JPS60251882A - ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法 - Google Patents
ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法Info
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- JPS60251882A JPS60251882A JP10714584A JP10714584A JPS60251882A JP S60251882 A JPS60251882 A JP S60251882A JP 10714584 A JP10714584 A JP 10714584A JP 10714584 A JP10714584 A JP 10714584A JP S60251882 A JPS60251882 A JP S60251882A
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- protease
- peptide synthesis
- strain
- bacillus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
- C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ペプチド合成用プロテアーゼの製造法に関す
る。更に詳しくは、バチルス属菌由来のペプチド合成用
プロテアーゼ構造遺伝子を、宿主菌に導入して形質転換
を行い、得られたペプチド合成用プロテアーゼ高生産性
形質転換株を培養し、培養物中にペプチド合成用プロテ
アーゼを生産蓄積せしめた後、これを採取することを特
徴とするペプチド合成用プロテアーゼの製造法に関する
。
る。更に詳しくは、バチルス属菌由来のペプチド合成用
プロテアーゼ構造遺伝子を、宿主菌に導入して形質転換
を行い、得られたペプチド合成用プロテアーゼ高生産性
形質転換株を培養し、培養物中にペプチド合成用プロテ
アーゼを生産蓄積せしめた後、これを採取することを特
徴とするペプチド合成用プロテアーゼの製造法に関する
。
従来の技術
近年、酵素を用いるペプチド合成法は、化学的合成法に
比してラセミ化やその他の望ましくない副反応を避ける
ことができ、操作も簡単で、反応条件も常温、水性媒質
系であることなどの利点を有しているため、さかんに行
われるようになった。
比してラセミ化やその他の望ましくない副反応を避ける
ことができ、操作も簡単で、反応条件も常温、水性媒質
系であることなどの利点を有しているため、さかんに行
われるようになった。
例えば特開昭５１−１１００．９４号、特開昭５２−５
１０９２号、特開昭５２−１２８２９０号、特開昭５２
−！２８２９１号等に記載されている。
１０９２号、特開昭５２−１２８２９０号、特開昭５２
−！２８２９１号等に記載されている。
しかしながら、ペプチド合成に使用される酵素は、強力
なプロテアーゼ作用を有し、かつペプチド合酸反応を阻
害しないためのエステラーゼ作用及びアミダーゼ作用を
殆ど有しないことが必要である。
なプロテアーゼ作用を有し、かつペプチド合酸反応を阻
害しないためのエステラーゼ作用及びアミダーゼ作用を
殆ど有しないことが必要である。
本発明者の一人が先に特公昭５’１−５３．０７４号公
報にて明らかにしたように、広く自然界からこの条件に
合うプロテアーゼ生産菌株をスクリーニングした結果、
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、 ） Ｎ
ｏ、３６ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、４７３６を見い出した
。
報にて明らかにしたように、広く自然界からこの条件に
合うプロテアーゼ生産菌株をスクリーニングした結果、
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ、 ） Ｎ
ｏ、３６ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、４７３６を見い出した
。
発明が解決しようとする問題点
バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、 ）
Ｎ［１３６ＦＥＲＬ−Ｐ Ｉｌｂ、 ４７３６は、優れ
た性質を有し、ペプチド合成用として使用可能であるが
、しかしこのものをより工業的に利用し易くするために
は、更にプロテアーゼ力を高めることが望まれていた。
Ｎ［１３６ＦＥＲＬ−Ｐ Ｉｌｂ、 ４７３６は、優れ
た性質を有し、ペプチド合成用として使用可能であるが
、しかしこのものをより工業的に利用し易くするために
は、更にプロテアーゼ力を高めることが望まれていた。
問題点を解決するための手段
そこで、該菌株を改良するために、従来より微生物によ
る酵素等の生産性増強方法として一般的に用いられてい
る紫外線或いは、ニトロソグアニジン等を用いる変異操
作を試みた。しかし、この試みは、エステラーゼ、アミ
ダーゼのような夾雑酵素の生産を抑制し、プロテアーゼ
力のみを増強させる点において非常に困難であり、かつ
又、これら変異操作により得られた菌株は、復帰変異を
起し易く、不安定であった。そこで本発明者らは、遺伝
子操作技術を用いて菌株を改良することを試みた。遺伝
子操作技術は、目的の酵素の遺伝子を適切なベクターに
