JPS6012984A - プラスミドｐＴＰ１１０３ - Google Patents
プラスミドｐＴＰ１１０３Info
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- JPS6012984A JPS6012984A JP58121789A JP12178983A JPS6012984A JP S6012984 A JPS6012984 A JP S6012984A JP 58121789 A JP58121789 A JP 58121789A JP 12178983 A JP12178983 A JP 12178983A JP S6012984 A JPS6012984 A JP S6012984A
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- Japan
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- solution
- dna
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なプラスミドに関するものである。
近年、ベクターとして使用可能と思われるプラスミドの
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
種々のものが知られるようになったが、更に多くの有用
なプラスミドの開発が期待されている。
本発明者は９分子量が約８．５メガダルトン（Ｍｄ ）
と使用に適した大きさで、コピー数が多く、制限酵素に
よる切断点があり、かつクロラムフェニコールおよびテ
トラサイクリン耐性を有するｆ１１シいプラスミドが、
枯草前（Ｂλｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ）に玄定
に存在することを確かめ本発明を完成した〇 すなわち、フリネバクブリウム・ギセロシス（０ｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ ｘｅｒｏｓｉｓ ）からプ
ラスミドｐＴＰ１０を分離し、これで枯草菌を形質転換
後再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、このものと
ブドウ球菌由来のプラスミドｐＮ８１（Ｇｅｎｅ ２１
，１０５〜１１２（１９８８））を制限酵素Ｈｉｎｄｕ
で切断した後ライゲイジョンすることにより分子量が約
４．８ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１０２が得られる
が、さらにこのものを制限酵素Ｘｂａ Ｉで切断ル１次
いでライゲイジョンすることにより分子量が約３．５Ｍ
ｄであるプラスミドｐＴＰ１１０１３を得ることができ
た。
と使用に適した大きさで、コピー数が多く、制限酵素に
よる切断点があり、かつクロラムフェニコールおよびテ
トラサイクリン耐性を有するｆ１１シいプラスミドが、
枯草前（Ｂλｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ ）に玄定
に存在することを確かめ本発明を完成した〇 すなわち、フリネバクブリウム・ギセロシス（０ｏｒｙ
ｎｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｎ ｘｅｒｏｓｉｓ ）からプ
ラスミドｐＴＰ１０を分離し、これで枯草菌を形質転換
後再びプラスミド（ｐＴＰｌｌ）を分離し、このものと
ブドウ球菌由来のプラスミドｐＮ８１（Ｇｅｎｅ ２１
，１０５〜１１２（１９８８））を制限酵素Ｈｉｎｄｕ
で切断した後ライゲイジョンすることにより分子量が約
４．８ＭｄであるプラスミドｐＴＰ１１０２が得られる
が、さらにこのものを制限酵素Ｘｂａ Ｉで切断ル１次
いでライゲイジョンすることにより分子量が約３．５Ｍ
ｄであるプラスミドｐＴＰ１１０１３を得ることができ
た。
これらの工程における処理手段は公知の一般的方法を使
用することができ９例えば次のような方法が用いられる
。
用することができ９例えば次のような方法が用いられる
。
コリネバクテリウムの培養と溶菌は５ｈｉｌｌｅｒらの
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｒｎｏｔｈｅｒ、 １８．８１４〜８２１（１９８０）
）に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出
はＪＪａｎｓｅｎおよび０１ｓ＋ｅｎの方法（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｔｏｌ、 υμ、 ２２７〜２８ Ｂ（１９
７８））に従って行なえばよい。
方法（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、 Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅ
ｒｎｏｔｈｅｒ、 １８．８１４〜８２１（１９８０）
）に準じて行ない、アルカリ変性法によるＤＮＡの抽出
はＪＪａｎｓｅｎおよび０１ｓ＋ｅｎの方法（Ｊ、 Ｂ
ａｃｔｅｒｔｏｌ、 υμ、 ２２７〜２８ Ｂ（１９
７８））に従って行なえばよい。
枯草菌の形質転換はＯｈａｎｇおよび０ｏｈｅｎのプロ
トプラスト法（Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
出、１１１〜１１５（１９７９））に準じて行なえばよ
い。
トプラスト法（Ｍｏ１ｅｃ、 ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、
出、１１１〜１１５（１９７９））に準じて行なえばよ
い。
プラスミドの分離にはアガロースゲル電気泳動法や密度
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断と、ＤＮ
Ａｇｌの連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイジ
ョン）も常法によって行なうことができる。
勾配遠心法のような一般的な方法を用いることができ、
また、プラスミドＤＮＡの制限酵素による切断と、ＤＮ
Ａｇｌの連結酵素（リガーゼ）による結合（ライゲイジ
ョン）も常法によって行なうことができる。
次に１本発明のプラスミドの製造法を実験例により詳述
するが、使用したコリネバクテリウム・キ七四シスＭ８
２Ｅ林は１本発明者が分離した菌株であり９分子爪が８
０．４±Ｌ ７ Ｍｄのプラスミドを保有しており、こ
のプラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、り
四ラムフェニコール、テトラサイクリン耐性遺伝子を持
っている。まント、染色体上にもストレプトマイシン耐
性遺伝子を有している。
するが、使用したコリネバクテリウム・キ七四シスＭ８
２Ｅ林は１本発明者が分離した菌株であり９分子爪が８
０．４±Ｌ ７ Ｍｄのプラスミドを保有しており、こ
のプラスミド上にエリスロマイシン、カナマイシン、り
四ラムフェニコール、テトラサイクリン耐性遺伝子を持
っている。まント、染色体上にもストレプトマイシン耐
性遺伝子を有している。
例１：コリネバクテリウム・キセロシスＭ８２Ｂ株から
のプラスミドＩ） Ｎ Ａの分Ｎ＃トリプトソイブイヨ
ン培地（トリプトン１７り、ソイペプトン３）、ブドウ
糖２．５９． リン酸−水素カリウム２．５り、塩化ナ
トリウム５り。
のプラスミドＩ） Ｎ Ａの分Ｎ＃トリプトソイブイヨ
ン培地（トリプトン１７り、ソイペプトン３）、ブドウ
糖２．５９． リン酸−水素カリウム２．５り、塩化ナ
トリウム５り。
蒸留水１１ 、 ｐＨ７，８）による入１８２Ｂ株の一
夜培参液を新鮮同培地に１７１００散液種し。
夜培参液を新鮮同培地に１７１００散液種し。
３７゛Ｃで約３時間振盪培養した後、ペニシリンＧを最
終り″Ｌ度５〜７ｒｎｔとなるように加え、さらに２時
間振盪培養した。
終り″Ｌ度５〜７ｒｎｔとなるように加え、さらに２時
間振盪培養した。
この培養液を冷却遠心し、得られたペレットをＴＢバッ
ファ（ＩＧｍＭ）リスアミノメタン。
ファ（ＩＧｍＭ）リスアミノメタン。
０．５ ｍＭ ＢＤ ＴＡ、 ｐｕ ８．０ ）で２回
洗浄後。
洗浄後。
’Ｉ’ Ｅ ／＜ッファに溶かした０、５Ｍシュークロ
ースに懸濁した。この懸濁液にリゾデーム（シグマ）を
最終濃度１ ｏ １４７ｍｌとなるように加え８７℃で
２時間インキエペートした０ この溶液に１０％ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液を最終濃度１％になるよ運こ加え。
ースに懸濁した。この懸濁液にリゾデーム（シグマ）を
最終濃度１ ｏ １４７ｍｌとなるように加え８７℃で
２時間インキエペートした０ この溶液に１０％ＳＤＳ （ドデシル硫酸ナトリウム）
溶液を最終濃度１％になるよ運こ加え。
５５゛Ｃで８０分間静置した。次に新たに調整した８Ｎ
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐｎ １２・１〜１２．
３とし軽く混和後、２人１トリス溶液（ｐＩ（７，０）
を水酸化ナトリウム溶液の２倍爪加えた。
水酸化ナトリウム溶液を加えてｐｎ １２・１〜１２．
３とし軽く混和後、２人１トリス溶液（ｐＩ（７，０）
を水酸化ナトリウム溶液の２倍爪加えた。
さらに５Ｍ塩化ナトリウム溶液を最終濃度ＩＭとなるよ
うに加えた後４”Ｃで一夜放置した０その後１０，０Ｏ
Ｏｒｐｒｎ、３０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
Ｅバッファで飽和した等量の再蒸留フェノールを加えよ
く混和した。
うに加えた後４”Ｃで一夜放置した０その後１０，０Ｏ
Ｏｒｐｒｎ、３０分の冷却遠心により上清を分取し、Ｔ
Ｅバッファで飽和した等量の再蒸留フェノールを加えよ
く混和した。
１０．００ Ｏｒｐｍ、２０分の冷却遠心により水層を
分取し、−２０°Ｃのエタノールを８倍景加えて、−２
０℃で一夜放置した。１０．００Ｏｒｐｍ８０分間の冷
却遠心によりベレットを集め、ＴＥバ、ファに溶解し、
ＤＮＡ溶液とした。
分取し、−２０°Ｃのエタノールを８倍景加えて、−２
０℃で一夜放置した。１０．００Ｏｒｐｍ８０分間の冷
却遠心によりベレットを集め、ＴＥバ、ファに溶解し、
ＤＮＡ溶液とした。
例２ ： ）、（８２Ｂ林より抽出されたプラスミドｐ
ＴＰ１０ ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１０８ＬＭＡＨ７６１２２２（１０８Ｌ。
ＴＰ１０ ＤＮＡによる枯草菌の形質転換 枯草菌１０８ＬＭＡＨ７６１２２２（１０８Ｌ。
ｍｅｔ”’、 ａｄｅ−＋ ｈｉｒ−）株のバクトーペ
ンアッセイブ四ス（ディ７コ：バクトービーフ抽出物１
．５り、バクトー醇母抽出物１．５り、バクトペプトン
５９ ＋バクトーデキストｐ−ス１ｇ、塩化ナトリウム
３．５ｇ、リン酸二カリウム３．６８り。
ンアッセイブ四ス（ディ７コ：バクトービーフ抽出物１
．５り、バクトー醇母抽出物１．５り、バクトペプトン
５９ ＋バクトーデキストｐ−ス１ｇ、塩化ナトリウム
３．５ｇ、リン酸二カリウム３．６８り。
リン酸−カリウムｉ、ａ２ｇ、蒸留水１１．ｐＨ７，０
±０．１）による−夜培養液を新しい同培地に１７１０
０散液種し３７℃で吸光度（ＯＤ ）０．４（６００１
′Ｌｍ）まで振盪培養した。菌体を遠心により集菌し、
ＳＭＭＩＰバッフＴ（０，５Ｍシュークロース、０．０
２Ｍマレイン酸二ナトリウム＋ＩＭＪｆｌ化マグネシウ
ムを２倍濃度のバクトーペンアッセイブロスに溶Ｍ）に
懸濁した後。
±０．１）による−夜培養液を新しい同培地に１７１０
０散液種し３７℃で吸光度（ＯＤ ）０．４（６００１
′Ｌｍ）まで振盪培養した。菌体を遠心により集菌し、
ＳＭＭＩＰバッフＴ（０，５Ｍシュークロース、０．０
２Ｍマレイン酸二ナトリウム＋ＩＭＪｆｌ化マグネシウ
ムを２倍濃度のバクトーペンアッセイブロスに溶Ｍ）に
懸濁した後。
最終濃度２ ｍｙ ／ ｍｌとなるようにリゾチームを
加えた。８７℃約１時間の培養の後８．ＯＯＯｒｐｍ１
５分の遠心により集菌し、８ＭＭＰバッファーで一度洗
浄後、菌体を（３ｔｎｔのＳ Ｍ Ｍ Ｐ ハラファー
