JPS59501228A - 有機物質の生合成もしくは人工合成由来を測定する方法およびその実現手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

有機物質の生合成もしくは人工合成由来を測定する方法およびその実現手段 本発明は有機物質の生合成および（または）人工合成由来を定性的におよび場合 に応じて定量的に測定する方法に関する。実際、あらゆる種類の有機物質にとっ て、その由来を表示することは、特に化学、生物学、食品化学、医薬、薬学の分 野、および当該物質の由来を解明することが重要である他のあらゆる分野におい て非常に重要である。 有機物質の由来を測定するために知られている種々の方法は、一般に、関係する 有機物質にその合成方法に従って特徴的に付随するｌまたは数種の副生成物もし くは不純物を確定することに基づいている。検査されるべき物質とは化学的に異 なる指示／標識物質を除去または誰加する可能性は、望む方向における見込まれ た分析の結果を誤らせ得るという欠点が結果す従って、あらゆる過誤から保護さ れた分析は化学的に純粋な状態における物質それ自体に対してのみおこなうこと ができる。純粋な物質は、その由来が生物学的であれ、人工的であれあるいは混 合であれ特定の化合物にとって同一であるその化学式によって表示されしたがっ て、化学的同一性のなかで特徴的で再現性のある差異を調査することすなわち、 構造化学式が実際は異なる同位体構造を含む分子のあるがままの姿の唯一の近似 であるという事実を用いることが適当であ実際、特定の物質について、その構造 形態の骨組の中には現在「イソトポマー」と名付けられている同位体種が存在す ることか知られている。その数は分子の複雑性とともに急激に増加する。−例と して、酢酸の炭素−１’３／炭素−１２同位体を以下に示す：総同位体比 位置的同位体比−％。＋３０ すなわち、この特別の場合および一般に４つの同位体同定パラメーターが定義さ れる。 ａ、　ここでは２つの可能性のある位置における炭素−１３の平均存在度に対応 する総同位体比（ａ）ｂ、　同一質量を有するが異なる同位体分布を有するイン トポマーの濃度の合計が存在するところの質量グループ Ｃ９位置による同位体比。同位体置換し得る非等価な位置の数Ｎと同じ数の位置 的同位体比（Ｃ）が存３ 存する。酢酸の場合、　Ｃ−一→Ｃは２に等しい。 ｄ、　同位体同一性を有する種もイントポマーと名付けられている。このイント ポマーは真の元素的化学物質を構成する。Ｎ個の等価でない位置がある場合２１ 個のイントポマーが存在し、加えてＮ“個の等価な位置があると２　（Ｎ’＋１ ）−・・個存在する等等である。すなわち、酢酸ナトリウムについてのイントポ マーの数は、炭素−１３７炭素１２同位体に関して２−４であり、重水素／プロ チウムに関して３＋１−４である。炭素原子および水素原子に関するその合計数 はしたがって１６である。 イソトポマーの探究は、既に、高富化媒体においておこなわれた数多くの研究の 主題であった。この目的のために、一方では重水素に関し高富化された媒体にお ける研究に関し文献（Ｅ、ベンスシュ、Ｍ−コＪｌ／　／＜　ル。 プリバレージョン・オブ・デユーテリニーテッド・エタノールＣ）１２Ｉ］ＣＨ ２０Ｈ、Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ、　Ｃｈｉｓ、　７ランス１９ｆ１３，１８Ｅｉ７Ｊ ８　−Ｅ、ベンブシュ、プリパレーション−オプ・サム・アイソトビツク・ホモ ログズφオブ・エタノール、フィジコーケミカル中スタディ−・オブ・ザ・コン ディションズ・オブ・ゼアφシンセシス・アンド・ゼアφビュアリフィケーショ ン、デイプロマＱオブ争バイヤー・スタディーズ、ファクルティー−オブ・サイ エンス書オブ拳パリ、１９６６年５月−Ｅ、ベンブシュ、ブリバレージョンφア ンド・スペクトロスコピック−アナリシス・オプ・デユーテレ−テッド・アイソ トビツク・スペシーズΦオブ脅エタノールＣ２Ｈｙ−、、ＤｒＬＯＨ，Ｂｕｌｌ 、　Ｓａｃ、　Ｃｈｉｍ、７ランス４Ｂ、＋９７１，１５−　Ｅ、ベンブシュ、 イントピーエフェクテ０イン・デル・プロトネンーウント・デューテロネンレソ ナンツーデルーデデューテリエルテン拳ホモロゲン会デス・エタノールス、コン トーランデュΦドウ・ラソンブレ・ドウ＃　５１＋ンシエテ参シミツク・ドウ９ うＲ，Ｆ、Ａ、、　１９７１年９月、　１７＋−２頁　−Ｅ、ベンブシュ。 コントリビュージョン・ツーーザ・スタディ−争オブ・ザもエタノール・モレキ ュール・パイ・ニュークリアー・マグネティック脅レゾナンス、デユーテリニー ジョン・アンド・ポジショナル・アナリシス６レゾナンス・オブ・ザ・プロトン ・アンド・オブ・グーデユートロン。イツトピー・イフェクツ、ドクトラ・テタ ・ユニベルシテ・ドウ・パリ　Ｖｌ、　１１１７２年６月−Ｅ、ベンブシュ、暦 、コルパル、阿、テリューモニー、フリバレージョン・オブ・デューデリエーテ フドーエタノールズＣ２−Ｈｙ−ｎＥｌ、ＯＨ，Ｂｕｌｌ、Ｓｏｃ、Ｃｈｉｍ、 ７ランス、１９７３、１７８８−１１３　−Ｅ、ベンブシュ、ニュークリアー・ マグネティック・レゾナツツｅ才ブ・ザ・プロトン・アンド・オブーカーボンー １３：イフェクッ・オブ・イツトビーｅオブザープド書つィズ□デユーテリニー テッド・メタノールズ、アクチュアリテΦシミツク、１！３７３゜Ｎｏ、４．１ ００　−Ｅ−ペンブシュ、ｘ、コルパル、Ｇ、Ｌ、マーチン、アイソトビツク・ アナリシス・オプ・デューテリエーテッド−エタノールーミクスチャーズ、オー ガニック・マグネティック・レソナンス　６　、１８７４゜１！３５−９　）を 挙げることができ、他方、炭素−１３に関して高富化媒体中の研究は、（「ステ ーブル・アイソトーフスφイン・ザ拳ライフ・サイエンス」アジャンスーアンテ ルナシオナル・ア傘しネルジ・アトミック１、Ａ、Ｅ、Ａ、　、ウィーン、オー ストリア、　ｌ！１７７、１９７−２０６頁におけるＥ、ペンブシュ、Ｘ、ブタ ツク、アナリシスーオブ・ザ・ＮＭＲ・スペクトラ・オプ・カーボン−１３・ア オー嚢サム・エンリッチド・アミン・アシッズｅアント・ザ・コレスポンディン グ・ペプチド６−Ｅ、ヘンブシュ、Ｊ、−Ｐｈ、グリベ、　Ｈ，Ｒ，シュルチン 、ノン−スタテイカル−ラベルΦディストリビューション・イン・バイオシンセ シス・　１３Ｃエンリツチド・アミン拳アシッド、第９回インターナショナル・ コンフェレンス・オブ−ＮＭＲ・イン・へイオロジカル自システムス、　１９８ ０年９月１〜６日、ポントル／マルセーユ　−Ｅ、ベングシュ、Ｊ、−Ｐｈグリ ベ、）１．Ｒ，シュルチン、ノン−スタテイカル・ラベルΦディストリビューシ ョン・インｅパイオーシンセティック・エンリッチドΦアミノーアシッド、　Ｚ 、Ｎａｔｕｒｆ、　３８ｂ　、　１９８１．１９８９−１９９６−Ｅ、ヘンブシ ュ、Ｊ　、　−Ｐｈ　、グリへ、Ｈ，Ｒ，シュルチン、インター−アンド争イン トラモレキュラー・アイントピ、り・ヘテルジェネイティ・イン番バイオシンセ テインク＃１３Ｃ−エンリンチトーアミノ・７シツズ・イン・アナリティカル・ ケミストリー−シンポジウム・シリーズ「ステープル・アイソトビツクＪＭ１１ ＠５　Ｂ　’／　−５９２頁（Ｈ，Ｌ、シュミット、Ｈ，フェルスチル、Ｋ、ハ インンインガー編エルセヴイール・アムステルダム、オックスフォード、ニュー ヨーク、１８８２）である。 