JPS6020998B2 - 高活性固定化グルコ−スイソメラ−ゼの効率的製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はグルコースィソメラーゼ水溶液から効率よく高
活性な固定化グルコースイソメラーゼを製造する方法に
関するものである。

より詳しくは、本発明は比表面積が５〆／ク以上、孔径
１００Ａないし２０００Ａのマクロポアーの紬孔容量の
合計が０．２ｃｃ／タ以上、かつアミ／基あるいは鷹換
アミ／基に基づく陰イオン交換容量の合計が２ｍｅｑ／
タ以上で、そのうちジェチルアミノェチル基に基づく陰
イオン交換容量がｌｍｅｑ／？以上であるマクロ多孔型
フェノールホルムアルデヒド系陰イオン交≠剣樹脂を担
体とし、グルコースイソメラーゼ水溶液を上記担体と接
触せしめて酵素的に活性な固定化グルコースィソメラー
ゼを製造する方法において、グルコースィソメラーゼ水
溶液の活性｛Ｃ，（単位，Ｕｎｉｔ／叫）｝、グルコー
スィソメラーゼの比活性｛Ａ，（単位，Ｕｎｉｔノ奴９
‐製白質）｝、グルコースィソメラーゼ水溶液の容量｛
Ｖ，（単位，泌）｝および担体重量｛Ｗ，（単位，の｝
の間の関係がＡＣ≧１００００ かつ Ａ≧２０ かつ ２００００ＺＣＶ／Ｗ≧７０００ であることを特徴とする高活性固定グルコースィソメラ
ーゼの効率的な製造方法に関する。

本発明の目的は工業的にグルコースの連続異性化を行う
場合に高活性で安定、従ってグルコース異性化能力が高
く、しかも取り扱いが容易でカラム操作性が良い固定化
グルコースイソメラーゼを簡単に効率よく得ることにあ
る。

園定イは酵素の工業的使用における有用性のために近年
数多くの酵素固定化技術が開発されている。

これら各固定化技術にはそれぞれ長所と短所があり、一
概にどの方法が優れているとはいえないが、実用的観点
からすれば固定化方法が簡単である程有利である。グル
コースイソメラーゼの固定化方法は、担体結合法のなか
では固定化グルコースイソメラ−ゼを用いた異性化糠シ
ロップの製造において、固定イ携酵素の費用をできるだ
け少なくする必要があるという経済的要請のために、工
業的には特に吸着法に集中してきている。

吸着法によって固定化グルコースイソメラーゼを製造す
るには、まず菌体を種々の方法で破壊してグルコースィ
ソメラーゼを菌体外に溶出させるといういわゆる抽出を
行い、次いでグルコースイソメラーゼ水溶液から菌体破
片を遠心分離や炉過等の手段で分離除去し、得られたグ
ルコースィソメラーゼ水溶液に固定化担体を接触させて
グルコースィソメラーゼを吸着固定化するのが一般的で
ある。

かくして得られた固定化グルコースィソメラーゼを用い
て工業的に異性化糖を生産する場合、固定化グルコース
イソメラーゼが高活性であればある程、少量の固定化グ
ルコースイソメラーゼによって多量の異性化糖を生産す
ることが可能であり、有利である。高活性な固定化グル
コースイソメラーゼを製造するには、さきに菌体外に抽
出したグルコースィソメラーゼを塩折、溶媒沈澱法ある
いはクロマトグラフィー等のなんらかの方法により精製
し、比活性の高いグルコースイソメラーゼとしたうえで
担体と接触させれば良いわけである。しかしながら、精
製工程は通常繁雑であり、結局上記のような酵素精製工
程を経た場合には経済的に不利になることが多い。

かくして比較的簡単に実用的に有利な高活性固定化グル
コースィソメラーゼを得る方法の一つは、比活性の高く
ない粗グルコースイソメラーゼからグルコースイソメラ
ーゼのみを選択的に、しかも大量に吸着する性能を有す
る固定イ＃酵素用迫体を見し、出し、グルコースィソメ
ラーゼの精製と吸着固定化を同時に行えばよい。本発明
者らはこのような実用的観点から新規の優れた固定化担
体を開発してきた。