連結し、主として異種微生物に導入し、遺伝子増幅効果
により生産性を高める方法である。しかしながら、酵素
がプロテアーゼである場合には、宿主微生物に阻害的な
影響を与える場合があり、これまで効率よく生産された
例は少なく、これを例示すれば、ニュクレイツク・アシ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ）第１１巻第７９１１頁（１９８３年）、ジャ
ーナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１５４巻第８３１
頁（１９８３年）及び特開昭５８−１６２２９１号等が
報告されているにすぎない。
る酵素等の生産性増強方法として一般的に用いられてい
る紫外線或いは、ニトロソグアニジン等を用いる変異操
作を試みた。しかし、この試みは、エステラーゼ、アミ
ダーゼのような夾雑酵素の生産を抑制し、プロテアーゼ
力のみを増強させる点において非常に困難であり、かつ
又、これら変異操作により得られた菌株は、復帰変異を
起し易く、不安定であった。そこで本発明者らは、遺伝
子操作技術を用いて菌株を改良することを試みた。遺伝
子操作技術は、目的の酵素の遺伝子を適切なベクターに
連結し、主として異種微生物に導入し、遺伝子増幅効果
により生産性を高める方法である。しかしながら、酵素
がプロテアーゼである場合には、宿主微生物に阻害的な
影響を与える場合があり、これまで効率よく生産された
例は少なく、これを例示すれば、ニュクレイツク・アシ
ド・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄ Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ ）第１１巻第７９１１頁（１９８３年）、ジャ
ーナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１５４巻第８３１
頁（１９８３年）及び特開昭５８−１６２２９１号等が
報告されているにすぎない。
本発明者らは、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ、 ） Ｎｏ、３６ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎ１４７３６
由来のペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子を宿主に導入
して形質転換を行い、得られたペプチド合成用プロテア
ーゼ生産性形質転換株の産生ずるプロテアーゼが、宿主
微生物に阻害的影響を与えることなく、かつエステラー
ゼ及びアミダーゼ等をほとんど生産しないことを知り、
真に実用的なペプチド合成用プロテアーゼの製造法を確
立し、本発明を完成せしめたものである。
ｓｐ、 ） Ｎｏ、３６ ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎ１４７３６
由来のペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子を宿主に導入
して形質転換を行い、得られたペプチド合成用プロテア
ーゼ生産性形質転換株の産生ずるプロテアーゼが、宿主
微生物に阻害的影響を与えることなく、かつエステラー
ゼ及びアミダーゼ等をほとんど生産しないことを知り、
真に実用的なペプチド合成用プロテアーゼの製造法を確
立し、本発明を完成せしめたものである。
作用
まず、ペプチド合成用プロ”テアーゼ生産性菌株バチル
ス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） Ｎａ３６
ＦＥＲＭ−ＰＩｔ ４７３６の染色体ＤＮＡを切断し
、得られたＤＮＡ断片をベクターｐＢＲ３２２に結合し
て、大腸菌Ｃ６００株に形質転換し、プロテアーゼ生産
株の選択を行った。次いでプロテアーゼ生産性大腸菌形
質転換株より、プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドを
凋製し、サブクローニングにより低分子化した後、プロ
テアーゼ遺伝子断片を取り出し、ベクターｐＵＢ１１０
に結合して、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ＲＭ１２５株に形質転換した
。
ス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） Ｎａ３６
ＦＥＲＭ−ＰＩｔ ４７３６の染色体ＤＮＡを切断し
、得られたＤＮＡ断片をベクターｐＢＲ３２２に結合し
て、大腸菌Ｃ６００株に形質転換し、プロテアーゼ生産
株の選択を行った。次いでプロテアーゼ生産性大腸菌形
質転換株より、プロテアーゼ遺伝子を含むプラスミドを
凋製し、サブクローニングにより低分子化した後、プロ
テアーゼ遺伝子断片を取り出し、ベクターｐＵＢ１１０
に結合して、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂｔｉｌｉｓ ） ＲＭ１２５株に形質転換した
。
本形質転換株からカゼイン含有選択培地でプロテアーゼ
生産性菌株を選択した。このプロテアーゼ生産性形質転
換株を培養し、菌体を除去した培養ろ液は、そのもので
もペプチド合成用プロテアーゼとして使用することがで
きるのは勿論であるが、ろ液を加熱処理することによっ
てエステラーゼ、アミダーゼを全く含有しないより優れ
