JPS6019992B2 - ラクタ−ゼの製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、クルイベロマイセス （Ｋ１ｕＷｅｒｏｍｙｃｅｓ）属に属し、ラクターゼ生
成館がカタボラィト・レプレッション抵抗性である性質
、ラクターゼ生成館が構成性である性質、およびラクタ
ーゼ活性阻害剤の生育阻害に抵抗性である性質の少なく
とも１つの性質を有し、かつラクターゼ生成館を有する
菌株を栄養培地に培養し、培養物中にラクターゼを生成
蓄積せしめ、核培養物よりラクターゼを採取することを
特徴とするラクターゼの製造法に関するものである。

ラクターゼは、別名８−ガラクトシダーゼとも呼ばれ、
情乳動物の乳汁中に含まれる乳糖を加水分解しグルコー
スとガラクトースに分解する酵素で、近年乳糖不耐症の
治療や乳製品の加工上、注目されている酵素である。

従来微生物を用いるラクターゼの製造に好適な微生物と
しては、カビ類、細菌類、酵母類の多くのものが知られ
ているが、中でもクルイベロマイセス属に属する酵母の
ラクターゼは、食品添加物としても優れた性質を有する
ため極めて有用な酵素の一つである〔持関昭５３−２４
０９４、バイオケミカル・バイオフイジカ・アクタ（Ｂ
ｉＭｈｅｍｉｃａｅｔＢｉｏｐｈ鱗ｉｃａＡｃｔａ）１
６７巻、３７３ １９鼠ふ ジャーナ０ル・オブ・デア
リイ・サイエンス（Ｊ．ＤａｉびＳｃｉｅｎｃｅ），９
亀１６２０，１９７４〕。

しかしながら、これらのクルイベロマイセス属酵母の生
産するラクターゼの生成量は、工業的生産に供するには
なお低く、より経済的に有利な方法の開発が望まれて夕
いた。その生成量が低い原因としては、微生物本釆のラ
クターゼ生成能力が低いことの外に、グルコースその他
の糖の存在によって本酵素の生成が抑制される、いわゆ
るカタボラィト・レプレッションの強い調節を受け、表
１の野性株の場合につ０いて示すように、培地中に１％
以上のグルコースその他の糠類（例えば、フラクトース
、シュークロース等）が存在するとラクターゼの生成が
抑制されるので、これらの糖類を基質とする発酵生産に
おいては充分な量のラクターゼが生成しないこ夕とにあ
る。また、クルイベロマイセス属酵母における本酵素の
生成は乳糖あるいはガラクトースといった誘導物質を発
酵塔地に通常１％程度以上添加すると顕著に誘導される
ことが知られている〔ジヤーナル・オブ・ミルク・フー
ド・テクノロジイ（Ｊ．ＭｉｌｋＦ広めＴｅｃｈ血１）
３３，４５１．１９７０〕が、これらの譲導物質が高価
な物質であるために、これら譲導物質添加によるラクタ
ーゼの生産は工業的に不利である。本発明者らは、食品
添加物その他の使途に適する性質を持つラクターゼの工
業的に有利な生産について鋭意研究を重ねた結果、クル
イベロマイセス・ラクチス（Ｋ１ｕＷｅｒｏｍｙｃｅｓ
ｌａｃｔｉｓ）属に属し、ラクターゼ生成がカタポラィ
ト・レプレッションに抵抗性（すなわち、グルコースそ
の他の糖の高龍度存在下でラクターゼ生成が抑制されな
いか抑制されにくくなっている）である性質、ラクター
ゼ活性の阻害剤による生育阻害に抵抗性である性質、お
よびラクターゼの生成が構成性（すなわち、譲導物質無
添加あるいは誘導物質の添加館．度が低くても著量のラ
クターゼが生成する）である性質の少なくとも１つの性
質を有する菌株が、極めて高力価のラクターゼを生産す
ることを見出し本発明を完成した。