に懸ｆＱし、プロトプラスト溶液とした。
加えた。８７℃約１時間の培養の後８．ＯＯＯｒｐｍ１
５分の遠心により集菌し、８ＭＭＰバッファーで一度洗
浄後、菌体を（３ｔｎｔのＳ Ｍ Ｍ Ｐ ハラファー
に懸ｆＱし、プロトプラスト溶液とした。
例１で得たＤＮＡ溶液５０μｌ（約ＤＮＡ０．１５μＬ
ｊ）に同量の二倍濃度のＳ Ｍ Ｐ、ｌバッファー（１
Ｍシュークロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム
、２Ｍ塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプ
ラスト溶液１ ｍｌを加えた。
ｊ）に同量の二倍濃度のＳ Ｍ Ｐ、ｌバッファー（１
Ｍシュークロース、０．０４Ｍマレイン酸二ナトリウム
、２Ｍ塩化マグネシウム）を加えた後、上述のプロトプ
ラスト溶液１ ｍｌを加えた。
さらに４０％ポリエチレングリコール６０００溶液３ｒ
ｎｌを加えて、Ｏ”Ｃ２づ〕間静置後５イのＳＭＭＰバ
ッファーを加え３，０００ｒｐｍｌＯ分間の遠心により
集菌した。集めたプロトプラストベレットを１ｍｇのＳ
ＭＭＮ’／＜ラフＴ−に懸濁し３０°Ｃで１．５時間培
養後、その０．１ｆｎｔをクロラムフェニコール２５／
ｌり／−含有のＤＭ−８再生培地（リン酸二カリウム３
．５ｇ、リン酸−カリウム１．５り、カザミノ酸５ｇ、
塩化マグネシウム４．０６９． コハク酸ナトリウム１
８５り。
ｎｌを加えて、Ｏ”Ｃ２づ〕間静置後５イのＳＭＭＰバ
ッファーを加え３，０００ｒｐｍｌＯ分間の遠心により
集菌した。集めたプロトプラストベレットを１ｍｇのＳ
ＭＭＮ’／＜ラフＴ−に懸濁し３０°Ｃで１．５時間培
養後、その０．１ｆｎｔをクロラムフェニコール２５／
ｌり／−含有のＤＭ−８再生培地（リン酸二カリウム３
．５ｇ、リン酸−カリウム１．５り、カザミノ酸５ｇ、
塩化マグネシウム４．０６９． コハク酸ナトリウム１
８５り。
酵母抽出物５９．グルコース５）、寒天８９゜牛血清ア
ルブミンｏ、ｏ５９＊蒸留水１１．ｐＨ７，８）に塗抹
し、８７”Ｃで２〜ａ口間培養することにより形質転換
株を得た。
ルブミンｏ、ｏ５９＊蒸留水１１．ｐＨ７，８）に塗抹
し、８７”Ｃで２〜ａ口間培養することにより形質転換
株を得た。
例８：形質転換株からのプラスミド］） Ｎ Ａの分！
ｌ！ｉ１ 得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換株をディ
フコラボラドリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＩ（Ｉ培地）ｌ〇−に接種し、−夜装置培養
した。この培養液をＯＹ培地（リン酸二カリウム０．７
％、リン酸−カリウム０．８％、硫酸アンモニウム０６
１％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．
２％。
ｌ！ｉ１ 得られたクロラムフェニコール耐性の形質転換株をディ
フコラボラドリース社製プレインハートインフュージョ
ン培地（ＢＩ（Ｉ培地）ｌ〇−に接種し、−夜装置培養
した。この培養液をＯＹ培地（リン酸二カリウム０．７
％、リン酸−カリウム０．８％、硫酸アンモニウム０６
１％、クエン酸ナトリウム０．０５％、カザミノ酸０．
２％。
酵母抽出物０．１％、硫酸マグネシウム０．０２５％、
ブドウ糖０．５％Ｔ ｐＨ７，０） １０ｔｎｔに吸光
度０．１（６００ｎｍ） になるように加えた。
ブドウ糖０．５％Ｔ ｐＨ７，０） １０ｔｎｔに吸光
度０．１（６００ｎｍ） になるように加えた。
８７°Ｃで振盪培養し、吸光度０．８（６００ｗｍ）の
時にデオギシアデノシンを最終濃度２５０ ／１９／ｒ
ｎｔになるように加えた。８分後トリチウム標識デミジ
ンを最終濃度１０μｃ ｔ １ｔｎｔになるように加え
た。
時にデオギシアデノシンを最終濃度２５０ ／１９／ｒ
ｎｔになるように加えた。８分後トリチウム標識デミジ
ンを最終濃度１０μｃ ｔ １ｔｎｔになるように加え
た。
吸光度０．８（＋３００＋ｚｍ）の時点で氷にて発育を
停止させ、１０，０００Ｘ９で１５分間４°Ｃに於て遠
心してブロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥ８
緩衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ）に再
懸濁した。
停止させ、１０，０００Ｘ９で１５分間４°Ｃに於て遠
心してブロスから菌体を分離し、菌体ペレットをＴＥ８
緩衝液（０，０５Ｍ塩化ナトリウム、０．００５Ｍ Ｅ
ＤＴＡ含有トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０） ）に再
懸濁した。
次に、 ０．５Ｍ ＦＤ’ｌ’Ａ液Ｑ、２ｗ４． ｌ
Ｏｍ９／−濃度のリゾチーム液０．１−を加え、混合物
を１０分間８７℃で培養した。これにプリジー５８（花
王アトラス■）を最終濃度０．５％となるように加え、
３７℃で１０分間培養した。次にＮ−ラウ四イルサルゴ
シンナトリウムを最終濃度２．５％になるように加え、
５０℃で８０分間培養し溶菌を行った。
Ｏｍ９／−濃度のリゾチーム液０．１−を加え、混合物
を１０分間８７℃で培養した。これにプリジー５８（花
王アトラス■）を最終濃度０．５％となるように加え、
３７℃で１０分間培養した。次にＮ−ラウ四イルサルゴ
シンナトリウムを最終濃度２．５％になるように加え、
５０℃で８０分間培養し溶菌を行った。
溶菌液をピペットにて粘性を４とり、軟化させたのち、
塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．
５５８の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで
平衡まで（約４０時間）遠心した。
塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し、密度１．
５５８の溶液とした。この溶液を１２６，０ＯＯＸりで
平衡まで（約４０時間）遠心した。
遠心管下部末端より、溶液を分画分取し、各分画ごとに