たペプチド合成用プロテアーゼとすることができる。夾
雑酵素であるエステラーゼ及びアミダーゼは、宿主に由
来して産生されるものであり、非耐熱性であるが、一方
、プロテアーゼの方は、耐熱性が大であるので、６５℃
程度の加熱処理によっても簡単に夾雑酵素を失活させる
ことができるからである。次に本発明を実施例にてより
具体的に説明するが、本実施例で用いた各種酵素活性測
定法は次の通りである。
生産性菌株を選択した。このプロテアーゼ生産性形質転
換株を培養し、菌体を除去した培養ろ液は、そのもので
もペプチド合成用プロテアーゼとして使用することがで
きるのは勿論であるが、ろ液を加熱処理することによっ
てエステラーゼ、アミダーゼを全く含有しないより優れ
たペプチド合成用プロテアーゼとすることができる。夾
雑酵素であるエステラーゼ及びアミダーゼは、宿主に由
来して産生されるものであり、非耐熱性であるが、一方
、プロテアーゼの方は、耐熱性が大であるので、６５℃
程度の加熱処理によっても簡単に夾雑酵素を失活させる
ことができるからである。次に本発明を実施例にてより
具体的に説明するが、本実施例で用いた各種酵素活性測
定法は次の通りである。
（１）プロテアーゼ活性
１．５％ミルクカゼイン溶液１πｅを試験管にとり、３
７℃、５分間予熱後、希釈酵素液１ ｍｃを加え、６０
分間反応せしめた後、０．４Ｍ ）リフロール酢酸２ｍ
ｅを加え、反応を停止せしめ、次いでろ過して得られる
ろ液１−を別の試験管にとり ０．４Ｍ炭酸すトリウム
塩５ ｍｅ及び５倍希釈のフォリン試液１ ｍＥを加え
、３７℃で２０分間発色する。この液にっき６６０Ｍｍ
の波長における吸光度をめる。酵素液のかわりに水を用
いた場合をブランク値とする。力価は、上記条件下１
ｍｌ！中に１００γのチロシンに相当するアミノ酸を生
成するときを１単位とする。
７℃、５分間予熱後、希釈酵素液１ ｍｃを加え、６０
分間反応せしめた後、０．４Ｍ ）リフロール酢酸２ｍ
ｅを加え、反応を停止せしめ、次いでろ過して得られる
ろ液１−を別の試験管にとり ０．４Ｍ炭酸すトリウム
塩５ ｍｅ及び５倍希釈のフォリン試液１ ｍＥを加え
、３７℃で２０分間発色する。この液にっき６６０Ｍｍ
の波長における吸光度をめる。酵素液のかわりに水を用
いた場合をブランク値とする。力価は、上記条件下１
ｍｌ！中に１００γのチロシンに相当するアミノ酸を生
成するときを１単位とする。
（２）エステラーゼ活性
シュウェルトＧ、Ｗ、 （Ｓｃｈｗｅｒｔ Ｇ、Ｗ、
ｅｔ ａｌ） ら、バイオキミカ・エト・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ）第２６巻第５７０頁（１９５
５年）に準じて測定する。即ち、基質としてＮ−ヘンヅ
イルーし一アルギニンエチルエステルを酢酸カルシウム
０．００２Ｍを含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解（最終濃度２５０μＭ）したちの３ ｍｆ
！と酵素液０．２ｍＦを混合し、３７℃、６０分間反応
後、００２５３Ｍｍを測定し、反応直後のｏＤ２５３ｎ
ｍとの吸光度差が１．０のときの酵素力価を１単位とす
る。
ｅｔ ａｌ） ら、バイオキミカ・エト・バイオフィジ
カ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈ
ｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ）第２６巻第５７０頁（１９５
５年）に準じて測定する。即ち、基質としてＮ−ヘンヅ
イルーし一アルギニンエチルエステルを酢酸カルシウム
０．００２Ｍを含む０．１Ｍ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
，０）に溶解（最終濃度２５０μＭ）したちの３ ｍｆ
！と酵素液０．２ｍＦを混合し、３７℃、６０分間反応
後、００２５３Ｍｍを測定し、反応直後のｏＤ２５３ｎ
ｍとの吸光度差が１．０のときの酵素力価を１単位とす
る。
（３）アミダーゼ活性
（２）のエステラーゼ活性測定法中のＮ−ベンゾイル−
Ｌ−アルギニンエチルエステルにかえてＮ−ベンゾイル
−し−アルギニンアミドを用いる以外はエステラーゼ活
性測定法と同様にして測定する。
Ｌ−アルギニンエチルエステルにかえてＮ−ベンゾイル
−し−アルギニンアミドを用いる以外はエステラーゼ活
性測定法と同様にして測定する。
３７℃、６０分間反応後、００２５３Ｍｍを測定し、反
応直後のＯＤ ２５３Ｍｍとの吸光度差が１．０のとき
の酵素力価を１単位とする。
応直後のＯＤ ２５３Ｍｍとの吸光度差が１．０のとき
の酵素力価を１単位とする。
実施例１
（１）ペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子の大腸菌によ
るクローニング 斉藤らの方法〔ハイオキミカ・エト・ハイオフイジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ＾ｃｔａ）第７２巻第６１９頁（１９６３年）〕
に従い鋼製したバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ、） ＮａＮａ３６ＦＥＲＰ Ｎｏ、 ４７３６
株の染色体ＤＮＡ １．８ｐｇを含む２ｐＥと旧ｎｄｌ
ｆｆ用緩衝液（０，１Ｍ１−リス塩酸緩ｔＦ液（ｐＨ７
，５＞ ２容、７０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液２容、