（例えば特関昭５４−６７０９１号公報）こうした挺体
のうちで米国特許第４１７０６９６号明細書に開示され
ている担体の一つである。比表面積が５め／タ以上でか
つ孔径１００Ａないし２０００Ａのマクロポアーの網孔
容量の合計が０．２ｃｃ／タ以上であり、アミ／基ある
いは置換ァミ／基に基づく陰イオン交換容量の合計が２
ｈｅｑ／タ以上で、そのうちジェチルアミノェチル基に
基づく陰イオン交換容量をｌｍｅｑノタ以上を有するマ
クロ多孔型フェノールホルムアルデヒド系陰イオン交換
樹脂を坦体として、グルコースィソメラーゼの吸着を行
うと、吸着固定化と精製が同時に行われることを見し、
出した。本担体を用いた場合に高情性の固定化グルコー
スィソメラ−ゼの効率のよい製造方法について詳細に検
討した結果、グルコースイソメラーゼの固定化に重要な
影響を与える要因として、（ｉ）グルコースィソメラー
ゼ水溶液の活性，Ｃ，（単位，Ｕｎｉｔ／肌【）（ｉｉ
）グルコースイソメラーゼの比活性−Ａ（単位，Ｕｎｉ
ｔ／雌−蛋白質）（ｉｌｉ） 損体重量Ｗ（単位，夕）
に対するグルコースィソメラーゼ水溶液の容量，Ｖ（単
位，叫）の比，Ｖ／Ｗがあり、高活性のグルコースィソ
メラーゼを効率良く、高い固定化率で上記担体に吸着固
定化するには、比活性凶の低いグルコースィソメラーゼ
の場合には、グルコースイソメラーゼ水溶液を濃縮して
得た濃厚な、即ち単位体積当りの活性（Ｃ｝が高いグル
コースィソメラーゼ水溶液を使うこと、逆に比活性■が
高い場合には、グルコースィソメラ−ゼ水溶液の活性【
Ｃ’はやや低くても良いことが明らかになった。

すなわち上述の条件により固定化酵素童の多い固定化グ
ルコースィソメラーゼが得られることが明らかになって
きた。更にＶ／Ｗはあまり大き過ぎては容積効率が悪い
のみならず、吸着完了までに時間がかかり、逆に小さ過
ぎると溶液の蝿梓ができないこと、また園定イは酵素量
の多い高活性の固定化グルコースィソメラーゼを得るた
めには、担体重童はＷ）当りのグルコースイソメラーゼ
活性の投入量（ＣＶ／Ｗ）にも制限があることなどを見
し、出し本発明を完成した。次に本発明を詳細に説明す
る。本発明において固定化グルコースィソメラーゼを製
造するには、まず公知の方法でグルコースイソメラーゼ
含有菌体からグルコースィソメラーゼを抽出し、菌体破
片を溶出したグルコースイソメラーゼを含むスラリーと
する。

次いでこのスラリーから炉過あるし、は遠心分離等の手
段により菌体破片を除去し、粗グルコースイソメラーゼ
水溶液を得る。

この粗グルコースィソメラーゼ水溶液を通常は濃縮し、
ある濃度以上の高活性な粗グルコースィソメラーゼ水溶
液を調製する。このグルコースィソメラ−ゼ水溶液にイ
オン交換基の一成分として、ジェチルアミノェチル基を
ｌｍｅｑ／タ以上含有するマクロ多孔型フェノールホル
ムアルデヒド系陰イオン交宅剣樹脂、即ち本発明におけ
る担体を添加し、必要に応じて鍵拝しながら十分に接触
させるとグルコースイソメラーゼが効率的に該担体に吸
着固定化される。該迫体はグルコースイソメラーゼに対
する選択吸着能力が高いから接触条件を選べば高活性な
固定化グルコースィソメラーゼが得られるわけである。
吸着固定化後は水あるいは適当な濃度の緩衝液で洗浄し
、単に付着しているだけの雑蛋白質等を除去した方が望
ましい。得られた固定化グルコースィソメラーゼを所望
による適当な含水量まで乾燥することも可能である。本
発明において使用するグルコースィソメラ−ゼ含有菌体
の起源は大して重要でなく、任意のものが使用可能であ
る。

しかし、ストレプトマィセス属起源のものが工業的には
好んで使用される。グルコースィソメラ−ゼ含有菌体は
培養後、培養液から一担分離した後、特に処理せず懸濁
液としても良いし、また凍結或いは熱処理等を行ったも
のを懸濁液として用いても良い。菌体懸濁液から何らか
の方法、例えば高圧差法によりグルコースイソメラーゼ
を抽出する場合、抽出効率は菌体懸濁液の濃度の影響を
受けるから、その濃度を知っておくことは重要である。
菌体の破砕によるグルコースィソメラーゼの抽出は超音
波法、摩砕法、凍結融解法、自己消化法、高圧差法およ
びリゾチーム等の溶菌酵素添加法等公知の任意の方法の
いずれもが適用できる。抽出の際の懸濁液のｐＨは通常
軸６ないしｐＨＩＯで、好ましくはｐＨ７．０なし、し
ＰＨ９．０に保持し、１０℃ないし６０℃程度の温度で
抽出を行うのがよい。また、懸濁液に１×１０‐４岬濃
度ないし５×１０‐キ濃度程度のマグネシウムイオンを
添加することは酵素の安定性および活性の回収率の点か
ら好ましいことである。グルコースイソメラーゼは比較
的高価であるから抽出はできるだけ完全に行い、菌体懸
濁液の活性の９０％以上、好ましくは１００％に達する
まで行うべきである。