１０μｌをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに段着させ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（バラカード８８００ ）にて測定し
ｃｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活性を
示ず分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する
小さなピークの２つが得られた。この小さなピークを示
した分画をとり、ｎ−オクタツールで２回処理すること
により、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層をＳ
ＳＣ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウＡ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、 ｐＨ７，０）の１０倍希釈液に
対して透析してプラスミドを分離した。分離したプラス
ミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測定したところ
４．７ Ｍｄであった。本プラスミドをｐＴＰｌｌとす
る。また本プラスミドを所有する菌株を枯草菌ＬＭＡＨ
（ｐＴＦｌｌ）株と名付けた。本プラスミドのコピー数
は約２０であった。
１０μｌをワットマンろ紙ＧＦ／Ａに段着させ、このろ
紙に吸着されたトリチウムの放射活性を液体シンチレー
ションカウンター（バラカード８８００ ）にて測定し
ｃｐｍにて表わすと、染色体ＤＮＡに由来する高活性を
示ず分画の大きなピークとプラスミドＤＮＡに由来する
小さなピークの２つが得られた。この小さなピークを示
した分画をとり、ｎ−オクタツールで２回処理すること
により、臭化エチジウムを抽出除去した。次に水層をＳ
ＳＣ緩衝液（０，１５Ｍ塩化ナトリウＡ、０．０１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、 ｐＨ７，０）の１０倍希釈液に
対して透析してプラスミドを分離した。分離したプラス
ミドＤＮＡの分子量を電子顕微鏡により測定したところ
４．７ Ｍｄであった。本プラスミドをｐＴＰｌｌとす
る。また本プラスミドを所有する菌株を枯草菌ＬＭＡＨ
（ｐＴＦｌｌ）株と名付けた。本プラスミドのコピー数
は約２０であった。
例４ニブラスミドｐＴＰ１１による枯草菌ＲＭ１２５株
の形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐ’ｌ’Ｐ１１）株よりプラスミドＤ
ＮＡを下記の方法により調製した。
の形質転換 枯草菌ＬＭＡＨ（ｐ’ｌ’Ｐ１１）株よりプラスミドＤ
ＮＡを下記の方法により調製した。
枯草菌ＬＭＡＩ（（ｐＴＰｌｌ）株をＢｌ（Ｉ培地ＩＱ
Ｑｗ＋／に接種し、８７℃で約１８〜２４時間振盪培養
する。
Ｑｗ＋／に接種し、８７℃で約１８〜２４時間振盪培養
する。
この細胞懸濁液を１％の率で同培地の２０本のフラスコ
に接種するのに使用する。８７℃で１８〜２４時間振盪
培養後、Ｎｏ、０ＯＯＸりで約１５分間４℃に於て遠心
し上澄を傾斜で除く。
に接種するのに使用する。８７℃で１８〜２４時間振盪
培養後、Ｎｏ、０ＯＯＸりで約１５分間４℃に於て遠心
し上澄を傾斜で除く。
得た菌体ペレットをＴＢＳ緩？ｌｉ液によって２回洗浄
後、１００−の２５％蔗糖含有ＴＥ８緩御液に再懸濁す
る。
後、１００−の２５％蔗糖含有ＴＥ８緩御液に再懸濁す
る。
次に０．５Ｍ−ＥＤＴＡ溶液４０ ｄ、 １０ｔｎ９／
ｌｎｌ濃度のリゾチーム溶液２０−を加え混合物を８０
分間３７°Ｃで培養する。次に５ｏｍｇ／−濃度のブリ
ジー５８２０−を加え、混合物を３７°Ｃで１０分間培
養する。さらに２５０１ｎｇ／ｎ１濃度のＮ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム２０−を加え、５０℃で１０〜
８０分間培養する（＃Ｔｌｌ飽破壊）。
ｌｎｌ濃度のリゾチーム溶液２０−を加え混合物を８０
分間３７°Ｃで培養する。次に５ｏｍｇ／−濃度のブリ
ジー５８２０−を加え、混合物を３７°Ｃで１０分間培
養する。さらに２５０１ｎｇ／ｎ１濃度のＮ−ラウロイ
ルサルコシンナトリウム２０−を加え、５０℃で１０〜
８０分間培養する（＃Ｔｌｌ飽破壊）。
溶解物を２６，０ＯＯＸり、３０分間冷却遠心後、上澄
に５Ｍ塩化ナトリウム溶液５（１＋ｔ／を加え一夜放置
後、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％
となるように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。こ
の混合物を１０，０００ｘ９．ｌｓ分間遠心し、得られ
たペレットをＴＢＳ緩衝液に溶解した。
に５Ｍ塩化ナトリウム溶液５（１＋ｔ／を加え一夜放置
後、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％
となるように加え、さらに−夜４°Ｃにて放置した。こ
の混合物を１０，０００ｘ９．ｌｓ分間遠心し、得られ
たペレットをＴＢＳ緩衝液に溶解した。
この溶液を塩化セシウムおよび臭化エチジウムと混合し
て密度１．５５８の溶液を製する。この溶液を１２６，
０００）ｌで平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線
照射下で（８６５ｔＬｍ ）線状染色体およびプラスミ
ドＤＮＡは強い螢光を発するバンドとして遠心機チュー
ブの中に見られる。
て密度１．５５８の溶液を製する。この溶液を１２６，
０００）ｌで平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線
照射下で（８６５ｔＬｍ ）線状染色体およびプラスミ
ドＤＮＡは強い螢光を発するバンドとして遠心機チュー
ブの中に見られる。
このプラスミドＤＮＡを密度勾配がら取り出し、ｎ−オ
