JPS59501546A - ガンマグロブリン含有組成物の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ガンマグロブリン含有組成物の製造法 本発明は、ガンマグロブリン含有組成物の限外口過およびイオン交換処理に関す る。特に、本発明はガンマグロブリン濃縮物の膜限外口過および／またはイオン 交換処理中抗補体活性の発生を阻止することに関する。

ガンマグロブリン濃縮物は、ガンマグロブリンの割合が正常のプールしたヒト血 漿中に検出されるよりも大きい、免疫グロブリンＧおよび他のタンパクを含む組 成物である。該濃縮物は公知であり、そしてアルコール類その他によるプールし た血漿の分画沈澱によって得ることができる。

塩類、生物学的に活性なポリペプチドおよび他の望ましくない低分子を除去する ため、そしてまた溶液中のタンパクを濃縮するため、そのような濃縮物を限外口 過することがしばしば望ましい。同時にタンパク濃度を増すことなく低分子を除 去するように限外口過を実施することも透析として公知である。ここでの目的に 対しては、膜限外口過は、溶液または懸濁液中の比較的低分子が比較的大分子か ら、大分子が膜または障壁を通過するのを許容するには小さ過ぎる孔径を有する 膜または障壁（ゲルのような）を低分子が通過することを強制または許容するこ とによって分離されるすべての操作を含むものと解釈されるであろう。ガンマグ ロブリン濃縮物は、一般に約１００，０００ダルトンより小さい分子を通過させ る膜を有する商業的に入手し得るカセットの使用によって限外口過される。該濃 縮物は、同じ膜で製作されかつ透析すべき濃縮物を収容しているバッグに対して 透析液を交換することによって透析することができる。

Ｈａｂｅｅｂ　ｅｔ　ａｌ　（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ　”　３２　：　１４３−１５ ８　（１９７７）　）は、コーン因子■（エタノール沈澱によって得られた上昇 したガンマグロブリンレベルを含有する血漿分画）の溶液を透析し、該溶液をＤ ＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）−セルロースカラムを通過させて透析した溶 液から望ましくないタンパクを吸着し、次いで強化されたガンマグロブリン溶出 液を回収することを教える。著者によれば、ロＥＡＥ−セルロース上のクロマト グラフィーは最終免疫グロブリン製品中のガンマグロブリン凝集体および抗補体 活性の低レベルを生じた。

抗補体活性を除去することはしばしばこの技術の目的であった。

この活性はガンマグロブリン製品を安定に静注することを困難にしていた。なぜ ならばそのような注射はしばしば重大な副作用を生ずるからである。代替法は製 品を筋注することであったが、しかしこれはガンマグロブリンの治療効果を低下 させる。

本発明者らの観察においては、ガンマグロブリン濃縮物の限外口過、およびより 低い程度において陰イオン交換樹脂上のクロマトグラフィーは許容できない高補 体活性を有する製品を生ずる。従って、本発明の目的はそのような製品中の抗補 体活性の発生を減少また防止しながら、ガンマグロブリン製品の製造にイオン交 換樹脂上のクロマトグラフィーおよび／または限外口過を使用することである。

本発明のこのおよび他の目的は本明細書を全体として検討することによって一層 明らかになるであろう。

ネ捌 限外口過および／またはイオン交換樹脂での処理を含む方法によって作られたガ ンマグロブリン製品の抗補体活性は、そのような限外口過および／またはイオン 交換樹脂処理中にガンマグロブリン濃縮物へ一種または二種以上の実質上非表面 活性安定剤を加えることによって相当に低減される。これまでそのような工程中 安定剤をガンマグロブリンへ加えることは役に立つまたは必要であると信じられ ていなかったので、抗補体活性の許容し得る低レベルを有するガンマグロブリン の製造にそのような安定剤が必要であるとの発見は驚くべきであった。