高圧差法では抽出条件を選べば１００％以上の活性が抽
出、取得されることが見し、出されている（特開昭５４
−１５４５９４号公報）。これは菌体の比較的内部に存
在し、菌体懸濁液の活性測定時には測定にかからないグ
ルコースィソメラーゼが抽出されるためであろうと考え
られる。この様にできるだけ完全な抽出を行うことは経
済的に有利と考えられるが、他に大きな問題点が存在す
る。それは抽出のために破砕した際に生じた小さな菌体
破片の存在の為に菌体残湾の分離が困難なことである。
そしてこの困難さは菌体破砕をより完全にして、グルコ
ースィソメラーゼの抽出率を高める程増大する額向があ
る。この困難さのために通常はグルコースィソメラーゼ
の活性の回収率を犠牲にし、８０％あるいはそれ以下の
抽出率の時点で抽出を終了するか、あるいは菌体残笹を
分離せずスラリーのまま固定する方法が提案されている
。しかしながらスラリー中には、リポボリサツカライド
あるいはリポプロティンと考えられる吸着固定化を妨害
する物質も同時に含まれている。この為であろうが菌体
残笹を分離せず、スラリ−と担体を薮触ごせて吸着固定
化する場合には、乾燥担体１夕当り７０００Ｕｎｉｔ程
度以上のグルコースイソメラーゼを固定化したものは殆
んど見うけられず、本発明において使用している様なグ
ルコースィソメラーゼを特異的に吸着する担体を用いた
場合においてさえも高活性グルコースィソメラーゼを高
収率で得ることは極度に困難である。かくして高活性固
定化グルコースィソメラーゼを製造するためには、菌体
残澄の分離が必要であると思われる。

菌体残総の炉過・分離にあたり菌体残澄を含むスラリ−
をできるだけ容易に、しかも活性の回収率を高く炉過す
る方法を本発明者らは別途に見し、出している。この点
を簡単に述べると主鎖に４級アンモニウム塩を一成分と
して含有するポリアミドであって、たとえばスミレーズ
レジン■という商標で紙用湿潤強度向上剤として市販さ
れているカチオン性ポリマ−スラリ−に０．１ないし０
．３５％程度添加し、スラリーを処理後炉過すると通常
の炉過に要する時間の１／３なし、し１／１の睦度の短
い時間で炉過できる。

しかもスラリーの全活性に対する活性回収率は、通常９
０％以上であり、上記のカチオン性ポリマー処理を行わ
ずに炉過した場合よりも炉液中の活性回収率は高い。こ
れは上記カチオン性ポリマーを使用した場合には、炉液
の水切れがことのほか良く、炉溝と共に失われるグルコ
ースイソメラーゼが少くなるためである。また、スラリ
−を上記カチオン性ポリマー処理することのもう一つの
好ましい点は、グルコースィソメラーゼの比活性凶が最
大１．７倍程度まで上昇することである。かくして得ら
れたグルコースィソメラーゼ水溶液は、必要に応じて濃
縮して本発明において使用する担体に吸着固定化し、高
活性な固定化グルコースイソメラーゼを得ることができ
る。

しかしながら本発明においては、スラリーを上記カチオ
ン性ポリマーで処理して得られたグルコースィソメラー
ゼ水溶液を使用することは何ら必須でなく、菌体残澄を
容易に分離する一方法として例示しただけであることを
明確にしておく。グルコースイソメラーゼ水溶液が所定
の条件さえ満たせば、いかなる方法によって得られたも
のであろうと全く問題ない。経済的に有利に高活性グル
コースイソメラーゼを得る方法の一つは、グルコースイ
ソメラーゼを選択的に吸着する能力の大きい担体を使用
することである。

しかし担体さえよければ常に高活性固定化グルコースィ
ソメラーゼが効率よく、すなわち高い固定イＧ率で得ら
れるわけではない。吸着されるグルコースイソメラーゼ
と担体がある条件を満たすべきであることが鋭意研究の
結果、明確になってきた。固定化グルコースィソメラー
ゼを実際に製造する場合には、損体と接触させたグルコ
ースィソメラーゼの活性（投入活性）が殆んど全て吸着
固定化されてしまうこと、すなわち活性固定イゼ率が高
いことが経済的に重要である。