生物学的分子に関し、同位体の総および位置的分布は統ＪＩ的でもなければ均一 でもないことが知られている（Ｂｅｒ、Ｄｅｕｔｓｃｈ　Ｂｏｔ、Ｇｅｓ、９２ ，１８７９，１８５−１９１頁におけるＨ、Ｌ、シュミットおよびＦ、Ｊ、ヴイ ンクラー、並びにＢｅｒ、［１ｅｕｔｓｃｈ　Ｂｏｔ、Ｇｅｓ、９２，１９７Ｊ １８９−１８４頁におけるＨ、ツァイグラー。反対に、これは、生物の酵素系が 多かれ少なかれ多数天然同位体すなわち炭素−１３に対する炭素−１２、重水素 に対するプロチウム等を好むということにより、細胞内条件の撹乱に従って変化 する。その結果、生物学的物質については、とりわけ光、合成のいくつかの主反 応によって生じる重質同位体における区別が存在する。この区別は二次代謝中実 質的に維持され、場合により植物−植食動物一肉食動物連鎖中にも維持され、し たがって、 １、充分な数の同位体パラメーターａ、ｂ、ｄ、ｄを測定すること； ２、代謝経路の複雑さにもかかわらず同位体分布の現象を、再現性があり予測し 得る標準に基づいて、体系づけること に成功し得るならば、植物由来すなわち、特定の物質の光合成由来に回帰するこ とを望み得る。 特に、ある分子において、例えば−Ｃ００Ｈ、−Ｃ）Ｉえ０Ｈ（ｎ＝０．１また は２）のような親木特性を持つ基、および（または）−ＣＯＯＨ基のように代謝 中に容易に再環化し得る基は、当該分子の平均的同位体含有率に比べ重質同位体 に富み、一方例えば、−ＣＨまたは一〇Ｈ２−のような疎水性基は重質同位体が 欠乏することが観察されている。 反対に、人工合成によって得た有機物質については、合成のプロセスが１００％ に近い収率で操作されるので、同位体分布が異なり、均質になる傾向にある。そ のプロセスは物質の経路の枝分れを避ける。すなわち、後者の全てもしくはほと んど全てが転化されるので、反応に関与した分子断片の初期および最終組成は非 常に近似している。合成プロセス中におこる不均等化はいくつかの位置に限られ ており、合成プロセスに従って予測できる。 その結果、ある物質の同位体特性は、その物質の由来を同定させることとなる。 天然存在における重水素の位置的同位体比を核磁気共鳴によって測定することに ょ９４１機物質の由来を決定することが既に提案されている。そのために、テト ラヘドロン・レターズ第２２巻、　、Ｎｏ、３Ｇ、３５２５−３５２８．１８８ １にあるＧ、Ｊ、マー天ンおよびＭｔ　Ｌ　、マーチンの論文を挙げることがで きる。しかしながら、重水は安価な工業的１　物質であることを考慮しても、そ の添加によって、場合によっては、望む方向におけるそのような測定の結果を誤 らせ得る。さらに、そのような測定は、時に、調へられるべき物質の環境条件に ついてしか意味を持たないことがあり得、これは次に、むしろ、その生合成、そ の地理的由来および生合成の水系媒体に関係した他のファクターの気候条件を決 定させることとなる。事実、例えばエチルアルコールはｔの由来により、その重 水素比がむしろ劇的に変動することが観察されている。しかしながら、この変動 は、上記の環境ファクターおよび植物の形だ１に極度に敞感であり、したがって それは、あらゆる場合において、アルコールの生物学的および（または）合成的 由来を決定する単一の判定基準たりえないことが確立されている。 それ故、物質例えばアルコールの生合成および（または）人工合成由来の他の有 意義な同位体特性を測定することが必要である。 現在まで、炭素−１３についての天然存在度において、総同位体比（ａ）（分子 の全燃焼による）、およびあてにならない不確実な方法で負部のグループ（ｂ） を測定するこのだけが可能であった。加えて、定量的化学劣化、純粋な状態で集 められた断片の損失のない燃焼および燃焼生成物（Ｃ０２，Ｈ２Ｏ）の質量分析 よりなる方法に従ってファクター（Ｃ）および（ｄ）を測定する試みがなされて きている。