の−　な− 出発物質ガンマグロブリン濃縮物は、血漿、組織、組換え微生物培養物または他 のソースから得られる分画を含有するガンマグロブリンである。もしヒト血漿か ら得たならば、−適当な出発濃縮物は、正常プールヒト血漿中に検出されるより も高い、タンパク単位重量当たりのガンマグロブリン濃度を持っているであろう 。そのような濃縮物は一般に重量で総タンパクの約８０％以上、好ましくは９６ ％より多いガンマグロブリンを含有し、残りのタンパクはアルブミン、プロトロ ンビン複合体および他の血漿成分を含んでいる。分画■のようなコーン分画は限 外口過およびイオン交換処理のための良く知られたそして好適な出発濃縮物であ る。濃縮物は好ましくはガンマグロブリンのプロテアーゼ加水分解フラグメント を実質上台まない。

濃縮物は興味ある特定の抗原または抗原群について高い力価を含有し得る。これ は、濃縮物がプールした正常血漿中に検出されるよりも大きい割合のそのような 抗原または抗原群に対して特異性の抗体を持っていることを意味する。そのよう な高免疫グロブリン濃縮物はクロストリジウムまたは肝炎のような種々の細胞ま たはビールス病原に対する高い力価を通常含有するであろう。

ここで使用される安定剤は、ガンマグロブリン濃縮物の限外口過またはイオン交 換処理中におこる抗補体活性の発生を阻止する物質である。与えられた物質がこ の目的に有効かどうかは、該物質の存在下または不存在下に免疫グロブリン含有 出発物質の、限外口過および／またはイオン交換処理を実施し、その後処理した 物質の抗補体活性を測定することによって容易に決定される。もし試験物質で処 理した物質が試験物質なしで処理した物質よりも少なくとも約２０％低い抗補体 活性を持っていれば、その時該物質は所望の活性を発揮する。

安定剤は好ましくは生理的に許容し得るか、または最終製品が安定剤の生理的許 容量を含有するような量で使用される。これは、石鹸、洗剤、界面活性剤および 他の高度に極性の物質は患者の血球に対して有害であり得るので、安定剤は実質 上非表面活性でなければならないことを意味する。さもなければ、製品濃縮物が 患者へ投与できる前に、安定剤の濃度を除去または減らすために余分の工程が必 要となろう。この工程は高価でそして時間がか＼ることがあり得る。

好適な安定剤は一般に三つの群、すなわち親水性マクロ分子、アミノ酸および低 分子量ポリオールに分けられる。

親水性マクロ分子は通常ポリマーであり、そして望ましくは患者の循環系で無害 なフラグメントへ完全に代謝または消化および／または排泄できるポリマーであ る。そのようなポリマーは約１０００ダルトンより大きい、好ましくは約３００ ０ないし５００００ダルトンの平均分子量を持つであろう。実際問題として、す べての分子が同じ分子量であるポリマーはまれにしか入手できない。従ってここ に開示する分子量は、実際の分子サイズが約３０％までプラスまたはマイナスす る平均であると考えるべきである。

マクロ分子は好ましくは非タンパクである。この理由は非人間ソースからの合成 タンパク性アミドまたはタンパクは患者への投与に際ししばしば抗原性であり、 そしてヒトソースからのタンパクは限外口過および／またはイオン交換中杭補体 活性の生成を防止するのに比較的無効であるからである。

マクロ分子は濃縮物を安定化するため十分に水溶性でなければならない。これは マクロ分子が少なくとも３　ｗ　／　ｖ％の濃度において室温において食塩水中 に可溶であるのに十分親水性であることを意味する。明らかにこの溶解度要件は 濃縮物溶液中のタンパク濃度に依存して変化し、低いタンパク濃度はより少ない 安定剤を必要としそしてこのため溶解度は低くてもよい。飽和溶液を使用でき、 そして過剰の水不溶性マクロ分子のコロイド粒子によって得られる少々の混濁は 許容し得る。しかしながら、マクロ分子は少なくとも適度な安定化に必要な量に おいて容易かつ完全に水溶性であることが望ましい。