従来、酵母類で、ラクターゼの生成がカタボラィト・レ
プレツションに抵抗性となった変異株、あるいはラクタ
−ゼ活性阻害剤の生育阻害に対して抵抗性となった変異
株またはそのラクターゼ生成能が構成的（非議導的）に
なった変異株は知られておらず、また、かかる性質を有
する変異株が野性株よりも高単位のラクターゼを生成す
ることも知られていない。以下本発明について詳細に説
明する。

本発明における使用菌は、クルィベロマィセス属に属し
、ラクターゼ生成館がカタボラィト・レプレッション抵
抗性である性質、ラクターゼ活性阻害剤の生育阻害に抵
抗性である性質、およびラクターゼの生成が構成性であ
る性質の少なくとも１つの性質を有し、かつラクターゼ
生成能を有する菌株が挙げられる。

これらの菌株を差異処理で得る場合は、クルィベロマィ
セス・ラクチスに属する適当な菌株に、Ｘ線照射、紫外
線照射、ＮＴＣ処理などの通常の差異処理を施こし、例
えば以下のような選択法によって取得することができる
。すなわちラクターゼ活性阻害剤の生育阻害に抵抗性の
変異株は、乳糖を単一の炭素源とする培地〔乳糖１％、
（ＮＨ４）夕０４０．５％、ＫＨ２Ｐ０４０．０５％、
Ｋ２ＨＰ０４０．０５％、ＭｇＳ０４・７比００．０２
５％、ＭｈＣぐ２・４日２００．００１％、徴量金属液
（ホウ酸ソーダ・１０Ｋ和物磯倣、モリブデン酸アンモ
ニウム・４水和物３７のｐ、硫酸亜鉛・７水和物８．８
の夕、硫酸鋼．・５水和物２７０雌、塩化マンガン・４
水和物７．２の２および塩化第二鉄・６水和物９７０の
３を蒸留水に溶かしてＩＺとしたもの）１の‘／〆、ビ
タミン縁液（サィアミン１柵、リボフラビン０．５の２
、パラアミノ安息香酸０．５の３、ニコチン酸２．０雌
、パントテン酸２．０のｐ、ピリドキシン０．賭、ヨウ
素０．０５地、コリン２．０の夕、イノシトール１０の
９、ビオチン０．００２のｏ、ビタミンＫＩ．０柳、お
よびビタミンＢ２０．００１秘を蒸留水にとかして１そ
としたもの）１の‘／そ、寒天２％〕にラクターゼ活性
阻害剤、例えば、ヨウ素あるいは、Ｐーアミノフェニル
ー１一チオーガラクトサイドを親株の生育を阻止する濃
度添加した寒天平板上に、変異処理した菌体を適当な菌
濃度塗布し、２〜３日間３０ｑｏで培養後世現した集落
を抵抗性変異株として選択することができる。ラクター
ゼ生成がカタボライト・レプレッション抵抗性あるいは
構成性の変異株は、上述のラクターゼ阻害剤の生育阻害
に抵抗性の変異株の中から、あるいはフェニルー８−○
ーガラクトシドを単一炭素源とする寒天平板上に、差異
処理した菌体を適当な菌濃度塗布し、２〜３日間３０℃
で培養後出現する集落の中から、あるいはその他の公知
の方法によって高頻度に分離することができる。本発明
に使用する代表的な微生物としては、上述の方法でヨウ
素抵抗性株として分離したクルィベロマイセス・ラクテ
イス８１Ｒ−１０と、母Ｒ−１０から上述の方法でフェ
ニルー８一Ｄ−ガラクトシド資化性株として誘導した変
異株１０Ｒ−７をあげることができる。

両株は表１に示すように、培地中に１％以上のグルコー
スを添加してもラクトースの生成が明らかに抑制されに
くくなったいわゆるカタボラィト・レプレッション抵抗
性の変異株である。表１ 本表の実験は実施例２と同一の方法で行われた。