単に高活性の固定化グルコースィソメラーゼを製造する
だけであるならば活性間定イｂ率を考慮せず、投入活性
さえ大きくすればよい。

しかし活性固定イり率をも高くするためには、担体と接
触されるグルコースイソメラーゼ水溶液の活性、Ｃ，（
単位，Ｕｎｉｔ／凧【）のみならず、グルコースイソメ
ラーゼの比活性Ａ，（単位，Ｕｎｉｔ／功９・蛋白質）
もまた重要な役割をはたす。すなわち、ＡＣＺＩＯＯＯ
ＯかつＡＺ２０なる値を満たすことが必要である。ＡＣ
＝１００００の場合、乾燥時の単位担体重量当りの活性
投入量（ＣＶ／Ｗ）を７０００Ｕｎｉｔ／夕ないし１０
０００Ｕｎｉｔ／夕とすると約８０％以上の活性固定化
率で吸着される。

逆にこの条件が満たされないときは、参考例に見る如く
活性固定イゼ率‘ま非常に低くなり、酵素はムダに使わ
れる。菌体を破砕しただけで菌体銭笹を分離しないスラ
リーの場合、ＡＺ２０になることは殆んどありえず、こ
の条件からも菌体銭笹の分離による粗酵素液の調製が必
要となる。固定化に際して乾燥状態基準の坦体重量Ｗ（
単位，夕）に対するグルコースィソメラーゼ水溶液の容
量Ｖ（単位，の【）の比はあまり４・さすぎても縄梓が
うまく行かず、またあまり大き過ぎても容積効率が悪く
なり、大きな容器がいるだけで何ら有利な点はない。結
局３≦Ｖ／Ｗ≦６０であれば良く、更に好ましくは５≦
Ｖ／Ｗ≦２０であり、実際にはこの程度の値が適当であ
る。グルコースィソメラーゼに対する吸着性能の高い担
体を用いて、高活性の固定化グルコースィソメラーゼを
製造するという本発明の趣旨に照して、あまり低活性の
グルコースィソメラーゼを固定化しても意味がないし、
本発明の担体の長所を生かしていることにもならない。

一方、あまり高活性のグルコースィソメラーゼを固定化
すると、異性化糖の生産性が固定化されたグルコースィ
ソメラーゼ活性に比例して増大しなくなってしまう。結
局７０００≦ＣＶ／Ｗ≦２００００であれば良い。高活
性グルコースイソメラーゼが得られ、しかも異性化糖の
生産性が固定イは酵素量にほぼ比例し、かつ活性固定化
率が十分高い範囲として１０皿ＯＳＣＶ／Ｗ≦１６００
０で、かつＡＣＺ３００００であればより好ましい。こ
の場合活性固定イＧ率‘まほぼ９０％程度になる。更に
好ましくはｌｏｏ００ミＣＶ／ＷＳ１６０００で、かつ
ＡＣ≧５００００であることである。この場合は、投入
酵素は９５％以上固定化され、ムダがない。担体と接触
させられたグルコースィソメラーゼの活性圏定イＧ率‘
ま投入酵素活性が一定の場合、Ａ値が高い程高くなり、
またＣ値が高い程高くなる。

比活性Ａ値は菌体活性１５００Ｕｎｉｔ／夕−凍結菌体
以上であれば４０Ｕｎｉｔ／奴‐蛋白質程度を容易に得
られるが、それち久上の非常に高い比活性値Ａは特別な
精製工程を経ることないこは得ることはむつかしい。一
方、Ｃ値の方は減圧蒸発あるいは膜処理等の公知の濃縮
技術によって容易に１０００Ｕｎｉｔ／私以上にできる
し、濃縮工程における活性の損失なしに２０００Ｕｎｉ
ｔ／の‘以上に濃縮することはそれほど困難ではない。

濃縮技術がいずれのものであれ、餌が軸６ないしｐＨＩ
Ｏで温度が６５℃以下で濃縮を行えば失活は殆んど起ら
ない。従って、ＡＣ≧ｌｏｏ０止 Ｚ３００００あるい
はＺ５００００なる条件は主としてグルコースィソメラ
ーゼ水溶液の濃縮即ち、Ｃ値を高めることによって達成
するのが実際的である。かくして得られたグルコースィ
ソメラーゼ水溶液に固定化坦体を接触せしめ、必要に応
じて燈拝しながら吸着固定を行う。吸着固定化条件はｐ
Ｈ６からｐＨＩ０で、温度は０から７ぴ○、より好まし
くはｐＨ７からｐＨ８．５で、温度４ぴ○から６５℃で
ある。吸着固定化に要する時間は温度によって異なるが
、通常１時間ないし２Ｇ時間である。実際に好ましい温
度である４０℃から６５℃では２時間ないし６時間程度
で十分である。

