JPS60209567A - 過酸化水素測定用組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 ＋１）　発明の分野 本発明は、酸化性物質（オキシダント）特に過酸化水素
との接触によって光学的信号を生ずる光学的指示薬化合
物に関し、その製造及び使用方法に関する。特に、本発
明は、過酸化水素に対する螢光原性指示薬並びに診断用
棲査法などの、測定されるべき分析対象物に反応して起
きる過酸化水素の生成及び検出に基づく分析方法中にお
けるその使用に関する。

（２）先行技術の説明 多くの分析方法において、最終的検出物質として酸化性
物質を測定することが必要とされている。測定される被
分析物は、それ自体がそのようなオキシダントであるか
又は、分析対象物が、測定可能なオキシダントを生成す
るかもしくは分壊する化学的、生化学的、免疫学的ある
いは類似の反応に関与している。これらのオキシダント
には、過酸化水素、オゾン、過ヨウ素酸塩、過酸及び超
酸化物（５ｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　）がある０特に、酸化
性酵素の活性は、臨床診断方法におけるその有用性の故
に、分析化学及び生化学において重要である。より一般
に研究されている酸化性酵素の中に、グルコースオキシ
ダーゼ、キサンチンオキシダーゼ及びコレステロールオ
キシダーゼ等の、過酸化水素を生ずるオキシダーゼがあ
る。

一般に、そのような酵素がそれらの基質に作用すること
によって生じる過酸化水素は、通常、′ルオキシダーゼ
の存在下、様々な種類の光学的指示薬との酸化還元反応
によって測定される。過酸化水素を測定する為の最も感
度の良い手段の一つは、過酸化水素とのペルオキシダー
ゼに触媒された反応により螢光性を有する生成物を生じ
る螢光原性のペルオキシダーゼ基質の使用によるもので
ある。

文献においては、螢光原性のペルオキシダーゼ基質の例
は比較的少い。文献中に報告されたそのような指示薬の
中には、ホモバニリン酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸、４−アミノ−ＩＨ−１，５−ペンシ
ソアゼピン−＋３−カルボニトリル及びソアセチルソク
ロロフルオレセイン（Ｋ、財津及ヒＹ、大倉によるｒＡ
ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　１０９：１０９（１９
８０）　。

千イチ、コロディ（Ｈ，Ｃｏｒｒｏｄｉ　）及びビー、
パイティニス（Ｂ、　Ｗｅｉｄｉｎｉｕｓ　）による［
、Ａｃｔａ　Ｃｈｅｍ、５ｃａｎｄ　Ｊ１９：１８５４
（１９６５）、　ワイ、オカモト（Ｙ。

Ｏｋａｍｏｔｏ　）等によるｒｃｈｅｍ、　Ｐｈａｒｍ
、　Ｂｕｌｌ、Ｊ　２８　：２３２５（１９８０）、エ
イ、ニス、ケストン（Ａ、Ｓ。

Ｋｅｓｔｏｎ　）及びアール、プラント（Ｒ，Ｂｒａｎ
ｄｔ　）　によるｒＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ　
１１　：　１　（１９６５）及び米国特許第４，２６９
，９３８号〕がある。過酸化水素の螢光分析法による測
定は、酸化されて非螢元性生成物になる螢光性化合物６
−メドキシー７−ヒドロキシー１，２−ベンゾピロンを
用いること　（、Ｗ、Ａ。

Ａｎｄｒｅａｅ、　ｒＮａｔｕｒｅＪ　１７５　：　８
５９　（１９５５）　’）によυ、そして水素供与体と
０−アルキル化−７′−ヒドロキシクマリン類との間の
カップリング反応を利用すること、〔欧州特許出願第８
２１０１９４７号〕によっても達成されてきた。

出願者らによって出願中の米国特許出願第４’／ｂ、Ｚ
（ＪＵ（１９１１牛３月１４■１〕に、Ｊ［化水素など
のオキシダントに反応する光学的指示薬のカルコゲン（
セレン化物又は硫化物）化合物に関している。酸化によ
シ、その結果化じる中間体は、同時に、カルコダン残基
の脱離を起こし、螢光性などの光学的信号を生じる信号
化合物を生じる。好ましい指示薬は、３−カルコゲン−
３゜４−ジヒドロクマリン類及び３−カルコゲン−３゜
４−ジヒドロ−２−キノロン類である。

〔発明の概要〕

本発明は、過酸化水素に対して反応する、新規な一群の
螢光原性指示薬化合物を提供するものである。好ましく
はペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存在下、過
酸化水素による酸化により、本発明の実質的に非螢元性
の化合物は、強い螢光性を有する反応生成物を生じる。

従って、本発明は、過酸化水素の検出用、及び対象とな
る被分析物の存在による機能として、過酸化水素が生成
もしくは消費される分析法用の高感匿の指示薬を提供す
る。

本発明による化合物は、王として、一般式〔式中、Ｒ１
は水素原子、アルキル、アルケニル、アリール又は電子
吸引基を表わし；Ｒ２はヒドロキシル又は−ＮＲ３Ｒ’
　（この時　Ｒ３及びＲ４は、同一であっても異ってい
てもよ＜、昶４艮子、アルキル、アルケニル、又ハアリ
ールを示す）を衣わし；そして、Ｙは＝０又は＝Ｎ−Ｒ
５（この時、Ｒ５に水素原子又は低級アルキルを示す）
を衣わす〕 によって示される３、４−ジヒドロキシロン類及び３，
４−ジヒドロクマリン類である。

過酸化活性物質の存在下、過酸化水素による酸化により
、３−位と４−位の間に二重結合が生じ、螢光性のある
生成物を生じる。二重結合が導入される過程は、図面の
第１図に書かれた一連の段階に従って起こると信じられ
る。

第１の段階は、７−位のへテロ原子（Ｒ２置撲基）の最
初の酸化によりラソカルカチオン（ｒａｄｉｃａｌｃａ
ｔｉｏｎ　）を生じる段階（Ａ□）であシ、ベンジル性
水素原子（ｂｅｎｚｙｌｉｃ　ｈｙｄｒｏｇｅｎ　ａｔ
ｏｍ）　ｆ失って脱水素化芳香族中間体を生じる段階（
Ａ２）が続くと思われる。次に、３−位の陽子が失われ
て二重結合を導入し、螢光性のあるキノロン類及びクマ
リン類（式中、Ｒ”、Ｒ２及びＹは上記と同様である。

）を生じる。。

特に好ましい指示薬化合物は、式（２）においてＲ２が
−ＮＲ３Ｒ’でアシ（この時Ｒ３及びＲ４は両方とも低
級アルキルであって、同一であっても異っていてもよく
、好ましくは両方ともメチルである）かつ、Ｙが＝Ｎ−
Ｒ５である（この時、Ｒ５１は水素原子又は低級アルキ
ルである）７−ジアルキルアミノ銹導体類でおる。その
ような好ましい化合物には、図面の第２図において示さ
れている第２の酸化が起きると思われる。過酸化水素に
よる酸化によって生成する７−ソアルキルアミノーキノ
ロン及び−クマリン生成物（０扛、７位のへテロ原子（
Ｒ２ｆｆｉｌ基）において、二度−目に酸化し、ラソカ
ルカチ、＋ｔ　：ｙ　（ｒａｄｉｃａｌ　ｃａｔｉｏｎ
　）を生じ（Ｃ１）、　次に、窒素原子に隣接する水素
原子を失って中間的インモニワムイオンを生成する（Ｃ
２）。次に、加水分解によシ新しい種類のモノアルキル
アミノ螢光踵を生じる（Ｃ３）が、これは、ジアルキル
アミノ体よシはるかに螢光性が強いことが見出された。

本発明の新しい螢光原性指示系化合物には、特別に有利
な特徴がある。本発明の指示薬化合物は本質的に非螢元
性であシ、ペルオキシダーゼなどの過酸化活性物質の存
在下、過酸化水素と速やかに反応し、ペルオキシダーゼ
単独では反応性を持たず、蛋白質の結合によって阻害さ
れない。酸化によって生じる信号化合物は非常に螢光性
が強く、背景となる蛋白質の蛍光性の波長を超える励起
及び発光波長（例えば、３９０　ｎｍ　よシ長い波長）
を有し、妨害副産物を生成せず、過酸化水素及び過酸化
活性物質の存在下安定であシ、そして、妨害蛋白質結合
を示さない。