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き１次に水層を１０倍希釈ＳＳａ緩衝液に対して透析
してｐＴＰｌｌを得た。
クタツールで２回抽出することにより臭化エチジウムを
除き１次に水層を１０倍希釈ＳＳａ緩衝液に対して透析
してｐＴＰｌｌを得た。
得られたｐ〒Ｐ １１ ＤＮＡを前述のプロトプラスト
法により枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲＭ１２
５株へ形質転換した。
法により枯草菌の制限欠損−修飾欠損株であるＲＭ１２
５株へ形質転換した。
得うしたクロラムフェニフール耐性コロニーのひとつを
使い、トリチウム標識チミジンラベル法によりプラスミ
ドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分子量の
プラスミドを検出することが出来た。本実験よりプラス
ミドｐＴＰ１１上にはり四ラムフェニコールｉＬｔ［ｆ
ｉ伝子が存在していることがＷｍ Ｈされた。
使い、トリチウム標識チミジンラベル法によりプラスミ
ドの検出を行ったところｐＴＰｌｌと全く同じ分子量の
プラスミドを検出することが出来た。本実験よりプラス
ミドｐＴＰ１１上にはり四ラムフェニコールｉＬｔ［ｆ
ｉ伝子が存在していることがＷｍ Ｈされた。
例５ニブラスミドｐＴＰ１１の制限酵素開裂意地図の作
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＦ
ｔバッファーに溶解した後１次の酵素反応を行った。
成 制限酵素によるプラスミドＤＮＡの消化は次の条件によ
り行った。また、２種の制限酵素を組み合わせて反応さ
せる場合は、一方の酵素反応をフェノールで停止させ、
さらにフェノールをエーテル抽出した後に２倍量のエタ
ノールを加え、析出したＤＮＡを遠心によって集めＴＦ
ｔバッファーに溶解した後１次の酵素反応を行った。
ＥｃｏＲＩ １０ ｍＭ ）リスー塙酸縫衝液（ＰＨ７
，２）。
，２）。
５ｒＪＩＭ＠化マグネシウム、２ｍＭメルカプトエタノ
ール、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８７℃ Ｈｐａ Ｊｌ ２０ ｍＭ ） リＸ−ｍｍ１ｍ衝液（
ｐＨ７，４） ＋７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジヂ
オスレイトー＃（ＤＴＴ）、３７°Ｃ Ｘｂａ Ｉ ６ｍＭ）リス−塩ｍ ｔ’Ａ ｇｊ液（ｐ
Ｈ７−４） ＋１００ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化
マグネシウム、３７℃ Ｂｃｌ Ｉ １２ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
）。
ール、５０ｍＭ塩化ナトリウム、８７℃ Ｈｐａ Ｊｌ ２０ ｍＭ ） リＸ−ｍｍ１ｍ衝液（
ｐＨ７，４） ＋７ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭジヂ
オスレイトー＃（ＤＴＴ）、３７°Ｃ Ｘｂａ Ｉ ６ｍＭ）リス−塩ｍ ｔ’Ａ ｇｊ液（ｐ
Ｈ７−４） ＋１００ｍＭ塩化ナトリウム、６ｍＭ塩化
マグネシウム、３７℃ Ｂｃｌ Ｉ １２ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，４
）。
１２ｍＭ塩化マグネシウム、１２ｍＭＪｊＪ化−３−）
！Ｊ Ｙ＞ ム、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、 ５０”Ｃ
ＨｉｎｄＪＩ［２０ｍＭ）リスー塩ｍｇ衝液（ｐｕ ７
．４ ） 。
！Ｊ Ｙ＞ ム、０．５ ｍＭ ＤＴＴ、 ５０”Ｃ
ＨｉｎｄＪＩ［２０ｍＭ）リスー塩ｍｇ衝液（ｐｕ ７
．４ ） 。
’ｙｍＭ塩化マグネシウム、ｅｏｍｐｔ塩化ナトリウム
、３７℃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ８ｂＡｒｐ ｅｔａｌ
、 Ｂｌｏｃｈｅｍｉ ８Ｌｒ３’＋旦８０５５〜＋
３０６８（１９７８））。
、３７℃ 消化混合物はシャープ等によってつくられた１％アガロ
ースゲル中で分析した（ Ｊ、 ８ｂＡｒｐ ｅｔａｌ
、 Ｂｌｏｃｈｅｍｉ ８Ｌｒ３’＋旦８０５５〜＋
３０６８（１９７８））。
ＢｃｏＲＩ 消化λＩ） Ｎ Ａを分子量対照として使
用した（ Ｔｈ□ｕｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｅｉｏｌ
、、 ９１８１５〜８２ Ｂ（１９７５））。
用した（ Ｔｈ□ｕｓら、 Ｊ、 Ｍｏ１． Ｅｉｏｌ
、、 ９１８１５〜８２ Ｂ（１９７５））。
ＦＴＰＩＩの制限酵素ｙｒＪ裂点り数および開裂断片の
分子量を表に示す。
分子量を表に示す。
例６：プラスミドｐＴＰ１１０２の製造枯草菌ＲＭＩ
２５ （ｐＮｓ １ ）（４ｉ（Ｇｅｎｅ ２１゜１０
５〜１１２（１９８８））よりプラスミドｐＮ８１ＤＮ
Ａを前述の方法（例４）と同様にして抽出し、プラスミ
ドｐＴＰ１１ＤＮＡとＵ合後制限酊素Ｈｉｎｄｕで切断
した。
２５ （ｐＮｓ １ ）（４ｉ（Ｇｅｎｅ ２１゜１０
５〜１１２（１９８８））よりプラスミドｐＮ８１ＤＮ
Ａを前述の方法（例４）と同様にして抽出し、プラスミ
ドｐＴＰ１１ＤＮＡとＵ合後制限酊素Ｈｉｎｄｕで切断
した。
ずなわち、ｐＴＰｌｌ ＤＮＡ１μりとｐＮｓ １１／
９を２０ｍ？１１）リス墳酸緩衝液（ｐＨ７Ｊ ）＋７
１１１Ｍ塩化マグネシウム、１３０１１１Ｍ塩化ナトリ
ウム、 １（１ｎｄ １１０単位含有溶液中で３７℃。
９を２０ｍ？１１）リス墳酸緩衝液（ｐＨ７Ｊ ）＋７
１１１Ｍ塩化マグネシウム、１３０１１１Ｍ塩化ナトリ
ウム、 １（１ｎｄ １１０単位含有溶液中で３７℃。
１時間の反応により切断する。反応をフェノールを加え
ることにより停止させ、エーテル抽出によりフェノール
を除去後２倍爪のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させ
た。
ることにより停止させ、エーテル抽出によりフェノール
