JPS60156393A - 発酵によるアコニツト酸製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はアコニット酸の製造、特に発酵によるアコニッ
ト酸の製造に関する。

アコニット酸はトリカプト属ならびに、ビートの根及び
サトウダイコンを含めた、他の植物類に存在する自然発
生酸である。この酸はサトウダイコン・ジュース及びシ
ロップから回収されたカルシウム・マグネシウム塩から
製造することができる。アコニット酸はクエン酸の脱水
によっても営利的に製造されている。アコニット酸はト
リカルボン酸サイクルの中間体であシ、このような中間
体という意味では多くの微生物によって産生されている
。しかし、これは通常有意な量では蓄積されていたい。

アコニット酸がメチレンブルー存在下でクロカビ（Ａｓ
ｎｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）　の発酵によって産
生°されると主張されているが（板目と馬場、日本展装
化学会誌１９４２年１８巻、１２号、１１２７−１１ろ
０頁、英文抄録９５）、営利的な規模でアコニット酸を
製造する発弾方法は今までに開発されていない。

アコニットｗは不飽和トリカルボン酸であるので、その
カルボン酸機能のために、これが組み入れられたポリマ
ーに特別な性質を与えるコモノマーとして有用であると
いう可能性がある。ざらに、アコニット酸はそのエステ
ルとして、合成ゴム用及び、ポリ塩化ビニルのような、
他のポリマー用可塑剤とｌ、ての特別な用途も見い出し
ている。しかし、このような用途はアコニット酸の製造
コストが高いためにあまり普及していない、もし、よシ
安価なアコニット酸製造方法が発見されるならば、この
ような用途がさらに魅力的なものになるばかりでなく、
経済的なものになると思われる。

アコニット服用途に関するレヴユーはＭｉｌｌｅｒ　と
Ｃａｎｔｅｒによって「炭水化物化学の進歩（Ａｄｖａ
ｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈ印１
ｓｔｒｙ）Ｊ１９５１年、６巻、２３１−２４９頁に発
光されている。

今回、我々はアスペルギルス−テルレウス（ＡＳｐｅｒ
ｇ’１ｌｌｕ、９　ｔｅｒｒｅｕｓ）の成る突然変異株
がしよ糖またはグルコースを含む適当な炭水化物基質の
発酵によって良好な収量でアコニット酸を産生じ得ると
・とを我々は発見した。現在、公知のアスペルギルス・
テルレウス菌株はこれらの基質から主としてイタコン酸
を産生ずるものである。さらに、例えばアスペルギルス
・イタコニカス（ＡｓｎｅｒＢｉｌｌｕｓ　１ｔａｃｏ
ｎｉｃｕｓ）のような、良好な収率でアコニット酸を産
生じ得る他のイタコン酸産性アスペルギルス属の変異株
も存在すると確信される。さらに、例えばフルオロ酢酸
塩を加えることによって発酵培地におけるアコニターゼ
の生産率（すなわち活性）を阻害するならば、このよう
な変異株が有意な収量でクエン酸を産生じ得ることも我
々は発見している。アコニターゼの生産率（すなわち活
性）を阻害する他の方法も明らかに同じ効果を有するは
ずである。

従って、本発明では、アコニターゼの生産率を阻害しな
いような炭水化物含有の水性栄養培地中の好気性条件下
で、アスペルギルス・イタコイカスまたはアスペルギル
ス・テルレウスのアコニット酸産生菌株をアコニット酸
の有意な量が蓄積されるまで増殖させ、次にアコニット
酸またはその塩を培地から回収することから成るアコニ
ット酸製造方法を提供する。