この方法は、実行するに非常に時間がかかり、非常に簡単な特定の化 合物に制限され、し刃１も、それ自体同位体分別が結果する化学反応を要するの で信頼性がほとんどない。 ある有機物質の由来を定性的におよび（または）定量的に測定するための方法で あって、重水以外の少なくとも１種の軽質で安定で磁気的に活性な同位体の位置 的同位体分布を定量核磁気共鳴のよって測定することからなる方法が見い出され た。その一般的な観点において、本発明の方法は、充分な感度並びに共鳴してい る核の数と信号の振幅との完全な比例関係を確保する条件の下で、関係するの核 のスペクトル特に炭素−１３のそれをフーリエ変換による定量核磁気共鳴によっ て記録して異なる線の表面積を算出し、それら表面積をそれら表面席の平均値と 比較することからなる。 本発明の方法は、 ｌ、化学的および生物学的反応の順序の選択性が低いことから生じるように、天 然同位体存在度の差を検出するための充分に正確な定量分析がＮＭ、Ｒ特に炭素 −１３のそれによって実現することができなっがた、 ２、仮に、そのことがいくつかの例外的な場合および富化媒体において可能であ ることが示されても、例えば炭素−１３においてただ１つの天然存在度しか持た ない化合物について同じ測定をおこなことは現在まで考えられなかった、 ３、生物学的分子における同位体の系統的分子内（Ｃ）分Ａｊについて見い出さ れた可能性のある規則すなわち、富化された媒体について確立された規則は。 天然同位体存在度条件で生成した化合物に置き換えることはできない という特に炭素−１３について現存する技術的偏見にもかかわらず、天然存在度 において、予期せざることに、上に定義したパラメーター（Ｃ）および（ｄ）測 定可能にする。 調べるべき物質のＮＭＲスペクトルの定量的利用は、面積測定法によって、自動 積分によっておよび（または）繰返しスペクトルシミュレーションすなわち、分 光パラメーターが既知の全スペクトルに寄与する各イソトポマーについてその重 みを、算出されたスペクトルが記録されたスペクトルと同一になるまで変更する ことによっておこなうことができる。 他の態様によれば、内部同位体対照として採用した分子のある位置に関する微分 測定を有利におこなうことができる。 他の態様は、同一条件下で、スペクトルをモジュラスで記録することからなる。 この態様は、異なる信号間のわずかな差を強調する、すなわち最低ピークを減少 させかつ最高ピークを相対的に増加させ、したがって積分することなく炭素−１ ３が富化または欠乏した位置を定性的により容易に認識することができる。 本発明に従っておこなわれる分子内同位の定量的利用は、同一質量（ｂ）を持つ 基の質量分析、好ましくは電場脱着すなわち分子の断裂がなくそれ改定量的同位 体測定に特に適している方法によって有利に完結させることができる。好ましく はナトリウムのようなモノ同位体金属によるカチオン化を利用するこの方法は、 はとんどの場合揮発性の殆どない極性分子であり、断裂を受け、かつ場合により 比較的複雑である生物学的分子にとって特に都合がよい。質量分析の通常の方法 はこの種の分子についてはどのような結果も期待できない、質量グループについ ての値（既に定義したパラメーターａおよびｂ）を簡単に迅速に正確に得ること は、スペクトルの集積を可能とする記録装置を持ちいることによって達成される （Ｅ、Ｄ、レーマン、Ｈ３Ｐ、シュルチン、クウォンテイタテイヴ・フェルトや デソルブチオン　−　マツセンスペクトロスコピーＶｌ。 イン・ザ・パイオシンセシス・オブ・ビタミンＢ１２．ナチュールヴイッセンシ ャフテン　旺、１９８０，２５６−２５７）。 加えて、この方法は、物質を数ミクログラムしか要さないという利点を持つ。 