JPS60252492A - 触媒性アルコ−ルを使用するオリゴヌクレオチドトリエステル合成速度の促進方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は、オリゴヌクレオチド合成のトリエステル法
に、触媒としても作用し得る３′〜リン酸封鎖基を用い
ることにより、ホスホトリエステル形成速度を促進する
方法に関する。

発明の背景 オリゴヌクレオチド類、またはデオキシヌクレオチド（
ｄ−オリゴヌクレオチド〕類の合成には、基本的には直
鎖ポリマー状糖のホスホジエステルの形成が必要である
。この形成を成就するには、ヌクレオチドまたはデオキ
シヌクレオチド（ｄ−ヌクレオチド〕のリン酸基に他の
ヌクレオチドまたはヌクレオシドの５′−水酸基を連結
させることによって、逐次、エステル結合を形成してい
かなければならない。ヌクレオチド鎖を形成するために
は、好適な３′−リン酸位において該結合形成が行なわ
れること（この３′−リン酸位は、当然最初のヌクレオ
チドの末端位置に存在しなければならない）、およびそ
の結合が第２のヌクレオチドの５′水酸基と結合し、そ
の糖残基の他の反応性部位のいずれかと結合しないよう
にしなければならない。この二元的目標は、所望する反
応部位の保護と脱保護を選択的に逐次実施することによ
って達成される。

好ましい合成法として繁用されているｄ−オリゴヌクレ
オチド合成のトリエステル法では、各ヌクレオチド間結
合（インターヌクレオチド結合〕を達成するために、リ
ン酸のトリエステルを形成させる。典型的には、この°
トリ、エステルは、まず末端ヌクレオチドの３′−リン
酸基とアリール封鎖基を含んでいるｄ−ヌクレオチドホ
スホジエステルを製造することにより形成する。アリー
ル封鎖基には、一般にオルト−またはパラ−クロロフェ
ニル誘導体が使用されるが、また、β−シアノアルキル
基も効果的な封鎖基であることがわかった。

次いで、このｄ−ヌクレオチドホスホジエステルの５′
−水酸基部位に望ましからぬ結合が生じるのを防止する
ため、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチ
ル基を代表例とする封鎖剤で、この部位を封鎖する。５
Ｈ−テトラゾール、Ｎ−メチルイミダゾールまたは４−
Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンのような複素環式アミ
ン類を触媒として加え、保護基を付したｄ−ヌクレオチ
ドホスホジエステル（保護ホスホジエステル〕を、他の
ｄ−ヌクレオチドの５′−水酸基と縮合させてｄ−ヌク
レオチドホスホトリエステルを形成する。

その後、アリール封鎖基を除去することによって、ジー
ｄ−ヌクレオチド即ちｄ−オリゴヌクレオチドを得るこ
とができる。この５′−水酸基を脱トリチル化すること
により脱保護化したｄ−ヌクレオチド即ちｄ−オリゴヌ
クレオチドが得られる〔クロケラト（ＣｒｏＣｋｅｔす
、ザ、ケミカル、シンセシス、オブ、Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｔ
ｈｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆＱ
ＮＡ）、フルドリツチミカ、アクタ（Ａｌｄｒｉｃｂｉ
ｍｉｃａＡｒ、ｔす、１６巻、３号、１９８３年、参照
〕。

また、アセトニトリル、メチレンクロリド、ピリジンま
たはジオキサンのような有機溶媒中で、Ｎ−メチルイミ
ダゾールの存在下にアリールスルホニルクロリドをカッ
プリング試薬として使用すると、ヌクレオチド間の縮合
反応速度を増すことができる〔エフイモフ（Ｅｆｉｍｏ
す、レベルダット（Ｒｅｖｅｒｄａｔ　ｔｏ）＋チャク
マクチｘ　ハ（Ｃｈａｋｈｍａｋ　−ｈｃｈｅｖａ）−
ニュー１エフエクテイブ、メソッド、フォア、ザ、シン
セシス、オブ、オリゴヌクレオチドズ、バイア、ホスホ
トリエステル、インターメデイエーツ（Ｎｅｗ　Ｅｆｆ
ｅｃｔｉｖｅ　Ｊ＊ｔｈｏｄ　Ｅａｒ　ｔｈｅＳｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
　ｖｉａ　Ｐｈｏｓｐｈｏｔｒｉｅｓ　−ｔｅｒ　Ｉｎ
ｔｅｒｍｅｄｉａｔｅす、ヌクレイツク、アシツズ、リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡＣ１ｄ８　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、）　１０巻、８２号、１９８２年、参照〕。

ｄ−オリゴヌクレオチド合成におけるトリエステル法に
伴う諸問題のうち、ｄ−ヌクレオチド同志の反応速度が
低いという問題があり、複雑なｄ−オリゴヌクレオチド
類の合成に必要なｄ−ヌクレオチド間の多段階連続的結
合の形成を困難にし。

時間のかかるものとしている。カップリング剤としてア
リールスルホニルクロリドを使用することも、このスル
ホニルクロリド基がヌクレオチドの複素環塩基と反応し
くこの反応はグアニジン塩基のＯ〜６の位置で最もよく
起る）２それによって塩基の化学的修飾をもたらし、最
終生成物の純度を低下させるという新たな問題を生じて
いる〔クロケラト（Ｃｒｏｃｋｅｔす、５２（前掲）参
照〕０また、保護されていない５′−水酸基はアリール
スルホニルクロリド ることも考えられる。最後にヌクレオチド塩基の環外窒
素は核性であり、従って、これを保護しておかないと副
反応に加わる可能性がある。

以上のような点から、必要なことはヌクレオチド間結合
反応をより一層速め、それによってオリゴヌクレオチド
合成に消費する時間を短縮させ。

更に一層実用的なものとなし得る方法である。更に、ヌ
クレオチド間連結反応を速めることは、３′−リン酸の
位置に起こる副反応、スルホニルクロリド・カップリン
グ試薬と複素環塩基との間の副反応、およびスルホニル
クロリド・カップリング、試薬と保護されていない５′
−水酸基との間の副反応の減少に役立つ。結合反応を速
めることはまた、核外窒素が関与するあらゆる副反応を
減少させ、従って、更に純度の高い最終生成物を入手し
得る結果をもたらす。

発明の要旨 こノ発明は、３′−リン酸に、ジエステル結合触媒部分
／封鎖基を有するヌクレオチド化合物、この化合物をヌ
クレオチド間縮合反応（インターヌクレオチド縮合反応
〕におけるホスホトリエステル形成触媒として使用する
方法，および該縮合反応生成物の一つであるこのホスホ
トリエステルを提供するものである。ＤＮＡ合成のトリ
エステル法における標準的な手法および試薬とともに、
この発明の化合物を使用すれば、ホスホト’Ｊエステル
の形成速度を促進することができる。

この発明の化合物は、式； （式中、塩基とはヌクレオチド塩基を意味する。

Ｐｒはヌクレオチドの５′−水酸基の保護基、例えばモ
ノメトキシトリチルまたはジメトキシトリチルの如き基
を表わし、またｋは、置換基を有していてもよいアリー
ル、アルキル、シクロアルキルまたはβ−シアノアルキ
ルの如き保護基を表わす。

ＣＡＴは触媒活性部分を表わし、ここにおいて触媒活性
部分とは、例えば置換基を有していることもある含窒素
複素環基、第３級アミンまたはカルボン酸を意味するつ で示される。

触媒活性部分Ｎ−メチルイミダゾールおよびテトラゾー
ルが、フェニル基のオルト位にあるとき、特に効果的に
反応速度を促進することがわかった。

本発明化合物のジエステル結合封鎖基はアリール、アル
キル、シクロアルキルまたはβ−シアノアルキルのいず
れの基でもよい。テトラゾールおよびイミダゾール以外
の含窒素複素環化合物類および／または第３級アミン類
もまた７ジエステル結合封鎖基と連結すると、ヌクレオ
チドホスホトリエステル形成速度を促進する。また更に
、カルボン酸モ好適な位置にあるとホスホトリエステル
形成速度を増すものと考えられる。