固定化時のイオン強度は０．０１ないし０．１程度が好
ましい。バッチ法でもカラム法でも固定化できるが、一
般にバッチ法の方が好ましい。本発明において使用され
るマクロ多孔型フェ／ールホルムアルデヒド系陰イオン
交換樹脂は先に述べた様に比表面積が５〆／タ以上で、
かつ孔径１００Ａないし２０００Ａのマクロポアーの紬
孔容量の合計が０．２ｃｃ／タ以上であり、ジヱチルア
ミノェチル基に基づく陰イオン交換容量がｌｍｃｑ／？
以上で、かつアミ／基あるいは／および置換アミ／基に
基づく陰イオン交換容量の合計が２ｈｅｑ／タ以上であ
るという特性を有していればいかなる方法で製造された
ものでもよい。

本発明の具体的説明に際して使用した担体は、市販のフ
ェノールホルムアルデヒド重縮合物を樹脂母液とするマ
クロ多孔型陰イオン交ｆ鰯樹脂にジヱチルアミノェチル
基をｌｍｅｑノタ以上付与したものであり、その製造法
は袴関昭弘一１１９０８４号公報あるいは米国特許第４
１７０６９６号明細書に開示されている。しかし、他の
公知の方法によって製造したものでもよい。形状はグラ
ニュー状あるいはまれにはビーズ状であって、その大き
さはおよそ１２メッシュ（１４１０ｒ）からおよそ６０
メッシュ（２５０ム）程度が使用しやすい。より好まし
くは２０メッシュ（８４０山）から６０メッシュ程度で
ある。粒子があまり大きいと空隙体積が大きくなり、体
積当りの活性は小さくなる。一方、あまり細かい粒子で
は圧損が大きくなり過ぎて好ましくない。なお、本発明
における上記迫体のグルコースイソメラーゼに対する選
択的吸着性能は次の実験結果からも明らかである。

（ｉ）活性Ｃ＝６５０Ｕｎｉｔ／凧【であるグルコース
ィソメラーゼ水溶液Ｖ＝６７の【に、本発明における担
体特性を有する樹脂Ｗ＝３．１夕（乾燥状態）を浸簿し
、固定化グルコースィソメラーゼを製造した。

グルコースィソメラーゼの投入活性（ＣＶ／Ｗ）は担体
１夕当りの表示で１４０００Ｕｎｉｔ／夕、投入蛋白質
量は担体１夕当りの表示で３００の９一蛋白質ノタ、従
って比活性Ａ＝４６．７Ｕｎｉｔ／雌一蛋白質であった
。

固定化された活性は１２６００Ｕｎｉｔ／夕で、活性の
固定化率は９０％であつた。

一方、固定化された蛋白質は９１の９−蛋白質／夕で、
蛋白質の固定化率は３０％であった。

（ｉｉ） Ｃ＝８６０Ｕｎｉｔ／泌、Ｖ＝３７．５の【
なるグルコースイソメラ−ゼ水溶液に本発明における特
性を有する迫体、Ｗ＝２．８夕を浸潰して固定化した。
この場合の投入活性ＣＶ／Ｗ＝１１．５００Ｕｎｉｔ／
夕、投入蛋白質量は３８２岬一蛋白質／夕、従ってＡ＝
３０Ｕｎｉｔ／奴−蛋白質であった。

固定化された活性は１０２００Ｕｎｉｔ／夕で、活性の
固定率は８９％、一方、固定化された蛋白質は１４５雌
‐蛋白質／夕で、蛋白質の固定化率は斑％であった。

以上詳細に群明した様に本発明の方法によって高活性な
固定化グルコ−スイソメラーゼを効率的に製造すること
ができる。

次に実施例により本発明を更に詳細に説明するが、その
趣旨を越えない限り以下の実施例によって限定されるも
のではない。

本発明におけるグルコースィソメラーゼの活性、蛋白質
含量および担体と固定化グルコースィソメラーゼの乾燥
重量は次の方法で求めたものである。

‘１１溶液状グルコースイソメラーゼの活性測定グルコ
ースイソメラーゼ水溶液に０．１Ｍ濃度のＤ−グルコー
スと０．０９Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液と０．００９け濃
度のＭｇＳ０４・７４０を加え、ｐＨ７．５に保ちなが
ら７び０で１時間反応させて生成したフラクトースの量
を測定する。