かくして１本発明の好ましい態様によれば、有機物質の生合成および（または） 人工合成由来を測定するために、定敬核磁気共鳴と質量分析とが、好ましくは電 場脱着によって、組合される。この場合、本発明に従って測定された位置的強度 は炭素の絶対比で表すことができる。 本発明の方法を実施するために、測定されるべき物質は比較的濃縮された溶液中 になければならない。電場−周波数サーボカップリングは、溶媒が重水素化され た形態（Ｄ２０　、　にＤＣ：＋３等）で利用できるならば溶媒の重水素核共鳴 に対し、あるいは測定すべき溶媒／物質混合物と混和性の重水素化物質に対して 、もしくは同軸チューブ内に置かれた対照物質に対しておこなわれる。 以下に、充分な感度並びに共鳴核の数と信号の振幅との間の完全な比例関係を確 保するところの、測定すべき物質のスペクトルのＮＭＲによる記録にとって特に 好ましい条件を示すニ ー章動角度は９０°、 一集積された走査数は１００ないし５０，０００、好ましくは５．　ＯＯＯない し２０．０００、有利には５．０００でなければならない、 一数値解像度は０．８ないし０．０５Ｈｚ／ポイント、好ましくはＯ１工ないし ０．２でなければならな信号のディジタル化は注意しておこなわなければならな い。ヘルツ当りのポイント数が低すぎると、細線についての測定領域が軽視され 、同位体分析を誤らせる。 この欠点を回避するために、 ａ）類似の幅を優先的に比較する、 ｂ）最も細い線が少なくとも１０のポイントによって表されるように数値解像度 を遠足する、Ｃ）打切り誤差が０．５％未満となるように積分アルゴリズムを選 択する、あるいは ｄ）フーリエ変換の曲に信−号の指数乗算によってまたは試料に緩和剤を加える こと番とよって全ての幅を実際」二同じようにする ことのいづれかをおこなわな（すれｉｆならなｌ／）。 プロトンの全デカップリング力（おこなわれる、オーバーハウゼル核効果に及ぼ す同（ｒｚ体効果による結果のいかなる変化をも回避するために、庄ｊ者をＲ０ 〕１ノードマン、Ｈ，Ｄ、ヒルおよびＲ，カブティンによって記載されたゲート 制御された照射方法（プロトン−デカップルザブレストＪ、Ｍａｇｎ、Ｒｅｓ、 　７　、１８７２，３２７−３２９）によって抑制する。 各照射後のポルツマン′平衡の１とんど完全な再確立を確保するために、最も遅 し＼核のＴ１と１１とんど差のない緩和時間Ｔ２の１０倍に相当するところの各 通過後の待ち時間Ｔ、を観測する。 炭素−１３の緩和時間を１秒のオーダ゛−まで減少させるために、例えば、三塩 化ガド゛１ノニウムのような既知の緩和剤を添加する。試料力く常磁性イオンに よって汚染されてはならない場合は、第四イオンを考慮することを望むとき数日 に達し得る長ｌ／）記録時間も許容できる。 分析すべき信号が重ね合せられてｌ、％る場合、また（よイントポマー（ｄパラ メーター）を測定することを望む場合、必要により実験的スペクトル間の微分面 積測定により、各同位体積による全スペクトルに対する寄与を繰返し変更するこ とによってスペクトルシミュレーションを適用しくプルツカ−１１ＲＣＡＬおよ びラオクーン４Ｂプログラム）、同一性が得られるまでシミュレーションする。 これをおこなうために、ＮＭＲパラメータすなわち、信号の位置、線の幅、場合 によりカップリングおよびこれらパラメータに及ぼす同位体効果について考慮し なければならない。 一般に、炭素−１３の信号は比較的離れており、あるＭＮＭＲスペクトロメータ ーは用いた周波数領域におけるスペクトルの全体の幅に渡って正確に同一の強度 特性（共鳴曲ｍ、）を持っていない。一般に、この共鳴曲線は、原理的に、アナ ログ−ディジタルコンバーターの前に用いられている低域フィルターの特性によ って決まる。