CN114436892A - 一种Aβ响应的光激活荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种Aβ响应的光激活荧光探针及其制备方法和应用，该探针结构式如下式Ⅰ所示。本发明的探针是具有光激活功能的探针监测Aβ，以邻硝基苄醇为光响应基团。本发明的探针制备简单，使用方便，从响应前后的荧光强度变化可以快速检测Aβ，实现快速检测的目的。该探针的特点在于本身无荧光不能与Aβ结合，但在光激活下可与Aβ迅速结合，产生明显的荧光信号增强，从而实现对Aβ选择性快速检测。因此，本发明中的探针可以作为一个有效的工具来检测阿兹海默症中的生物标记物Aβ，可以为设计Aβ响应探针提供思路，具有早期诊断阿兹海默症的潜力。

Description

一种Aβ响应的光激活荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种探针及其制备方法和应用，尤其涉及一种Aβ响应的光激活荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
阿尔茨海默症(AD)是一种常见的神经退行性疾病，主要在老年人群中盛行，影响老年的生活质量和健康状况。研究表明，AD生物标志物的变化在临床症状出现前几十年就已经存在。其中一种生物标记物是β-淀粉样肽，其在毛细血管、动脉和小动脉壁上沉积。因此，对Aβ的检测至关重要。荧光探针具有灵敏度高、选择性好、无创等优点，是一种检测Aβ的可靠方法，然而已经发明的探针因为不能通过血脑屏障、背景荧光信号干扰、合成复杂等限制了进一步应用。近年来，引入刺激激活基团(包括PH激活基团、酶激活基团、光激活基团)设计荧光探针的研究蓬勃发展。但是目前没有人将光激活设计的探针用于阿兹海默症生物标记物Aβ的检测。
发明内容
发明目的：本发明的目的是提供一种响应高效的Aβ响应的光激活荧光探针；本发明的另一目的是提供一种Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法；本发明的另一目的是提供Aβ响应的光激活荧光探针在对阿兹海默症疾病生物标记物的响应性检测和脑组织切片成像中的应用。
技术方案：Aβ响应的光激活荧光探针，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003491755650000011
式中R1、R2各自独立地为-CN、-COOC2H5、苯并噻唑基团。
进一步地，R1为-CN或-COOC2H5，R2为-CN或苯并噻唑基团。
进一步地，荧光探针选自下组任一化合物：
Figure BDA0003491755650000021
进一步地，所述的制备方法为：
(1)在碱性条件下，4-(二甲基氨基)苯基硼酸盐酸盐和4-溴-2-羟基苯甲醛溶于有机溶剂中，反应后纯化得到中间体化合物1；
(2)将中间体化合物1溶于有机溶剂中，再加入碳酸钾和碘化钾以及4，5-二甲氧基-4-硝基溴苄进行反应，纯化后得到中间体化合物2；
(3)将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和丙二腈，反应后得到PTAD-1；
或者，将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和苯并噻唑-2-乙腈，反应后得到PTAD-2；
或者，将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和2-(2-苯并噻唑)乙酸乙酯，反应后得到PTAD-3。
进一步地，步骤(1)中，加入钯催化剂，钯催化剂为四三苯基磷钯，反应时间为5-10h；
进一步地，步骤(2)中，避光条件下反应搅拌4-6小时，且采用硅胶柱色谱法纯化粗品。具体的，将中间体化合物1溶于乙腈中并加入碳酸钾和碘化钾。然后在氮气保护下加入4，5-二甲氧基-4-硝基溴苄，70℃避光条件下搅拌4-6小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，转移到分离漏斗中，混合物用二氯甲烷提取，并将有机层在无水硫酸钠上干燥，过滤，减压浓缩。采用硅胶柱色谱法纯化粗品，得到化合物2。
进一步地，步骤(3)中，制备PTAD-1过程中，制备PTAD-1过程中，避光条件下搅拌4-6小时，得到的产物经过冷却过滤，用乙醇洗涤无需进一步纯化；具体的，将中间体化合物2溶于二氯甲烷中并加入哌啶，氮气保护下加入丙二腈，室温避光条件下搅拌4-6小时；形成的固体经过冷却过滤，用乙醇洗涤无需进一步纯化，得到探针PTAD-1；
制备PTAD-2过程中，反应时间为10-12小时；具体的，将化合物2溶于二氯甲烷和乙醇的混合溶剂中并加入哌啶，氮气保护下加入苯并噻唑-2-乙腈，在40℃避光条件下搅拌10-12小时。形成的固体经过冷却过滤，用甲醇洗涤，无需进一步纯化，得到探针PTAD-2；
制备PTAD-3过程中，反应时间为8-10小时；具体的，将化合物2溶于乙醇中并加入哌啶，氮气保护下加入2-(2-苯并噻唑)乙酸乙酯，在80℃避光条件下搅拌8-10小时。减压浓缩除去溶剂，采用硅胶柱色谱法纯化粗品，得到探针PTAD-3。
另一方面，本发明的Aβ响应的光激活荧光探针在检测阿兹海默症疾病生物标记物响应性检测中的应用，以及在制备检测阿兹海默症疾病生物标记物响应性的试剂中的应用。响应性检测的过程为：将含有探针的反应体系中加入Aβ，将该反应溶液快速混合后，用灯照射同时在石英比色皿中孵育不同时间，测定其荧光发射光谱。
另一方面，本发明的Aβ响应的光激活荧光探针在脑组织切片成像中的应用。成像的过程为：取一定浓度的探针与脑切片共孵育，并暴露于灯下照射，最后用倒置荧光显微镜进行脑组织切片成像。
本发明提出的光激活探针结构，在Aβ存在的情况下，经过光照光敏键断裂，可以释放荧光团，接着与Aβ的疏水域结合，通过疏水性相互作用产生荧光信号，从而以高灵敏度和信噪比检测Aβ。探针作为一个有效的工具来检测阿兹海默症生物标记物Aβ，具有临床早期诊断阿兹海默症的潜力。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)从响应前后的荧光强度变化就可以快速检测Aβ，实现了快速检测的目的。
(2)该探针的合成比较简单，并且与Aβ响应的机理是基于光敏键断裂释放出荧光团。
(3)该前药的特点在于本身无荧光，但光照后可与Aβ快速反应之后，产生明显的荧光增强，从而实现对Aβ选择性快速检测，具有临床早期诊断阿兹海默症的潜力。
(4)该探针引入光敏基团，为响应Aβ的探针设计方面提供一些思路。
附图说明
图1为PTAD-3探针光照后与Aβ孵育不同时间的荧光发射光谱；
图2为PTAD-3探针光照后与不同浓度Aβ孵育的荧光发射光谱；
图3为PTAD-3探针光照后在不同干扰物质存在下的荧光发射光谱；
图4为PTAD-3探针光照后与脑组织切片的成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
光激活荧光探针的制备
1、中间体化合物1的合成：
称取4-(二甲氨基)苯硼酸盐酸盐(800mg,4.0mmol)和4-溴-2-羟基苯甲醛(850mg,5.1mmol)溶解在乙二醇二甲醚(35mL)中。在氮气保护下加入四三苯基膦钯(287mg,0.25mmol)和碳酸钠水溶液(2M,41mL)。混合物在90℃下加热搅拌10小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，转移到分离漏斗中，加入100mL盐水。混合物用乙酸乙酯(100mL)萃取三次，有机层在无水Na2SO4上干燥，减压过滤浓缩。粗品经硅胶柱层析纯化得到化合物1。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ9.11(s,1H),8.12(d,J＝8.2Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,1H),7.75(d,J＝8.7Hz,1H),7.68-7.62(m,4H),7.56(ddd,J＝8.3,7.1,1.3Hz,1H),7.45(td,J＝7.6,7.1,1.1Hz,1H),6.92(s,2H),3.09(s,6H).
其中混合物在90℃下加热搅拌5小时同样可制得化合物1。
Figure BDA0003491755650000041
2、中间体化合物2的合成：
称取碳酸钾(411mg,2.96mmol)和碘化钾(63mg,0.37mmol)加入化合物1(503mg,1.82mmol)的乙腈溶液(25mL)中。然后在氮气保护下加入4,5-二甲氧基-2-硝基溴苄(400mg,1.66mmol)，在70℃黑暗条件下搅拌4h。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，转移到分离漏斗中，加入50mL蒸馏水。混合物用二氯甲烷(50mL)萃取三次，结合的有机层在无水Na2SO4上干燥，减压过滤浓缩。以正己烷/CH2Cl2(1:4,v/v)为洗脱剂，经硅胶柱层析纯化得到化合物2。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.26(s,1H),7.77(d,J＝8.1Hz,1H),7.75(s,1H),7.71-7.63(m,3H),7.46(s,1H),7.40(d,J＝8.2Hz,1H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),5.69(s,2H),3.93(d,J＝19.8Hz,6H),2.99(s,6H).