従って、この発明の好ましい態様は、Ｒ−ＣＡＴが２−
（２’−ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダゾール
または５−　（２’−ヒドロキシフェニルつテ［ラゾー
ルであり、この場合、これらの化合物のいずれにおいて
も、ヌクレオチドの３７−リン酸ジエステル結合によっ
てその水酸基が置換される。また、Ｒ−ＣＡ　Ｔが以下
に挙げる触媒性アルコール類、すなわち ８−ヒドロキシキノリン、（２−ヒドロキシエチル）Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミン、（３−ヒドロキシプロピル）Ｎ
、Ｎ−ジメチルアミン、２−（ヒドロキシメチル）ピリ
ジン、２−　（２’−ヒドロキシエチル）ピリジン、２
−（ヒドロキシメチル）Ｎ−メチルイミダゾール、２−
（２−ヒドロキシエチル）Ｎ−メチルイミダゾール、ま
たは５−　（２’−ヒドロキシエチル）テトラゾールの
なかから選ばれ、それがヌクレオチドの３′−リン酸に
ジエステル結合している場合、これらもまたヌクレオチ
ド縮合に著しく好影響を与λる。

Ｒ−Ｃ，ＡＴは、ヌクレオチドの３′−リン酸にジエス
テル結合している触媒性アルコールであって、そノ触媒
活性部分が、パラ−クロロフェニル−３′−リン酸封鎖
基と、溶液中、Ｎ−メチルイミダソール触媒を使用して
行なうヌクレオチド間縮合反応に比較しＣ、ヌクレオチ
ド間縮合反応速度に好影響を寿えるように位置している
場合、これらの触媒性アルコールのすべてであると広く
定義することができる。Ｒ−ＣＡ　Ｔは、隣接基を参加
させることしこより機能するものと考えられる。より詳
細には、３′−リン酸と活性ｆｌｉ状構造を形成し、こ
の活性環状構造か５′−水酸基からの核攻撃をうけ得る
ことによって機能するものと考えられる。

ここに仮定した活性環状構造は、３′−位のリンとジエ
ステル結合酸素を２個の複素環原子の一員として含み、
触媒性アルコールの個有原子が複素環の残りを構成して
いるという複素環式中間化合物であると考えられる。

ヌクレオヂドホスホトジエステル形成の反応速度に好影
響をもたらすのは、触媒活性構造（部分）および封鎖基
の特性そのものよりも、むしろその触媒活性構造（部分
〕の３′−リン酸基に対する適切な位置関係にあると言
い得る。封鎖基がフェニル基またはフェニル誘導基であ
る場合、例えば触媒活性構造（部分つをそのオルト位に
置くことによって、隣接基を参加させ、活性環状構造を
形成できるものと推測される。

この発明の目的は、ヌクレオチド間縮合の反応速度を速
め、それによって複雑なオリゴヌクレオチドの合成を一
層実用的にそ［７て消費時間を一層短縮して行なうこと
である。反し６速度を速めるこトニヨってホスホジエス
テルの反応性部Ｑ＋こお＆する副反応を減少させ、また
保護されて０な＋＋）５’−水酸基とスルホニルクロリ
ドの副反応を減少させ、それによって目的とするオリコ
゛ヌクレオーｆ−ド生成物の収得し得る純度を高めるこ
と力Ｓできる。

発明の開示 縮合反応の説明 反応式１に、ヌクレオチド間縮合反応を図式イヒし、て
示ス。式１は、ホスホトリエステルを形成する縮合反応
８を示す。

反応８では、触媒性アルコールをジエステル結合によっ
て含んでいるこの発明の保護ホスホジエステル１２を、
この反応態様８に於いて、担体にカルボキシル結合した
ヌクレオチドどして示されている化合物１４と反応させ
る。保護ホスホトリエステル１０．保護ホスホジエステ
ル１２および化合物１４の種々の位置に結合した各基に
ついて、以下に説明を加える。

「Ｐｒ」は５ジメトキシトリチルおよび七ノメトキシト
リチルの様ＩＳ（ただし、これに限定されない）５′−
水酸基の既知の保護基を表わす。「塩基」は、チミジン
、ウラシル、および好適に保護されているアデニン、グ
アニンおよびシトシンを表わす。ｒＲＪは、ホスホトリ
エステル１０の形成反応速度をたかめるように触媒活性
部分を配置し得る３′−リン酸封鎖基を表わす。Ｋはア
リール。

アルキル、シクロアルキルおよびβ−シアノアルキルの
ような基である。「ｃＡＴＪは、保護ホスホジエステル
の３′−リン酸と活性環状構造を形成し、それによって
化合物１４（またはその他のヌクレオチド、ヌクレオシ
ド、オリゴヌクレオチド、またはそれらのデオキシ体か
ら選ばれる化合物）の５′−水酸基と反応を行ない得る
反応速度に好影響を与える触媒活性部分を表わす。ＣＡ
Ｔは、カルボン酸、置換基を有しまたは有さない含窒素
複素環基、または置換基を有しまたは有しない第３級ア
ミン類である。

一般に「Ｒ−ＣＡＴＪは、ジエステル結合をしている反
応速度促進性触媒性アルコール（これはまた封鎖基とし
ても機能する〕を表わし、以下に示すものが挙げられる
： ８−ヒドロキシキノリン、 （２−ヒドロキシエチル）　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン、
（３−ヒドロキシプロピル）　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン
、 ２−（ヒドロキシメチルつピリジン、 ２−　（、２’−ヒドロキシエチル）ピリジン、２−（
ヒドロキシメチル）Ｎ−、メチルイミダゾール、 ２−（２’−ヒドロキシエチル）Ｎ−メチルイミダゾー
ル、 または５−（２’−ヒドロキシエチルつテトラゾール。

好ましい態様では、Ｒ−Ｑ　Ａ　］７は２−　（、２’
−・ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダゾールまた
は５−（２’−ヒドロキシフェニルつテトラゾールのい
ずれかである。

「（イオン）」は、トリエチルアミンまたはＨを包含す
るすべての陽イオンを表わす。

「担体」とは、シリカゲルを含むヌクレオチドまたはヌ
クレオシドのための不溶性担体を表わす。

「Ｒｅ」は、脱水剤を表わし、これにはアリールスルホ
ニルクロリド、アルキルスルホニルクロリド、メシチレ
ンスルホニルクロリド、オルト・ニトロベンゼンスルホ
ニルクロリド、トルエンスルホニル−キクロリド、アリ
ールスルホニルプロミド、カルボジイミド化合物ま・た
はニトロトリアゾールが挙げられるが、これに限定され
るものではない。

［ｃＡＴｓＯＬＪは、溶液内に遊離してヌクレオチド間
縮合反応を促進する触媒を表わす。

「溶媒」とは、−例としてピリジンのように、縮合反応
８中に生成する酸を緩衝し得る有機溶媒であるか、更に
、そのような溶媒に、アセトニトリルおよびメチレンク
ロリドの様な不活性溶媒のように、反応試薬に対して不
活性なもう一つの溶媒を混合した有機溶媒を表わす。

推定される反応機構の説明 反応式１に示されている多数の基について、縮合反応８
におけるそれらの役割りの面から説明を加えた。反応式
１に示されるこれら個々の基の機能について更に理解を
深めるため、縮合反応８の三つの異なる態様に関して推
定される一連の機序１６．１８および２０を、それぞれ
反応式２，３および４に示す。

反応式２，３．４において、Ｎｕｌは縮合反応８の保護
ホスホジエステル１２であり、（イオンつは縮合反応８
と同じ陽イオンであり、ＮＬ１２は化合物１４であり、
また保護ホスホトリエステル１／ｂは最終生成物として
示される。