〔好適な実施態様の説明〕

本明細書中の使用においては、「アルキル」は、結合点
に１個以上の水素原子又は１個以上の炭素もしくはヘテ
ロ猿原子（例えは、窒素、酸素又は硫黄）と単結合によ
シ結合している炭素原子を有する脂肪族及び環式有機化
合物残基を含むものである。従って、アルキル基には、
式−ＣｍＨ２ｍ＋□の非置換炭化水素残基並びにその置
換及び環式形が含まれる。そのような炭化水素残基には
、線状及び分校状のものが含まれ、通常は、「低級アル
キル」脂肪族型であって、そのときｍは６以下の数ヲ衣
わす（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イング
ロビル、ｎ−ブチル、イソブチル、第三ブチル、ｎ−ヘ
キシル等）が、ヘプチル、オクチル、ノニル及びデシル
などのよシ高級の脂肪族アルキルも含む。アルキル基に
は、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチル
等のシクロアルキルも含まれる。上記のように、アルキ
ルには置換された残基が含まれるが、それは、以下に詳
しく論じられるように、実質上本発明の化合物の新しい
特徴を無に帰せしめないように選択される。１個以上の
官能基又は置換基（同一であっても異っていてもよい）
を有する炭化水素残基全台むように意図されている。

本明細書中に使用されている「アリール」は。

水素原子の除去によシ芳香族炭化水素又は複索環もしく
は環系から誘専された有機残基全台むことが意図されて
いる。従って、アリール基には、フェニルもしくにナフ
チルなどの非置換炭化水素環残基及びその置換形が含ま
れる。複素環式アＩＪ　−ル残基は、ピリジル、トリア
ゾイル、フラニル。

イミダゾリル、キノリニル、チオフェニル、チアゾリル
、オキサシリル、オキサソアゾリル及びビリミソニル並
びにそれらの置換形などの、環構造中に１個以上のへテ
ロ原子（例えば、窒素、酸素又は硫黄）ヲ有する複素環
式アリール残基である。

本発明の目的から、アリール残基にな、以下に詳しく論
じられるよりに、本発明の化合物の新規な特徴全実質的
に無に帰せしめないように選択された１個以上の官能基
又は置換基（同一であっても異っていてもよい）を有す
るアリール残基が含まれるものとする。

更に、「アルケニル」には、少くとも１個のＣ−Ｃ単結
合がＣ−Ｃ二重結合によって置換されている上に定義さ
、れたアルキル基が含まれ、従って、非置換低級アルケ
ニル、例えば、ビニル、１−１０ベニル、２−プロペニ
ル等及びその置換形が含まれる。「アルコキシ」及び「
アリールオキシ」は、それぞれエーテル結合された、上
記のアルキル及びアリール基（例えば、メトキシ、エト
キシ、フェノキシ）の意味である。「カルボアルコキシ
」及び「カルだアリールオキシ」は、それぞれカルボキ
シルエステル結合された上に定義されたアルキル及びア
リール基（例えば、アセチル、エトキシカルボニル、ベ
ンゾイルオキ→の意味である。

「カルボキシアミド」は、非置換並びにモノ−もしくは
ソーＮ−置換アミド基の意味である。

ここに使用されている本発明の文脈においては、特定の
基（例えば、アルキル、アリール、アルケニル等）が置
換されているという指摘は、本発明の化合物の新規な特
徴を実質的に無に帰せしめない官能基によって−又は多
置換された時のそのような基を含むよりに意図されてい
る。そのような官能基には、合成的に導入され、安定な
指示系化合物となシ得るほとんど全ての化学基が含まれ
る。

官能基の例としては、ヒドロキシル、ハロ（例工ば、フ
ルオロ、クロロ、ブロモ）、アミン（アルキルアミノ及
びジアルキルアミノなどの置換されたアミンを含む）、
シアノ、ニトロ、チオール、カルボキシル（置換及び非
置換エステル（カルブアルコキク及びカルボアリールオ
キシ）などの置換カルボキシル並びにカル？キサミド類
を含む）、アルコキシ、アリールオキシ、アルキル、及
びアリールがある−０ 一般的に、本発明の螢光原性指示薬化合物は、実質的に
螢光性を有しないか又は、過酸化水素による酸化の螢光
性キノリン及びクマ１）ン生成物（砂とは実質的に異る
螢光性（例えば、励起及び／又は発光反ベクトル）を有
することを特徴とする。

過酸化的酸化に関係のある特殊な分析法におけるその有
用性に関して、公式（Ｂ）の−殻構造を有する螢光性キ
ノロン類及びクマリン類を選択し、次に選択されたキノ
ロンもしくはクマリンを変性せしめ、又は合成経路を考
案して、その３，４−ソヒドロー誘導体囚を製造するこ
とができる。本発明のソヒドロ化合物を得るには、主と
して二つの経路がある。第１のものは、炭素−炭素の二
重結合を単結合にするために発螢光体（Ｂの直接的化学
変性を必要とし、第２のものは、非螢光性化合物からの
ソヒドロ化合物の合成を必要としている。

さて、過酸化水素用の好ましい螢元原住指示薬並びにそ
の製造法及び使用法を個別的に叙述することによシ本発
明を説明する。そのような指示薬は、上記の式（Ａ）の
構造を有している。そのとき、Ｙが二〇であると、その
化合物は、クマリン誘導体であυ、Ｙが＝Ｎ−Ｒ５であ
ると、２−キノロン肪導体である。

特に好ましい指示薬は、式： （式中、Ｒ及びＲはアルキル、好ましくは低級アルキル
である）によって表わされる７−ジアルキルアミノ−２
−キノロン類であシ、対応する公知のキノロン類〔西独
国特許公開公報第２３６３４５９’　号（Ｑｅｒｍａｎ
　０ＬＳ２３　６３　４５９））　を、水素化ホウ素ナ
トリウムを用いるなどによ）還元することによシ製造す
ることができる。Ｒ５置換基を有する環窒素は、必要に
応じて、水素化ナトリウム、次にハロゲン化アルキルに
よジアルキル化し、還元して、Ｎ−置換ジヒドロキシロ
ン類を製造することができる。Ｒ５は、水素原子又は低
級アルキル、特にメチルであることが好ましい。

Ｒ１置換基は、適当に出発キノロンを選択することによ
シ、既に記載した原子団の範囲内で広く変化し得る。

Ｒ１が−ＣＯＯＲ６，−ＣＯＮＨＲ’もしくは−ＣＯＮ
（Ｒ’）２（この時、Ｒ６は水素原子、アルキル、アル
であるジヒドロキシロン類は、式： （式中、Ｒ７はアルキル、アルケニルもしくはアリール
であり、好ましくはは級アルキル（第３図参照）である
）によって表わされる桂皮酸ジエステル類から製造する
ことができる。

そのような桂皮酸ジエステル類は、４−ジ置換−アミノ
−２−ニトロベンズアルデヒド（西独国特許第２３　６
３　４５８号）と適当なマロン酸ジアルキル、マロン酸
ヅアルケニル又はマロン酸ジアリールを反応させること
によυ、製造することができる。桂皮酸ジエステル０中
の２重結合は、水素化ホウ素ナトリウムを用いる等によ
り、還元し、次に、触媒的に水素添加して輩素頁能価を
減じてアニリン中間体としく第３図の化合物（５）錠前
）、これが環化して３−位に−ＣＯＯＲ７置換基（式（
Ｃ１中する。Ｒ、（すなわちＣ０ＯＲ）置換基は、次に
多様な公知の方法によシ変性せしめ、Ｒ１が−ＣＯＯＨ
。

−ＣＯＮＨＲ’又は−〇〇Ｎ（Ｒ’）２であるジヒドロ
キシロン類（Ｃ１を得ることができる。例えば、エステ
ル（Ｃ１（Ｒ”＝Ｃ０ＯＲ７）を、けん化し、カルボン
酸又は塩を生ぜしめることができ、これを次に適当なア
ミンと縮合せしめて、ジヒドロキシロン類（Ｃ）　（Ｒ
’　ハＣ０ＮＨＲ’又はＣ０Ｎ（Ｒ６）　２　）を製造
することができる。

螢光原性クマリン指示薬（Ａ）（Ｙは酸素、がっＲ２は
ヒドロキシル）すなわち、ウンベリフェロン誘導体は、
適当な７−ヒドロキシクマリン〔ブイ。

ニス、カマト（Ｖ、　Ｓ　、Ｋａｍａｔ　）等著ｒ　Ｔ
ｅｔｔ、１ｅＬｔ、Ｊ２３：１５４（１９８２））の３
，４−二重結合を還元することによシ製造することがで
き、式：で示される指示系化合物を得ることができる。