を除去後２倍爪のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿させ
た。
沈殿したＤＮＡペレットを６６ｆｆｉＭ）リス塩酸緩丙
液（ｐＨ’７．ｅ ） 、 ｏ、ｏ １１１Ｍ塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭ７゜デ
ノシン三リン酸溶液ｚｏｏｐｔに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．０１単位を加え１６°ｃ、１６時間の反応に
よってＤＮＡを連結させた。フェノールにより反応を停
止させ、エーテル抽出にヨリフェノールを除去後、２倍
量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤ
ＮＡを滅菌蒸留水５０／ｌ／に溶解し、形質転換用１）
Ｎ Ａ試料として用いた。
液（ｐＨ’７．ｅ ） 、 ｏ、ｏ １１１Ｍ塩化マグ
ネシウム、１０ｍＭジチオスレイトール、４ｍＭ７゜デ
ノシン三リン酸溶液ｚｏｏｐｔに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ０．０１単位を加え１６°ｃ、１６時間の反応に
よってＤＮＡを連結させた。フェノールにより反応を停
止させ、エーテル抽出にヨリフェノールを除去後、２倍
量のエタノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤ
ＮＡを滅菌蒸留水５０／ｌ／に溶解し、形質転換用１）
Ｎ Ａ試料として用いた。
形質転換は例２に記載したプロトプラスト法により行っ
た。受容菌には枯草菌几Ｍ１２５株を用いた。
た。受容菌には枯草菌几Ｍ１２５株を用いた。
得られたクロラムフェニコール、テトラサイクリン両耐
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２ｐ９７ｍｌ＋ＲＮａｓｅ Ｏ，１”９／ｍｌ
、 ２５％シュークｐ−スとなるようにＴＢバッファー
にｍＭ）４０ノＩｔに懸濁し８７℃、２時間反応させた
。この溶液に５％ＢＤＢ溶液ｌＯ／１１を加え、完全に
溶菌後、フェノール５０１ｔｌを加え１０，０ＯＯｒｐ
ｎｔｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
性を持つコロニーについてプラスミドＤＮＡの検索を行
った。すなわち、得られたコロニーを溶菌用緩衝液（リ
ゾチーム２ｐ９７ｍｌ＋ＲＮａｓｅ Ｏ，１”９／ｍｌ
、 ２５％シュークｐ−スとなるようにＴＢバッファー
にｍＭ）４０ノＩｔに懸濁し８７℃、２時間反応させた
。この溶液に５％ＢＤＢ溶液ｌＯ／１１を加え、完全に
溶菌後、フェノール５０１ｔｌを加え１０，０ＯＯｒｐ
ｎｔｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
この水層についてアガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドＤＮＡの確Ｈを行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選択
した。
ラスミドＤＮＡの確Ｈを行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株を選択
した。
各形質転換株より前述の方法でプラスミドＤＮＡを調製
し、 Ｅｃｏ几Ｉ、ＨｌｎｄｕおよびＫｐｎｌに閂する
制限酵素開裂点地図を作成した。Ｋｐｎｌの反応条件は
ＩＩＩＩＭ）ＩＪスー塩酸緩術液（ｐＨ７，５）、６ｆ
ｆｉＭ塩化ナトリウム、６１Ｍ塩化マグネジ１ンム、６
ｍＭ２−メルカプトエタノール。
し、 Ｅｃｏ几Ｉ、ＨｌｎｄｕおよびＫｐｎｌに閂する
制限酵素開裂点地図を作成した。Ｋｐｎｌの反応条件は
ＩＩＩＩＭ）ＩＪスー塩酸緩術液（ｐＨ７，５）、６ｆ
ｆｉＭ塩化ナトリウム、６１Ｍ塩化マグネジ１ンム、６
ｍＭ２−メルカプトエタノール。
８７℃である。
この結果、ｐＮｓ１由来のＨｉｎｄｕ−Ａ断片（１，５
Ｍｄ）とｐ’ｌ’Ｐ１１由来の２．８Ｍｄの断片とが結
合したプラスミドｐ Ｔ Ｐ １１０２を持つ形質転換
株が存在することが確認された。この株を枯草閉孔Ｍ１
２５（ｐＴＰ１１０２）株と名付けた。
Ｍｄ）とｐ’ｌ’Ｐ１１由来の２．８Ｍｄの断片とが結
合したプラスミドｐ Ｔ Ｐ １１０２を持つ形質転換
株が存在することが確認された。この株を枯草閉孔Ｍ１
２５（ｐＴＰ１１０２）株と名付けた。
例７：プラスミドｐＴＰ１１０２ＤＮＡの調製枯草菌Ｒ
Ｍ１２５（ｐＴｌ’１１０２）株をディ７コ・ラボラト
リーズ製プレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培
地１００−に接種する。ｐＨが７．４±０．２であるこ
とをｍｉ４？４する。
Ｍ１２５（ｐＴｌ’１１０２）株をディ７コ・ラボラト
リーズ製プレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）培
地１００−に接種する。ｐＨが７．４±０．２であるこ
とをｍｉ４？４する。
培地を５００−坂ロフラスコ中で予め滅菌する。
接種後フラスコを８７℃、約１８〜２４時間振盪＃ｇ着
する。
する。
この細胞懸濁液を１％の率で同培地の２０本のフラスコ
に接種するのに使用する。３７°Ｃで１８〜２４時間振
盪培養後、ｉｏ、ｏｏｏｘｇで約１５分間４°Ｃに於て
ブロスから分離し、上澄を菌体ペレットから傾斜で除く
。上澄を捨てペレットをＴＢＳ緩衝液によって２回洗浄
後。
に接種するのに使用する。３７°Ｃで１８〜２４時間振
盪培養後、ｉｏ、ｏｏｏｘｇで約１５分間４°Ｃに於て
ブロスから分離し、上澄を菌体ペレットから傾斜で除く
。上澄を捨てペレットをＴＢＳ緩衝液によって２回洗浄
後。
１００−の２５％蔗糖含有ＴＥＳ緩衝液に再懸濁する。
次に０．５Ｍ−ＥＤＴＡ溶液４０−１１０ ｍ９７ｍ１
ｌｊＪ度のリゾチーム溶液２０−を加え混合物を３０分
間８７°Ｃで培養する。次に５０ｍｇ ／ ｗｔｔｉＱ
度のブリジー５８ ２０ｆｎ／を加、ｔｔｉ合物を８７
℃、１０分間培養する。さらに２５ｏｍ９／−濃度のＮ
−ラウルイルサルコシンナトリウム２０−を加え、５０