ここに推定された機構１６．１８および２０において、
脱水剤（Ｒｅ）はメシチレンスルホニルクロリドであり
、ＣＡＴＳＯＬはＮ−メチルイミダゾールである。

反応式２ ％式％ ｕＩ Ｅｌ （イオノ＋）ｃｒ− 挿入式Ｆ 反応式　３ ３−ヒドロキシフェニル（２−Ｎ−メチルイミダ７’−
／り触媒ｆ（Ｏ ｕ２ Ｎｕ’ １ ０−５−Ｒ １ （イオン士）Ｃ１− 挿入弐Ｆ 反応式　４ Ｎｕ　”　Ｂ １　− 〇 並 挿入式　Ｆ 反応式２　ハ、５−（２’−ヒドロキシフェニル〕テト
ラゾールを触媒性アルコールとして使用したヌクレオチ
ド間縮合反応において推定される反応機構を図式的に示
している。

反応式３　ｉｌｌ、　２−（２’−ヒドロキシフェニル
〕Ｎ−メチルテトラゾールを触媒性アルコールとして使
用したヌクレオチド間縮合反応において推定される反応
機構を図式的に示している。

反応式４は、（２−ヒドロキシエチル）　Ｎ、Ｎ　−ジ
メチルアミンを触媒性アルコールとして使用したヌクレ
オチド間縮合反応において推定される反応機構を図式的
に示している。

反応式２のＡに見られるように、機構１６の最初の段階
は、テトラゾールの窒素によって硫黄原子が核的に攻撃
され、それによってクロリドの離脱を生じ、このクロリ
ドがテトラゾール基に残存している水素原子と結合する
ときに起こるテトラゾールのスルホン化である。もしＣ
ＡＴがカルボン酸であれば、カルボン酸の酸素によって
核的に攻撃される硫黄原子によって核反応が始まリ、そ
れによってクロリド・アニオンが置換される。このよう
に、もしＣＡＴが攻撃可能な核試薬、例えばＴＬｅがス
ルホニルクロリドまたはそれに類するスルホニル誘導体
である脱水剤Ｒｅの硫黄原子、でありさえすれば、機構
１６のＡは明らかに進行する。またＲｅが、もしカルボ
ジイミドであれば、その反応機構の本質はまだ不明では
あるが、機構１６．１８および２０のＡは機能する。

式に示した機構１６．１８．２０では、ＣＡＴＳＱＬは
いずれもＮ−メチルイミダゾールであるが、ここに示す
ように、まずアリールスルホニルクロリドを核的に攻撃
し、然るのちにアリールスルホニル基を触媒活性構造部
分（ＣＡＴ、ｌへと移行させることによって、テトラゾ
ールの最初のスルホン化の反応速度を促進すべく機能す
るものと考えられる。ＣＡＴに最初に起こるこのスルホ
ン化が、反応の律速段階であると推測される。このよう
に、反応８のＣＡＴＳＯＬは、理論的には、アリールス
ルホニル基またはその他の脱水作用基の結合によってＣ
ＡＴのスルホン化の開始を促進し、次いで、この基をＣ
ＡＴＳＯＬから移行させ、ＣＡＴへと結合させ得る如何
なる基であってもよい。

式に示した機構１６のＢで、ホスポジエステル１２の３
１−リン酸のＯアニオンはスルホニル基（この段階では
この基はすでにテトラゾールと結合している）の硫黄原
子を攻撃し、テトラゾールに結合しているＨＣの水素を
生じることによりクロリドアニオンを形成する。

従って、反応式１において列挙した脱水剤ばかりではな
く請求電子試薬として機能し、ホスホジエステル１２の
３′−リン酸の０アニオンからの核的攻撃を受け入れ得
る化合物であれば、いずれも理論的には、この縮合反応
８態様に使用できる。

式に示した機構１６のＣは、３′−リン酸のリン原子が
テトラゾールのＮ１から核的攻撃をうけ、それによって
テトラゾールの水素が放たれて、アリールスルホニルの
残りの基と結合し、このようにしてＤ部に示される活性
環状°中賜体が形成される過程を示している。

式に示した機構１６のＤでは、活性環状中間体が化合物
１４の５′−水酸基から核的攻撃を３′−リン酸のリン
原子の位置にうけ、テトラゾールのと新たにＮ−Ｈ結合
を形成する。

従って、反応式１に関連して挙げたＣＡＴおよびＲ−Ｃ
ＡＴを包含する（但しそれに限定されることのない）い
かなる触媒活性構造部分／触媒性アルコールでも、それ
が活性環状構造を形成でき、化合物１６の５′−ヒドロ
キシルから核的攻撃をうけることが可能なものであれば
、触媒活性構造部分／触媒性アルコールとして機能でき
る。

反応式３および４（機構１８および２０月こ示した縮合
反応８の態様では−２−（２”−ヒドロキシフェニル）
Ｎ−メチルイミダゾールおよび（２−ヒドロキシエチル
）　Ｎ　、　Ｎ’−ジメチルアミンを、それぞれジエス
テル結合触媒性アルコールトシテ使用する。式に示した
二つの機構１８と２０のＤ部に見られる如く２形成され
ると推定される活性環状中間体は、いずれも機構１６に
示した活性環状中間体とよく類似し一部いる。これらの
活性環状中間体は、すべてその環構造のなかに、３′の
リン、エステルの酸素および触媒性アルコールの一部を
含んで環を形成している。その他の活性環状中間体にお
いても、例えば、その触媒性構造部分が好適に配置され
たカルボン酸であるならば、その環状構造はカルボン酸
とリン酸からなる混合無水物の形の類似した構造をとり
得る。式１に関連１．で挙げた種々の触媒性アルコール
類のすべてに関して推定される機構は、１６．１８およ
び２０の機構から当然自明のことであるので示さなかっ
た。

置換基を有しまたは有しない芳香性複素環化合物および
置換基を有しまたは有しない第三級アミン類はともに核
試薬であり、従って式に示した機構１６，１８．２０の
Ａに見られる請求電子基の最初の攻撃を開始することが
できる。

更にまた、これらの化合物が好適に配置されるべき構造
を有しているならば、これらもまた機構１６．１８およ
び２０のＤに示し、だのと類似の活性環状中間構造を形
成することができる。従って、これらの化合物もまた触
媒性構造部分として使用するのに好適である。

推定機構１６のＥには、縮合反応８によって形成された
保護ホスホトリエステル１０、反応８の結果生成したア
リールスルホニルクロリド基、およびクロリドアニオン
と静電気的に結合している初めの陽イオンが示されてい
る。

反応式２，３および４にメカニズム的に示シた縮合反応
８の三つの態様（および別の触媒性構造部分を使用する
縮合反応８の他の同様な態様〕において、ホスホトリエ
ステル１０の形成速度は３′ＩＪン酸に対する触媒活性
構造部分の幾伺学的位置関係によって促進されることが
推測される。この仮説から、もし触媒活性構造部分が３
′−リン酸に対して適切な位置に置かれており、またも
し３′ＩＪン酸位における副反応を防止することだけを
目的とするのであるのなら、リン酸封鎖基（ｋ）が何で
あるかということは重要ではないという結論が導かれる
。従って、反応式１に関連して記載された前述の特性を
有する（但しそれだけに限定されない良いかなるリン酸
封鎖基でも理論的に使用できる。触媒活性構造部分をそ
のように配置し得るリン酸封鎖基は、アリール基、アル
キル基、シクロアルキル基およびβ−シアノアルキル基
である。

５′−水酸基の保護基（縮合反応８のＰｒ　）は、ホス
ホジエステル１２の末端５′の水酸基の位置と結合でき
２５′−末端水酸基が溶液中の他のホスホジエステルの
３′−リン酸および他の化合物と反応することを防ぐこ
とができるものであれば、いかなる基であってもよい。