活性の単位はＵｎｉｔで表現し、上記条件でフラクトー
ス１のｐを生成する酵素量をＩＵｎｉｔとする。■ 固
定化グルコースィソメラーゼの活性測定（本明細書にお
いてこれを実測活性と称する。

）０．００９Ｍ濃度のＭｇＳＱ・７日２０を含み、０．
０８Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液によってｐＨ７．５に保た
れている２Ｍ濃度のＤ−グルコ−ス溶液に３０雌ないし
８０池程度の固定化グルコースイソメラーゼを添加し、
６０℃で３０分間、振幅３５仇のしシプロカル振函を１
０比ｐｍで続けながら反応を行わせる。反応後、０．８
い濃度のＨＣＺＱで反応を停止せしめ、生成フラクトー
ス量を定量する。上記条件で１分間に１ムｍｏｌｅのフ
ラクトースを生成する固定化酵素量を１１ＧＩＵとし、
乾燥重量１夕当りの単位で表示（ＩＧｍ／ＩＭＧＩ）す
る。‘３’フラクトース量の測定フラクトース量は４ぴ
０でシステイン−カルバゾールー硫酸法により、３０分
後に５６Ｍ帆の吸収強度により定量する。

この条件では混在するグルコースの発色率は、フラクト
−スの約２００分の１であり、グルコースによる発色は
無視できる。‘４｝ 蛋白質量の測定 生イｂ学実験講座５巻２刀頁を参考にし、ローレィ（山
ｗｒｙ）法によって蛋白質量を測定する。

なお検童線は結晶ウシ血清アルブミン（２５０仏夕／泌
溶液）を用いて作成した。■ 損体と固定化グルコース
イソメラーゼの乾燥重量の測定適当量の担体または固定
化グルコ−スイソメラーゼを２柳程度以下の厚さに広げ
、５０ｑｏで８時間減圧（５側Ｈｇ以下）乾燥する。

その後、担体または固定化グルコースイソメラーゼを１
．印時間以上室溢（１蝋０なし、し２６０）のデシケー
ター中に放置した後重量測定を行い、更に恒量に達して
いるのを確認した後その重量を乾燥重量とする。本明細
書に記載されている担体および固定化グルコースィソメ
ラーゼの重量は全て本法で測定した乾燥重量である。実
施例 １ グルコースイソメラーゼ「ナガセ」（８００Ｕｎｉｔ／
夕、ストレプトマイセス・フェオクロモゲネス起源、長
瀬生化学工業製、凍結菌体）２１０夕を０．別Ｍ濃度の
Ｍ簿０４・７日２０を含む餌７．５の８ｈＭリン酸塩緩
衝液３のこ懸濁させ、ゴーリンホモジナイザ−により函
体を破砕し、グルコースイソメラーゼを抽出した。

このスラリーに主鏡に４級アミノ基を有するポリアミド
であるスミレーズレジン■６５ｏ（住友イヒ学工業■製
）をスラリーの０．３％濃度だけ添加し、縄梓後、遠心
分離により菌体残澄を除去し、粗グルコースィソメラー
ゼ水溶液を得た。活性６７Ｕｎｉｔ／泌、比活‘性３１
Ｕｎｉｔ／の９−蛋白質。この水溶液を減圧濃縮し、活
性１０３０Ｕｎｉｔ／泌、比活性３１Ｕｎｉｔ／雌−蛋
白質のグルコースィソメラーゼ水溶液を調製した。この
溶液３０の‘に粒子径が２５０山ないし８４０〆で、比
表面積が３２．５〆／夕、孔径１００Ａから２０００Ａ
までのマクロポアーの紬孔容量の合計が０．５４ｃｃ／
夕でアミノ基および置換アミノ基に基づく全陰イオン交
換容量が６．７４ｍｅｑ／夕、かつジェチルアミノェチ
ル基に基づく陰イオン交換容量が１．８位ｈｅｑ／夕で
あるマクロ多孔型フェノールホルムアルデヒド系陰イオ
ン交換樹脂（市販のデュオラィト■Ａ−７（ダイヤモン
ドシャムロック社製）樹脂にジェチルアミノヱチル基を
化学的に結合したもの）３夕を添加、浸潰し、温度を約
５０℃に保ちながら５時間１８比ｐｍで回転鷹拝しなが
ら吸着固定化を行った。