この化合物は、過酸化水素による酸化によって、既に記
載したように、３．４二重結合の再導入によシ式： の螢光性クマリン類を生じる。

Ｒ１置換基は、既に記載した原子団の範囲内で、広く変
化し得る。多様な３−置換クマリン類〔式％式％ Ｃ０Ｎ）１２等〕が公知であシ、（Ｗ、Ｒ，ジャーマン
及びイー、ロビング（Ｅ、　Ｒｏｂｉｎｓ　）著ｒＡｎ
ａ１．　Ｃｈｅｍ、Ｊ　４０　：８０３（１９６８）〕
又は天然に植物中に存在する〔アール、シー、エルダー
フィールド（Ｒ−Ｃ−Ｅｌｄｅｒ−ｆｉｅｌｄ）　編集
［ヘテロサイクリツクコンパウンズ（Ｈｅｔｅｒｏ６ｙ
ｃｌｉｃ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　）　Ｊ第２巻、２１４
−２１６頁、ションウィリーアンドサンズ社（Ｊｏｈｎ
　Ｗｉｌｅｙ　＆３ｏｎｓ）　（＝ニーヨーク１９５１
）：Ｉｏ多くのぞのような天然に存在するクマリン類は
、ベンゼン場に置換基を有し、他のものは、合成によっ
て作られている〔ソエイ、アイ、デグロ−（Ｊ、　１．
　ＤｅＧｒｏｗ）等著り、Ｍｏｄ、Ｃｈｅｍ、Ｊ　１１
：３７５（１９６８）；ソエイ。

バネルジ（Ｊ、　Ｊ３ａｎｅｒｊ　ｉ　）等ｒＪ、ｃｈ
ｅｍ、ｓｏｃ、ｌ　Ｃ２３：　３９９２（１９７１）；
　及びエム、バンドパドキアイ（Ｍ。

Ｂａｎｄｏ　ｐａｄ　ｋｙａｙ　）等著ｒＩｎｄｉａｎ
　Ｊ、ＣｈｅｍＪ　１２　：　２９５（１９７４））。

Ｙが酸素であり、Ｒ２が−ＮＲ３ｇ　’であるものにつ
いては、螢光原性指示薬（４）は、適当な７−アミノク
マリンの還元により製造して、式：の７−アミノ−３，
４−ジヒドロクマリン類を製造することができる（　Ｒ
３及びＲ４が水素である指示系は、７−アミノ又は、７
−ニトロクマリン類の接触水素添加によシ得ることがで
きる）。７−アルキルアミノ又はジアルキルアミノ−３
，４−ソヒドロクマリン類が必要とされている場合、そ
れらは７−アミノジヒドロクマリンのＮ−アルキル化又
は７−アミノジヒドロクマリンのシッフ塩基の接触水素
添加によシ製造することができる。

あるいはまた、Ｎ−アルキルアミノクマリンは適当な３
−アルキルアミノフェノール又は３−ヅアルキルアミノ
フェノールを出発物質として用い、下記の方法によシ製
造することができる。過酸化水素による酸化によって作
られる螢光性のある物を有する。

３−置換−７−アミノクマリン類は、４−アミ／−２−
ヒトｏキシ又は２−〇−保護ベンズアルデヒド類〔ダブ
リュー、イー、ソロダール（Ｗ、Ｅ。

５ｏｌｏｄａｒ　）等著ｒＪ、ｏｒｇ、ｃｈｅｍ、Ｊ　
２３：１０３（１９５８）　；イー、ブロンド（Ｅ、Ｐ
ｒｏｆｆｔ　）等著ｒ　Ａｒｃｈ、　Ｐｈａｒｍ、Ｊ３
００：１（１９６７）：ｌ　；又はシッフ塩基〔エイ、
エイ、ゴールドペルグ（Ａ、Ａ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　）
　等著［Ｊ。

Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｊ　２６４１（１９！５４）；：ｒ
−イテ、イテパガセ（Ｈ，ＩＣｈｉｂａｇａｓｅ）　ｒ
Ｊ、Ｐｈａｒｍ、ｓｏｃ、ＪａｐＪ　７５　：　１４７
７（１９５５）；　西独国特許第１２　９３　１６０号
（１９６４年）、Ｃ，Ｗ、シｘ　ルハ７−ｒ　−（Ｃ，
Ｗ、　５ｈｅｌｌ−ｈ　ａｍｎｅ　ｒ　）、Ｋ、Ｗベユ
ーラー（Ｋ、Ｗ、Ｍｕｅｌｌｅｒ　）、Ｒ，レイン（Ｒ
，Ｒａｎｅ　）　）　をアシル酢酸エステル類又はマロ
ン酸エステル類を用いてクネーフエナーグル縮合するこ
とにより得ることができる。〇−保護の場合、環化が起
きるには脱保護化が必要である。

Ｙが＝ＮＲ８，Ｒ２がヒドロキシルである螢光原性指示
系囚、即ち、２−キノロン誘導体は、上記のようにキノ
ロン類又は桂皮酸エステル類にょシ、によって表わされ
る適当な７−ヒドロキシ−３゜４−ジヒドロ−２−キノ
ロン類〔エン。ジグマツ（Ｎ、Ｓｈｔｇｅｍａｔｓｕ）
　、　ｒｃｈｅｍ、Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、Ｊ　９　
：　９７０（１９６１））　から製造することができる
。上記ヒト０キシル基は、その２−テトラヒドロピラニ
ルエーテル〔第５図の化合物（１３）参照〕に転換する
などの適当な方法で保護される。次に保護されたキノロ
ンは、必要に応じて、適当な置換又は非置換ハロゲン化
アルキル並びに水酸化ナトＩＪウムなどの塩基を用いて
処理するなどによシ、Ｎ−アルキル化することができる
〔上記、エヌ、シｒマツ（Ｎ、　Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ
　）　）　。過酸化水素による酸化によって作られる螢
光性を有する物質は、式 によって表わされる。Ｒ１置換基は、既に記載された原
子団の範囲内で広く変化させることができる。上記ラク
タムを強い塩基を用いて、次に炭酸ソエチルなどのアシ
ル化剤を用いて反応させることによシ、３−エトキシカ
ルボニル置換基を導入し、それをさらに、上記の様々な
３−置換ジヒドロキシロン類に合成することかできる。

また、７−ヒドロキシル基は、７−　（’低級アルキル
）アミノ置換基によシ置換することができ、様々な誘導
体が知られている〔上記エン。ジグマン（Ｎ、Ｓｈｉ−
ｇｅｍａｔｓｕ）　；　エイチ、ベータ（Ｈ，Ｖｅｄａ
　）及び−４＝’　７ド。

エイチ、ヤ／（Ｚ、Ｈ，Ｙａｎ　）著、ｒ　Ｊ　、　Ｊ
ａｉｗａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅａｔ。

Ａｓ５ｏｃＪ　１：８８（１９４９）；ワイ、タムラ（
Ｙ、Ｔ　ａｍｕｒａ）尋者、ｒＣｈｅｎｉ、　Ｉｎｄ、
Ｊ　（ｏンド７）１９７５．９２２；そし−Ｃ，ソー、
ニス、シドヒ”　（Ｇ、Ｓ、５ｉｄｈｕ）尋者［アナｖ
ｙ　（Ａｎｎａｌｅｎ）Ｊ　６２７：２２４（１９５９
）参照〕。

式（４）に関しては、本発明の螢光原性指示系の一般構
造を示しながら、Ｒ１置換基は本発明の独創的特徴を離
れることなく、広く変化することができる。Ｒ１置換基
は、一般に、水素原子、アルキル、通常は低級アルキル
、アルケニル、通當ハ低級アルケニル、アリール、又は
電子吸引基である。

電子吸引基は、非置換の場合に関して、誘起又は共鳴効
果（ジエイ、マーチ（Ｊ、Ｍａｒｃｈ　）著［アトパー
ンスト　オーガニック　ケミストリー：リアクションズ
、メカニズムズアンドストラクチャー（Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　：　Ｒｅａ
ｃｔｉｏｎｓ　、　ｒｎｅｃｈａｎｉｓｍｓ　。

ａｎｄ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　）Ｊ　２２８頁　マグロ
−ヒル社にューヨーク））によシ、Ｃ−３陽子の酸性度
を増加する基であるものとし、シアン、カルボキシル、
カルボアルコキシ、カルボアリールオキシ、カルボキサ
ミド、スルホニル、スルホキシ、スルホニウム、ホスホ
ニル、ホスホニウム、ハロ、ニトロ、及びアリールによ
って代表される。カルボキシルエステル類は、主として
、カルボメトキシ、エトキシカルボニル等などのアルキ
ルエステル類であシ、カルボキサミドは、Ｎ−アルキル
カルボキサミド類及びＮ−アラルキルカルボキサミド類
（例えば、Ｎ−エチルカルボキサミド、Ｎ−ブチルカル
ボキサミド、Ｎ−べ／ジルカルボキサミド、Ｎ−フェネ
チルカルボキサミド、及びＮ　−２−ヒＩＪツルメチル
カルボキサミド）などの置換アミド類を含む。Ｒ１は、
式−ＣＯＯＲ６，−ＣＯＮＨＲ６又は−ＣＯＮ（Ｒ６）
　（このとき、Ｒ６は水素原子、又は置換もしくは非置
換アルキル又はアリールである）で表わされるものが好
ましい。３−置換キノロン類及びクマリン類に関し、上
に挙げられた幾つかの引例と、オランダ国特許出願第６
，６０３，９８５号及び６，６０４，７６６号並びに西
独国特許公開公報第２５　０２　５８８号も参照された
い。

