球1個1個について励起光34を当
てその蟹光偏光度を求め、各々について蟹光偏光度と個
数とをヒストグラムで実時間表示すれば、信号成分は平
均化されることなく、近似的にCa船sian分布とし
て表示される。
この分布のピーク近傍部分が免疫反応の情報量を最も多
く担っているリンパ球の群ということができる。しかし
、リンパ球(直径約lowm)1個から放出される総光
の量は通常極めて微弱であり、尋常の手段では検出でき
ない。
そのため、励起光源としてレーザーを用い、高エネルギ
ーでリンパ球を励起して蟹光強度を高めるという手段が
考えられる。しかし、レーザーは一般に固定波長であり
、リンパ球の蟹光偏光度を検出するに適合した波長が得
難い。一方、ダーィレーザーなどの可変波長レーザ−を
用いることも考えられるが、パルス発振では速い流速で
流れる試料には不適格であり、かつ光源としての不安定
、短寿命、保守の複雑さ等から実用的でない。
これに対して、Xe、Hgランプ等を光源に選べば励起
波長はフィル夕によって自由に選択でき信頼性も高いが
、上述したように励起エネルギー不足で後光強度が微弱
となる。
従って、本発明の目的はXeランプ等の広波長城光源を
用いて、個々のリンパ球の蟹光偏光度を検出する光学的
手段をもつ蟹光偏光度測定装置を提供することにある。
以下、本発明を図面を用いて詳細に説明する。第2図は
本発明により細胞の蟹光偏光度測定装置の概略構成を示
す図である。図において、1はXeランプ、2は集光鏡
、3はコールドミラーである。このコールドミラー3は
励起光より長い波長を透過し、励起光近傍波長のみを反
射する性質をもっている。4はスリット、5は励起光を
平行光東にするためのレンズ、6は干渉フィル夕、7は
カットフィル夕である。
干渉フィル夕6をカットフィル夕7とによって励起波長
を選択する。8は集東レンズでF(焦点距離)数のなる
べく小さいレンズを用いる。
9は平板形の偏光素子で垂直方向の直線偏光を与える働
きをする。
1川ま四角形試料セルで、第1図に示したようなリンパ
球流出機構を内蔵している。
偏光素子9はこのセル10‘こ密着するか、あるいは近
接するように配遣されている。このようにすることによ
って、垂直偏光した励起光はセル10の壁面を透過し、
比較的偏光解消の少ない状態で、第1図に示したように
リンパ球30の流出口部分35へ集東される。11は試
料セルー川ま密着するか、あるいは近傍するように配置
されている平板形偏光素子であり、リンパ球からの蟹光
の水平偏光成分1↓(励起光と直角)を備えるように配
置される。
12はF数の小さい大口径の集光レンズであり、入射光
を平行ビームに変える働きをする。
13は干渉フィル夕、14はカットフィル夕であり、こ
れらによって後光の特定波長を選択する。
15は集東レンズ、16はピンホールである。
このピンホール16は流出リンパ球以外からの雑音光を
カットする働きを行なう。17は光検出器、18は前層
増幅器ある。
他方、11′は平板形偏光素子であり、上述した平板形
偏光素子と同様に配置されているが、唯一の相違点は蟹
光の垂直偏光成分1ク(励起光と平行)を捕えるように
配置されていることである。
他の引出し番号12′〜18′は全て上述した引出し番
号12〜18と同一物、同一機能であるのでその説明は
省略する。次に信号処理系について述べる前層増幅器1
8,18′からの出力信号の比を割算回路19によって
求めると偏光解消度Qとなる。
すなわち、Q=1↓/1〆として表わされる。さらに、
偏光度pは、r〆−1」 P=口ウ了工 で表わされ、これは加算回路20、減算回路21、割算
回路22によって求めることができる。
偏光解消度Q、偏光度pは共にリンパ球の流速に対応し
た幅のパルスとして出力されるので、マルチチャンネル
アナライザー、或はマイクロコンピューター23に入力
すればQ,pはヒストグラムの形で表示される。以上述
べた本発明による細胞の蟹光偏光度測定装置の効果には
次のようなものがある。
‘1ー 1個1個のりンパ球の偏光度と個数分布として
ヒストグラムの形で補え、ピーク部分の形の変化として
検出するので、平均値として補える従来の方法に比較し
てS/N比が極めて大きい。
■ リンパ球から放出された蟹光はまず大形の平板形偏
光素子で受けるので集光レンズの直径を大きくすること