また、１にＲ−７は、この性質に加えて、表２に示すよ
うにラクターゼ生成の誘導物質であるガ＊ラクトースや
乳糖を添加しない培地においても野性株と比較して明ら
かに高いラクターゼ生成能を持ち、いわゆるラクターゼ
生成が構成性の変異株である。

表２ 本表の実験は実施例３と同一の方法で行われた。

また、１にＲ−７は乳糖やガラクトースといった誘導物
質が存在する場合にはさらに高力価のラクターゼを生成
するが、野性株の場合より低濃度（１％以下）の誘導物
質の添加でそれらの物質の誘導効果は最大になり、この
種の変異株を用いるラクターゼの発酵生産ではこれらの
誘導物質の使用量は著しく低減される。

クルイベロマイセス・ラクテイス乳Ｒ−１０およびクル
イべ０マイセス・ラクテイスＩＯＣＲ−７は工業技術院
微生物工業技術研究所にそれぞれ徴工研菌第５７１ぴ号
および第５７１１号として寄託されている。

クルィベロマィセス・ラクティスの菌学的性質は“ザ・
イースト”ロツダー糠、１９７１，払９直に記載がある
。

本発明のラクターゼの製造に当っては、菌株を栄養塔地
に好気的に培養する。

本発明方法で使用される培地については、主炭素源のほ
か窒素線、無機物、その他の栄養物を程よく含有する培
地ならば、合成培地、または、天然塔地の何れも使用可
能である。

また必要に反じて、乳糖、ガラクトース等のラクターゼ
譲導物質夕を添加する場合もある。炭素源としては、グ
ルコース、フラクトース、シュークローズ、澱粉、澱粉
加水分解物、廃糖密などの炭水化物、グリセロール、ソ
ルビトール、マニトールなどの糠アルコール、エタノー
ル、メタノールなどのアルコー０ル、コハク酸、フマー
ル酸、乳酸、酢酸などの有機酸、グルタミン酸、アスパ
ラギン酸などのアミノ酸、またはｎ−パラフィンなどの
炭化水素など種々のものが使用できる。窒素源としては
、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、
炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなど各種の無機お
よび有機のアンモニウム塩類あるいは、尿素および他の
窒素含有物、並びにべプトン、肉エキス、酵母エキス、
コーン・スチープ・リカ−、カゼイン加水分解物、フィ
ッシュミールあるいはその消化物、脱脂大豆粕あるいは
その消化物、蟻加水分解物など種々の天然物が使用可能
である。更に無機塩として、燐酸カリウム、硫酸マグネ
シウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガンお
よび炭酸カルシウムなども使用する。使用する微生物が
生育のため栄養源を必要とする場合には、当然その要求
を満足させる栄養源を適当な添加量塔地に加えなくては
ならぬが、これらの物質は窒素源として使用される天然
物に含まれて添加される場合もある。培養は振函培養、
あるいは深部樽詩学培養など好気的条件下で行う。

培養温度は一般には、２０〜４０℃が好ましいが、菌が
生育する温度であれば、他の温度条件でも実施しうる。
培養中のｐＨは、中性から弱酸性付近に維持することが
高収率をうるためには望ましい。培養期間は、１〜５日
間で培養菌体中にラクターゼが生成する。培養終了後、
菌体を集菌し、菌体破砕後、常法によりラクターゼを回
収することができる。ラクターゼの力価は次の方法で測
定した。即ち、０ーニトロフエニルー８一Ｄーガラクト
ピラノシド２仇ｈＭを含有する基質液４の‘に、酵素液
１肌【を混合し、３７０で２０分反応後、ＩＭ濃度の炭
酸ナトリウム液０．５叫を加え反応を停止し、４２０ｈ
ムの波長で比色定量し、０ーニトロフェノールの検量線
より、生成した○−ニトロフェノール量を求める。同条
件で１分間に１０‐６Ｍの○−ニトロフェノールの生成
力をもって１単位と定める。以下に実施例をあげて、本
発明を具体的に説明する。