ファイザー培養コレクションのＭ４９０という名称のイ
タコン酸産生菌株の突然変異によって、アスペルギルス
Φテルレウスの特に有効なアコニｉ−ト酸蓄積菌株が得
られた。この変異株（Ｍ１４１と呼ばれる）はブタベス
）４ｉＫ約下での特許手続きのために、連邦菌類学研究
所（ＣｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈＭｙｃｏ：Ｌｏｇｉｃａ
ｌ　工ｎ５ｔｉｔｕｔｅ）（イギリス、サリー州キュー
）に１９８６年１２月９日に寄託され、そこでＣＭｌ　
ｃｃ　２８１９２４と名づけられている。この肉株は主
としてアコニット酸を産生じ、クエン酸及びイソクエン
酸のような他の酸を少量産生する。アコニット酸、クエ
ン酸及びイソクエン酸の産生量の比は典型的に約９２：
３：５である。イタコン酸の産生は検出不能である。ア
スペルギルス・テルレウスとアスヘルギルスｅイタコニ
カスの他の変異株ももちろん使用できる。

本発明においてこれらの変異株を使用するための唯一の
判断基準は、適当な炭水化物基質の発酵によってこれら
がイタコン酸またはその他の酸よりも顕著にアコニット
酸を蓄積するがどうがということである。

アスペルギルス□テルロイスＭ１４Ｌ（ＣＭＩＣＣ２８
１９２４）は次のような、種々な媒質中で増殖させるこ
とによって（全て３７℃において５日間）得られた結果
から同定することができるニ ゲルコース／酵母エキス／麦芽エキス寒天：豊富な淡褐
色胞子による厚い増殖；裏側は黄色−褐色 ツアペック・ドックス寒天： 白色好気性菌糸体による良好な増殖；淡褐色胞子若干 ジャガイモ／テキストロース寒天： 豊富な暗褐色胞子によるまばらな増殖 栄養寒天：良好な増殖；淡黄色胞子少数を■する好気性
菌糸体 グリセロール／無機塩寒天：豊富に淡褐色胞子による良
好な増殖。

全ての場合に２８℃における増殖は同様であったが、胞
子産生は一般にあ一！シ豊富ではなかった。

次の炭素源が増殖を促進する（６７℃において４８時間
後に分析）ニゲルコース、グリセロール。

２−オキソグルタレート、アラビノース、キシロース、
キシリトール、イノシトール、ソルビトール、Ｎ−アセ
チルグルコサミン、セロビオース。

ラクトース、マルトース、サッカロース、トレハロース
及びラフィノース、アドニトール、ガラクトース及びメ
ーレチトースでは弱い増殖が得られるが、メチルＤ−グ
ルコシドでは増殖は生じない。

６７℃４８時間の増殖後に次の炭素源から酸の生成が観
察される：グルコ−ス、グリセロ−／Ｌ／。

Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、ソルビトール、セ
ロビオース、マルトース、メレチトース、およびラフィ
ノース：しがし、Ｄ−アラビノース、Ｌ−キシロース、
アドニトール、ガラクトース捷たはＮ−アセチルグルコ
サミンによる増殖からは酸が産生されなかった。キシリ
トール、イノシトール及びトレハロースによっては軽度
に酸が産生された。

アスペルギルス赤テルレウスＭ１４１　（ＣＭＩＣＣ２
８１９２４）は、実施した全ての形態学的及び生理学的
テストに関して、これが派生した親菌株（Ｍ４９０）及
びアスペルギルス・テルレウスの他の菌株に同じであっ
た１１本発明に含まれルアスベルギルス・テルレウスｌ
ＶＮ４１（ＣＭＩＣＣ２８１９２４）とこれに関係した
菌株を特色づける重要な特徴はこれらの菌株が有意な量
のアコニット酸を蓄積し得るということである。