もっと高いバンドパス例えば、関係するスペクトル幅よりも３倍高 いものを選択することによってこの効果を一部避けることができる。しかしなが ら、これは、信号／雑音比ひいては感度のかなりの低下という結果を招く。 生物学的化合物と比較すべき技術とのスペクトルを厳密に同一の条件の下で記録 することによってこの誤差原因を部分的に抑制することができる。 しかしながら、この欠点を克服するための理想的な手段は、ある同位体について ＮＭＲ中に各１つの線のみを生みだし、それぞれについて全同位体含有率が既知 の化合物の特定の混合物を含有する検量・較正チューブを用いてスペクトロメー ターを較正することである。この較正チューブは本発明の他の局面を構成する。 較正混合物をａ成する化合物は１等価な炭素を有する炭素−１３のＮＭＲについ ては、所定の割合で全てτいに混和性であり、互いに不活性であり、かつ燃焼に よって分解し得るものである。 好ましい較正混合物は、実質的に等しい量の炭素−１３の化合物の混合物であっ て、その線がスペクトルの全幅に渡って比較的規則的に離れているものであごの 発明の目的に好適な較正混合物の例として１重水中の以下の化合物の混合物を挙 げる。括弧内には、ｐｐｍで表示し弱い電界に対して計算したところのジメチル スルホキシドに対するその信号の相対的位置が示−ナトリウムチオシアネートＮ ａ５ＣＮ（＋　１００１００ｐｐ尿素ＮＨ２Ｃ０ＮＨ２（＋　７０ｐｐ団）−ジ メチルスルホキシド（ＣＨ３）２５Ｏ−グリコール（ＣＨ２０Ｈ）２（−１３， ８ｐｐｍ）−メチルアルコール 量は、各化合物が同一モル量の炭素に寄与するようなものである。 本発明は、上に定義したタイプの混合物を含有する較正チューブにも関し、この チューブは好ましくは封止チューブである。 スペクトルの内部較正は、多項補償関数を用いて自動化することができる。上記 較正混合物の特性をコンピューターに入力し、較正混合物のスペクトルを記録し ，コンピューターは、スペクトロメーターの応答曲線における変動を中和すると ころの多項補償関数を確立し、その結果各信号についてその位ｌとは独立に、表 面積がＣＨ３核の実際の数と厳密に比例することとな本発明の方法の実施には、 対照標準を用いることを要さない。 本発明の方法により、ある与えられた物質の生合成および（または）人工合成由 来が、本発明の方法によって得た同位体特性を対照物質もしくは基準物質のそれ と比較することによって決定できる。 そのような対照物質の不存在下において、本発明の方法はまた、構造的化学式に よって予め決められた同位体分布マトリックスを標準分析手段として用いること によって物質の由来について指標を与えることがで炭素について，親木特性を有 する基および（または）代謝中に容易に環化し得る基は当該分子の平均的同位体 含有率に対し重質同位体が富化され，他方鋳水特性を有する基は重質同位体が欠 乏する。 複雑な分子の場合、いくつかの２　（Ｎ　’　＋１）（Ｎ”＋２）　・・・イン トポマーを、ある位置だけ好ましくは相互についてその重質同位体のレベルを特 に表示する２つの位置をそれぞれ考慮することによって測定することで充分であ る。 本発明を実施するための用いるＮＭＲスペクトロメーターは、有利にはマイク− コンピューターと結合され、そこにおいて、例えば、植物ＣＢ、Ｃ４、ＣＡＭ（ Ｃ，とＣ＋との混合メカニズム）もしくは海中栽培から、４導された物質用のお よび人工物質用の標准同位体組成物がまず記憶される，また、同位体変動を生起 させるところの、環境の気候，地理的ファクターおよび由来の植物の形態の気候 、地理的ファクターを考慮した経験的適止要因を入力することもできる。次に、 このマイクロコンピュータ−に、試料のスペクトル特性特に、炭素−１３同位体 に関係するものを入力する。 