其中在70℃黑暗条件下搅拌6h同样可制得化合物2。
Figure BDA0003491755650000042
3、化合物PTAD-1的合成：
称取中间体化合物2(50mg,0.1mmol)和丙二腈(34mg,0.45mmol)溶于二氯甲烷(20mL)混合物中并加入两滴哌啶，在氮气保护下室温搅拌5h。形成的固体通过布氏漏斗抽滤并用乙醇洗涤滤渣，得到探针PTAD-1。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.36(s,1H),8.11(d,J＝8.5Hz,1H),7.88-7.66(m,3H),7.53-7.49(m,2H),7.42(s,1H),6.83(d,J＝9.0Hz,2H),5.68(s,2H),3.93(s,3H),3.90(s,3H),3.00(s,6H).
其中在在氮气保护下室温搅拌4或6h同样可制得化合物PTAD-1。
Figure BDA0003491755650000051
4、化合物PTAD-2的合成：
称取中间体化合物2(100mg,0.23mmol)和苯并噻唑-2-乙腈(48mg,0.28mmol)溶于无水乙醇(8mL)和二氯甲烷(20mL)的混合物中并加入两滴哌啶，在40℃条件下搅拌过夜。形成的固体通过布氏漏斗抽滤并用乙醇洗涤，得到探针PTAD-2。1H-NMR(500MHz,CDCl3)δ8.94(s,1H),8.44(d,J＝8.3Hz,1H),8.03(d,J＝8.2Hz,1H),7.92(d,J＝7.9Hz,1H),7.82(s,1H),7.62(d,J＝8.4Hz,2H),7.53(s,2H),7.50(s,1H),7.44(d,J＝7.7Hz,1H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.28(s,2H),5.70(s,2H),4.00(s,3H),3.98(s,3H),3.08(s,6H).
其中在40℃条件下搅拌10或12h同样可制得化合物PTAD-2。
Figure BDA0003491755650000052
5、化合物PTAD-3的合成：
称取化合物2(52mg,0.12mmol)和2-(1,3-苯并噻唑-2-基)乙酸乙酯(43mg,0.19mmol)溶于无水乙醇(20mL)中并加入5滴哌啶，在80℃条件下搅拌10h。粗品以正己烷/CH2Cl2(1:10,v/v)为洗脱液，经硅胶柱层析纯化得到PTAD-3。1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.42(s,1H),8.01(d,J＝8.2Hz,1H),7.89(d,J＝7.9Hz,1H),7.79(s,1H),7.58-7.46(m,5H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.25(s,2H),6.82(d,J＝8.4Hz,2H),5.66(s,2H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),3.97(s,3H),3.84(s,3H),3.03(s,6H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H).