アコニット酸はシスとトランスの異性体として存在する
。生存有機体中でのタレブズトυカルボン酸サイクルで
形成されるのはシス異性体であることが知られているが
、植物体では自然に、種々な割合で、両異性体が生成す
る。しかし、トランス異性体の方が安定な形であり、温
朋及びｐＨの適当々条件下では、シス形が異性化して、
トランス異性体を目立って多く含む平衡混合物を形成す
る。従って、本発明の方法では、発酵と回収の条件が産
生されるシスとトランス異性体の割合に影響を及はし得
る１゜ 本発明に用いる水性媒質は基質と、用いるアスペルギル
スｅイタコニカスまたはアスペルギルス・テルレウスの
だめの栄養物を含んでいる。炭水化物トシテハ、スクロ
ース、マルトース、グルコースまたはこれらの適当な発
生源であるジャガイモもしくはコーンの殿粉、デキスト
リンまたは稠密を用いることができる。栄養物は同化し
得る璧素源及び無機塩を含む。多くの窒素源の中で、コ
ーンステイープリカー、小麦モミガラ、大豆ミール、綿
実ミール、尿素、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム
、もしくは塩化アンモニウム、アミノ酸、ペプトン及び
その他の、酵素によって消化されたたんばく質が適して
いる。ビタミン及び必須無機物は痕跡量で粗炭水化物中
及び／又は窒素源中に不純物として１．ばしば存在する
、または必要に応じて培地に加えることができる。

当業者が熟知の方法（例えば［代謝−次産物（Ｐｒｉｍ
ａｒｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓ
ｍ）ＪＥｃｏｎｏｍｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｖ　
２巻　、４７−１１９頁Ａ、　Ｈ，Ｒｏｓｅ　ｆｉｉｌ
集、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｏｎｄｏｎ１
９７８年におけるり、Ｍ、Ｍｊａｌｌによるレヴユーの
参考文献参照）によって複合培地の重金属含量を減する
と、アコニット酸の収量が増すことを桟状は発見した。

マンガン及び鉄のような重金属レベルは典型的に５　ｐ
ｐｍ以下寸で減少させる。

さらに、亜鉛塩のような代謔阻害剤が培地に含有される
とアコニット酸の収量が増すことも発見した。例えば、
ＺｎＳＯ４・Ｈ２１，）を１〜１０ｙ７ｔの濃度で加え
ると、効果的であることがわかった。

アスペルギルス争イタコニカスまたはアルペルギルス・
テルレウス菌株は２８〜４２℃の温度、１．５〜４．０
のｐＨ範囲において培養することができ、２〜７日商の
発酵後にアコニット酸が良好な収量で得られる。３チ塩
化ナトリウムを含む麦芽寒天のような適当な培地上で増
殖した凶株の細胞を、振とりフラスコ内の炭水化物含有
の水性栄養培地に移すことによって接種材料を調製する
。適当な温度で充分な時間振とり培養した後、次にこの
接種材料のアリコートを攪拌通気した発酵器内の園じ無
菌培地に移丁。この処置をくり返して、生産発酪器に移
す〜Ｉに幾つかの接種段階で培養菌を前増殖させる。例
えば水酸化ナトリウムもしくはアンモニアの水溶波型た
は水酸化カルシウムもしくは炭酸カルシウムの水性懸濁
液のようなアルカリを添加することによって、生産培地
のＤＨｉ適当なレベルに維持する。

アコニット酸の有意な量が蓄積したことがサンプルの分
析によって判明したならば、技術上周知の水溶性有機カ
ルボン酸回収方法によって培地から酸を回収する；すな
わち、例えばｅ３Ｉｊ４または遠心分離によって微生物
の細胞を除去し、例オば蒸発によって濃縮レアコニット
酸またはその塩を析出させるか、又は例乏ばカルシウム
塩のような不溶性塩として沈殿させ、例えば硫酸水浴液
によって酸の状態に再生１−１水溶液を分離蒸発させて
アコニット酸を得る。