本発明は、ガンマグロブリン濃縮物へマクロ分子を固定として、またはあらしめ 溶解した溶液として添加することを企図する。濃縮物と混合する前に溶液をつく るためにマクロ分子を加熱または他に処理することが必要かも知れない。そのよ うな場合、マクロ分子は熔解処理の冷却または停止に際してゲル化、沈澱または 結晶してはならない。

適当なマクロ分子は通常三つの一般的クラス、ポリエーテル類、ポリサ・７カラ イド類および親水性ビニルポリマー類に属す。一般に１番目のクラスが最大のガ ンマグロブリン安定性のために好ましく、ポリサンカライドは生理的許容性のた めにもっとも好ましい。

好適なポリエーテル類は一般にヒドロキシル化モノマーがら合成されたポリエー テルである。それらは以下の一般式（式中、Ａ゛はＨ，ＡはＨ，ＯＨ，−ＮＨ２ ，−ＣＨ２０Ｈ，ＣＨ２ＮＨ２、または−ＣＨ２ＣＯＯＨ，ａは１ないし３．　 ｎは約２０より大、ｂはゼロまたは１゜ＺはＣＨ２である）を有するポリマーと 、そのようなポリマー°のブロック共重合体とを含む。ポリエチレングリコール が好ましいポリマーである。

使用し得るポリサッカライドは、リポース、キシロース、マンノース、グルコー ス、ガラクトースおよびフルクトース、それらの誘導体のような糖を含む、５お よび／または６炭糖の分枝または非分枝ポリマー（ｎ＞３）を含む。例示的なポ リサッカライドは、デンプン、グリコーゲン、ヒドロキシエチルデンプン、ポリ グルコース、デキストラン、キシラン、ペクチン、アカシアおよびその加水分解 物である。

親水性ビニルポリマーは、ポリヒドロシキ置換されているが、または他の親水性 置換基を持っている。その例は、ポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリ ドンヲ含ム。

使用すべきマクロ分子の量はある程度任意である。最適量はありフｔＬｔ、＝実 験によって決定すべきであり、しかし一般にガンマクロプリン濃縮物中に存在す る総タンパクに対する重量比で、約０．００７５ないし０．０６２．好ましくは ０．０１ないし０．０５に範囲するであろう。この量は、ガンマグロブリンがマ クロ分子を含む溶液中で沈澱する沈澱工程の後で残っている微量または残存レベ ルより多くなくてはならない。このため、マクロ分子は前の精製操作の一部とし てガンマグロブリンをそれから沈澱する溶液中に存在しても、補充量のマクロ分 子が再溶解した沈澱タンパクへそれが限外口過またはイオン交換樹脂で処理され る前に添加されなければならない。

他の２種のガンマグロブリン安定剤、すなわちアミノ酸および低分子量ポリオー ルをマクロ分子と併用することによって特に有益な結果が得られる。親水性マク ロ分子とそのよ−うな安定剤の１種または２種以上の併用は、任意の１種の安定 剤単独を使用するよりも少ない各安定剤の使用を許容する。

ポリオールは約１００ダルトン未満の分子量と、そして分子量た−り一般に約７ 個のヒドロキシル基により、ヒドロキシル基による高置換度を有する化合物であ る。好ましいポリオールは糖アルコールまたは還元および非還元性モへジおよび トリサンカライドである。

例示ポリオールは、マンニトール、ソルビトール、グルコース、マンノース、ラ クトース、フルクトースおよびマルトースを含む。グルコースが最も好ましい。

アミノ酸は一般に脂肪族または中性アミノ酸、すなわちロイシン。

イソロイシン、バリンまたはグリシンである。グリシンが好ましい。

使用するポリオールまたはアミノ酸の量は、マクロ分子について前記した同じ態 様で決定されるが、ポリオールおよびアミノ酸の典型置は、それぞれ濃縮物中の 総タンパクに対する重量比で、約０．０５ないし１．２５．好ましくは０．１な いし０．５、および約０．０５０ないし０．６．好ましくは０．０７５である。