実施例 １ グルコース３％、乳糖１％、コーン・スチ−プ・リカー
１％、塩化アンモン０．２％、ＣａＣ０３０．５％の組
成よりなる種培地（ｐＨ７）１００泌を含む５００の【
客三角フラスコに、クルィベロマィセス・ラクティスの
変異株１にＲ−７（ヨウ素耐性−カタボラィト・レプレ
ツション抵抗性、ラクターゼ構成性変異株）を接種し、
。

ータリーシェーカー上で、３０℃の温度条件下で２餌時
間振濠培養して得た種培養液２０の‘宛を、２００の【
の発酵培地を含む邪魔板付きの２ぐ客三角フラスコに接
種して、３０００の温度条件下で２岬時間ロータリー・
シェーカー上で０振鰹培養した。用いた発酵塔地の組成
は、グルコース６％、ガラクトース０．９％、コーンス
チープリカー４％、酵母エキス０．２％、硫酸アンモニ
ウム１％、Ｋ比Ｐ０４０．０５％、Ｋ２ＨＰ０４０．０
５％、ＭｇＳ０４・７日２００．０２５％、ＭｎＣＺ２
・４日２００．００１タ％、ＣａＣ０３２％（ｐＨ７
．０）である。培養液２００の【ずつを遠心分離にかけ
て集菌し、これに１０の‘のクロロホルムを添加した後
Ｍ／１０のリン酸緩衝液（ｐＨ６．５）を加えて２００
叫となし、これを３０ｑｏの温度条件下で１筋時間振溢
して菌を自己０消化させた。このようにして得られた上
燈液中のラクターゼ活性は平均７２．５Ｕ／地であった
。同様にして抽出したラクターゼ含有液を集めて１夕と
なしこれを炉過して得られる上燈を４０００以下で減圧
濃縮して４５の‘となし、冷却後７０の‘の冷ェタノー
タルを添加してラクターゼ蛋白を沈澱させた。得られた
沈澱物のラクターゼ総活性は３１，２００Ｕであつた。
同様にして培養処理した野性株ＫＹ−５１８８の場合の
沈澱物のラクターゼ総活性は６，３１０Ｕであ０つた。

実施例 ２種培地２０の‘を含む２５０泌客三角フラス
コを用いて種培養を行い、発酵培地５の‘を含む大型試
験管を用いて、試験管振顔器上で発酵を行い、発酵培タ
地中のグルコース濃度と使用菌株を表３に示すように変
えたほかは、実施例と同一の方法で培養した結果表３に
示すごとき力価のラクターゼが生成した。

表３ 実施例 ３ グルコース１％、コーン・スチ−プ・リカー４％、酵母
エキス０．２％、硫酸アンモニウム１．０％、ＫＨ２Ｐ
０４０．０５％、Ｋ２ＨＰ０４０．０５％、ＭｇＳ０４
・７ＱＯ０．０２５％、ＭｎＣ 〆２ ・４日２００．
００１％、ＣａＣ０３２％の組成を有するｐＨ７．０の
発酵塔地、およびこれにガラクトースまたは乳糖を添加
した発酵塔地を用い、使用菌としてクルィベロマィセス
・ラクティスＫＹ−５１楓と１にＲ−７を用いた外は実
施例１と同様に実施した結果表４に示すごとき力価のラ
クターゼが生成した。

表４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ クルイベロマイセス属に属し、ラクターゼ生成能が
   カタボライト・レプレツシヨン抵抗性である性質、ラク
   ターゼ生成能が構成性である性質、およびラクターゼ活
   性阻害剤の生育阻害に抵抗性である性質の少なくとも１
   つの性質を有し、かつラクターゼ生成能を有する菌株を
   栄養培地に培養し、培養物中にラクターゼを生成蓄積せ
   しめ、該培養物からラクターゼを採取することを特徴と
   するラクターゼの製造法。 ２ 該栄養培地として乳糖およびガラクトースの含量が
   １％以下の培地を用いることを特徴とする特許請求の範
   囲第１項のラクターゼの製造法。