発酵培地内のアコニット酸ヲ定量するために、培地のｐ
Ｈを最初に塩酸または硫酸によって土７〜２．０に調節
し、次に沢過または遠心分離によって菌の菌糸体を除去
する。次に１液または上溝液を次の方法によって分析す
る： １）ガスクロマトグラフィ これは発酵培地中の有機酸を分離定量する便利な手段を
捺供する。アコニット酸の測定には、次のような方法が
用いられている。分析はフレームイオン化検出器を装備
したＰｙｅ１０４ガスクロマトグラフによって実施する
： カラム温度　１４８℃ 検出器温度　２５０℃ 注入器温度　１４８℃ ヘリウム流量　３０祠／分 水素流量　６０ｍｅ１分 空気流＃　５００ｍ１７分 約１０．２’０．４０．６０及び１００ｍｇのアコニッ
ト＝を正確に秤量し、それぞれテトラヒドロフラン（Ｔ
ＨＦ　）１０ｔｎｌ中に溶解することによって、標準曲
線を最初に作成する。次に各サンプル中 を次のように処理する：乾燥したバイアルビン入れた峙
液１−にＮ、Ｏ−ビス−（トリメチルシリル）−アセト
アミド０２−を加え、このピンを円板状に仕上げられた
ＰＴＦＥで素早く密封し、フタをした。このビン’に１
００℃に１時間加熱する。次に透明な上清１．μｙ＋（
ｉ７カラムの上部に注入する。

酸蕾を横座標に、対応するクロマトグラムビータの面積
を縦座標にプロットすることによって、標準曲線を作成
する、ピーク面積の測定はガスクロマトグラムに取り付
けた積分器によって簡便に行うことができる。

発酵液Ｐ液を分析するだめには、残留炭水化物が分析を
妨げるおそれがあるので、これを最初に除去しなければ
ならない１、この除去はアンモニウム形の工Ｒｋ６Ｂ陰
イオン交換樹脂５ｍ７！を含むカラムにＰ液２　ｍｅを
通すことによって達成される。

澱液中の有機酸は樹脂に付着し、残留炭水化物は水２０
ｒｎ１．でカラムを洗浄することによって除去される。

次にｍ＊２ｏｓｗ／ｖアンモニア溶液５ｒｎｌによって
位ｆ脂から溶出させ、このアンモニア溶出故２−をビン
に装入し、水浴中で加熱することによって過剰なアンモ
ニアを除去する。このビンを次に凍結乾沫器に入れ、水
分を全て除去する。

ＴＨＦ　１−を加え、標準溶液に対して上述したように
サンプルを処理する。

サンプルに含まれるアコニット酸量は標準曲線との比較
によって容易に算出される。この他に存在する酸、例え
ばイタコン酸、クエン酸及びインクエン酸の量も同様に
１．て算出することができる。

２）高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）発酵液中
のアコニット眼含蕾は、下記のいずれかの条件下で操作
するＨＰＬ（１’クロマトグラフ（Ｗａｔ　ｅｒ　ｓ　
）にサンプル１０μｌを注入することによって分析する
ことができる。方法Ａでは、発酵液上清の１液を直接注
入することができる。方法Ｂでは、ρ液または上溝を注
入前にアセトニトリルで少なくとも１０倍に希釈してｒ
遇する。

方法Ａ カラム：　Ｐａｒｔｉｓｉｌ　ＳＡＸ　（Ｗｈａｔｍａ
ｎｌ　３０ｍＸ４ｍ＋ｎ（同径） ’ｒｅｙｘ　：　５　［ｊ、１５０メタノール／　ｏ、
　０８　Ｍ　Ｎａ２ＨＰ○４水浴液、酢酸でＫＩＩＨ６
，６に脚整 流量：２．０＋＋ｍ／分 検出器：２３０ｎｍで操作するＵＶ検出器（Ｃｅｃｉｌ
　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ’　）んｙ留時間：シス・ア
コニット酸は約５．１分後に溶出する７ トランス・アコニラ）Ｓ＆は約６．４分後に溶出する。

方法Ｂ カラム：　Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ｄｉｏｌ、粒度１０
μ（Ｍｅｒｃｋ　）　３０ｚＸ　４ｍｍ　（内径）溶　
媒：９８／２アセトニトリル１０．０３ＭＨ３ＰＯ４水
溶液 流　量：１．６ｄ／分 検出器：屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ）　また２００ｎ
、　ｍで操作するＵＶ検出器（Ｃｅｃｉｌ工ｎｓｔｒｕ
ｍｅｎｔｓ　） 血留時ＩＶＩ：アコニット酸は約４．７分後に溶出する
。