ガンマグロブリン濃縮物の限外口過はイオン交換処理の前または後でもよい。限 外口過がイオン交換工程の前に行われる時は、それは一般に望ましくない分子、 一般には塩類および溶媒６のような低分子量分子を除去する目的で透析として実 施される。イオン交換処理後の限外口過は、凍結乾燥または貯蔵前にタンパク濃 度を上げるためにしばしは行われる。ガンマグロブリン安定剤はどちらの場合で も、または限外口過およびイオン交換吸着単独においても有用である。

透析限外口過のための濃縮物中の総タンパク濃度は一般に約３０ないし６０ｇ／ ｎであり、そのうち約９０重量％はガンマグロブリンである。限外口過すべき溶 液は約１００，０００ダルトンより小さい分子を通過させる能力を持つ膜のよう な、透析膜ハング中に入れられる。ハングは次に循環する透析液中に浸漬される 。小さい分子は透析液中へ拡散し、それは慣例的に吸い出され、そして透析が進 行するにつれて新しい透析液で交換される。透析残留物中の小さい分子の所望濃 度に達した時に透析が停止される。これは小さい分子の種類と、そしてもしあれ ば透析後どんな分画操作が続くかの関数である。このように透析時間、温度およ び他のパラメーターはケース毎に必要に応じ最適化ささるであろう。

限外口過濃縮物はタンパク（そしてこのためガンマグロブリン）濃度を上昇する ために使用される。それはまた濃縮物溶液へ透析液を加え、そして高い所望のカ ンバク濃度、通常的４ないし８ｗ　／　ｖ％タンパクに達するまで限外口過を継 続することによって透析モードで使用することもでき、その間望ましくない低分 子が除去される。

限外口過透析または濃縮は、商業的に入手し得る限外口過膜システムの使用によ り大規模で実施される。これらは限外口過システムの幾何構造がタンパク溶液か らの水および／または小さい溶質分子の最も効率的な除去のために最適化されて いる、残すタンパクによってフィルター般ボアの目詰まりを減らすために残留物 流れを膜を横切って導くことを含む装置である。

本発明によれば、ガンマグロブリン濃縮物の溶液は前記した量で１種または２種 以上の安定剤を含むであろう。もし限外口過膜が安定剤のそれよりも高い分子量 カットオフを持っていれば、その時はどんな透析液も処理中の安定剤濃度の低下 を防止するために、安定剤の類似濃度を含有するであろう。

イオン交換樹脂の使用によるガンマグロブリン濃縮物の精製方法は公知である。

例えば、Ｒｅ１ｆ″Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　”β　：　７２３−７３ １　（１９６９）　、　Ｈｏｐｐｅ　ｅｔ　ａｌ、“Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ、”　２ ５　：　３０Ｂ−３１６（１９７５）および米国特許第４，３１２，９４９号を 見よ。イオン交換樹脂は正または負に帯電したイオン性基によって、またはその ような基の混合物（両性樹脂）によって置換された水不溶性物質である。それら は一般に顆粒状であり、使用前塩素、ヒドロキシルまたはアルカリ金属イオンの ような生理的に許容し得るイオンによって平衡化されている。一般に、ＤＥＡＥ −セルロースのような陰イオン交換樹脂が、それらは濃縮物からプロトロンビン 複合体を優先的に吸着し得るためにグロブリン精製に使用される。

ガンマグロブリン濃縮物溶液は、不溶性樹脂およびその結合タンパクを除去する ため遠心または口過によって回収される。イオン交換吸着操作は数回繰り返し得 る。本発明によれば、イオン交換樹脂とインキュベートしたガンマグロブリン濃 縮物溶液は前記した量で１種または２種以上の安定剤を含むであろう。

限外口過工程をイオン交換操作と同時に実施することが可能である。これは単に イオン交換樹脂を濃縮物溶液と混合し１、そして得られる混合物を限外口過する ことによって容易に達成される。しかしながら、一般に限外口過およびイオン交 換処理を順番に、限外口過透析をイオン交換処理前に実施するのが好ましい。