本発明の化合物のキノロン並ひにクマリン核の４−．５
−．６−及び８−位は、本発明の指示薬の独創的特徴か
ら離れることなく、多様な置換基を有し得ることは明ら
かである。本発明の化合物のそのような置換形は、本発
明の３，４−ジヒドロ−指示薬の同等物と見なされるべ
きである。はとんどいかなる螢光性キノロンもしくはク
マリン、又は吸光度などの他の有用な光学的性質を示す
キノロンもしくはクマリンであっても、それを選び、本
明細書中に記載のように３，４−二重結合を還の有用な
指示系化合物を生成することができる（この時、Ｂｌ　
、　Ｒ２及びＹは上記の通シであシ、Ｒ８及びＲ９は、
はとんどいかなる所望の置換基でもよく、ｎは０から３
までの整数であって、フェニル環の置換度を表わす）。

一般に、Ｒ８置換基は、水素、アルキル、通常は非置換
低級アルキルもしくはフッ素置換低級アルキル（例えば
、トリフルオロメチル）、アルケニル、再び、通常は低
級アルケニル、又はアリール（全て上に定義された通り
）である。そのような所望のＲ８置換基は、還元されて
３，４−ジヒドロ指示系を生成するキノロン又はクマリ
ン中に存在してもよく、あるいは、技術文献において、
見出される方法により、後で導入されたシ、変性せしめ
たシしてもよいｏ４−置換キノロン類及びクマリン類位
、公知である（　７　＃　、ｘ　ム、ホルビｘ　（Ｒ，
Ｍ、Ｆｏｒｂｉｓ　）等著、ｒＪＡｃｓＪ　９５　（１
５）　；カナダ国特許第１，０８８，６５９号：イー、
アール、ビア　セル（ＩＦ；、Ｒ，Ｂｉａｓｅｌｌ　）
等著。

ｒＪ、Ｏｒｇ、ｃｈｅｍ、Ｊ　４５（２１）　：２２８
４−７Ｃ１９８０）　；西独国特許公開公報第２５　０
２　５８８号及び第２８２７５６６号〕。

Ｒ９置換基は、天然に見出されるクマリン類及び２−キ
ノロン類中に存在することが知られている置換基又は合
成されて螢光原性指示系を生じ得る置換基から選択する
ことができる。Ｒ９置換基は、もし存在すれは（すなわ
ち、ｎが１以上である時）、環核上の５−２６−及び８
−位を占める。

Ｒ９＠換基がそのような位置の１以上のいかなる位置に
も存在していない場合には、そこは水素原子によって占
められる。ｎが１である時、Ｒ９置換基は４−２６−及
び８−位のいずれにあってもよいが、通常は５−又は６
−位にあシ、６−位にあることが好ましい。ｎが２であ
る場合、２つのＲ９置換基は、５−及び６−位、５−及
び８−位、又は６−及び８−位にあってよく、同一であ
っても異っていてもよい。そのようなＲ９置換基として
ハ、ハロ（フルオロ、クロロ、ブロモ）、アルキル、通
常は非置換低級アルキル、アルケニル、再び通常は非置
換低級アルケニル、アルコキシ（好ましくは、メトキシ
及びエトキシ等の非置換低級アルコキシ）、又はアリー
ルがある。一般に、Ｒ９置換基には、生成する指示薬化
合物に必要な螢光性を高めるかもしくは大きく減じない
で、かつ螢光性キノロン類及びクマリン類の形成に至る
酸化の過程を妨害しない有機ラジカル又は官能基であれ
ばいかなるものでも含めることができる。そのよりなＲ
９置換基は、還元されて本発明の指示薬を生成する出発
キノロン類又はクマリン類中に存在していてもよく、後
で導入されてもよい（上記のソエイ、アイ、デグロ（Ｊ
、１．　ＤｅＧｒｏｗ）等、及びエム、バンドパドキア
イ（Ｍ、　Ｂａｎｄｏｐａｄｋｙａｙ　）　）　ｏ芳香
ｉｓの化学的変性は、フリーデルクラフッ反応によシ〔
ソー、エイ、オラー（Ｇ、Ａ、　０１ａｈ　）　、ｒ　
７リ一デルークラフツ反応及び関連する反応（Ｆｒ１ｅ
ｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ　ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｒｅ
ａｃｔｉｏｎｓ　）　Ｊ　、インターサイエンスパブリ
ツシャーズ（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉｓ
ｈｅｒｓ　）、にニーヨーク、１９６４年）第２巻、第
１部〕；又は、ハロゲン化アルキルを用いてフェノール
をアルキル化し、次にクライゼン転位を行うことにより
（ニー　、スパ７ホルＡ　（Ｕ、Ｓｖａｎｈｏｌｍ）　
等、１−Ｃｈｅｒｎ、Ｃｏ＋ｎｍ、Ｊ　６４５　（１９
７２）　；又は、スルホン化〔イー、イー、ギルパー）
　（Ｅ、Ｅ、Ｇ１１ｂｅｒｔ　）　。

［抹ルホン化及び関連する反応（５ｕｌｆｏｎａｔｉｏ
ｎ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　）　
Ｊ　、インターサイエフ　ｘ　／：プリツシャーズ（Ｉ
ｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ　ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　）　
（＝　−Ｌ　−ヨ　ゝ−ク、（１９６５）７９及び８０
頁〕により行うことができる。

さらに、シクロアルキル、シクロアルケニル及びアリー
ル環は、フェニル環に縮合し、同等の置換指示薬化合物
を生成することができるが、特に縮合がＲ置換基を通じ
て生じる時にそうである。

例えば、Ｒ２が窒素である時、１又は２つのＲ９置換基
は、Ｒ２置換基に隣接した位置の片方又は両方を占める
ことができ、Ｒ２（すなわち窒素）と共に、フェニル環
に縮合された１又は２のテトラヒドロピリジニル環〔第
６図〕を形成する線状ブチレン基であってもよい。

過酸化水素の螢光原性指示薬の好ましい下位概念のもの
は、式 （式中、Ｒ１は水素原子、シアノであるか又は、式−〇
〇〇Ｒ’　、　−ＣＯＮＨＲ’　、もしくはＣ０Ｎ（Ｒ
’）２（この時Ｒ６は、水素原子、アルキル、アルケニ
ル、又はアリール）で示され；Ｒ２は−ＯＨ又は−ＮＲ
３Ｒ’　（この時、Ｒ３及びＲ４は、同一であっても異
っていてもよいが、水素又は低級アルキルであり；そし
てＹは＝０又は＝Ｎ−Ｒ５（この時、Ｒ５は水素原子又
は低級アルキルである） によって表わされる、螢光原性指示薬である。

本発明は、診断の分野の分析方法において使用する為の
特に優れた過酸化水素反応性を有する指示薬を提供する
ものである。最終的に過酸化水素の測定に基く診断上の
検査方法が数多く知られている。例えは、特異的オキシ
ダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ）の作用に基いた、グルコース、ガラクトース、コ
レステロール及び尿酸などの様々の分析対象物の測定法
がある。同様に分析対象物が酵素的にもしくは非酵集的
に反応して、生成物を生じ、その生成物が、次に、１以
上の酵素的なあるいは非酵集的な段階において反応して
最終的に過酸化水素を生成する酵素学的検査方法がある
。

さらに、本発明の指示薬は、過酸化水素の発生によって
検知可能となる標識化物質が用いられる、免疫検定法な
どの特殊な結合分析法にも用いることができる。そ９よ
うな結合分析方法には、標識が、オキシダーゼ酵素であ
るか又はある物質を生成し、その物質が次に酵素と関係
してもしくは関係せず反【６して過酸化水素全生成する
酵素であるような結合分析法が會まれる。そのような方
法の例としては、米国特許第３，６５４，０９０号及び
第３．８１７，８３７号などの文献に記載されている不
均質及び均質酵素標識免疫検定法がある。あるいはまた
、標識は基質、抑制因子、補酵素、又は、そのような酵
素に対する補欠分子族であってもよく、それは、米国特
許第４，２７９，９９２号、第４，２３８，５６５号、
第４，１３４，７９２号及び第４，２７３，８６６号並
びに英国特許明細書箱１，５５２，６０７号に記載され
ている。

本発明の指示薬化合物を用いて測定される過酸化水素を
含有している検査試料又は反Ｖ＆混合物は当該分野で公
知の過酸化活性物質にも接触させることが好ましい。ワ
サビダイコンペルオキシダーゼ、もしくはジャガイモペ
ルオキシダーゼなどの植物性ペルオキシダーゼを用いる
ことができる。

ペルオキシダーゼ活性を有する無機化合物には、ヨウ化
ナトリウム及びヨウ化アンモニウムなどのヨウ化物並び
にモリブデン酸塩がある。さらに、ウロヘミン並びに他
の幾つかのペルオキシダーゼ活性を有するポルフィリン
物質も用いることができる。