°Ｃで１０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
ｌｊＪ度のリゾチーム溶液２０−を加え混合物を３０分
間８７°Ｃで培養する。次に５０ｍｇ ／ ｗｔｔｉＱ
度のブリジー５８ ２０ｆｎ／を加、ｔｔｉ合物を８７
℃、１０分間培養する。さらに２５ｏｍ９／−濃度のＮ
−ラウルイルサルコシンナトリウム２０−を加え、５０
°Ｃで１０〜８０分間培養する（細胞破壊）。
溶解物を２６，０００Ｘｇ、８０分間冷却遠心後、上澄
に５Ｍ濃度の塩化ナトリウム溶液５〇−を加え一夜放置
後、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％
となるように加え。
に５Ｍ濃度の塩化ナトリウム溶液５〇−を加え一夜放置
後、ポリエチレングリコール６０００を最終濃度１０％
となるように加え。
さらに−夜４℃にて放置した。この混合物を１０．００
０Ｘｇ、１５分間遠心し、ペレットをＴＥＳ緩摘液に溶
解した。
０Ｘｇ、１５分間遠心し、ペレットをＴＥＳ緩摘液に溶
解した。
この溶液を塩化セシウム、臭化エチジウムと混合し、密
度１．５１ｚｌの溶液とする。この溶液を１２６．０Ｏ
ＯＸ９で平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線照射
下で（３６５ａｍ）線状染色体およびプラスミドＤＮＡ
は仙い螢光を発するバンドとして遠心機チューブの中に
見られる。
度１．５１ｚｌの溶液とする。この溶液を１２６．０Ｏ
ＯＸ９で平衡まで（約４０時間）遠心する。紫外線照射
下で（３６５ａｍ）線状染色体およびプラスミドＤＮＡ
は仙い螢光を発するバンドとして遠心機チューブの中に
見られる。
このプラスミドＤＮＡを密度勾配から取り出し。
昏−オクタノールで２回抽出することにより臭化エチジ
ウムを除き１次に水層を１０倍希釈ＳＳＣ緩衝液（０，
１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ’７．ｏ ）に対して透析してｐＴＰ１１０２
ＤＮＡを得た。
ウムを除き１次に水層を１０倍希釈ＳＳＣ緩衝液（０，
１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウ
ム、ｐＨ’７．ｏ ）に対して透析してｐＴＰ１１０２
ＤＮＡを得た。
例８；プラスミドｐＴＰ１１０２からのＤＮＡ断片欠損
プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドｐＴＰ１１０２ＤＮＡ２．ｌ’＋７を。
プラスミドＤＮＡの調製 プラスミドｐＴＰ１１０２ＤＮＡ２．ｌ’＋７を。
６１１１Ｍ−）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４） 。
１００１１１Ｍ塩化ナトリウム、６１１１Ｍ塩化マグネ
シウム、ＸｂａｌｌＧ単位含有溶液中で８７”Ｃ。
シウム、ＸｂａｌｌＧ単位含有溶液中で８７”Ｃ。
１時間の反応により切断する。反応をフェノールを加え
ることにより停止させ、エーテル抽出によりフェノール
を除去後、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿さ
せた。
ることにより停止させ、エーテル抽出によりフェノール
を除去後、２倍量のエタノールを加え、ＤＮＡを沈殿さ
せた。
沈殿したＤＮＡペレットを６６ｍＭ）リス塩酸緩衝液（
ｐｎ ７．０ ）、０．６ ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭジヂオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リン酸
溶液１００μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０１
単位を加え１６°Ｃ９１６時間の反応によってＤ Ｎ
Ａを連結さぜた。フェノールにより反応を停止させ、エ
ーテル抽出により、フェノールを除去後、２倍量のエタ
ノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを滅
菌蒸留水５０ｐｌに溶解し、形質転換用ＤＮＡ試料とし
て用いた。
ｐｎ ７．０ ）、０．６ ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭジヂオスレイトール、４ｍＭアデノシン三リン酸
溶液１００μｌに溶解後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ０．０１
単位を加え１６°Ｃ９１６時間の反応によってＤ Ｎ
Ａを連結さぜた。フェノールにより反応を停止させ、エ
ーテル抽出により、フェノールを除去後、２倍量のエタ
ノールを加えＤＮＡを沈殿させた。沈殿したＤＮＡを滅
菌蒸留水５０ｐｌに溶解し、形質転換用ＤＮＡ試料とし
て用いた。
例９：形質転換
枯草菌ＲＭ１２５株のバクトーベンアッセイブロスによ
る一夜培養液を新しい同培地に１／ｌ ００散液種し８
７℃で０Ｊ）０．４（（＋００１０まで振盪培養した。
る一夜培養液を新しい同培地に１／ｌ ００散液種し８
７℃で０Ｊ）０．４（（＋００１０まで振盪培養した。
菌体を遠心により集菌し、８ＭＭＰバ、７γ−（０＋５
Ｍシュークロース、０．０２Ｍマレインｆｉ２二ナト
リウム、ＩＭＪｉ化マグネシウムを２倍β度のバクトー
ペンアッ七イブロスに溶解）に懸濁した後、最終り度２
ツ／−となるようにリゾチームを加えた。
Ｍシュークロース、０．０２Ｍマレインｆｉ２二ナト
リウム、ＩＭＪｉ化マグネシウムを２倍β度のバクトー
ペンアッ七イブロスに溶解）に懸濁した後、最終り度２
ツ／−となるようにリゾチームを加えた。
８７℃約１時間の培養の後３．ＯＯＯｒｐｍ１５分の遠
心により集菌し、ＳＭＭＰバッファーで一度洗浄後、菌
体を６−のＳ Ｍ Ｍ Ｐバッファーに懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
心により集菌し、ＳＭＭＰバッファーで一度洗浄後、菌
体を６−のＳ Ｍ Ｍ Ｐバッファーに懸濁し、プロト
プラスト溶液とした。