固定化後０．１Ｍ濃度のリン酸塩緩衝液、ついで水で洗
液中に酵素活性が全く見し、出されなくなるまで洗浄し
た。固定イ○酵素量は固定化されずに洗液中に流出した
活性から１００００Ｕｎｉｔ／夕−担体と算出された活
性固定化率は９７．１％であった。この固定化グルコー
スィソメラーゼの実測活性は６２０１０ｍ／夕−ＩＭＧ
Ｉであった。連続カラム反応の生産性 本固定化グルコースィソメラーゼを外套管付きカラム（
内径１２胸×長さ９仇舷）に充填し、カラム温度を６０
℃に保ちながら８ｈＭ濃度のＭぶ０４・７伍○を含む乳
の濃度の工業用精製グルコース溶液（Ｎａ２Ｃ０３でｐ
Ｈ７．５に調節し、Ｃｏ＋＋イオンは含まない）をカラ
ムに通液し「グルコースの連続異性化反応を行った。

流速は上記グルコース溶液のグルコースの４３％をフラ
クトースに転換するのに必要な流速に制御した。初期流
速は空間速度ＳＶ＝３桝ｒ‐１であった。

フラクトースへの転換率４３％（以後ＦＥ＝４３と記述
する）を常に保ちながら流速が初期流速の１′２になっ
た時を半減期とすると半減期は２５日であった。ＦＥ＝
４３を保持した状態で流速が初期流速の１／４の値にな
るまでに処理された糖固形分を生産性・ＲＡＩ／４で表
わすと固定化グルコースィソメラーゼ１夕当り３９９０
夕であった。即ち、生産性・ＲＡＩ／４＝３９９０夕／
夕。実施例 ２ グルコースイソメラーゼ「ナガセ」 （１６００Ｕｎｉｔ／夕、以下実施例１と同じ）３５０
夕を０．２ｈＭ濃度のＭが０４・７日２０を含むＰＨ７
．５の８ｈＭ濃度のリン酸塩緩衝液４．６５のこ懸濁さ
せ実施例１と同様の操作により、粗グルコースイソメラ
ーゼ溶液を得た。

活性は１３０Ｕｎｉｔ／私、比活性は５９Ｕｎｉｔ／の
９−蛋白質である。この溶液を減圧濃縮し、活性１６０
０Ｕｎｉｔ／の‘、比活性６０Ｕｎｉｔ／地−蛋白質な
る溶液を得た。この濃縮グルコースイソメラーゼ溶液２
５の‘に市販デュオラィト■Ａ−７にジェチルアミノェ
チル基をイＧ学結合した樹脂（比表面積が３５〆／夕、
孔径１００人ないし２０００Ａのマクロポアーの紬孔容
量の合計が０．鼠ｃｃ／夕、全陰イオン交ｆ製容量が８
１０ｈｅｑノタで、そのうちジェチルアミノヱチル基に
基づく陰イオン交換容量が２．７伍ｈｅｑ／の ３夕を
添加し、実施例１と同様の操作により固定化グルコース
ィソメラーゼを得た。固定化された活性塁は１３３００
Ｕｎｉｔ／夕で、活性固定化率は実質的に１００％であ
り、実測活性は９００１ＧｍノターＩＭＧＩであった。
カラム連続凪反応の生産性 本固定イＱ酵素を外套管付きカラムに充填し実施例１で
用いたのと同じＸＭ濃度の工業用グルコース溶液を基質
とし、ＦＥ＝４３に保ちながら連続異性化反応を行った
。

初期流速はＳＶ＝４．抽ｒ‐１で半減期は２６日、生産
性ＲＡＩ／４＝４９２０タノタであった。なお、流速は
初期の１／４に低下してもまたＳＶ＝１．１ｈｒ‐１で
あるから更に連続反応を継続することが可能である。実
施例 ３グルコースイソメラーゼ「ゴード−ＡＧＩ」（
１斑ＯＵｎｉｔノタ、ストレプトマイセス属起源合同酒
精製、凍結菌体）３６０夕を実施例１と同一組成の緩衝
液６Ｚに懸濁し、実施例１と同様の操作により糠グルコ
ースイソメラ−ゼ溶液を得た。

活性は８６Ｕｎｉｔ／似、比活性は４１Ｕｎｉｔ／敬一
蛋白質であった。この溶液を減圧濃縮し、濃縮液を淀過
すると活性が１２８０Ｕｎｉｔ／凧【で比活性４７Ｕｎ
ｉｔ／泌なるグルコースイソメラーゼ溶液を得た。この
濃縮溶液１００私にデユオライト■Ａ−７にジエチルア
ミ／エチル基をイヒ学績合した樹脂（比表面積と細孔容
量の合計は実験誤畠葦内で実施例と同じ値。全陰イオン
交換容量７．１８ｍｅｑ／夕で、そのうちジェチルアミ
ノェチル基に基づく陰イオン交換容量が２．０仇ｈｅｑ
／の１１夕を添加し、実施例１と同様の操作により固定
化グルコースィソメラーゼを製造した。固定化された活
性量は１１３００Ｕｎｉｔノタで、活性固定化率は９７
．２％、実測活性は７１０１ＧＩＵ／夕−山ＭＧＩであ
った。カラム連続反応の生産性 本固定イは酵素を１２の‘を外套管付きカラム（内蓬１
５凧、長さ１仇舷）に充填し、実施例１で用いたのち同
じグルコース溶液を基質とし、ＦＥ＝４３に保ちながら
連続異性化反応を行った。