本発明の方法は、炭素−１３について有利に実施されるが、窒素−１５、酸素− １７および硫黄−３３についても実施できることに気付くであろう。 加えて、炭素−１３の同位の測定を重水素または他の上記の同位体のそれと組合 せることができる。 本発明を以下の限定的ではない例によって説明するが、そこでは、メチル炭素− １３に欠乏しかつカルボを用いている。 以下の例で記録したスペクトルは、プルツカ−ＷＨ８０、ＷＰ２００ＳよよびＷ Ｍ４００　スペクトロメーターによつ１：　−の由−の ここでの方法は、分子内比′３ＣＨ，／　ＣＯＯＨの定量Ｎ　Ｍ　Ｒによる単一 測定に基づいている。 酢酸は生合成における浮化合物である。この超単純な分子は、特に、その炭素− ｉ３の内部分布の測定が従来技術によって成功した唯一のものである（Ｅ、Ｒ。 シュミット、Ｈ−グルントマン、■、フオギー、イントラモレキュラー１３Ｇ／ ”Ｃニアイソトープ・レイシオズ・オプ・アセティツク令アシッド・オブ・バイ オロジカル・アンド・テクニカル・オリジン、バイオロジカル・マス・スペクト ロメトリ一旦、１９８１．４９６−４ｉ３０　−Ｗ。 スト・アセティツク・アシッド　ｌ　、　１９７４．１７２−１７４参照）。 ７−製−純生物学的試料（Ｉ）を、２１日間の「オールド−タイム」表面発酵で 得た８、５ｒ、インビネガー（「ビエイユ・レゼルベ」ビネガー、マルタンズー し、オルレアン）から得た６連続抽出プラントにおいて、イソプロピルエーテル １．５リツトルにつきこのビネガー１リツトルを少なくとも２４時間抽出した。 こニして抽出された酢酸を単離し、分別蒸留によって精製した。酢酸的６０ｇを 得、これは出発ワインのエタノールの炭素＝１３組成を実質的に再現して人上山 　の試料（ＩＩ）として、リープルードウ−アニン（セルブ、ｎ、Ｆ、Ａ、）米 酢Ｍを用いた。この化合物は、石油のクララキンラグ方法の二次生成物であるエ チレコからアセトアルデヒドの・酸化によって製造される喧ワッカーーヘキスト 法）、このアセトアルデヒドから得た酢酸は、次に、ポリ酢酸ビニルの製造に用 いられる。この生成物の部分加水分解によって、この酢酸の一部の回収がおこな われる。このいわゆる回収酢酸は、化学的観点から特に純粋であり、そのままで 販売される。この製造方法のいくつかの段階により、炭素の同位体の分別が結果 し、カルボキシル基の炭素−１３の比が一方的に減少することが見い出される６ 本発明によれば、この同位体分布が生合成由来の酢酸のそれから反転することが わかった。 試料ＣＩ）と（ＩＩ）との等分子混合物（ＩＩＩ）も用い第４の試料（ＩＶ）と してメルク（ダルムシュタット、Ｒ，Ｆ、Ａ、）氷酢酸を用いた。これにつｌ、 Ｎた、正確な「生物学的」分子内分布が見い出された０次に、この生成物が床材 蒸留から誘導されていることが観察された。 酢ｉの４つの試料に、重水約２０容量％を加えた。 痕跡量の三塩化ガドリニウム（ＧｄＣ，４３）を加えること

【こより、炭素−１ ３の平均磁性緩和時間Ｔ２が１秒に近似した。そのときの試料はガドリニウムの ついて０．００２ないし０．００５モル濃度であった。エチレンジアミノ四＝Ｅ ［ｌＴＡ　（ティトリプレックシＩＩＩ　、メルク）の二ナトリウム塩な錯化剤 として、ガドリニウムに対して２倍量加えた。 ・　・−１３の　鳴によるａ位　の測１！以下の実験条件を確立することによっ て、充分な信号／雑音比および共鳴核と信号の振幅との間の完全な比例関係を確 保するように注意した。 １６０　ｐｐｍだけ離れた炭素−１３の２つの信号の籠単な積分をおこなった。 １０．０００走査、０．２：Ｈｚ／ポイント、　Ｔ３＝　ｌ　Ｏ秒ＮＭＲプロー ブのタイプＱ、７＋ｎｌ（５ｍｍのチュー浄書（内容に変更なし） ブ）または２　ｍｌ　（１０１１Ｍのチューブ）の試料を用いた。