０．６Ｍ食塩水２容及び蒸留水１ｏ容からなる混液）４
Ｍと制限酵素旧ｎｄｌｌ［、（宝酒造社製品）０．１扉
を混合し、３７℃、５分間反応後６５℃、１ｏ分間の加
熱により反応を停止させた。次に旧ｎｄＩＩＩで消化後
、アルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ３２２約１０
Ｊ’ｇを含む４ ｐＥ 、 Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガー
上１ ｐｉ’、７５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液８ｇ、
５００ＭＭＡＴＰ水溶液６ ｐＥ、０．１Ｍジチオスレ
イトール５ ｐＥを混合し、１０℃、２０時間反応させ
る。この反応液のｌｋｌ’を用いて斉藤の方法〔ジャー
ナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１２１巻第３５４
頁（１９７５年）〕により、ニジエリシア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｃ６００ｒＨ−ｍ
Ｒ−ｔｈｉ ｔｈｒ−１ｅｕ−を受容株として形質転換
した。３７℃で約２時間Ｌ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ
） ５ ｒｔｄ！に培養した菌株を集菌し、０．１Ｍ食
塩５ ｍＭ、塩化マグネシウムを含む５ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６） ３ ｍｌ！で洗浄し、次に １
００ｍＭ塩化カルシウム、 ２５０ｍＭ塩化カリウムを
含む同緩（ｈ液３祿にて懸濁した。懸濁液を０℃、２５
分間インキュヘート後、遠心分離し、菌体を再ひ１１０
０ＩＴＩ塩化カルシウム、２５０ｍＭ塩化カリウムを含
む同緩衝１０．５ｍＣ’に懸濁したのち、ＤＮＡ反応液
１０ｐ！！を混合し、０℃、３０分間インキュヘート後
、３７℃、２０分間保温し、遠心分離により菌体を集め
て洗浄後、５ ｍｌ！のＬ−ブロスに懸濁し、３７℃で
２時間培養した。アンピシリン（＾ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
、ベーリンガー社製品） １．０ ｋｇ ／ ｍＥとス
キムミルク１％を含むＭ−３寒天培地（ディフコ社製品
〉に上記培養液０．２ｍＥをまき、生育するアンピシリ
ン耐性株のうち、プロテアーゼ生産性を持つ形質転換株
３株を得た。このうちの１株を選び、常法に従ってプラ
スミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ （宝酒造社製品
）、ＣＬａＩ （ベーリンガー社製品）等を用いて、サ
ブクローニング、挿入遺伝子断片の低分子化を行い、プ
ラスミドｐＲＴ１１５を調製した。このプラスミド制限
酵素地図を第１図ａに示す。又、プラスミドｐＲＴ１１
５を制限酵素ＥｃｏＲＶ （宝酒造社製品）で切断し、
ＥｃｏＲｌ ’Ｊンカーを接続後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断して、ＥｃｏＲｌで消化後、アルカリホスファタ
ーゼ処理したｐＢＲ３２２と結合し、上記と同様に大腸
菌０６００株に形質転換し、次いでプロテアーゼ生産性
形質転換株よりプラスミドｐＲＴ２０３を鋼製した。
るクローニング 斉藤らの方法〔ハイオキミカ・エト・ハイオフイジカ・
アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａ＾ｃｔａ）第７２巻第６１９頁（１９６３年）〕
に従い鋼製したバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ、） ＮａＮａ３６ＦＥＲＰ Ｎｏ、 ４７３６
株の染色体ＤＮＡ １．８ｐｇを含む２ｐＥと旧ｎｄｌ
ｆｆ用緩衝液（０，１Ｍ１−リス塩酸緩ｔＦ液（ｐＨ７
，５＞ ２容、７０ｍＭ塩化マグネシウム水溶液２容、
０．６Ｍ食塩水２容及び蒸留水１ｏ容からなる混液）４
Ｍと制限酵素旧ｎｄｌｌ［、（宝酒造社製品）０．１扉
を混合し、３７℃、５分間反応後６５℃、１ｏ分間の加
熱により反応を停止させた。次に旧ｎｄＩＩＩで消化後
、アルカリホスファターゼ処理したｐＢＲ３２２約１０
Ｊ’ｇを含む４ ｐＥ 、 Ｔ ４ Ｄ Ｎ Ａリガー
上１ ｐｉ’、７５ｍＭ塩化マグネシウム水溶液８ｇ、
５００ＭＭＡＴＰ水溶液６ ｐＥ、０．１Ｍジチオスレ
イトール５ ｐＥを混合し、１０℃、２０時間反応させ
る。この反応液のｌｋｌ’を用いて斉藤の方法〔ジャー
ナル・オブ・ハクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂａｃｔ、ｅｒｉｏｌｏｇｙ ）第１２１巻第３５４
頁（１９７５年）〕により、ニジエリシア・コリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｃ６００ｒＨ−ｍ
Ｒ−ｔｈｉ ｔｈｒ−１ｅｕ−を受容株として形質転換
した。３７℃で約２時間Ｌ−ブロス（Ｌ−ｂｒｏｔｈ
） ５ ｒｔｄ！に培養した菌株を集菌し、０．１Ｍ食
塩５ ｍＭ、塩化マグネシウムを含む５ｍＭ）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，６） ３ ｍｌ！で洗浄し、次に １
００ｍＭ塩化カルシウム、 ２５０ｍＭ塩化カリウムを