そのような５′−水酸基の保護基は、例えばモノメトキ
シトリチル基およびジメトキシトリチル基である。

式１の反応８に示される塩基は、いずれのヌクレオチド
塩基でもよい。ここに記載している塩基はチミンを使用
しているが、これはチミンが核外窒素をもっていないか
らである。他のヌクレオチド塩基には存在している核外
窒素は核的であり。

従って保護して置かないと副反応に関与して来る。

典型的な保護基は、塩基の核外窒素とアミドを形成する
基である。

式１の反応８に示される溶媒は、反応８のすべての試薬
および化合物を溶解でき、しかも反応８によって生成さ
れる塩酸を緩衝できるいかなる溶媒でもよい。ＨＣ４は
、式に示した機構１６のＢに示されている。

化合物１４は、遊離または担体を付したあらゆるヌクレ
オシド、ヌクレオチド、デオキシヌクレオシドまたはデ
オキシヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドまたは
デオキシヌクレオチド、またはこれらの化合物のいずれ
かのジエステルまたはトリエステルで、その末端５′−
水酸基が脱保護化されている限り適用され得ることが明
らかになった。

また、式で示される機構１６．１８および２０から、反
応式１において、保護ホスホトリエステル１０が保護ジ
デオキシヌクレオチドとして示され、化合物１４が担体
を付したデオキシモノヌクレオシドとして示され、そし
て保護ホスホジエステル１２が保護デオキシモノヌクレ
オチドジエステルとして示されていても、化合物１４お
よび保護ホスホジエステル１２がそれぞれ担体を付した
りボヌクレオシドおよび保護リボヌクレオチドホスホジ
エステルを表わしている場合は、縮合反応８によってジ
リボヌクレオチドホスホトリエステルが形成されること
ができることが明らかになった。更にまた、 υ　ホスホジエステル１２が、ジーまたはオリゴヌクレ
オチドホスホジエステルまたはジーまたはオリゴデオキ
シヌクレオチドホスホジエステルであって、この場合、
Ｐｒ力ξ他のヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、ま
たはヌクレオチド群またはデオキシヌクレオチド群の連
鎖との結合を表わしているか、または ■　化合物１４が、担体を付したヌクレオチド群または
デオキシヌクレオチド群の連鎖、またはそれらのエステ
ル類を表わし、この場合、該連鎖の末端５′−水酸基が
保護されていない場合、縮合反応８は、保護オリゴヌク
レオチドまたはデオキシオリゴヌクレオチドのホスホト
リエステルを形成できる。

触媒活性構造を配置することによって反応速度が速めら
れること、Ｃ：ＡＴＳＯＬがＣＡＴの最初のスルホン化
の開始を促進すること、および好ましい二つのジエステ
ル結合触媒性アルコールが、顕著な反応速度の促進を提
供することを示すため、一連の実験を下記の如〈実施し
た。

５′−ジメトキシトリチル−３’＝Ｃ０−（５−テトラ
ゾリル）フェニルホスフェ−トコチミジン（以下、オル
ト・テトラゾールジエステルと称す９０．０５モル、メ
シチレンスルホニルクロリド０．１５モルおよびＮ−メ
チルイミダゾール０．４５モルをともにピリジンに溶解
し、この溶液を、チミジンスフレオシドと３′−カルボ
キシルで連結されているシリカゲルと混合した。シリカ
１ｇ当たり約２０マイクログラムのチミジンをシリカゲ
ルに負荷し、またオルト・テトラゾールジエステルはシ
リカゲルに結合しているチミジンに対し約１００当量の
大過剰を使用した。種々の時間毎に、アセトニトリル／
水（９：　１　ｖ／ｖ　）を加えて反応を停止させ、０
．１モルのｐ　−Ｔ　Ｓ　Ａ　／　ＣＨ３ＣＮでジメト
キシトリチル基を除去したー十分に洗滌した後、濃厚水
酸化アンモニウムを用いて生成物を担体から切り離し、
未反応のまま残っているもとのチミジンを、逆相高速液
体クロマトグラフィーにより定量した。

得られた成績を第１図の実線Ａに示した。時間に対して
プロットした未反応チミジンの百分率から、反応速度の
かなりの促進が認められた。

２−　（２’−ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダ
ゾール（オルト−イミダゾールジエステルから収得）を
触媒性アルコールとして使用し、同じ実験を実施した。

得られた成績を第１図の実線Ｃに示した。

次に、オルト・テトラゾールジエステルを使用し、但し
余分のＮ−メチルイミダゾールを溶液に加えずに実験を
行なった。得られた成績を第１図の実１ｉＢに示した。

次いで、３′−リン酸に結合させたパラ−クロロフェニ
ル封鎖基を用い、余分のＮ−メチルイミダゾールを溶液
に加えて同じ実験を行なった。得られた成績を第１図の
実線りに示した。更に、５−　（４’−ヒドロキシフェ
ニル）テトラゾール（パラ位にテトラゾールを入れた触
媒活性構造部分をチミジンと縮合させて収得するつを触
媒性アルコールとして使用し、余分のＮ−メチルイミダ
ゾールを溶液に加えて実験を行ｔＳつた。

得られた成績を第１図の実線Ｅに示した。

線Ａと線Ｂから、余分のＮ−メチルイ、ミダゾールを溶
液に加えることにより、反応速度の促進が得られること
が判る。この反応速度に対する促進効果に関しては、反
応式に示した機構１６の挿入図Ｆに示される機構と一致
する。

Ｂ線（パラ−クロロフェニル基は３′−リン酸にジエス
テル結合しているつをＡ線、Ｂ線またはＣ線（これらの
場合、ホスホジエステルはオルト・テトラゾールジエス
テルか、あるいはオルト・イミダゾールジエステルであ
る〕を比較すると、パラ・クロロフェニル基を使用した
場合、反応速度がはるかに遅いことが判る。この遅い速
度は、パラ・クロロフェニル基が３′−リン酸のリンと
単一の活性環状中間体構造を形成するのではないらしい
ということを示しているものと推測される。後段に論じ
るように、パラークロロフェニル基ハ多数の非環式構造
を形成するようである。

５４１図（７）（：線から、オルト・イミダゾールジエ
ステルを使用すると、顕著な反応速度の促進が見られる
。然しなから、その速度はオルト・テトラゾールジエス
テルを使用したときに見られた速度に比べて若干遅い。

テトラゾールが、Ｎ−メチルイミダゾールに比べてやや
高い反応速度を与え得る理由は、多分（推定した機構１
６および１８のＤに見られるように）、Ｎ−メチルイミ
ダゾールの触媒活性構造部分によって形成される環状中
間体ではメチルが付いているＮ原子の位置にプラスの電
荷が示されるのに対して、テトラゾールでは、荷電窒素
を全く含まない電気的に中性な環状中間体が得られるこ
とによるのであろう。このようにＮ−メチルイミダゾー
ルを触媒活性構造部分として使用すると環状中間体の電
荷の平衡が破れ、電荷の分離は吸熱過程であるから、こ
の電荷の分離が縮合反応からエネルギーを奪い、その結
果、テトラゾールを触媒活性構造部分として使用したと
きに比べて縮合反応はやや遅くなる。然し、Ｎ−メチル
イミダゾールは二量体の合成の場合は速度がやや遅いに
もかかわらず、後段で論じられるように、長鎖状ヌクレ
オチドを合成するときは望ましい触媒活性構造部分であ
る。