サンノルのアコニット酸含量を該肖するピーク面積の積
分及び、正確に秤量したアコニット酸量を含む、子連の
ように処理１７た標準混合物に対する比較によって算出
する。方ｌ！ｉ！ｉ−Ｂはアコニラｌをクエン酸、イソ
クエン酸、リンゴ酸及びα−オキソグルクール酸のよう
な他の酸から分離するためにも用いることができる。

６）無水酢酸−ビリジン法 この方法はＭ、　５ａｆｆｒａｎとＯ，Ｆ、　Ｄｅｎｓ
ｔ　ｅａｔ　がＪ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　１７５
．８４９頁（１９４８年）に述べているオリジナル方法
をＪ　、　Ｍ、　Ｌｏｗｅｎｓ　ｔｅ　ｉｎが［酵素学
における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
−ｏｇｖ）Ｊ　頌Ｊ巻５１ろ負〔Ｊ、Ｍ、　Ｌｏｗｅｎ
ｓｔｅｉｎ　編集、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　
（１９６９年）］に述べているように改良したものであ
り、アコニットばの定量に用いられている。オリジナル
方法では、クエン酸とアコニット酸の両方、々らびに他
の干渉物質が無水酢酸とピリジンに反しして、４２５ｎ
ｍにおいて吸光する有色物質を形成する。し力）し、Ｌ
ｏｗｅｎ　Ｓ　ｔ　ｅ　ｉｎの指摘によると、この反応
を０−−＋　ｌ＋ｒ、’＋−１−イＣｇ　−ｋ　ｌ−ン
Ａ　〒に・ソｋ　ｎｗ　Ｆｒ　、Ａ　ｆｘ−１ｄｌｌ　
５ａすることができる。

以下では、本発明の方法の実施例を述べる。

実施例１ ｙ７ｔで衣した濃度で下記の取分を含む第一段階用接種
培地を調製した（水道水中）：マニトール　５０．０ ＮａＮＯ□２．Ｏ Ｆ　ｅｓ０４命７　Ｈ２０ｏ、　ＯＯｌＺｎ５Ｏ４・４
　Ｈ２Ｏｏ、　００６ Ｃ嘘０４・５Ｈ２００，００１５ ＣａＣＯ３２［１１ ＭｇＳＯ４曝７Ｈ２０１，０ ＫＨ２ＰＯ４２，４ 栄養ブイヨン粉末（Ｏｘｏｉｄ　）　Ｑ、　’１この培
地１ｔを２．Ｂｔ振とうフラスコ（Ｆｅｒｍｂａｃｈ、
　）に投入し、１５　ｐｓｉのオートクレーブにおいて
２０分間殺銅ヒた１、この培地にアスペルギルス・テル
レウスＭ１４１（ＣＭＩ　ｃｃ２８１９２４　）の斜面
培養からの胞子を添加することによって接種し、６２℃
において５日曲、ダ子気的に振とり培養した。

（Ｂ）　！／ｌで表した＠厩で下記の成分を溶解する（
水道水中に）ことによって第二段階用接種培地を調製し
た： 重金属含量を減するように処理　１７５した加水分解コ
ーン殿粉、グル コースは等１曲。

ＫＨ２ＰＯ４０，１１ ＪＳ○４・７Ｈ２０２，ｌ ＭｎＳＯ４−４Ｈ２００，００２ ＣｕＳＯ４−！５Ｈ２０、ｏ、ｏ　１８ＮＨ４ＮＯ３２
，１ この培地２．５ｔを５を発酵器に投入し、１５ｐＳ１の
オートクレーブにおいて２０分曲殺困した。