本発明を、以下の実施例により説明するが、本発明は、
これのみに限定されるものではない。

実施例 λ ０の中の斜字体の数字は、第３〜６図中の図で示した構
造式をさし、実施例の末尾の衣中に使用されている。

トルエン４００ミリリツトル中の４−ジメチル７ミ／−
２−二トロペンズアルデヒド〔エイチ。

パ＋７−ｑ　ン（Ｈ，Ｂａｗｍａｎｎ　）等、西独間特
許第２３６３４５８号）　８．９１！　（５０ミリモル
）マロ／酸ツメチル２３．７Ｆ（１４８ミリモル）、ピ
ペリジン３．４４５’（４０，４ミリモル）及び酢酸２
．４３　Ｐ　Ｃ４０，４ミリモル）の混合物を、付屈の
ディーンスタークトラップ（Ｄｅａｎ　５ｔａｒｋ　ｔ
ｒａｐ）を用いて、アルゴン下で１６時間還流した。溶
液は、室温まで冷却し、水酸化カリウム（ＫＯＨ）５％
水溶液２００ミリリツトルを用いて洗浄した。有機相を
分離し、硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ４）上で乾燥し、
濾過し、溶媒を蒸発させた。暗赤色の固体残留物を、塩
化メチレン（ＣＨ２Ｃ１□）４０ミリリツトル中に溶解
し、ヘキサン１００　ミＩＪ　ＩＪソトルを加えた。１
時間放置した後、溶液を濾過してオレンジ色の結晶Ｈ）
、４グを得た。ＣＨ２Ｃｌ□−ヘキサンからの再結晶化
によシ、分析用試料（融点：１０１〜１０２℃）を生成
した。

分析：計算値：　Ｃ１６Ｈ２ｏＮ２０６：Ｃ，５７、１
４；Ｈ，５，ｃ＋９；Ｎ、８．３３ 実測値：　Ｃ，５７，６５；Ｈ，６，１２；Ｎ、８．３
４’ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ　３）δ：８．０８（ｓ、ＩＨ
）　；７．３−７．５（ｍ、２Ｈ）　；６．８４（ｄｄ
、Ｊ＝３．８Ｈｚ、１ｌ−１）　；４．３＝１（（１，
Ｊ＝８．２Ｈ）　；４．２３（ｑ、Ｊ＝８．２Ｈ）　；
３．１０（ｓ、６Ｈ）　：１．２７（ｑ、Ｊ＝８．６Ｈ
）。

エチル−α−エトキシカルボニル−４−メチルア桂皮酸
エステル（７）（５，０り、　１４．８ミリモル）を酢
酸１００ミリリツトル中に溶解し、四酢酸鉛７．６　ｙ
　（１７，２ミリモル）を加えた。混合物を室温で１時
間撹拌した後に、溶媒を除去した。トルエン（１００ミ
リリツトル）を加えてスラリーを濃縮し、次にクロロホ
ルム（ＣＨＣｌ８）１００　ミリリットルを加え、固形
物を完全に粉砕し、溶液をデカント（傾しゃ）した。ク
ロロホルム（１００＜リリットル）を固形物に加え、混
合物を簡単に還流し、濾過し、Ｐ液を前記のＣＩ（Ｃ１
３溶液と混合した。その有機溶液を濃縮した後、残留物
にシリカゲル３５０ｙ上でクロマトグラフィを行いアセ
トンとＣＨＣｌ３（容積比：１：１９）を用いて溶出し
た。第８３〜第１４０分画（１５ミリリットル／分画）
を混合し、濃縮し、これをＣＨ２Ｃｌ２（３，４５２７
２％）によシ結晶化して生成物（融点：１１３〜１１４
℃）を得た。

分析：計算値：　Ｃ□５Ｈ，８Ｎ２０６．：Ｃ，５５，
９０ｉＨ，５，６３；Ｎ、８．６９゜ 実測値：　Ｃ，５５，５７；Ｈ，５，７８；Ｎ、８．５
９゜”ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）Ｊ：８．００（ｓ、ＩＨ
）；７．３３（ｄ、Ｊ＝ｉｏ。

ＩＨ）；７．２５（ｄ、Ｊ＝４．ＩＨ）；６．７３（ｄ
ｄ、Ｊ＝４．１０．ＩＨ）；４８０（ｂｒｏａｄ　ｑ、
ＩＨ）　；４．３゜（ｍ、４Ｈ）；２．９０（ｄ、Ｊ＝
５，３Ｈ）：１．３０１（１，Ｊ＝８．６Ｈ）　。

水素化ホウ素ナトリウＡ　（ＮａＢＨ４）　（０，２Ｆ
　、　５．８ミリモル）を無水エタノール１００ミリリ
ツトル中の桂皮酸エステル（２）　（３，４ｙ　、　１
０．５ミリモル）のスラリーに加え、反応混合物を室温
で１．５時間撹拌した。酢酸（０，５ミリリツトル）を
加え、混合物を濃縮した。残留物を、ＣＨＣｌ３２５０
ミリリツトル中で溶解し、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣ
Ｏ３）の飽和溶液１００　ミリリットル、そしてＨ２Ｏ
（１００ミリリツ１ル）を用いて洗浄した。有機相を分
離し、乾燥しくＮａ２５ｏ、）濃縮してオレンジ色の固
形物３．１ノを生成した。分析用試料をメタノール（Ｍ
ｅＯ）ｌ）−水からの結晶化によって得た。融点７５−
７７°ｃ。

分析二計算値：　Ｃｌ６Ｈ２０Ｈ２０６：Ｃ，５５，５
５；Ｈ，６，２１；１（，８６４゜ 実測値：　Ｃ，５５，３４；）１．６．０８．Ｈ，８，
４５゜Ｈ”ＮｙｌＲ（ＣＤＣ１ａ）　’　ニア−２（ｍ
、２Ｈ）；６．７０　（ｄｄ、　Ｊ＝４　、９　。

ＩＦ）　；４．１３（ｑ、Ｊ＝７，４Ｈ）　；３．９５
−３．２０（ｍ、３）１）　；２．８６（ｄ、Ｊ＝５゜
３Ｈ）　；１−２０（ｔ、Ｊ−７，６Ｈ）。

３．４−ジヒドロ−２−キノロン（５）無水エタノール
（ＥｔＯＨ）　１００ミリリツトル中の桂皮酸エステル
（ハ５．Ｏｆ　（１４，８ミリモ欠）のスラリーに、Ｎ
ａＢＨ４の０．３４Ｆ（９−２ミリモル）を加えた。混
合物を室温で２．５時間撹拌し、次に、氷酢酸（Ａｅｏ
ｌ（）　１　ミリリットルを加え、溶媒を減圧下で除去
した。残留物をＣＨＣｌ３２５０ミリリツトル中に溶解
し、飽和ＮａＨＣＯｓ　浴液１００ミＩＪ　リットルを
用いて洗浄した。８２０１００ミリリツトルを用いて洗
浄後、有機相を乾燥（Ｎａ２ＳＯ４）　シ、濾過し、溶
媒を減圧下で蒸発させて、粗製ソヒドロ桂皮酸Ｑ（３１
４，８６Ｐを暗赤色の油状物質として生成した。ジオキ
サン（５０ミリリンドル）を加え、溶液を濃縮した。油
状の残留物をジオキサン５０ミリリツトル中に溶解し、
１０％パラジウム−炭素０．５ｙを加えた。混合物を水
素ガス（Ｎ２）の５０ｐＳｉ圧力下、５０℃で６．５時
間振とうした。反応混合物が室温まで冷却した後で、触
媒をケイソウ±（セライト；米国、コロラド州デンバー
のションズーｑンピル（Ｊｏｈｎｓ−Ｍａｎｖｉｌｌｅ
　）社製）によυ濾過することによって除去し、溶媒を
容積２５ミリリットルまで濃縮した。ソエチルエーテル
（５ミＩＪ　ＩＪットル）を加え、溶液を一晩放置した
。濾過によシ生成物２．３Ｆを白色の固形物として生成
した。融点＝１８１〜１８２℃。

分析：計算値：　Ｃ１４Ｈ□８Ｎ２０３：Ｃ’、　６４
．１０　；Ｈ，６，９１；Ｎ、１０．６８゜ 実測値：　Ｃ，６４，４５；Ｈ，６，８７；Ｎ、１１．
１１゜７−メチルアミノル３−エトキシカルボニル−３
ジエステル＋４）　２．６　Ｐ、木炭上の１０％ｐｄ　
及びジオキサン７５ミリリツトルを水素の５　（ｌ　ｐ
ｓｉ圧力下、５０℃で、１７＠間振とすした。触媒ｒセ
ライトで濾過することにより除去し、溶媒を除去した。