含む同緩（ｈ液３祿にて懸濁した。懸濁液を０℃、２５
分間インキュヘート後、遠心分離し、菌体を再ひ１１０
０ＩＴＩ塩化カルシウム、２５０ｍＭ塩化カリウムを含
む同緩衝１０．５ｍＣ’に懸濁したのち、ＤＮＡ反応液
１０ｐ！！を混合し、０℃、３０分間インキュヘート後
、３７℃、２０分間保温し、遠心分離により菌体を集め
て洗浄後、５ ｍｌ！のＬ−ブロスに懸濁し、３７℃で
２時間培養した。アンピシリン（＾ｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
、ベーリンガー社製品） １．０ ｋｇ ／ ｍＥとス
キムミルク１％を含むＭ−３寒天培地（ディフコ社製品
〉に上記培養液０．２ｍＥをまき、生育するアンピシリ
ン耐性株のうち、プロテアーゼ生産性を持つ形質転換株
３株を得た。このうちの１株を選び、常法に従ってプラ
スミドを調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩ （宝酒造社製品
）、ＣＬａＩ （ベーリンガー社製品）等を用いて、サ
ブクローニング、挿入遺伝子断片の低分子化を行い、プ
ラスミドｐＲＴ１１５を調製した。このプラスミド制限
酵素地図を第１図ａに示す。又、プラスミドｐＲＴ１１
５を制限酵素ＥｃｏＲＶ （宝酒造社製品）で切断し、
ＥｃｏＲｌ ’Ｊンカーを接続後、制限酵素ＥｃｏＲＩ
で切断して、ＥｃｏＲｌで消化後、アルカリホスファタ
ーゼ処理したｐＢＲ３２２と結合し、上記と同様に大腸
菌０６００株に形質転換し、次いでプロテアーゼ生産性
形質転換株よりプラスミドｐＲＴ２０３を鋼製した。
（以下余白）
（２）ペプチド合成用プロテアーゼ遺伝子のバチルス属
細菌への形質転換 プラスミドｐＲＴ１１５約１０７５ｇを含む溶液１０ｐ
１と制限酵素ＥｃｏＲＩ用緩衝液〔組成：ＩＭＦリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） ５ｍｅ、１Ｍ塩化マグネシウ
ム水溶液０．３５ｍ、５Ｍ塩化ナトリウム０．５−１２
Ｍ２−メルカプトエタノール０．１７５ｍ、１％ウシ血
清アルブミン１−１滅菌水２９．７５ｍ） １０ｐ１、
蒸留水２８ｍと制限酵素ＥｃｏＲＩ２４を混合し、３７
℃、３時間反応後、６５℃、１０分間の加熱により反応
を停止させた。次にあらかじめ、ＥｃｏＲＩで消化後、
アルカリホスファターゼ処理したプラスミドｐＵＢ１１
０の約３ｐｇを含む１０ｐＲ，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１
ｍ、７５ＩＩＩＭ塩化マグネシウム水溶液８ｐ１．５０
０μＭ ＡＴＰ水溶液６ｐ１、Ｏ，１Ｍジチオスレイト
ール６ｐＩ！を混合し、１０℃、２０時間反応させた後
、反応液の５０ｐ１を用いてチャック（Ｃｈａｎｇ ）
の方法〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ
イクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第１６８＠第１１１〜１１５頁（１
９７９年）〕によりバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ１２５株（ｒＭ−ｏ＋
Ｍ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−）を受容株として形質転換した。
細菌への形質転換 プラスミドｐＲＴ１１５約１０７５ｇを含む溶液１０ｐ
１と制限酵素ＥｃｏＲＩ用緩衝液〔組成：ＩＭＦリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，５） ５ｍｅ、１Ｍ塩化マグネシウ
ム水溶液０．３５ｍ、５Ｍ塩化ナトリウム０．５−１２
Ｍ２−メルカプトエタノール０．１７５ｍ、１％ウシ血
清アルブミン１−１滅菌水２９．７５ｍ） １０ｐ１、
蒸留水２８ｍと制限酵素ＥｃｏＲＩ２４を混合し、３７
℃、３時間反応後、６５℃、１０分間の加熱により反応
を停止させた。次にあらかじめ、ＥｃｏＲＩで消化後、
アルカリホスファターゼ処理したプラスミドｐＵＢ１１
０の約３ｐｇを含む１０ｐＲ，Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１
ｍ、７５ＩＩＩＭ塩化マグネシウム水溶液８ｐ１．５０
０μＭ ＡＴＰ水溶液６ｐ１、Ｏ，１Ｍジチオスレイト
ール６ｐＩ！を混合し、１０℃、２０時間反応させた後
、反応液の５０ｐ１を用いてチャック（Ｃｈａｎｇ ）
の方法〔モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネテ
イクス（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）第１６８＠第１１１〜１１５頁（１
９７９年）〕によりバチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ＲＭ１２５株（ｒＭ−ｏ＋
Ｍ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−）を受容株として形質転換した。
即ち、３０℃、約４時間Ｍ−３培地５ｒＩｅにて培養し
た菌体を集菌し、ＳＭＶＰ Ｏ，４〆に懸濁し、リゾチ
ーム１■を含むＳＭＭＰ ０．１ｍを加えて３７℃、２
時間反応後、遠心分離により集菌し、ＳＭＭＰＩ−を加
えて洗浄後、ＳＭＭＰ ０．５ｍ！に懸濁させてプロト