この無醒培地に、ＦＡ）で述べたように増り１１させた
第一段階接ｔｉ培養物１００ｍ１を接第１し、さらに通
気（２，０１１分）及び攪拌（１５０［）ｌｌａ１転／
分）　Ｌ々から６０℃において２８時間インキュベート
した。

（Ｃ）　ｙ／ｌで表した礫ＩＧで下記の成分を溶解する
（水道水中に）ことによって、第三段Ｉ有用接種培地を
調製した： 重金縮合Ｊ−，−＜減するように　１７５処理した加水
分解コーン取 粉、グルコースは等価 ＫＨ２ＰＯ４０，１ Ｍｇ５０４・７Ｈ２０２，０ ＣｕｓＩＯ４−５Ｈ２Ｃ０，２ ＮＨ４Ｎ○３２．Ｏ ＣａＣＯ３１，０ グルタミン酸ナトリウム　５．０ この培地２．５ｔを５を発酵器に投入し、上述のように
殺困■７た。この培地に、（Ｂ）で述べたように増殖さ
せた第二段階接種培養物４００−を接種し、さらに通気
Ｃ２，Ｏｔ１分）及び猾拌（１５００回転／回転上なが
ら６０℃において２４時出」インキュベートした。

（Ｄ）　ｆ／／ｌで表した濃度で下記の成分を溶解する
（水道水中に）ことによって生理段階用培地ケ調峡した
ニ ゲルコース（ＣｅｒｅｌＯ８ｅ）２００ＫＨ２ＰＯ４０
，２５ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２，０ ＮＨ４Ｎｏ３３．０ ＺｎＳＯ４ＩＩＨ２ｏ４．０ この培地２．５ｔｌｒ５を発酵器に投入して、上述のよ
うに殺菌した。

この無菌培地に、（Ｃ）に述べたように増殖させた第三
ノ段階接種培養物２００−を接種し、通気（２ｔ／分）
及び攪拌（１，５００回転／分）しながら１２０時間（
５日間）インキュベートした。

最初の４時間は温度を６５℃に制御し、次に４１℃に制
御し、水酸化ナトリウム水浴液を添加することによって
ｐＨを４．０に調節した。最終培養物はアコニット酸５
０１ｆ／ｌを含有した。

実施例２ 生産培地にグルコースの代りにスクロース（２００グ／
ｌ）を用いた点以外は、実施例１の方法をくり返した。

最終培養物はアコニット酸５２、Ｏｉｒ／４を含有した
・ 実施例６ 生産培地が？／１で表した濃度で下記の成分を含む点を
除いて、実施例１の方法ケくり返した二重金属含量を減
するように　２５０ 処理した加水分解コーン殿 粉、グルコース等価 ＫＨ２ＰＯ４０，２ ＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｃ，５，０ 最終培養物はアコニソ）岐１０　ｏ、５．ｙ　７ｔを含
有した。

実施例４ 生産培地からＺｎ　Ｓ　Ｏ４・Ｈ２０’ｉｚ除いた点以
外は実施９ｉｌ　１の方法をくり返した。最終培養物は
アコニット酸４５．１？／ｌを含有した。

実施例５ 生産培地のｐＨを調節するために、水酸化ナトリウム水
浴液の代りに水酸化カルシウム水性懸濁液を用いた点以
外は、実施例乙の方法をくり返した。

最終培養物はアコニット酸７９．６ｙ／１（ｒ−含有し
た・ 実施例６ 重金属金側を減するように処理したスクロース２２０ｒ
／４含有水溶液に、ＫＨ２ＰＯ４０，２５ｔ　／ｌとＺ
ｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ４，Ｏｆ／ｌを溶解することによって
生産培地を調製した。この培地を５を発酵器に投入し、
１５　ｐｓｉのオートクレーブで２０分間殺菌した、こ
の無藺培地に、実施例１（Ａ）に述べたように増殖した
第一段階接種培養物２００−を接種した。生産段階は、
水酸化ナトリウム水溶液の代りに水酸化カルシウムＩｔ
ｉｉｌ濁液を用いてｐＨを調節した点板外は、実施例１
（Ｄ）に述べたように実施した。最終培養物はアコニッ
ト酸８２，９グ／ｌを含有した。