ができ(F数小)、微弱な蟹光強度でも高効率で受光で
きる。
このように、従来タブー視されていた偏光能の悪い平板
形偏光子が使用できる理由は、本発明が偏光度の絶対値
を測定するのでなく、ヒストグラムの形の変化という相
対値を測定してリンパ球の免疫反応を検知するためであ
る。もし、絶対値を知ろうとすれば偏光能の良いCla
n−Thompsomプリズムなどの結晶偏光素子を使
用しなければならない。これを集光効率の高いレンズの
前に配置するとすれば結晶も当然大形化されなくてはな
らず、それでなくとも高価なプリズムがさらに、極端に
高価なものとなり、実用的に使用不可能となる。‘3}
t2}に関連して、励起光側の偏光子も大形の平板偏
光子が使用できるので、大きな袋東レンズでエネルギー
を絞り込み、励起エネルギーの増大と同時に姿光強度の
増大を図り得る。{4) 偏光子が四角試料セルに密着
、あるいは近接して配置される(励起光の最終段、蟹光
受光の初段)ので、レンズその他の光学素子によって派
生する偏光解消現象が最小限にくし、止められる。
■ 一般に、試料セルに斜めに入射した励起光は偏光が
幾分解消する。
また、斜めに出射した蟹光もセル壁面で偏光解消する。
従って、本発明の装置のようにレンズ系で絞ったり、焦
点を合わせたりする光学系の使用は従来、誤差発生要因
の最たるものとしてタブー視されてきたが、本発明が偏
光度のヒストグラムの形の相対的変化のみを検知するこ
とを主眼にしているので、レンズ系の使用が初めて可能
となりXeランプ等のエネルギーの少ない光源でもリン
パ球1個1個の微弱な蟹光を捕えることが可能となる。
次に、さらに高感度検出を可能にするため、リンパ球に
FDA(Fluorescein−diacetate
)を加えて蟹光偏光を求める場合の測定装置について述
べる。第3図はその装置の概略構成を示す図である。図
において、光学系についての説明は第2図における説明
とほぼ同様であるので簡単に行なう。41はランプ光源
、42は励起光の波長選択および垂直方向の直線偏光を
得るための光学系、43は細胞1個1個からの水平偏光
成分を検出する光学系、44は同垂直偏光成分検出用光
学系、45は四角状の透明壁面を有し、中央部を細胞1
個1個が一列に揃って流出するように構成した謙料送出
機構である。
この図面では、細胞は紙面に垂直に流れる。46は励起
光の強度を検知する光電変換素子である。
光学系43,44で得られた信号は光検出器49,49
′で光軍変換された後、前暦増幅器50,50′で増幅
される。
これらの信号をそれぞれ、水平偏光成分(励起光と直角
)11、垂直偏光成分(励起光と平行)1〆とすると、
加算器52、減算器53、割算器54により偏光度pが
、また、割算器51により偏光解消度Qが、それぞれ求
められる。すなわち、1↓ p:傷台、Q=i亥 となる。
47はマルチャンネルアナラィザー(波高分析計)で個
々の細胞の偏光度p、偏光解消度Qの値の個数分布、す
なわちヒストグラムを表示する。
48はマイクロコンピューターで各種処理を行なつoさ
て、細胞として人のりンパ球を対象とし、蚤光剤として
FDA(Fluorescein−diacetate
)を用いる場合は、殆んどのリンパ球の偏光度p値は約
0.13〜0.27の間に在ることが明らかとなった。
そして、免疫反応でリンパ球の偏光度p値が僅かに変っ
たとしても、上甑の数値範囲にある時は必らずしも感度
よく、かつ鮮明に(S/N比よく)微小変化を捕えるこ
とができなかった。これに対して、偏光解消度Qのヒス
トグラムを表示した場合は上記微小変化を高感度でS/
N比よく検知でき、免疫反応を知るには偏光度pより偏
光解消度Qが有効であることが判明した。
その理由は次の通りである。偏光度pが書きかえるとp
=(1−Q)/(1十Q)となる。従って第4図に示し
たように、偏光度pが約0.13〜0.27の範囲では
偏光解光消度Qの変化に対して偏光度pの変化が鈍い。
しかも、リンパ球を試薬(Phytohema鞍lut
inin)によって刺激した場合は偏光度p値に更に低
下(例えば、0.1〜0.23位)し、益々偏光解消度
Qの変化率の方が大きくなる。偏光解消度Qを捕える事
の有利性は以上の理由による。さらに、人のりンパ球で
は免疫反応、あるいは酵素活性化作用、あるいはその他