線Ｅに示されるように、パラ位に入れた触媒活性構造部
分を使用したときの反応速度は、パラ−クロロフェニル
ジエステルを使用した速度とほぼ同程度である。このこ
とは触媒活性構造部分をアリール基に連結する本発明記
載の態様において、速度に好影響を与えるのは触媒活性
構造部分の位置の問題であり、オルト位に活性構造部分
を入れるのがよいということを実験的に裏付けるもので
ある。よく知られているように、テトラゾ−のオルト位
からパラ位への移動は電気的に中性の移動テする。従っ
て、５−（２’−ヒドロキシフェニルノナトラゾール触
媒性アルコールで見られる速度の促進を、封鎖基または
触媒活性構造部分内の電気的な変化に由来するというこ
とは最も考え得ないことである。むしろ、テトラゾール
が３′−リン酸に対し隣接基として参加し環状活性構造
を形成し得る位置に配置されたことに起因するという方
が可能性が高い。

先に示した実験方法を用いたもう一組の実験で、１−メ
チル−２−（４’−ヒドロキシフェニルライミダゾール
を、ジエステル結合した触媒性アルコールとするヌクレ
オチドジエステルの反応性の検討を行なった。この触媒
性アルコールは、ヌクレオチドとの縮合によってパラ位
にＮ−メチルイミダゾールをもつ触媒活性構造部分が得
られた。

パラ位にＮ−メチルイミダゾールを有するジエステルに
おける観察では、標準的パラ・クロロフェニルジエステ
ルで達成される速度と匹敵する縮合反応速度が得られた
。これらの成績は、触媒活性構造部分がフェニル基に連
結している態様において、触媒活性構造部分がオルト位
にあることによって隣接基参加効果を発揮し得ること、
およびそれによってヌクレオチド縮合反応速度に好影響
を与えることを重ねて指摘している。

この同じ実験群の中で、オルト・イミダゾールジエステ
ルを使用した場合は、反応液にＮ−メチルイミダゾール
を全く加えなくても縮合反応速度を有意に減少させない
ことが示された。

Ｎ−メチルイミダゾールおよびテトラゾール触媒活性構
造部分による縮合反応速度を、標準的パラ・・クロロフ
ェニル基の縮合反応速度と比較する前ル高速液ヘク゛ラ
フイーを行なう時間と労力を省略するため）、発明人は
まず、どの触媒性アルコールが反応速度を有意に高める
かについて初期測定を行なった。

保護ホスホジエステルにダンジルアルコール基をトリエ
ステル結合させるために、種々の触媒活性構造部分をジ
エステル結合させたジメトキシトリチル保護チミジン単
量体と、ダンジル螢光供与体で螢光標識したアルコール
の水酸基とを反応させた。このトリエステル結合を反応
式５に示す。

０ ＣＡＴ−Ｒ−０−Ｐ＝０ 反応式　５ ダンジルアルコールは紫外光で照射すると螢光を発する
ので、長波長の紫外光の照射によるトリエステルの螢光
を視覚的に観察することにより、生成物トリエステルの
量を定量的に検定した。ダンジルアルコールの水酸基は
、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの末端５−水酸基の
反応と類似の態様でジエステルと反応するので、観察さ
れる螢光量にもとずいて種々の触媒性アルコールの相対
的な反応性を判定することができる。以下にその全実験
方法を説明する。

１、タンジルアルコールノ合成 ダンジルクロリド２７０■（１ミリモル）およびエタノ
ールアミン６１■（１ミリモル）をピリジン５ｄに溶解
した。１時間後に、ピリジン５ｄに溶解したエタノール
アミン５０（１ミリモル）を加えて反応を緩和した。１
時間後、水５０μｌで反応を停止し、得られた混合液を
蒸発させてガム状とし、これをメチレンクロリドに溶解
した後、塩化ナトリウム飽和溶液を用いて有機溶媒に抽
出した。有機層を分取して蒸発し、調製用薄層クロマト
グラフィー板で、ジエチルエーテルを溶離液として用い
て精製した。

２、タンジルアルコールトリエステルの調製ト反応性の
検定 調製したダンジルアルコールを使用し、これを５′−水
酸基を保護したチミジンのパラ・クロロフェニル、８−
ヒドロキシキノリン、（２−ヒドロキシエチル）Ｎ、Ｎ
−ジメチルアミン、（３−１ドロキシプロピル）　Ｎ、
　Ｎ−ジメチルアミン、２−（ヒドロキシメチル）ピリ
ジン、２−（２−ヒドロキシエチル）ピリジン、２−（
ヒドロキシメチル）Ｎ−メチルイミダゾール、２−（２
−ヒドロキシエチル〕Ｎ−メチルイミタソール、５−（
２−ヒドロキシエチル）テトラゾール、１−（２−ヒド
ロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダゾールおよび５−（
２−ヒドロキシフェニル〕テトラゾールの各ジエステル
類と反応させた。すべてのジエステル類およびすべての
ダンジルアルコール）　ＩＪエステル類の調製における
反応性の検定は全く同じである。従って、反応性の比較
の全実験は、ジメトキシトリチルで保護したチミジンの
５−　（２’−ヒドロキシフェニル）テトラゾールジエ
ステルとパラ・クロロフェニルジエステルの比較だけを
示す。同様に、調製の全実験はチミジンの５−（２’−
ヒドロキシフェニル）テトラゾールダンジルアルコール
トリエステルと、チミジンのパラ・クロロフェニルダン
ジルアルコールトリエステルのみについて示す。

オルト・テトラゾールジエステル１０■およびパラ・ク
ロロフェニル保護ジエステル１０■を、Ｎ−メチルイミ
ダゾール６μｌ、ダンジルアルコール０．１■およびピ
リジン０．５　ｍｌに加えた。溶液をガム状になるまで
蒸発させ、乾燥ピリジン４００μｊに再度溶解した。３
０分間反応後、水１０μｊを加えて反応を停止し、反応
混合液３μＥを薄層クロマトグラフィーにより、最初エ
ーテル、次にクロロホルム中１０％ＭｅＯＨで溶出する
ことにより分析した。生成物トリエステルの量は、先に
記載の如く螢光量を判定することにより測定した。

４、種々の触媒性アルコールジエステル類ドパ反応式ｌ
のＲ−ＣＡＴとして挙げた各種のホスホトリエステル形
成触媒／封鎖基のすべての反応速度比を上記の方法によ
り測定した。これらの反応速度比を第１表に示す。

第１表　各種ホスホジエステルとダンジルアルコールの
カップリング反応速度比 ５−（２’−ヒドロキシフェニル）テトラゾールおよび
２−（２’−ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダゾ
ールの触媒性アルコールが反応速度を最も促進すること
を観察した後、シリカゲルカラム高速液体クロマトグラ
フィーの完全実験（先に記載）をこれら二つのオルト・
ジエステルについて実施した。

前述のように、チミジンは、アミドとして保護を要する
環外窒素を有していないことから、これらの実験のヌク
レオチドとして使用した。当該技術の当業者にとって自
明の如く、反応性検定に関する同様の実験および反応ｌ
および５に示した同様の反応はアデニン、グアニンおよ
びシチジンのような他のデオキシヌクレオチドのホスホ
ジエステル類、またはウリジンのような他のりボスクレ
オチド類（２′−水酸基を封鎖）、または他のりボヌク
レオチド連鎖（２−水酸基を封鎖）、または他のデオキ
シヌクレオチド連鎖のホスホジエステル類の場合でも実
施できる。他のヌクレオチド類または他のりボスクレオ
チド類を使用しても、反応機構に変りはなく（これらは
先に提起した機構１６．１８および２０と全く同じかま
たは類似していると考えられる）、また先に挙げた各種
のジエステル結合触媒性アルコールとの反応速度比も、
理論的に同じ結果が得られる。

ＭＲデータ 実験Ａ ジメトキシトリチルで保護したチミジンのオルト・テト
ラゾールジエステル（０，２ｎ）とＮ−メチルイミダゾ
ール（０，８Ｍ）を過剰のピリジンに溶解し、反応を行
なった。Ｐ　３１　ＮＭＲスペクトルをとり、その結果
を第２図のＡ線で示した。第２図に示した外部標準のピ
ークはリン酸である。