実施例１〜乙のそれぞれにおいて次の方法によって、ア
コニット酸を遊離酸捷たはそのナトリウム塩として最終
培養物から回収する。

実施例７ ケイ貿フィルターによって全培養物を１過して細胞を除
去し、アコニット酸ナトリウムを含むＰ故を蒸発によっ
て破網し、及び粗生成物を水から再結晶することによっ
て、実施例１〜４で調製した最終培養物からアコニット
酸ナトリウムを回収した（収率５０〜６０％）。

実施例８ 実施例１〜４で調製した最終培養物から、実施例７で述
べたように濾過し、Ｐ液をイオン交換樹脂カラム（酸性
型のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＣ５０）に曲すことによ
ってナトリウムを除去し、水によってアコニット酸を溶
出することによって、アコニット酸全回収する。次に、
アコニット酸を含有するカラムからの溶出液をさらに、
実施例７でＰ液に対して行ったように処理する（収率５
０〜６０％）。

実施例９ 実施例５と６で調製したような最終培養物から、硫酸の
添加によって培養物をｐＨ１，０〜３．０（典型的には
１．９）に酸性化し、細胞及び沈殿した硫酸カルシウム
を除去するために１過し、及びＰ液を蒸発によって濃縮
することによって、アコニット酸を回収する。次に、粗
生成物を活性炭で処理して脱色し、水からアコニット酸
を再結晶する（収＼率２４襲）。

特許出願人　ファイザー・コーポレーション、　（外５
名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）アスペルギルス・イタコニカス（Ａｓｎｅｒ−ｇ
   ｉｌｌｕｓ　１ｔａｃｏｎｉｃｕｓ）　ｉたはアスペル
   ギルス・テルレウス（Ａｓｎｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｅｒ
   ｒｅｕｓ）のアコニット酸蓄槓菌株をアコニターゼ産生
   が阻害されないような炭水化物含有水性栄養培地内の好
   気性条件下で、培地内に有意な量のアコニット酸が蓄積
   されるまで増殖させ、次にアコニット酸またはその塩を
   培地から回収することから成るアコニット酸峡造方法。 （２１ｍ株がアスペルギルス争テルレウスＭ　１４１（
   ＣＭ、ＩＣＣ２８１９２４，）である特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 （３）培地の重金属音量を５　ｐｐｍ以下に減する特許
   請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 （４）培地がＺｎ５Ｏ４−Ｈ２Ｏ１〜１０　ｆ　／ｌに
   相邑゛　するレベルでＺｎ塩を含有する特許請求の範囲
   第１項から第６項までのいずれか１項に記載の方法。 （５）菌株を２８〜４２℃の温度、１．５〜４．０のｐ
   、Ｈ範囲において２〜７日間増殖させる特許請求の範囲
   第１項から第４項のいずれか１項に記載の方法。 （６）培地の１過、蒸発によるｔ液の濃縮及びアコニッ
   ト酸ナトリウム結晶を培地から回収することによって、
   アコニット酸をナトリウム塩として回収する特許請求の
   範囲第１項から第５項のいずれか１項に記載の方法。 （７）培地を硫酸の添加によってＴ）Ｈ１，０〜３０に
   まで酸性化し、泊過し、沢液を蒸発によって濃縮し、そ
   して培地からアコニット＝の結晶を回収することによっ
   て、アコニット酸を遊離アコニット酸として回収する特
   許請求の範囲第１項から第６項のいずれか１項に記載の
   方法。 （８）特許請求の範囲第１項から第７項のいずれか１項
   に記載の方法によって製造ｌ〜だアコニット酸ミたはそ
   の壇。 （９）　アスペルギルスΦテルレウスＣＭ工　ＣＣ２８
   １９２４゜