残留物にシリカゲル２０　ｔ）　Ｐ上でクロマトグラフ
ィを行い、アセトンとＣ１１□ｃ１□　（容積比：３：
１７）を用いて酪出］７た。第７５〜第１２０分画（１
７ミ１７　＋７ツトル／分画）を混合し、濃縮して白色
の粉末０．５　ｙ　＊得た。Ｍｅ　０Ｈ−１８２０から
の再結晶化により、分析用試料（融点、１７１〜１７２
′Ｇ）を製造した。、 分析：１ｉｔＸ値：　Ｃ１３Ｈ１６Ｎ２０３：Ｃ，６２
，８＋ｑ；Ｈ，６，５０；Ｎ、１１．２８゜ 実測値：　Ｃ，６３，０３；Ｈ，６，６２；Ｎ、１１．
５４゜”ＨＮＭＲ（Ｄ６ＤＭＳＯ）ａ：１０．１０（ｓ
、ＩＨ）；６，８６（ｄ、Ｊ＝−８゜ＩＨ）　；６，８
６（ｄ、Ｊ＝８．ＩＨ）　；６．Ｈｌ（ｍ、２Ｈ）　；
５．５７（ｂｒｏａｄ　ｒ４．ＩＢ）；４．０７（ｑ、
Ｊ＝７．２１）；３．４９（ｔ。

Ｊ＝８．１）］ンｉ２．９５（ｄ、Ｊ＝８，２Ｈ）；２
．６０（ｄ、Ｊ＝５，３Ｈ）；１．１５（ｔ。

Ｊ＝７　、３Ｈ）　。

７−シメチルアミノー３−カルボキシ−３，４−ジヒド
ロ−２−キノロンカリウム塩（７）無水エタノール５５
ミリリツトル中のエチルエステル（５）　１．４３　Ｆ
　（５，４５ミリモル）のスラリーに、水に溶かしたＫ
ＯＨ１６ミリリツトル（８，３ミリモル）を加えた。混
合物をアルゴン下室温で、２４時間撹拌した。反応物を
濾過し、カリウム塩（７）（融点＝１９３〜１９５℃）
１．３〆（８４％）を得た。

分析：計算値：　Ｃｌ２Ｈ工、Ｎ２０３Ｋ・３／４Ｈ２
０：Ｃ、５０・４４；Ｈ，５，１１；Ｎ、９．８０゜ 実測値：　Ｃ，５０，５３；Ｈ，５，４６；Ｎ、９．８
２゜７−ソメチルアミノー３−（Ｎ−エチルカルボキサ
ミド）−３，４−ジヒドロ−２−キノロン（８）乾燥ツ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）　４５ミリリツトル中の
前段階のカルボキシレー）　塩（７）１．３　ｙ（４，
８ミリモル）のスラリーを、水浴中で５℃に冷却し、イ
ンブチルクロロホルム塩０．７２　Ｐ　（０，６８ミリ
リツトル、５．２ミリモル）ｔ３分間かけて一滴ずつ加
えた。反応混合物を放置して室温にもどし１５分間撹拌
した。次に、ＤＭＦ１５ミリリットル中の、前もって蒸
留し、水酸化ナト＋）ｒ：ｙＡ（ＮａＯＨ）上に保存し
たエチルアミン６ミリリツトルを急速に加えた。２時間
撹拌した後、溶液を濃縮し、残留物にシリカゲル１５０
ｙ上でクロマトグラフィを行い、ＣＨ３０）ＬとＣＨ２
Ｃｌ２（容積比＝１：１９）を用いて溶出した。第４５
〜第７５分画（１２ミリリットル／分画）は、アミド（
８）を含有しており、このアミドをソエチルエーテルー
ヘキサンから結晶化し、白色の固形物０．２７　（融点
：２１６−２１８℃）を得た。

分析：計算値：Ｃ□４Ｈ□、０□Ｎ３：Ｃ，６４，３５
；Ｈ。

７．３３；　Ｎ、１６．０Ｂ。

実測値：Ｃ，６４，９７；Ｈ，７，７８；Ｎ、１６．２
４゜”ＨＭＲδ：　８．１０（ｂｒｏａｄ　ｓ、ＩＨ）
；　７．６０（ｂｒｏａｄ、ＬＨ）；７．０５（ｄ、　
Ｊ＝９゜ＬＨ）ｉ７．０５（ｄ、　Ｊ＝９．ＩＨ）；６
．３３（ｄｄ、Ｊ＝４．９．ＩＨ）；６．０７（ｄ。

Ｊ＝４．ＩＨ）；３．６０−３．２０（ｍ、５Ｈ）；２
．９０（８，６Ｈ）；　１．１３（ｔ、Ｊ＝７゜３１（
）。

サミド）−２−キノロン（９） 桂皮酸エステル（Ｊ）　１．０　！　（３−０ミリモル
）、無水　ＥｔＯ）１　４　０　ミ　リ　リ　ッ　ト　
ル、Ｈ２Ｏ１ミ　リ　リ　ッ　ト　ル、濃塩酸（Ｈ，（
Ｊ？）　０．４ミリリツトル及び鉄屑（１ｒｏｎ１’ｉ
ｌｉｎｇｓ　）　１．５　Ｆ（２６，９〜−ａｔｏｍ）
　の混合物を激しく撹拌しながらアルゴン下、２．５時
間還流した。

さらに鉄屑１．７　ｙ　（３ｏ、４ｍｙ　−ａｔｏｍ）
を加え、３時間加熱を続けた。混合物を熱濾過し、Ｆ液
を蒸発させた。残留物を２．５５Ｍ　メタノール性ＨＣ
ｌ５０ミリリツトル中に醪解し、室温で２０分間放置し
た。次に、溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨＣｌ３１５０
ミリリツトル及び飽和ＮａＨＣＯｓ　ｆｎ液５０ミリリ
ットルに分配した。有機相を分離し、水性相をＣＨＣｌ
３７５ミリリツトルを用いて洗浄した。有機相を混合し
、乾燥しくＮａ２８０４）、濾過し、濃縮して、暗褐色
の固形物０．４９　ｆを得た。水性相をインブタノール
１２０ミリリツトルを用いて抽出し、それを乾燥しくＮ
ａ２ＳＯ４）、濾過し、留去して、さらに０．０８１を
製造した。２つの残留物を混合し、ＭｅＯＨ３０ミリリ
ットル中でスラリー化し、エチルアミン（ＥｔＮＨ，り
７０％−水（ル０）３０チの１０ミリリツトルを加えた
。混合物を室温で３日間攪拌し、次に、ステンレススチ
ール製のデン−’＋　中Ｋ　ｆｉｔ　＠、１００°Ｃで
６時間加熱した。溶媒を蒸発させてから、残留物にシリ
カケ゛ルア５ｆ上でクロマトグラフィを行いＣＨ＝　Ｃ
ｌｌ　ｔとＭｅＯＨ（各積比：　１９：ＩＸｌ’用いて
溶出した。

第２５〜第３４分画（７ミリリツトル／分画）全混合し
、濃縮して体積７ミリリツトルとした。

濾過により、黄色の針状結晶０．１９ｒ（融点：２９９
〜３００℃）を得た。

分析：計算値二Ｃ１４Ｈ１７Ｎ３０２　：　Ｃ、７４，
８５；Ｈ。

６．６１　；Ｎ、　１６．２０゜ 実測値：　Ｃ、７４，８４；Ｈ，６，７４；Ｎ、　１６
．１９゜’　ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌｓ　）δ：　７．５３
（ｄ、Ｊ＝９．ＩＨＧ６．６０（ｄｄ。

Ｊ＝４．９．ＩＨ）；　６．４０（ｂｒｏａｄ　ｍ。

１Ｈ）’　３．５３　（ｍ、２Ｈ）；　３．１０　（ｓ
。

６Ｈ）；　１．２５　（ｔ、Ｊ＝７．　３Ｈ）。

水素化ナトリウム（１０ｑ、０．２ミリモル）の５０％
油分散液をへキサ／を用いて２回洗浄し、ソオキサンエ
ミリリットルを加えた。スラリーに、ジオキサン／ＤＭ
Ｆ（１：　１　）の混合物２ミリリツトル中のキノロン
（９１５０ｑ（０，２ミリモル）を加えた。混合物を室
温で３０分間撹拌し、次に、ヨードメタン０．５６　Ｐ
　Ｃ４ミリモル）を急速に加えた。溶液を３０分間撹拌
した後、溶媒を蒸発させ、残留物をＣＨＣｌ３５０ミ１
ノリツトル中に溶解した。