プラストサスペンションとした。次にこのサスペンショ
ンに上記プラスミド反応液５０ｐ１を加え、更に１．５
ｄの４０％ポリエチレングリコールを加えて、直ちに２
分間軽く振盪後、ＳＭＭＰ５−を加えて遠心分離した。
た菌体を集菌し、ＳＭＶＰ Ｏ，４〆に懸濁し、リゾチ
ーム１■を含むＳＭＭＰ ０．１ｍを加えて３７℃、２
時間反応後、遠心分離により集菌し、ＳＭＭＰＩ−を加
えて洗浄後、ＳＭＭＰ ０．５ｍ！に懸濁させてプロト
プラストサスペンションとした。次にこのサスペンショ
ンに上記プラスミド反応液５０ｐ１を加え、更に１．５
ｄの４０％ポリエチレングリコールを加えて、直ちに２
分間軽く振盪後、ＳＭＭＰ５−を加えて遠心分離した。
生じた沈澱にＳＭＭＰｌｌＲｌを加えて懸濁後、３０℃
、９０分間インキュベートし、次いでカナマイシンを３
００ｐｇ ／ ｄ！含むＤＭ３培地にプレートし、３０
℃、２日間培養した。こうしてプレート上に生育したカ
ナマイシン耐性株をプロテアーゼ試験用寒天培地〔組成
：培地１０〇−当りリン酸２カリウム１．４ｇ、リン酸
１カリウム０．６ｇ 。
、９０分間インキュベートし、次いでカナマイシンを３
００ｐｇ ／ ｄ！含むＤＭ３培地にプレートし、３０
℃、２日間培養した。こうしてプレート上に生育したカ
ナマイシン耐性株をプロテアーゼ試験用寒天培地〔組成
：培地１０〇−当りリン酸２カリウム１．４ｇ、リン酸
１カリウム０．６ｇ 。
硫酸アンモニウム０．２ｇ、クエン酸ナトリウム０．１
ｇ、カザミノ酸０．２ｇ、グルコース０．３ｇ 、カゼ
イン１ｇ及びカナマイシン１■をそれぞれ含む。〕に移
し、３０℃、２４時間後、大型ハローを形成するコロニ
ーを取得し、プラスミドを調べた結果、プラスミドｐＲ
Ｔ１１５とｐＵＢｌｌｏＡ＜ ＥｃｏＲＩ切断位置で結
合したシャトルベクターであることが確認され、プラス
ミド９０１１Ｂ１１５と命名した。
ｇ、カザミノ酸０．２ｇ、グルコース０．３ｇ 、カゼ
イン１ｇ及びカナマイシン１■をそれぞれ含む。〕に移
し、３０℃、２４時間後、大型ハローを形成するコロニ
ーを取得し、プラスミドを調べた結果、プラスミドｐＲ
Ｔ１１５とｐＵＢｌｌｏＡ＜ ＥｃｏＲＩ切断位置で結
合したシャトルベクターであることが確認され、プラス
ミド９０１１Ｂ１１５と命名した。
なお、プラスミドｐＲＴ２０３についても全く同様に行
い、プロテアーゼ生産性形質転換株から調製されたプラ
スミドの解析を行ったところ、プロテアーゼ遺伝子断片
がＥｃｏＲＩ切断位置でｐＵ８１１０に組み込まれたも
のであることが確認され、そのプラスミドの１つをｐＵ
Ｔｌと命名した。
い、プロテアーゼ生産性形質転換株から調製されたプラ
スミドの解析を行ったところ、プロテアーゼ遺伝子断片
がＥｃｏＲＩ切断位置でｐＵ８１１０に組み込まれたも
のであることが確認され、そのプラスミドの１つをｐＵ
Ｔｌと命名した。
（３）各種プロテアーゼ生産株によるプロテアーゼ及び
夾雑酵素の生産性 親株であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ、）Ｎｏ ３６ Ｆｌｌ！ＲＭ−Ｐ隘４７３６、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ ） ９Ｍ１２５ （ｐｏｌＩＢ１１５
）ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、 ７６３１、形質転換株バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
） ９Ｍ１２５ （ｐＵＴｌ） ＦＥＲＭ−ＰＩｎｌ
ｌｌｔ ７６３０、及び対照菌株としてのバチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）
９Ｍ１２５ （ｐＵ８１１０）のそれぞれを、可溶性澱
粉５％、大豆粉２％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸
マグネシウム０．２％、炭酸カルシウム０．１％の組成
を有する培地１０〇−を含む５００ｄ容坂ロフラスコで
振盪培養した。培養条件は、親株は、４５℃で３５時間
、形質転換株は、３７℃で４８時間それぞれ行った。培
養終了後、除菌して得られたそれぞれの培養上清中のプ
ロテアーゼ、及び夾雑酵素であるエステラーゼ及びアミ
ダーゼ活性を測定した。その結果は表−１に示したよう
に、親株に比して形質転換株のプロテアーゼ活性が１．
７〜１．８倍に上昇しており、エステラーゼ活性は両者
においてほとんど変わらないことがわかった。なおアミ
ダーゼ活性に関しては、親株にはなく形質転換株におい
て若干みられるが、この程度ではペプチド合成に支障は
ない。
夾雑酵素の生産性 親株であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓ
ｐ、）Ｎｏ ３６ Ｆｌｌ！ＲＭ−Ｐ隘４７３６、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕ
ｂｔｉｌｉｓ ） ９Ｍ１２５ （ｐｏｌＩＢ１１５
）ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎｏ、 ７６３１、形質転換株バチル
ス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ
） ９Ｍ１２５ （ｐＵＴｌ） ＦＥＲＭ−ＰＩｎｌ
ｌｌｔ ７６３０、及び対照菌株としてのバチルス・ズ
ブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ ）
９Ｍ１２５ （ｐＵ８１１０）のそれぞれを、可溶性澱
粉５％、大豆粉２％、リン酸１カリウム０．２％、硫酸
マグネシウム０．２％、炭酸カルシウム０．１％の組成
を有する培地１０〇−を含む５００ｄ容坂ロフラスコで
振盪培養した。培養条件は、親株は、４５℃で３５時間
、形質転換株は、３７℃で４８時間それぞれ行った。培
養終了後、除菌して得られたそれぞれの培養上清中のプ
ロテアーゼ、及び夾雑酵素であるエステラーゼ及びアミ
ダーゼ活性を測定した。その結果は表−１に示したよう
に、親株に比して形質転換株のプロテアーゼ活性が１．
７〜１．８倍に上昇しており、エステラーゼ活性は両者
においてほとんど変わらないことがわかった。なおアミ
ダーゼ活性に関しては、親株にはなく形質転換株におい
て若干みられるが、この程度ではペプチド合成に支障は
ない。
（以下余白）
表−１
実施例２
加熱によるエステラーゼ及びアミダーゼの除去実施例１
（３）において得られた親株バチルス・エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） Ｎａ３６ ＦＥＲＭ−Ｐ １
ｌｋＬ４７３６、形質転換株バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） ＲＭ１２５ （ｐ
ＯＵＢ１１５ ） ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎａ７６３１、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ） ＲＭ１２５ （ｐｔ！Ｔｌ） Ｆｔ！Ｒ
Ｍ−Ｐ Ｎ１７６３０のそれぞれの培養上清を６５℃、
１時間加熱処理した後、プロテアーゼ、エステラーゼ及
びアミダーゼ活性を測定した。その結果は表−２に示す
ように、いずれの形質転換株もプロテアーゼ活性の減少
はほとんどみられず、かつエステラーゼ及びアミダーゼ
活性は完全に消失した。一方親株の方は、エステラーゼ
活性が残存していた。
（３）において得られた親株バチルス・エスピー（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｓｐ、） Ｎａ３６ ＦＥＲＭ−Ｐ １
ｌｋＬ４７３６、形質転換株バチルス・ズブチリス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ） ＲＭ１２５ （ｐ
ＯＵＢ１１５ ） ＦＥＲＭ−Ｐ Ｎａ７６３１、形質
転換株バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ
ｔｉｌｉｓ） ＲＭ１２５ （ｐｔ！Ｔｌ） Ｆｔ！Ｒ
Ｍ−Ｐ Ｎ１７６３０のそれぞれの培養上清を６５℃、
１時間加熱処理した後、プロテアーゼ、エステラーゼ及
びアミダーゼ活性を測定した。その結果は表−２に示す
ように、いずれの形質転換株もプロテアーゼ活性の減少
はほとんどみられず、かつエステラーゼ及びアミダーゼ
活性は完全に消失した。一方親株の方は、エステラーゼ
活性が残存していた。
表−２
（発明の効果）
本発明は、ペプチド合成用プロテアーゼ生産菌を遺伝子
組換え技術を応用し、改良することによって、より優れ
たペプチド合成用プロテアーゼを安価に製造することを
可能にならしめたものである。
組換え技術を応用し、改良することによって、より優れ
たペプチド合成用プロテアーゼを安価に製造することを
可能にならしめたものである。
第１図は、本発明のプラスミドｐＲＴ１１５の制限酵素
地図を示すものである。 特許出願人 天野製薬株式会社 Ｎ１図 ５ａｌｔ ＢａｍＨＩ ” ｎ′：ｌｌｉ’手続補正書
く自発） 昭和５９年８月に日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド合成用プロテアーゼの製造法 ３、補正をする考 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 図面 ６、補正の内容 図面を別紙の通り訂正します。 第１図 ５ａＴＩ ＢａｍＨＩ 手続補正書（自発） 昭和６０年１月３１日 特許庁長官 志 賀 学 殿 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド′合成用プロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 明細書の１発明の詳細な説明」の欄及び「図面」 ６、？ｉＭ正の内容 （１〉明細書第４頁第１２行の’ Ａｃ１ｄ」とあるを
「＾ｃｉｄｓ Ｊと訂正する。 （２）明細書第９頁第１０行の’ Ｌｅｕ−Ｊとあるを
’ １ｅｕ−Ｊと訂正する。 （３）明細書第１０頁第９行のｒＣＬａＩ」とあるを’
Ｃ１ａＩ」と訂正する。 （４）明細書第１１頁第１７行の「チヤツプ」とあるを
「チャン」と訂正する。 （５）明細書第１２頁第１行の「（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５株Ｊとあるを’ （
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ ） ＲＭ １
２５株」と訂正する。 （６）明細書第１２頁第１行の’ Ａｒｇ’−Ｊとある
を’ ａｒｇ−Ｊと訂正する。 （７）明細書第１２頁第２行の’ Ｌｅｕ−Ｊとあるを
ｒ Ｉｅｕ Ｊと訂正する。 （８）図面を別紙の通り訂正する。