溶液中にアリールスルホニルクロリドは存在せず、また
その他の脱水剤も存在しなかった。反応式２に於いて推
定した活性環状中間体は明らかに形成されていなかった
。

実験Ｂ 上記と同じ成分の同じ割合を使用し、実験Ａでシ 得られた反応混合液に過剰のメ。チレンスルホニルクロ
リド（０，４モル）を加え、これについてＰ３１ＮＭＲ
で得られた結果を第２図のＢ線で示した。

メシチレンクロリドは脱水剤として作用し、推定した反
応機構１６が進行して反応式２に示したＤの活性環状構
造を形成しているものと信じられる。

線Ｂに見られる新しいＮＭＲのピーク（シングレット）
から、新しい化合物が実際に形成されたことが示唆され
る。第２図には示していないが、線Ｂの新しいピークは
リン酸標準から−２０，４２０９ＰＰｍの周波数差に位
置することが碓かめられた。

実験Ｃ 次に実験Ｂと同じ成分の同じ割合を使用して、実験Ｂの
反応混合液に過剰の水を加え、これについてＰ　３１　
ＮＭＲで得られた結果を第２図のＣ線で示した。第２図
の線Ｃに見られるピークは、第２図の線Ａに見られたピ
ークと同じであり、このＤに示した攻撃と類似的機構）
、その結果、もとのジメトキントリチルで保護されたオ
ルト・テトラゾールジエステルへと逆戻りを生じたこと
を示している。従って、活性環状中間体および反応式２
のＤ段階およびＥ段階の存在は、これらの実験結果とよ
く一致している。

実験り 上記、実験Ａ、ＢおよびＣで概説したのと類似キ した一連の実験によって、ジメト△シトリチルで保護し
たチミジンのパラ・クロロフェニルジエステル（０，２
モル）をＮ−メチルイミダゾール（０，８モル）と反応
させ、すべてをピリジンに溶解した。

このＰ　３１　ＮＭＲスペクトルのピークを第３図の線
Ａに示す。このピークは、アリールスルホニルクロリド
またはその他の脱水剤を加えていない反応生成物を反映
したものである。ここにおいては、反応式２．３および
４の挿入式Ｆに見られるような最初の硫黄原子による核
的攻撃は起こらず、従って中間的構造も形成されないこ
とが仮定される。

そこで、この反応混合液に過剰のメシチレンクロリド（
０６４モル）を加え、その結果、得られた反応形成物の
Ｐ　３１　ＮＭＲのピークを第３図のＢ線に示した。線
Ｂから、メシチレンスルホニルクロリドで活性化された
パラ・クロロフェニルホスホジエステルの生成物によっ
て、複雑な多数のピークを有する生成物が形成されるこ
とが判る。このピークは、第２図のＢ線において単一の
ピークで示されたような単一の活性な環状中間体構造が
存在しないことを示しており、むしろ、溶液中の活性構
造は多数の異なった中間体であることを示している。パ
ラ・クロロフェニルを触媒活性構造部分／封鎖基として
使用した場合に単一の活性環状中間体構造が存在しない
ということが、比較的遅い縮合反応速度の理由であると
考えられる。

ここにおいても、反応式２．３および４のＤに示した単
一の活性中間体の存在を主張する機構１６．１８および
２０は実験的に示唆される。

第３図の線Ｃは、実験りにおいてメシチレンスルホニル
クロリドを添加した後、更に水を加えて反応を停止した
生成物のＰ　３１　ＮＭＲのピークを示している。形成
されたすべての中間体は水の水酸基によって核的な攻撃
をうけ、出発物質へと逆戻りを生じるものと信じられる
。Ｐ　３１　ＮＭＲのピークは線Ａのピークと同じであ
り、メシチレンスルボニルクロリドの添加によって形成
されたすべての中間体はもとのパラ・クロロフェニルジ
エステルに復元されたことを示している。

デオキシオリゴチミジンの合成実験 オリゴヌクレオチドの逐次的合成におけるこの好ましい
触媒性アルコールの利用を示すべく、８個のチミジンか
ら成るオリゴヌクレオチドの合成を行なった。

合成を遂行するに当たって、逐次的な鎖の伸長を行なう
不溶性の担体を形成させるため、まずシリカ５０■に１
マイクロモルのチミジンを負荷させた。最初の実験はチ
ミジンのオルト・イミダゾールジエステルを使用し、も
う一つはチミジンのオルト・テトラゾールジエステルを
使用する二つの実験をそれぞれ独立して行なった。チミ
ジンジエステルは一度に全部を加え、 （ａ）　ジクロロ酢酸の２．５％ジクロロメタン溶液５
罰を使用して２分間反応させ、ジメトキシトリチル封鎖
基を除去し、 ｉｂ）　シリカを１０％ピリジン／９０％アセトニトラ
イトで洗滌し、 ＦＣ＋　このチミジンモノマージエステルを、メシチレ
ンクロリド０．１５モル、Ｎ−メチルイミダゾール０．
４５モルおよびジメトキシトリチル保護ジエステル０．
０５モルから成るピリジン溶液６００＋＋ｙ／’を使用
して担体へカップリングさせ（この反応は５分間で行な
う）、 （ｄ）　シリカをｎ−ブタノール４０％アセトニトライ
ト溶液で洗滌し、そして （ｅ）　シリカを１０％ピリジン／９０％アセトニトラ
イト溶液で洗滌する ことから成る反応サイクルを繰り返した。

この反応サイクルは、シリカ担体に共有結合で結合して
いるデオキシチミジン８個の保護誘導体が生成するまで
７回反復して行なった。

このシリカゲル・カラムをジクロロ酢酸で再度処理する
ことによってジメトキシトリチル基を除去し、メタノー
ルで洗滌し、次いで濃厚水酸化アンモニウムで２時間処
理して、デオキシチミジン８量体（オクタマー〕をシリ
カゲルから切り取った。

得られた混合物を遠心し、上澄液をとって蒸発させた。

この残渣をジオキサン／水の１　：　１（Ｖ／Ｖ）溶液
に溶解し、この溶液をオルトニトロフェニルアルドキシ
ムおよびテトラメチルグアニジンについて０．３モルと
し、得られた溶液を６０℃で１２時間加熱した。このよ
うにして触媒性アルコール基をデオキシチミジン８量体
から切り離すことにより、ヌクレオチド−ヌクレオチド
ジエステル結合そのものだけを得た。次に、この溶液を
酢酸で中和し、エーテルで３回抽出を行なった。

水相部分の少量（約１％）をとって、キナーゼ反応とゲ
ル電気泳動法により分析した。キナーゼ転位にはＴ４キ
ナーゼと　γ−標識ＡＴＰを使用し、標準的な条件下で
反応を行なった。キナーゼ反応物を、７Ｍ尿素２０％ア
クリルアミドゲル上で電気泳動した。ゲル上にＸ線フィ
ルムを置いて得られたオートラジオグラムを第４図に示
した。

第４図において、Ａ列は標準ホスファイト化学で合成し
たデオキシチミジン２０（量体）標準であり、Ｔ２〜Ｔ
２０にあらゆるヌクレオチドオリゴマーの痕跡を含有し
ている。Ｂ列は、オルト・イミダゾールジエステルを使
用したＴ８合成法吐述の実験）の生成物である。０列は
、オルト・テトラゾールを使用した上述の実験のＴ８合
成法の生成物である。図から明らかなように、いずれの
ジエステル結合触媒性アルコールを使用した二つの試験
合成法とも、Ｔ８は抜群に優れた生成物であった。