溶液をＨ２Ｏ３０ミリリツトルを用いて、洗浄し、有機
相を乾燥しくＮａ２５Ｏ４）　、濾過し、留去した。生
成物の沈殿が生じ、残留物をＣＨＣｌ　３の５ミリリツ
トル中に溶解し、ジエチルエーテル２０ミリリツトルを
用いて、すシつぶした。濾過により、黄色の固形物（融
点：２４８−２５０℃）３２Ｉ＋ｖを製造した。エタノ
ールからの再結晶化により、黄色の針状結晶（融点：２
５２−２５３℃）を得た。

分析；計算値：Ｃ□５Ｈ２□Ｎ３０２：Ｃ，７５，０９
；　Ｈ。

？、００；　Ｎ、　１５．３７゜ 実測値：　Ｃ，７５，０８；　）ｌ、　６．（ｌａ；　
Ｎ、１５，３１゜”ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１ｇ）＃：８．４
０（ｓ、ＩＨ）；　７−５８（ｄ、　Ｊ＝９゜１）１）
；　６．６８（ｄｄ、　Ｊ＝４．９．ＩＨ）；６．２３
（ｓ、　３Ｈ）ｉ３，２−３．７　（ｍ。

２Ｈ）；　３．１３　（ｓ＋、　６Ｈ）；１．２６　（
ｔ。

Ｊ＝８．３Ｈ）。

前段階の２−キノロン＜１０）　０．３　ＩＩ　（１，
１５ミリモル）及び無水ＥｔＯＨ２５ミＩＪ　ＩＪフッ
トル中ＮａＢＨ４０、Ｉ　Ｆ　（２，６ミリモル）の混
合物を２４時間撹拌した。さらにＮａＢＨ４０，Ｉ　Ｐ
を加え、反応混合物を室温で一晩撹拌した。再び、　Ｎ
ａＢＨ４０，１ｊ’を加え、反応混合物音７０℃で２４
時間加熱した。次に、ＮａＢＨ４０，３Ｆを加え、２４
時間加熱を続けた。

溶媒を蒸発させ、残留物にシリカゲル１００Ｐ上でクロ
マトグラフィを行い、ＭｅＯＨとＣＨ，ＣＩ□（容積比
＝２．５％）を用いて浴出した。第５５〜第８５分画（
１２ミリリットル／分画）を混合し、濃縮して、淡い黄
色の固形物（融点：１０５−１０７℃）でソヒドロキシ
ロン０．１４７に得た。

分析：　”ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ　ｇ　）　’７．１０　
＜ｄ、　、ｒ＝ｓ、Ｉｎ）；６．３３　（８，ＩＨ）；
　３．４０　（８゜３Ｈ）；　３．２４　Ｃｍ、　５Ｈ
）：２．９７　（ｓ、　６Ｈ）；　１．１８　（ｔ＋Ｊ
＝８．３Ｈ）。

７−ヒドｏ＊シー３−エトキシカルブニル−３゜乾燥ジ
オキサン８ミリリットル中の７−ヒドａキシ−３，４−
ジヒドロ−２−キノロン（Ｊ２）（エヌ、シク゛９マツ
（Ｎ、Ｓｈｉｇｅｍａｔａｕ）　、　ｒｃｈｅｍ、Ｐｈ
ａｒｍ、ＢｕｌｌＪ９：９７０（１９６１年）〕のスラ
リーに、ジヒドロビラン８ミリリツトル及びｐ−）ルエ
ンスルホン酸５ｑを加えた。反応混合物を不活性ガス雰
囲気下、９０分間撹拌し、次に）１２０１５０　ミリリ
ットルを用いて希釈した。エーテルの５０ミリリツトル
分量の３仕損を用いて、それを抽出し、抽出物を混合し
て無水炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）　上で乾燥した。濾
過及び蒸発により、油状物質２ｙを得、ヘキサンを用い
てずシつぶし、結晶化した。

それを乾燥し、２−テトラヒドロピラニルエーテルＣ１
３）　（融点：１２９〜１３１℃）の白色の結晶１．１
８　Ｆ　（７８％）を得た。

ト　ルエ　ン　５０　ミ　リ　リ　ッ　ト　ル及びＨ２
Ｏ１ミ　リ　リ　ットル中のＮａｐ）ｆｌｙの溶液４ミ
リリツトルの混合物中の（１３）の２．４７Ｆ　（１０
ミリモル）及びベンジルトリエチルアンモニウムクロリ
ド２２８〜のスラリーを不活性雰囲気下、室温で撹拌し
た。ヨウ化メチル（１，２６ミリリットル　ミリモル）
ヲ加え、反応混合物を急速に４７℃（油浴）で２０時間
撹拌した。次に、ＣＨＣｌ３の２５０ミリリツトル分Ｉ
を用いて希釈した。ＣＨＣｌ　３抽出物をトルエン相と
混合し、乾燥し、留去した。油状残留物をヘキサンから
結晶化し、白色の固形物（融点：５３−５５℃）として
（１４）を２．５６Ｆ（９３％）得た。

乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２ミリリツトル中の
新しく蒸留したイソプロピルシクロヘキクルアミン０．
３１５　ミリリットルの溶液全２５ミリリツトルフラス
コ中に入れた。巨（様のアミン帆３１５ミリリットルを
５ミリリツトルフラスコ中のＴＨＦｌ、５ミリリンドル
に溶解することによシ、第二の溶液を製造した。両方の
溶液を、不活性雰囲気下撹拌しながら一７８℃まで１却
し、ｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍへキサン＠液の１．
２ミリリツトルを１．５分ＶＣ鉦シ注入器から１滴ずつ
反すさせ、リチウムイソプロピルシクロへキシルアミド
ヲ生成した。第一の溶液には、ＴＨＦ　の１ミＩＪ　Ｉ
Ｊシソトル中Ｃ１４）５０（ｌｖ’に６分間ｖｃ　Ｂ　
、！ｌ）　、−滴スつ加えた。反応混合物は、−７８’
Ｃで５分間に巨シ撹拌し、次にＴＨＪ”　０．５ミリリ
ツトル中の炭酸ソエテル０．１２ミリリットルの浴液を
、注入器にょ９１０分間Ｖこ斑シー滴ずつ加えた。さら
に３分間経過の後、リチウムイソプロピルシクロへキシ
ルアミドの第二の醇散を加え、次に災ｒ枚ヅエチルをさ
らに０６１２ミリリットル加Ｚ、−ｆｃ。−７８℃テ２
０分間経過の後に１反応混合物を室温に−ｉで加熱し、
１０分間撹拌し、次［Ｈ２Ｏ２ミリリットル中の酢酸０
．２ミＩＪ　リットルを用いて中和した。反応混合物を
Ｈ２Ｏ１００ミリリツトルとエーテル３５ミリリツトル
に分配した。エーテル相を分離し、乾燥し、濾過し、留
去し、そして残留物を高真空下で乾燥し、黄色の油状物
質を得た。それにシリカグル６０り上で、クロマトグラ
フィを行い、ＣＨ，α、とＥｊＯＨ（容積比２９：１）
を用いて溶出し、９ミリリツトル分画を集めた。第２９
〜第５１分画を混合し、留去し、透明な淡黄色油状物質
でエステル（１５）の５４８〜（収率８６％）を得た。

Ａ（！ＯＨとＨ２Ｏ（容積比：３：１）中のテトラヒド
ロピラニルエーテル（１５）の溶液を室温で１７時間撹
拌した。混合物ｔ！Ｉ縮し、トルエン１０ミリリツトル
を加え１次に留去して、白色の固形物（融点＝１２１〜
１２３℃）を得た。

分析二計算値二〇工ａＨ１，，ＮＯ３：Ｃ，６２，６４
；　Ｈ，６，０７；Ｎ、　５．６２゜ 実測値：　Ｃ，６２，９８；Ｈ，６，２５，Ｎ、　５．
２７゜”ＨＮＭＲ（ＣＤＣ１３）Ｊ　ニア、４５（ｂｒ
ｏａｄ、ＩＨ）；　７．０５　（ｄ。

Ｊ＝８．ｉｎ）；　６．６７（ｓ、ＩＨ）；６．５７（
ｄｄ、Ｊ＝２．８．ＩＨ）；４．２０　（ｔ。

Ｊ＝７，２Ｈ）；３．４０（８，３Ｈ）　；３．８−３
．０（ｍ、３Ｈ）；１．２０（ｑ、Ｊ＝７，３Ｈ）−、
クマリｙ３１４　（イースマンオーガニックケミカルズ
社（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉ　ｃ
ａｌｓ　）製、０．１ｊｉｌ）、１０％Ｐｄ／Ｃ０，０
５Ｆ及び酢酸２５ミリリツトルの混合物を水素５０　ｐ
ｓｉ圧力及び温度５０℃下に置き、２４時間振とうした
。触媒をセライトにょシ濾過することにょシ除去し、溶
液ｆｔ濃縮した。