半減期は２０日で生産性・ＲＡＩ／４は４１８０夕／夕
であった。実施例 ４実施例３と同じ菌体４２０夕を実
施例１と同一組成の緩衝液６クに懸濁し、ゴーリンホモ
ジナィザ一により菌体を破砕し、グルコースィソメラー
ゼを抽出した。

このスラリーに何も添加することなく３００のによる遠
心分離により菌体残溝を除去し、粗グルコースィソメラ
ーゼ水溶液を得た。活性は９５Ｕｎｉｔ／泌、比活性は
２８Ｕｎｉｔ／奴一蛋白質であった。この溶液を減圧濃
縮し、濃縮中に現われた不溶分を炉過すると活性６４０
Ｕｎｉｔ／の【で比活性が３１Ｕｎｉｔ／雌一蛋白質な
るグルコースイソメラーゼ水溶液が得られた。この水溶
液１００の‘にデュオラィト■Ａ−４にジヱチルアミノ
ェチル基を化学結合した樹脂（比表面積が６９〆／夕、
孔径１００人ないし２０００Ａのマクロポアーの細孔容
量の合計が０．５７ｃｃ／夕で全陰イオン交換容量が４
．８３ｈｅｑ／夕、そのうちジェチルアミノェチル基に
基づく陰イオン交換容量が１．２８ｈｅｑ／夕）６夕を
添加し、実施例１と同様の操作により固定化グルコース
ィソメラーゼを製造した。固定化された活性量は９１０
０山ｎｉｔ／夕で、活性固定化率は８５％であった。固
定化酵素の実測活性は５５０１０１Ｕ／夕−ＭＧＩであ
った。実施例５なし、し８および参考例以下の実施例に
おいては挺体と接触させ、固定化せしめたグルコースィ
ソメラーゼ水溶液の活性、比活性、単位担体重量当りの
活性投入量および活性固定量、活性固定率、実測活性等
を表にして示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 比表面積が５ｍ＾２／ｇ以上、孔径１００Åないし
   ２０００Åのマクロポアーの細孔容量の合計が０．２ｃ
   ｃ／ｇ以上、かつアミノ基あるいは置換アミノ基に基づ
   く陰イオン交換容量の合計が２ｍｅｑ／ｇ以上で、その
   うちジエチルアミノエチル基に基づく陰イオン交換容量
   が１ｍｅｑ／ｇ以上であるマクロ多孔型フエノールホル
   ムアルデヒド系陰イオン交換樹脂を担体とし、グルコー
   スイソメラーゼ水溶液を上記担体と接触せしめて酵素的
   に活性な固定化グルコースイソメラーゼを製造する方法
   において、グルコースイソメラーゼ水溶液の活性｛Ｃ，
   単位，Ｕｎｉｔ／ｍｌ）｝、グルコースイソメラーゼの
   比活性｛Ａ，（単位，Ｕｎｉｔ／ｍｇ−蛋白質）｝、グ
   ルコースイソメラーゼ水溶液の容量｛Ｖ，（単位，ｍｌ
   ）｝および担体重量｛Ｗ，（単位，ｇ）の間の関係が
   ＡＣ≧１００００ かつ Ａ≧２０ かつ ２００００≧ＣＶ／Ｗ≦７０００ であることを特徴とする高活性固定グルコースイソメラ
   ーゼの効率的な製造方法。 ２ ＡＣ≧３００００ かつ １６０００≧ＣＶ／Ｗ≧１００００ である特許請求の範囲第１項記載の製造方法。 ３ ＡＣ≧５００００ である特許請求の範囲第１項又は第２項記載の製造方法
   。 ４ ＡＣ≧１００００、３００００および５００００な
   る条件を、グルコースイソメラーゼ水溶液の濃縮により
   活性Ｃを高めることによつて達成する特許請求の範囲第
   １項，第２項又は第３項記載の製造方法。 ５ ６０≧Ｖ／Ｗ≧３ である特許請求の範囲第１項，第２項又は第３項記載の
   製造方法。 ６ ２０≧Ｖ／Ｗ≧３ である特許請求の範囲第１項，第２項又は第３項記載の
   製造方法。