安定剤が使用した量において生理的に許容し得る限り、限外口過およびイオン交 換処理に続いてガンマグロブリン濃縮物から安定剤を分離することは必要でない 。このため、広い好ましい具体例においては、コーン分画■の溶液または他の濃 縮物は、約０．０５ｗ／ｖ％から、その点で濃縮物中のタンパクが沈澱する直前 までの、一般に約５ないし８　ｗ　／　ｖ％までのポリエチレングリコールを含 有する、約５．０ないし５．６３通常５．３のＩ）Ｈを持つ溶液に熔解される。

これは濃縮物溶液中に存在するポリエチレングリコール（Ｗ／Ｖ）の約半分を含 有する溶液の約３ないし５容積に対して透析される。透析残留分は回収され、濃 縮物のｐＨは後へ続くイオン交換吸着を最適化する約８．０へ調節される。水和 したＤＥＡＥセファデックスが望ましくないタンパクを吸着するために濃縮物溶 液へ混合され、ＤＡＥＡセファデックスは次に濃縮物から分離される。ポリオー ル、アミノ酸およびアルブミンが凍結乾燥中杭補体活性の発生を阻止するのに十 分な量で添加され、濃縮物が無菌口過され、容器へ充填され、凍結乾燥され、そ して容器が密封シールされる。この製品はタンパクｇ当たり抗補体活性２００　 Ｃｈ５０単位未満を含有する。透析およびイオン交換吸着工程中にポリエチレン グリコールを使用しなければ、タンパクｇ当たりの抗補体活性はしばしば１０倍 以上である。

実施例 ２個のミリポアＰｅ１ｌｉｃｏｎカセントホルダー（ステンレスりと、２０個の ミリポアＰＴｆＩＫカセント　（１００，０００ダルトンカツトオフ）と、そし て２個のダイアフラムポンプよりなるミリポア透析システム中で透析を実施した 。透析前、システムはハタテリアパイロージェンを除去するために洗浄した。パ イロ−ジエン除去後、システム・を冷たい透析緩衝液数リットルで洗浄した。透 析操作は５℃で実施した。透析流量およびポンプ速度は泡の発生を避けるように 調節した。すべての溶液はパイロ−ジエン不合水を用いて調節した。

タンパク濃度５０ｇ／βおよびｐ　Ｈ５，３を有するコーン分画■の水性出発溶 液をＮａＣＪ！　２０　ｍＭおよびＰＥＧ−４０００を０．５　ｇ　／　１２含 有する溶液の４容積（約３００７２）に対して透析した。分画■溶液をミリポア カセットを通ってポンプ送りし、そこで１００，０００ダルトン未満の分子量を 有する物質は限外口過によって除去された。濃縮された免でいる免疫グロブリン 溶液へ帰し、混合した。同時に前述の透析液を口液が発生しそしてカセットを介 して除去されるのと同じ割合で免疫グロブリン溶液中へ連続的にポンプ送りした 。

免疫グロブリン溶液は残留物および連続的に加えられた゛透析液を分布するよう にたえずかきまぜた。透析液を供給するポンプおよび混合された残留物および透 析液をカセットへ供給ポンプを調節することにより、免疫グロブリン溶液の容積 および免疫グロブリン濃度は一定に保たれた。透析液３００ｊ２を除去する時、 免疫グロブリン溶液は慣用方法でカセットを使ってタンパク濃度５５■／戚へ濃 紺された。

濃縮された免疫グロブリン溶液は以下の態様でイオン交換樹脂で処理された。ト リス塩基を溶液へ加え、最初トリス濃度を０．０２５Ｍとし、そしてｐＨを８． ０±０．１へ調節した。水和したＤＥＡＥ　（ジエチルアミノエチル）セファデ ックスＡ−５０を５　ｇ／ｇタンパクの濃度で溶液と混合し、混合物を５℃で３ 時間かきまぜ、その後セファデックスＡ−５０溶液から口過した。Ｎａα、デキ ストロース、グリシンおよびアルブミンを溶液へ最終濃度それぞれ０．８５％、 　２．−０％。