更に一連の実験において、オルト・イミダゾールジエス
テルをペンタデカチミジル酸（１５個のチミジン酸）の
合成に使用した。これらの実験では、オルト・イミダゾ
ールジエステルを製造する方がオルト・テトラゾールジ
エステルを製造するより幾分容易であることと、長鎖ヌ
クレオチドを形成する場合はこのジエステルの方が一貫
した結果を提供する理由から、オルト・イミダゾールジ
エステルを使用した。これらの実験はチミジン８の合成
に記載したのと同様な方法で遂行した。縮合反応は５分
間で行なわれ、形成したヌクレオチドは２．５％のＤ　
ＣＡ　／　ＣＨ２ｃｌｊ２で逐次脱保護化した。アルド
キシム処理を行ない、高速液体クロマトグラフィー分析
から、長鎖ヌクレオチドの調製にはオルト・イミダゾー
ルジエステルの方がパラ拳クロロフェニルジエステルに
比べて優しタ結果を得ることが明らかにされた。

第４図では見られないが、オルト・テトラゾールジエス
テルおよびオルト・テトラゾールジエステルを使用した
方が、標準パラ・クロロフェニルジエステル封鎖基を使
用して得られるオリゴヌクレオチドより一層純度の高い
ものが得られる（特に、チミジン以外のヌクレオチドを
使用する場合）。

このように高い純度が得られるのは、触媒活性構造部分
の存在により、各モノマーの縮合が一層すみやかに進行
するため、副反応速度が縮合反応と競合し得ないためで
ある。

ジエステル結合した各種触媒性アルコールによるホスホ
ジエステルの調製実験 ンの調製 ２．４−’）クロロフェニルホスホジクロロデート１．
２ｄ（７，５ミリモル〕と２，６−ルｆシフ　３．　Ｏ
ａｌ（２５，ＯミｌＪモル）を無水テトラヒドロフラン
５０ｄに溶解して、直ちにｏ’ｃｉこ冷却し、攪拌しな
がらこれに５−ジメトキシトリチルチミジン２．’１（
５，０ミリモル）（ピリジンから共沸蒸発により乾燥）
のピリジン２５ＷＬｌ溶液を加えた。３０分後に反応液
を室温に戻し、５−（２−ヒドロキシフェニル）テトラ
ゾール１．６　Ｐ　Ｃ１０，０ミリモル）（アセトニト
リル／ピリジンから共沸蒸発により乾燥）を加えた。室
温で２時間攪拌した後、生成物溶液を蒸発して油状物を
収得し、これをメチレンクロリド５０ｄに溶解し、０．
１Ｍ−重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ８，２
Ｘ　５０　ｍｌ　）で洗滌し、無水硫酸す）　ＩＪウム
上で蒸発乾固して泡状物質を得た。この物質を濃厚水酸
化アンモニウム／ジオキサン（１／１　）５０ｄに溶解
し、溶液を６０℃で１２時間加熱した。これを蒸発させ
た後、９　：　１　（Ｖ／Ｖ）のアセトニトリル／水を
使用するシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで生成
物ジエステルを精製、分離した。生成物フラクションを
プールし、濃縮し、５％トリエチルアミン／アセトニト
リル（２Ｘ５０ｍｌ）から蒸発させて、目的とするジエ
ステルの無水トリエチルアンモニウム塩を得た。

２．５′−ジメトキシトリチル−３′−ユ鷹二工１−Ｎ
−メチルイミダゾール）フェニルホスフェ−２，４−ジ
クロロフェニルホスホジクロロテート１．２ｘＡ！（７
，５ミリモル）と２，６−ルチジン３．０ｄ（２５，０
ミリモル）を無水テトラヒドロフラン５０１１１ｇに溶
解して、直ちに０℃に冷却し、攪拌しながらこれに５−
ジメトキシトリチルチミジン２．９り（５，０ミリモル
）（ピリジンから共沸蒸発により乾燥）のピリジン２５
ｒｎｌ溶液を加えた。３０分後に反応液を室温に戻し、
２−（２’−ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイミダゾ
ール１．７９■（１０，’００ミリル）（アセトニトリ
ル／ピリジンから共沸蒸発により乾燥）を加えた。室温
で２時間攪拌した後、生成物溶液を蒸発して油状物を収
得し、これをメチレンクロリド５０ｍ１に溶解し、０．
１　Ｍ　−重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ＰＨ８
，２Ｘ５０ｍｌ）で洗滌し、無水硫酸す）　ＩＪウム上
で蒸発乾固して泡状物質を得た。この物質を濃厚水酸化
アンモニウム／ジオキサン（・１．／１）に溶解し、溶
液を６０℃で１２時間加熱した。これを蒸発させり後、
９：１（Ｖ／Ｖ）のアセトニトリル／水を使用するシリ
カゲル・カラムクロマトグラフィーで生成物ジエステル
を精製、分離した。生成物フラクションをプールし、濃
縮し、５％トリエチルアミン／アセトニトリル（２Ｘ５
０ｍｌ）から蒸発させて、目的とするジエステルの無水
トリエチルアンモニウム塩を得た。

ンの調製 ２．４−ジクロロフェニルホスホジクロロテートＬ２ｍ
ｌＣ７，５ミリモル）と２，６−ルチジン３．　Ｏｒｒ
ｔｌ（２５，０ミリモル〕を無水テトラヒドロフラン５
０ｍ１に溶解して、直ちに０℃に冷却し、攪拌しながら
これに５−ジメトキシトリチルチミジン２．９２（５，
Ｏミリモル）（ピリジンから共沸蒸発により乾燥）のピ
リジン２５罰溶液を加えた。３０分後に反応液を室温に
戻し、３−ヒドロキシプロピル−Ｎ、　Ｎ−ジメチルア
ミン１．０グ（１０，０ミリモル〕（アセトニトリル／
ピリジンから共沸蒸発により乾燥）を加えた。室温で２
時間攪拌した後、生成物溶液を蒸発して油状物を収得し
、これをメチレンクロリド５０ｍ１に溶解し、０．１Ｍ
−重炭酸トリエチルアンモニウム溶液（ｐＨ８，２Ｘ５
０ｄ）　で洗滌し、無水硫酸ナトリウム上で蒸発乾固し
て泡状物質を得た。この物質を濃厚水酸化アンモニウム
／ジオキサン（１／１　）に溶解し、溶液を６０℃で１
２時間加熱した。これを蒸発させた後、９：ｌ（ｖ／ｖ
）のアセトニトリル／水を使用するシリカゲル・カラム
クロマトグラフィーで生成物ジエステルを精製、分離し
た。生成物フラクションをプールし、濃縮し、５％トリ
エチルアミン／アセトニトリル（２Ｘ５０ｉＪ）から蒸
発させて、目的とするジエステルの無水トリエチルアン
モニウム塩を得た。

これらの三つの実験から判るように、これらのホスホジ
エステルの標品は、すべて同じ方法によって得られる。

第１表に示しだすへての触媒性アルコールのホスホジエ
ステル類は、いずれもこの方法によって調製される。

対応するホスホジエステルの調製に使用される下記の触
媒性アルコール／封鎖基群、 （ａ）８−ヒドロキシキノリン、 （ｂｌ（２−ヒドロキシエチル）Ｎ、Ｎ−ジメチルアミ
ン、 （Ｃ）（３−ヒドロキシプロピル）　Ｎ、　Ｎ−ジメチ
ルアミン、 （ｄ１２−（ヒドロキシメチル）ピリジン、および（ｅ
）２−（２−ヒドロキシエチル）ピリジンは商業的に入
手できる。

第１表に挙げた残りの出発触媒性アルコール類（［１２
−（２−ヒドロキシエチル）Ｎ−メチルイミダゾール、 （ｇ）２−（ヒドロキシメチル）Ｎ−メチルイミダゾー
ル、 （ＩＮ＋５−（２−ヒドロキシエチル）テトラゾール、
ｆｉ＋　５−（２’−ヒドロキシフェニル）テトラソー
ル、 および （ｊ）２−（２′−ヒドロキシフェニル）Ｎ−メチルイ
ミダゾール は、ロエ（Ｒｏｅ）、ジャーナル、オブ、ザ、ケミカル
、ソサイエテイー（Ｊ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）　
１９６３年、２１９５頁、フインネガン、Ｗ、　Ｇ　、
　（Ｆｉｎｎｅｇａｎ。