例８で得たＤＮＡ溶液ｒ＋ｏｐｔ（約ＤＮＡ０．５／４
）に同量の２Ｘ８ＭＭバッファーを加えた後。
）に同量の２Ｘ８ＭＭバッファーを加えた後。
上述のプロトプラスト溶液１−を加えた。さらに４０％
ポリエチレングリコール６０００溶液８ｆｎ１．を加え
て、０°ｃ２分間静置後５ｍｌのＳＭＭＰバフ７Ｔ−を
加え８．００ Ｏｒｐｍ ］、 Ｏ分間の遠心により集
菌した。集めたプロトプラストペレットを１艷のＳＭＭ
Ｐバッファーにｕ Ｋ４ａ Ｌ３０°Ｃ１，５時間培養
後、そのｏ、ｉ−をクロラムフェニコール２５１’９／
−含有のＤＭ−３再生培ｊｌｋニ塗抹し、３７℃で２〜
８日間培養することにより形質転換株を？（また。
ポリエチレングリコール６０００溶液８ｆｎ１．を加え
て、０°ｃ２分間静置後５ｍｌのＳＭＭＰバフ７Ｔ−を
加え８．００ Ｏｒｐｍ ］、 Ｏ分間の遠心により集
菌した。集めたプロトプラストペレットを１艷のＳＭＭ
Ｐバッファーにｕ Ｋ４ａ Ｌ３０°Ｃ１，５時間培養
後、そのｏ、ｉ−をクロラムフェニコール２５１’９／
−含有のＤＭ−３再生培ｊｌｋニ塗抹し、３７℃で２〜
８日間培養することにより形質転換株を？（また。
？好うレタクロラムフェニコール耐性コロニーを溶菌用
緩衝液（リゾチーム２μり／ ｍｌ 、 ＲＮａａ。
緩衝液（リゾチーム２μり／ ｍｌ 、 ＲＮａａ。
０．１ ｍｙ／ｍｌ、 ２５％シュークロースをＴＥバ
ッファーに溶Ｍ）４０μｔに懸濁し８７°Ｃ，２時間反
応させた。この溶液に５％ＳＤＳ溶液ｌＯμｌを加え、
完全に溶菌後、フ、ノール５０μｌを加え１０，０００
ｒｐｍｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
ッファーに溶Ｍ）４０μｔに懸濁し８７°Ｃ，２時間反
応させた。この溶液に５％ＳＤＳ溶液ｌＯμｌを加え、
完全に溶菌後、フ、ノール５０μｌを加え１０，０００
ｒｐｍｌＯ分間の遠心後、水層を分取した。
この水層についてアガロースゲル電気泳動法により、プ
ラスミドＤＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株につい
てさらに詳しく ｉ、’ａべた。
ラスミドＤＮＡの確認を行い１分子量が最も小さいプラ
スミドＤＮＡを持っているいくつかの形質転換株につい
てさらに詳しく ｉ、’ａべた。
すなわち、各形質転換株より前述の方法により、プラス
ミドＤＮＡを調整し、やはり前述の方法によりＸｂａ
Ｉ切断を行い、アガロースゲル電気泳動を行った結果、
プラスミドｐＴｐＨ０２の０．８ＭｄのＸｂａ Ｉ−断
片が欠損したプラスミドｐＴＰ１１０３の存在がｍ認さ
れた。
ミドＤＮＡを調整し、やはり前述の方法によりＸｂａ
Ｉ切断を行い、アガロースゲル電気泳動を行った結果、
プラスミドｐＴｐＨ０２の０．８ＭｄのＸｂａ Ｉ−断
片が欠損したプラスミドｐＴＰ１１０３の存在がｍ認さ
れた。
ｐＴＰ１１０８を有する株を枯草菌ＲＭ１２５（ｐＴＰ
１１０８）と名付けた。
１１０８）と名付けた。
ｐＴＰ１１０８は分子景８．５ Ｒ（ｄであり、コピー
数は約１００コピーであった。
数は約１００コピーであった。
以上の例で用いた微生物は工業技術院微生物１柴技術研
究所に寄託されており２次の番号を有している。
究所に寄託されており２次の番号を有している。
コリネバクテリウム・キセ四シスＭ８２ＥＦＦｉＲＭ
Ｆ〜６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＲ’１６１２２２ ＦＥＢＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＩＬＭ１２５ ＦＢＲＭ Ｐ−６９７８枯草菌ｎ
Ｍｘ２ｓ（ｐＮｓｘ） ＦＰｊＲＭ Ｐ−７００８
Ｆ〜６９７１ 枯草菌１６８ＬＭＡＲ’１６１２２２ ＦＥＢＭ Ｐ−６９７２ 枯草菌ＩＬＭ１２５ ＦＢＲＭ Ｐ−６９７８枯草菌ｎ
Ｍｘ２ｓ（ｐＮｓｘ） ＦＰｊＲＭ Ｐ−７００８
図１は、プラスミドの制御！Ｆｉ！酵素開裂点地図であ
り９図２はフローチャートである。
り９図２はフローチャートである。
Claims (1)
- テトラサイクリン耐性遺伝子およびクロラム７−二コー
ル耐性遺伝子をイＴ シ＋分子Ｅ（が約３．５メガダル
トンであり、制限酵素開裂点地図が次の通りであるプラ
スミドｐ’ｒｐｉｉｏａ
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58121789A JPS6012984A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | プラスミドｐＴＰ１１０３ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58121789A JPS6012984A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | プラスミドｐＴＰ１１０３ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6012984A true JPS6012984A (ja) | 1985-01-23 |
| JPH0141311B2 JPH0141311B2 (ja) | 1989-09-05 |
Family
ID=14819932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58121789A Granted JPS6012984A (ja) | 1983-07-05 | 1983-07-05 | プラスミドｐＴＰ１１０３ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6012984A (ja) |
-
1983
- 1983-07-05 JP JP58121789A patent/JPS6012984A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0141311B2 (ja) | 1989-09-05 |
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