２．２５％および０．１％となるように加え、ｐＨを７．０へ調節し、タンパク 濃度を５．２へ調節した。この溶液は透析工程からもたらされたＰＥＧ−４００ ０を約１．３■／ｄ含有していた。該溶液を無菌口過し、バイアルへ充填し、凍 結乾燥し、そしてバイアルをシールした。

ｌＩ表嘲５ｇ−５０１５４Ｇ　（５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ガンマグロブリン濃縮物を限外口過および／またはイオン交換樹脂で処理す ることを含むガンマグロブリンの製造方法において、限外口過および／またはイ オン交換樹脂での処理中少なくとも１種の安定剤をガンマグロブリン濃縮物へ加 えること、と、前記安定剤はそのようにして製造されたガンマグロブリンの抗補 体活性を減少させるのに十分な量で添加されることを含む改良。 ２、ガンマグロブリン濃縮物は濃縮物の総タンパク重量の約８θ％より多いガン マグロブリンを含有している第１項の方法。 ３、安定剤は親水性マクロ分子、低分子量ポリオールまたはアミノ酸である第１ 項の方法。 ４、マクロ分子はポリエーテル、ポリサッカライドまたは親水性ビニルポリマー である第３項の方法。 ５、ポリエーテルはポリエチレングリコールである第４項の方法。 ６、安定剤はタンパクでなく、そして実質上非表面活性である第４項の方法。 ７、限外口過は濃縮物溶液の容積当たりの濃縮物の重量を増すように実施される 第１項の方法。 ８、限外口過がイオン交換処理に先行する第１項の方法。 ９、限外口過はガンマグロブリン濃縮物を少なくとも４容の透析液に対して透析 することを含む、第１項の方法。 １０、透析液も前記安定剤を含んでいる第９項の方法。 １１、透析液は緩衝化されている第１０項の方法。 １２、ポリエチレングリコールは約４０００ダルトンの平均分子量を持っている 第５項の方法。 １３、限外口過がイオン交換処理の後に続く第１項の方法。 １４、安定剤は限外口過およびイオン交換処理の両方の間添加される第８項の方 法。 １５、イオン交換処理は濃縮物からタンパクを陰イオン交換樹脂へ吸着し、ガン マグロブリン含有未吸着タンパクを回収することを含む第８項の方法。 １６、マクロ分子はポリグルコースである第４項の方法。 １７、安定剤は約１０００ダルトンより大きい分子量を有するマクロ分子である 第３項の方法。 １８、ガンマグロブリン含有溶液を回収し、細胞状微生物を除去するように該溶 液を口過し、該溶液を容器へ充填し、溶液を凍結乾燥し、容器を密封シールする ことをさらに含む第１５項の方法。 １９、該濃縮物はヒト血漿からのガンマグロブリン含有タンパクのアルコール沈 澱である第１項の方法。 ２０、限外口過は約５．０ないし５．６のｐＨで実施される第１項の方法。 ２１、マクロ分子は帯電した基を実質上音まない第３項の方法。 ２２、マクロ分子は濃縮物に存在するタンパクを沈澱するには不十分な濃度で存 在する第４項の方法。 ２３、ポリエチレングリコールは濃縮物溶液巾約０．１ないし２．０Ｗ／Ｖ％の 濃度で存在する第５項の方法。 ２４、第１８項の製品を復元し、そして静脈内投与する第１８項の方法。 ２５、安定剤の混合物を使用する第１項の方法。 ２６、混合物はポリエチレングリコール、ポリオールおよび脂肪族アミノ酸を含 む第２５項の方法。 ２７．濃縮物はコーン分画■の溶液である第１項の方法。 ２８、安定剤はヒドロキシメチルデンプンを含まない第１項の方法。