の複合効果と目される現象によって蟹光変換効率が増大
することが判明した。
これをBと書き表わすと、3=(1〆十1↓)/lex
となる(lexは励起光強度)。
したがって、生化学的に因果関係が1対1に対応するパ
ラメータではないが、本発明にあっては蟹光変換効率8
のヒストグラムを表示し、生化学的な問題解明の1パラ
メータとする。この蟹光変換効率8は加算器52の出力
を、励起光強度検知器46からの信号lexを前層増幅
器58で増幅したもので割算器65によって割り算する
ことによって求められる。さらに、偏光解消度Qと麓光
変換効率Bとの積rをとりr=Q8なる値のヒストグラ
ムを表示したところ、偏光解消度Qだけの場合に比較し
てリンパ球の極めて僅かな免疫反応を遥かに高感度で、
しかも鮮明に検知することができた。
なお、積rは鶏算器56によって求められる。しかし、
積rなるパラメータが生化学的にも、物理的にも一体何
を意味するのか現時点では判っていない。当然の起給と
して、蟹光変換効率8と偏光度pとの比6、即ち6=3
/pも1つのパラメータとして高感度検出に有効である
。なお、比6は割算器57によって求めることができる
。以上述べたように、従来の表示パラメータpだけでな
く、リンパ球の生化学的反応を高感度で検出できるQ、
6、y、6なるパラメータをヒストグラムとして表示す
るので、これによって種々の反応を解明するのに有効と
なる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明によるリンパ球流出装置の概略構成図、
第2図は本発明によるリンパ球の蟹光偏光度測定装置の
概略構成図、第3図は本発明による高感度リンパ球蟹光
偏光度測定装置の概略構成図、第4図はパラメータQと
pとの関係を示すグラフである。 41・…・・光源、42・・・・・・励起光用光学系、
43・…・・直交偏光成分検出用光学系、44・・・・
・・平行成分検出用光学系、45・・・試料セル、47
・・…・マルチチャンネルアナライザー、48・・・・
・・マイクロコンピューター。 努’図 第4図 努之図 多づ釘

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 四角状の透明壁面を有し、中央部を細胞が順次一列
    に揃って流れるようにした試料流出機構と、 ランプ光
    源からの光を波長選択および垂直偏光して得られた励起
    光を上記試料流出機構の一側面に入射させるための上記
    試料流出機構に密着あるいは近接して設けられた第1の
    光学系と、 上記資料流出機構の上記第1の光学系と直
    交する一側面に密着あるいは近接して設けられ、個々の
    細胞からの螢光の垂直偏光成分を検出するための第2の
    光学系と、 上記試料流出機構の上記第2の光学系と対
    向する側面に近接して設けられ、個々の細胞からの螢光
    の水平偏光成分を順次検出するための第3の光学系と、
    上記の順次検出されたそれぞれの光を電気信号にそれ
    ぞれ変換するための光電変換手段と、 上記それぞれの
    電気信号出力を演算して各種パラメータを得るための演
    算手段と、 上記演算の結果を細胞の個数分布としてヒ
    ストグラム表示する表示手段とからなることを特徴とす
    る細胞の螢光偏光度測定装置。
JP57078237A 1982-05-12 1982-05-12 細胞の螢光偏光度測定装置 Expired JPS608738B2 (ja)

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Families Citing this family (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4577110A (en) * 1983-04-11 1986-03-18 Biochem Sensors, Inc. Optical apparatus and method for measuring the characteristics of materials by their fluorescence
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