地図を示すものである。 特許出願人 天野製薬株式会社 Ｎ１図 ５ａｌｔ ＢａｍＨＩ ” ｎ′：ｌｌｉ’手続補正書
く自発） 昭和５９年８月に日 １、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド合成用プロテアーゼの製造法 ３、補正をする考 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 図面 ６、補正の内容 図面を別紙の通り訂正します。 第１図 ５ａＴＩ ＢａｍＨＩ 手続補正書（自発） 昭和６０年１月３１日 特許庁長官 志 賀 学 殿 ■、事件の表示 昭和５９年特許願第１０７１４５号 ２、発明の名称 ペプチド′合成用プロテアーゼの製造法３、補正をする
者 事件との関係 特許出願人 住所 愛知県名古屋市中区錦−下目２番７号５、補正の
対象 明細書の１発明の詳細な説明」の欄及び「図面」 ６、？ｉＭ正の内容 （１〉明細書第４頁第１２行の’ Ａｃ１ｄ」とあるを
「＾ｃｉｄｓ Ｊと訂正する。 （２）明細書第９頁第１０行の’ Ｌｅｕ−Ｊとあるを
’ １ｅｕ−Ｊと訂正する。 （３）明細書第１０頁第９行のｒＣＬａＩ」とあるを’
Ｃ１ａＩ」と訂正する。 （４）明細書第１１頁第１７行の「チヤツプ」とあるを
「チャン」と訂正する。 （５）明細書第１２頁第１行の「（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ ＲＭ １２５株Ｊとあるを’ （
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂ−ｔｉｌｉｓ ） ＲＭ １
２５株」と訂正する。 （６）明細書第１２頁第１行の’ Ａｒｇ’−Ｊとある
を’ ａｒｇ−Ｊと訂正する。 （７）明細書第１２頁第２行の’ Ｌｅｕ−Ｊとあるを
ｒ Ｉｅｕ Ｊと訂正する。 （８）図面を別紙の通り訂正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ バチルス属菌由来のペプチド合成用プロテアーゼ構
造遺伝子を宿主菌へ導入して形質転換を行い、得られた
ペプチド合成用プロテアーゼ生産性形質転換菌株を培養
し、培養物中にペプチド合成用プロテアーゼを生産蓄積
せしめた後、これを採取することを特徴とするペプチド
合成用プロテアーゼの製造法。 ２ バチルス属菌由来のペプチド合成用プロテアーゼ構
造遺伝子が、バチルス・エスピー陽３６ＦＥＲＭ−Ｐ
Ｎａ ４７３６菌由来のものである特許請求の範囲第１
項記載のペプチド合成用プロテアーゼの製造法。 ３ 宿主菌がバチルス属菌である特許請求の範囲第１項
記載のペプチド合成用プロテアーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10714584A JPS60251882A (ja) | 1984-05-25 | 1984-05-25 | ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10714584A JPS60251882A (ja) | 1984-05-25 | 1984-05-25 | ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60251882A true JPS60251882A (ja) | 1985-12-12 |
| JPH0518555B2 JPH0518555B2 (ja) | 1993-03-12 |
Family
ID=14451651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10714584A Granted JPS60251882A (ja) | 1984-05-25 | 1984-05-25 | ペプチド合成用プロテア−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60251882A (ja) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5753074A (en) * | 1980-07-25 | 1982-03-29 | Amp Inc | Terminal mounted on circuit board |
| JPS58162291A (ja) * | 1982-03-23 | 1983-09-26 | Res Dev Corp Of Japan | 耐熱性プロテア−ゼの製造法 |
-
1984
- 1984-05-25 JP JP10714584A patent/JPS60251882A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5753074A (en) * | 1980-07-25 | 1982-03-29 | Amp Inc | Terminal mounted on circuit board |
| JPS58162291A (ja) * | 1982-03-23 | 1983-09-26 | Res Dev Corp Of Japan | 耐熱性プロテア−ゼの製造法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0518555B2 (ja) | 1993-03-12 |
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