褐色の残留物にシリカゲル４０Ｐ上でクロマトグラフィ
を行い、アセトンとメチレンクロリド（容積比：ｌ：１
９）を用いて浴出した。第３〜第１７分画（１５ミリリ
ットル／分画）を混合し、真空下で濃縮した。生成物を
メチレンクロリド−ヘキサンから結晶化し、白色の針状
物質（融点１４１−１４３℃）　０．０３　Ｆ　’（得
た。

分析：計算値：　ｃｍ、ｎ２□ｏ４Ｎ：ｃ、　６８−６
１　；　Ｈ＋６−７１　；Ｎ、　４．４４゜ 実測値：　Ｃ，６８，２５；　ｎ、　６．９６：Ｎ、　
４．４９゜第６図に示した一般式の化合物は、Ｒ１が水
素原子、シフ／又ｆｌ　−ＣＯＯＲ’　、　−ＣＯＮＩ
−ＩＲ’　４　Ｌ　＜　ハ、−ＣＯＮ（Ｒ’Ｌ＋　（こ
のとき、Ｒ６は水素原子、アルキル、アルケニル、又は
アリールである）であシ、かつＹが０又はＮ−Ｒ’（こ
のときＲ５は水素又は低級アルキルである）であるもの
に関して、適当な出発クマリン又は２−キノロンを選択
することによシ製造することができる。

ノロン ＭｅＯＨ４０ミリリットル中の７−ソメチルアミノー２
−キノ口／〔エイ、ライス（Ａ、Ｒｉｃｅ　）　Ｉ”Ａ
ｎｎ。

Ｃｈｉｍ、Ｊ４８：９５８−９９６（１９５８年））１
．０ｊｌ　（５，７ミリモル）の浴液に、マグネシクム
１．３ｊｉ（５，７ミリモル）を加えた。反応混合物を
、蒸気浴で、ゆるやかに温め、次に、室温で２時間撹拌
した。次に酢酸（８ミリリツトル）を加え、溶液を濾過
した。Ｐ液を濃縮し残留物にシリカダル２２０ｐ上でク
ロマトグラフィを行い、ＣＩ（、Ｃ１２とＭ１３０Ｈ（
容積比：　９７．５　：　２，５　）を用いて溶出した
。第５０〜第６０分画（１２ミリリットル／分画）を混
合し、濃縮して、白色の固形物（融点＝１５４〜１５６
℃）のソヒドロキシロン０．１４　Ｆを得た。

分析：　”ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ　３）δニア、ｏｏ（ａ
、　Ｊ＝８．　ｘｎ）； ６．４０（ｄｄ、　Ｊ＝２．８．　ｉｉｉ；６、＋３（
ｄ、　Ｊ＝２．　ＩＨ）； ２．９３（８，６Ｈ）；　２．７３ （ｍ、　４Ｈ）。

過酸化水素の検出 下記の表に列挙したソヒドロキシロン類及ヒジヒドロク
マリン類の燐酸ナトリウム緩衝液（１，０μＭ、ＰＨ７
，０又は７．５）を、適当な化合物のエタノール又はＤ
ＭＦ−エタノール溶液の緩衝液を用いて、次々に希釈す
ることにより製造し’ｆｃｏ　溶液を３７℃浴中で温め
、次に、ｌη／ミリリットルのワサビダイコンペルオキ
シダーゼ酵素の４０マイクロリツトルを１度に加えた。

キュベツト中の内容物を混合し、螢光性を少くとも５０
秒間（水晶セル及びその内容物は３７℃に一足に保った
）監視した０次に、冷水中に希釈し８時間よシ短い時間
０℃に保存した過酸化水素のｌ定置ｔ″、ジヒドロキシ
ロン対ペルオキシダーゼの所望の比に適した分１加えた
。次に螢光性を６００秒間に司シ監視した。

化合物（５）　、　Ｃ６）　、　（７）、　Ｃ１１）　
、　（１６）及び（１７）の螢光性の値は、研究の対象
物と同様の螢光出力を達成するのに必要となるであろう
螢光性の基準となる７−ヒドロキシ−３−（Ｎ−エチル
カルデキサミド）クマリン（米国特許第４，２７３，７
１５号）の濃度（ｎＭ）の単位で報告した。化合物（８
）は、光子７秒で報告されている。全てのスリット幅は
、２ナノメーター（ｎｍ）に設定した。

螢光性は、ＳＬＭ８０００分光螢光計（米国、イリノイ
州、ウルパナのＳＬＭインスツルメンツ社Ｓ　ＬＭ　Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　、　Ｉｎｃ、　）　製）にかけ
、水晶−ｔル中で測定した。スペクトルを処理する為に
ヒユーレット−パンカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋ
ａｒｄ　８９１５　Ａ　）８９１５Ａコンピユーターを
使用した。

結果を表１に示し、本発明の化合物が過酸化水素の存在
に対して有用な螢光反応を示すことを実証する。

上記の本発明の他の変種や変型を、本発明の精神及び範
囲を離れることなく、数多く製造できることは明らかで
ある。

【図面の簡単な説明】

第１及び第２図は、それぞれ本発明の化合物一般及び好
ましいソアルキルアミノ誘導体の酸化の予想される反応
メカニズムである。 第３乃至第６図は１本発明の指示薬化合物を製造する為
の特定の合成径路のフローダイヤグラムである。 ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、２ （ ＦＩＧ、３ 第１頁の続き

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （式中、Ｒ１は水素原子、アルキル、アルケニル、アリ
   ール、又は電子吸引基を表わし；Ｒ２はヒドロキシル又
   は−ＮＲ３Ｒ’　を表わし、この時、Ｒ３及びＲ４は、
   同一であっても異っていてもよいが、水素原子、アルキ
   ル、アルケニルもしくはアリールを示し；そして、Ｙは
   ＝０又は＝　Ｎ　−Ｒ５を表わし、この時Ｒ５は水素原
   子もしくは低級アルキルを示す）によって表わされる化
   合物。 ２　Ｒ２が−ＮＲ３Ｒ’であシ、かつＲ３及びＲ４が共
   に低級アルキルである特許請求の範囲第１項記載の化合
   物。 ３、Ｒ３及びＲ４が共にメチルである特許請求の範囲第
   ２項記載の化合物。 ４　Ｙが＝Ｎ−Ｒ５である特許請求の範囲第２項記載の
   化合物。 ５、Ｒ１が水素原子、アルキル、アルケニル、アリール
   、シアン、カルボキシル、カルボアルコキシ、カルボア
   リールオキシ、カルボキサミド、スルホニル、スルホキ
   シ、スルホニウム、ホスホニル、ホスホニウム、ハロ又
   ハニトロである特許請求の範囲第１項記載の化合物。 〔式中、Ｒ１は水素原子、シアン、又は−ＣＯＯＲ’　
   、　−ＣＯＮＨＲ６もしくは−〇〇Ｎ（Ｒ’）２（この
   時、Ｒ６は水素原子、アルキル、アルケニルもしくはア
   リールを示す）を表わし；Ｒ３及びＲ４は、同一であっ
   ても異つていてもよいが、低級アルキルを表わし；そし
   て、Ｒ５は水素原子又は低級アルキルを表わす〕 によって示される特許請求の範囲第１項記載の化合物。 ７、Ｒ３及びｔ　が共にメチルである特許請求の範囲第
   ６項記載の化合物。 ８、Ｒ１が−〇〇〇Ｒ’　、−ＣＯＮＨＲ６又は−ＣＯ
   Ｎ　（Ｒ’　）２である特許請求の範囲第７項記載の化
   合物。 ９、Ｒ６が水素原子又はメチルである特許請求の範囲第
   ５８項記載の化合物。 １０、過酸化活性物質の存在下、試験試ｆ＋’＋特許請
   求の範囲第１項記載の化合物と接触せしめ。 過酸化水素による該化合物の酸化によって生じる生成物
   の蛍光性を測定する工程からなる試験試料中の過酸化水
   素の測定法。 １１　過酸化活性物質がペルオキシダーゼである特許請
   求の範囲第１０項記載の方法。 １２、特許請求の範囲第１項記載の化合物と過酸化活性
   物質からなる試験試料中の過酸化水素を測定するための
   試験用組成物。 １３、過酸化活性物質がペルオキシダーゼである特許請
   求の範囲第１２項記載の試験用組成物。 〔式中、Ｒ１は水素原子、シアン、又は−ＣＯＯＲ６，
   −ＣＯＮＨＲ６もしくは一〇〇Ｎ（Ｒ’）２　（ここで
   Ｒ６は水素原子、アルキル、アルケニルもしくはアリー
   ルである）を表わし；そして、Ｙは；０又は＝Ｎ−Ｒ５
   （ここで、Ｒ５は水素原子もしくは低級アルキルである
   ）を表わす〕によって示される化合物。 １５、Ｙが一〇である特許請求の範囲第１４項記載の化
   合物。 １６、　Ｒ”　が−ＣＯＯＲ６（ここでＲ６は水素原子
   又は低級アルキルを表わす） である特許請求の範囲第１５項記載の化合物。