Figure BDA0003491755650000061
其中在80℃条件下搅拌8h同样可制得化合物PTAD-3。
实施例2
称取实施例制备的探针PTAD-3 1mg溶于1.56mL DMF溶液中，配制成浓度为1mM的标准液；用PBS缓冲液稀释到终浓度为250nm并放置于四通石英比色皿中。然后加入Aβ溶液(25μM)100μL放置于紫外灯下光照孵育。在453nm波长的激发下，将狭缝宽度设为5.0/5.0nm，收集了溶液在463-800nm波段的荧光发射光谱。如图1所示，探针PTAD-3的荧光强度曲线随着光照时间的增加而增加，并在20分钟到达峰值。说明探针光照后能够与Aβ很好的响应，光照可以激活探针释放荧光信号，为检测AD的探针设计提供思路。
实施例3
称取实施例制备的探针PTAD-3 1mg溶于1.56mL DMF溶液中，配制成浓度为1mM的标准液；用PBS缓冲液稀释到终浓度为250nm并放置于四通石英比色皿中。然后加入不同浓度Aβ溶液(0-100μM)放置于紫外灯下光照孵育20分钟。在453nm波长的激发下，将狭缝宽度设为5.0/5.0nm，收集了溶液在463-800nm波段的荧光发射光谱。如图2所示，探针光照后与Aβ响应具有很高的灵敏度，光激活的方法同时还能够降低探针本身的背景荧光信号。
实施例4
称取实施例制备的探针PTAD-3 1mg溶于1.56mL DMF溶液中，配制成浓度为1mM的标准液；用PBS缓冲液稀释到终浓度为250nm并放置于四通石英比色皿中。然后分别加入不同的干扰物质及25μM的Aβ溶液，包括碘离子硫酸根离子，钠离子，钾离子，铜离子，锌离子，镁离子，铁离子，谷氨酸，酪氨酸，精氨酸，甘氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，谷胱甘肽，二硫苏糖醇牛血清白蛋白，维生素C，硫酸酯酶(25U/ml)，β-葡萄糖苷酶(25U/ml)，葡萄糖氧化酶(25U/ml)。然后在灯光照下孵育20分钟。在453nm波长的激发下，将狭缝宽度设为5.0/5.0nm，收集了溶液在463-800nm波段的荧光发射光谱。如图3所示，荧光图显示，Aβ使得检测体系在575nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。说明探针对Aβ具有非常高的选择性，可用于近一步生物成像。
实施例5
将脑组织切片在稀释缓冲液(0.4％Triton X-100,1％山羊血清，2％TBS中的牛血清)中洗涤10分钟三次，然后在室温下用20％山羊血清封闭30分钟。切片与一抗6E10在4℃孵育过夜。稀释缓冲液冲洗10分钟三次后，室温下与二抗孵育2小时。然后用TBS冲洗10分钟三次。将PTAD-3(25uM)在50％乙醇/PBS中作为染色液，在灯下光照30分钟。在室温下用新鲜制备的染色液孵育脑片15分钟，然后用50％乙醇洗涤1分钟两次，然后用双蒸馏水洗涤2次。然后用Fluoro Shield安装介质(Abcam)覆盖切片，并涂上指甲油密封。使用具有绿色和红光激发通道的倒置荧光显微镜获得荧光图像。如图4所示，探针可在组织内暴露于光照下被有效激活并与Aβ结合，在生物医学的阿兹海默症疾病早期诊断领域具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.一种Aβ响应的光激活荧光探针，其特征在于，其结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003491755640000011
式中R1、R2各自独立地为-CN、-COOC2H5、苯并噻唑基团。
2.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针，其特征在于，R1为-CN或-COOC2H5，R2为-CN或苯并噻唑基团。
3.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针，其特征在于，荧光探针选自下组任一化合物：
Figure FDA0003491755640000012
4.一种根据权利要求3所述的Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的制备方法为：
(1)在碱性条件下，4-(二甲基氨基)苯基硼酸盐酸盐和4-溴-2-羟基苯甲醛溶于有机溶剂中，反应后纯化得到中间体化合物1；
(2)将中间体化合物1溶于有机溶剂中，再加入碳酸钾和碘化钾以及4，5-二甲氧基-4-硝基溴苄进行反应，纯化后得到中间体化合物2；
(3)将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和丙二腈，反应后得到PTAD-1；
或者，将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和苯并噻唑-2-乙腈，反应后得到PTAD-2；
或者，将中间体化合物2溶于溶剂中，然后加入哌啶和2-(2-苯并噻唑)乙酸乙酯，反应后得到PTAD-3。
5.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，加入钯催化剂，钯催化剂为四三苯基磷钯，反应时间为5-10h。
6.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，避光条件下反应搅拌4-6小时，且采用硅胶柱色谱法纯化粗品。
7.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，制备PTAD-1过程中，避光条件下搅拌4-6小时，得到的产物经过冷却过滤，用乙醇洗涤无需进一步纯化。
8.根据权利要求1所述的Aβ响应的光激活荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，制备PTAD-2过程中，反应时间为10-12小时；制备PTAD-3过程中，反应时间为8-10小时。
9.一种根据权利要求1-3所述的Aβ响应的光激活荧光探针在阿兹海默症疾病生物标记物的响应性检测中的应用。
10.一种根据权利要求1-3所述的Aβ响应的光激活荧光探针在脑组织切片成像中的应用。
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