Ｗ、Ｇ、　）、ヘンリー、Ｒ，Ａ、　（Ｈｅｎ、ｒｙ、
　Ｒ，Ａ、　）、ロフキスト、Ｒ，（Ｌｏｆｑｕｉｓｔ
、　Ｒ，）、ジャーナル、オブ、ジ、アメリカン、ケミ
カル　ソサイエテイ−（Ｊ、　Ａｒｎ、　Ｃｈｅｍ、　
Ｓｏｃ、　）８０巻　３９０８頁１９５８年、Ｇ、　Ａ
、　ｏジャーズ（Ｇ、　Ａ、　Ｒｏｇｃｒｓ）、Ｔ、Ｃ
，ブリュイｘ　（Ｔ、Ｃ，Ｂｒｕｉ　ｉｅ　）、ジャー
ナルオブ　ジ　アメリカン　ケミカル　ンサイエテイ（
Ｊ、Ａｍ、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　）、９６巻、２４
６３頁１９７４年、に記載されている当業者のよく知っ
ている文献調製法を参照佇して作成した。

その他の触媒性アルコールジエステル結合を有するホス
ホジエステルの調製方法は、ホスホジエステルおよび上
記に開示した調製方法から、当業者にとって自明のこと
である。

明細書に記載したこの発明の各種要件に追加されるこの
発明の他の修飾法および変法は当業者にとって自明のこ
とというべきである。この明細書に使用した用語および
表現は、もっばら説明上の用語であって制約的なもので
はなく、この発明は特許請求の範囲によってのみ限定さ
れるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、２種の好ましいジエステル結合触媒性アルコ
ールを使用したヌクレオチド間縮合速度を、他の態様お
よび標準封鎖基と比較した相対的反応速度を示すグラフ
である。 第２図は、チミジンの５−（２−ヒドロキシフェニル）
テトラゾールジエステルを各種試薬と反応させた後のＰ
　３１　ＮＭＲスペクトルを示すグラフである。 第３図は、チミジンのパラ・クロロフェニルジエステル
を各種試薬と反応させた後のＰ３１Ｎ］’ｔ４Ｒスペク
トルを示すグラフである。 第４図は、チミジン（Ｔ−２０）標準のゲル電気泳動後
のオートラジオグラム、および２種の好ましいジエステ
ル結合触媒性アルコールを使用し、多段階的に逐次連続
的に行なったヌクレオチド縮合反応物をゲル電気泳動し
たオートラジオグラムの模式図である。 特許出願人　ジエネンテク、インコーポレイテッド代　
理　人　弁理士　前出　葆　外１名第４図 製銑−７ｆｆｉ；ＡＶｔ誦 伽七Ｆ！！＋’、＋＋２．．１．＋ｍ ’！！Ｍｊｉ＆’ｉｌ’、〜・・嗜罐 γ）？、ｉ向快′ 一―ｉｔゾ′ ？ン・〆（、、、、、Ｈｍ、２ 増・※、繍 すＪ ；ＳΔ’３Ｑで、。 股部ｉ Ａ列 ・・＋；’；’ｙＲ３＾、、二・　械梨コＳｐ書、Ｊ、
？、、、−喝シｙ＋＝、＋＋゛　４−ヨ＠。 ＋Ｊ２ ・・ｉ−浄づ・・−＠ｔ９・ り甥がθＶ ８列　Ｃ列

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　ヌクレオチドの３′−リン酸にジエステル結合し
   ている触媒性アルコール。 ２、ヌクレオチドの３′−リン酸に結合した封鎖基に結
   合しているヌクレオチド間反応の触媒活性構造部分。 ３、　ヌクレオチドの３′−リン酸にジエステル結合し
   ている封鎖基であって、ホスホトリエステル形成時に隣
   接基が参加し得る様に触媒活性構造部分がそれ自身に結
   合している封鎖基、を含んでいる化合物。 ４、ヌクレオチドの３′−リン酸とジエステル結合して
   いる封鎖基であって、触媒活性構造部分とヌクレオチド
   の３′位のリンが関与して活性環状構造が形成され、こ
   の活性環状構造は他のヌクレオチドまたはヌクレオシド
   の末端５′−水酸基からの核的攻撃をうけることができ
   、この核的攻撃によってホスホトリエステルが形成され
   る様に、該触媒活性構造部分をそれ自身に結合して含ん
   でいる封鎖基７を含有している化合物。 ５、その封鎖基が置換基を有することもあるアリール、
   アルキル、シクロアルキルまたはβ−シアノアルキル基
   である第２項、第３項または第４項のいずれかに記載の
   化合物。 ６、その触媒活性構造部分が、置換基を有することもあ
   る芳香性含窒素複素環、第３級アミンまたはカルボン酸
   である第５項に記載の化合物。 ７、触媒活性構造部分が、置換基を有することもあるキ
   ノリン、ピリジン、イミダゾールまたはテトラゾールで
   ある第２項、第３項、第４項、第５項または第６項のい
   ずれかに記載の化合物。 ８、触媒性アルコールが８−ヒドロキシキノリン、（２
   −ヒドロキシエチル）　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン、（３
   −ヒドロキシプロピル）Ｎ、Ｎ−ジメチルアミン、２−
   （ヒドロキ・ジメチル）ピリジン、２−（２’−ヒドロ
   キシエチル）ピリジン、２−（ヒドロキシメチル）Ｎ−
   メチルイミダゾール、２−（２’−ヒドロキシエチル）
   Ｎ−メチルイミダゾール、５−（２’−ヒドロキシエチ
   ル）テトラゾール、５−（２’−ヒドロキシフェニル）
   テトラゾールマタハ２−（２′−ヒドロキシフェニル）
   Ｎ−メチルイミダゾールである第１項に記載の化合物。 ９、第１項に記載の化合物を使用するヌクレオチド間縮
   合反応において形成され、他のヌクレオチドまたはヌク
   レオシドの５′−水酸基から核的攻撃をうけ得る中間体
   化合物。 １０、式： 〔式中、Ｎｕｌ　はヌクレオチドを表わす〕で示される
   化合物であって、該化合物はヌクレオシドまたは第２の
   ヌクレオチドとの間の縮合反応時に形成される化合物で
   あり、該ヌクレオチドはその３′リン酸位にジエステル
   結合した５　−（２’−ヒドロキシフェニル）テトラゾ
   ールを持っている、ことを特徴とする第９項に記載の化
   合物。 １１、第１項、第２項、第３項、第４項、第７項または
   第８項のいずれかに記載の化合物を使用することから成
   るオリゴヌクレオチドの合成方法。 １２、ＣＡＴＳＯＬを添加することによってヌクレオチ
   ド縮合反応が更に促進される第１１項に記載の方法。 １３、ｔａ）第２項、第３項、第４項、第７項または第
   ８項のいずれかに記載の化合物の５′−水酸基を保護す
   ることにより保護ホスホジエステルを形成し、 （ｂ）このホスホジエステルの３′−リン酸に結合して
   いる水酸基の少なくとも１個をイオン化することによっ
   て酸素アニオンを形成し、 （Ｃ）この酸素アニオンに陽イオンを静電気的に結合さ
   せることによって塩を形成し、 （ｄ）脱水剤、該塩およびＣＡＴ’Ｓ’０″Ｌを有機溶
   媒に溶解することにより有機溶液を調製し、（ｅ）この
   有機溶液をヌクレオシドまたはヌクレオチドと接触させ
   ることによりホスホトリエステルを形成することから成
   る、 ヌクレオチド間縮合反応速度の促進方法。 １４、更に、（ａ）ホスホトリエステルを担体から切り
   離し、 （ｂ）５’−水酸基を脱保護化し、そして（Ｃ）封鎖基
   および触媒活性構造部分を除去する、ことから成る第１
   ３項に記載の方法。