酢酸の由来の 区別 各試料について、炭素−１３の２つの信号を計算し、これら表面積の平均をとり 、偏差△をめた。 Ｓｍａｘ＝最もＣに冨んだ位置に相当する信号の表面積 Ｓｍ１ｎ＝も最もＣの少ない位置に相当する信号の表面積 ８ｍ　−分子についての全ての信号の表面積の平均したがって、本発明に従う方 法により、親水位置＜　ＣＨ３）よりも１２％分炭素−１３に冨む親水位置（− ｃ　ｏ　ＯＨ）　ヲ有する１００％ワインベースノ酸（Ｉ）と、その状況がほと んど逆転している人工試料（、ＩＩ）との間の明確な区別が直接的に、迅速にか つ非破壊的におこなえる。これらの結果は、従来技術によって得たそれと一致し ている。試料（ＩＩＩ）としての混合物において、現在市販されている装置を用 いて約２０％の確度で相対的濃度が測定できる。 例　２：アミン　にアスパラギン　の　−の実験条件は例Ｎｏ、１に記載したも のと同一であった。 試料の調製 アミノ酸セリン（Ｓｅｔ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、グルタミンＭ（Ｇｌｕ）、 およびアスパラギン＃（Ａｓｐ）　ヲ用いた。それらのＬ光学異性体は、メルク 社（ダルムシュタット、Ｒ，Ｆ、Ａ、）およびフルツカ社（ブックス、スイス） から得た。これらは、単一のアミノ酸を選択的に生成する微生物による海中培養 で製造される。Ａｓｐについては中間体マレイン酸無水物を介して、石油からの クラッキングガスもくはコークスオーブンガスから製造される人工由来の生成物 であるＤ／Ｌラセミ体も測定した。 重水中のこれらアミノ酸の溶液を調製した。溶解度を増加させるために、耐媒体 （塩酸）を用いた。炭素−１３の緩和時間を減少させるために、既に述べたよ浄 岩（内容をこ変更なし） ２４　顛吐−５０１２２８（９） うに、痕跡量の三塩化ガドリニウムを加えた。 結果 以下の３つの試料について以下の同位体特性が測定された。 以下に、アスパラギン１Ｌ−ＡＳｐ（生物学的由来）およびＤ／Ｌ　Ａｓｐ　（ 人工由来ラセミ体）ついて得られた数値結果を示す。 スペクトロメーターの応答曲線を同じにするように、２つのスペクトルを厳密に 同・−の条件で記録した。 ンＴ’　：’、ｐＶ、　Ｉ伺’；’；ｉこ変】（！□なし）５ ＊５０閑の追跡アームを用いて０．１％の確度を可能とするプラニメーター（Ｏ ＴＴ、タイプ１３１Ｌ、ケンブテン、ＲＦ＆）で測定。 これらの結果から、次のようにして２つのアスノやライン醗をダイアグラム的に 表示することができる。 生物学的由来の酢酸について既に観察されたように、上記表の生物学的アミノ酸 全てについて、親水特性を有する位置および（または）代謝中に容易に再環化し 得る位置は当該分子の平均的同位体含有率よりも炭素−１３に冨み、他方疎水特 性を有する位置はこの同じ同位体が欠乏していることが見い出された。アミノ酸 の基Ｃ，（は疎水特性を有する位置のように挙動する。 生物学的相互作用のほとんど無制限の複雑さが、このように簡単にかつ一般に正 当に最終の同位体分布ダイアグラムとなり、このグイアゲラムが、その分析的用 途において基準化合物の助けを必要とせずに迅速な第１のオリエンテーションを ｉ’Ｔ能とすることは予測できなかった。 人Ｉ（［３／Ｌ）アスパラギン酸は生物学的化合物（Ｌ−Ａｓｐ）について観察 されたものとほとんど反対の同位体分布を示す。両化合物は化学的には同一であ るとみなされているか、本発明に従う方法により、それらそれぞれの由来をあい まいさなく測定できる。 Ｌグルタミン酸について炭素−１３における全同位体比（−１−に定義したパラ メーター）が測定されている。この分子は、総炭素（”ｃ　＋”ｃ　）に対して １０．７３ ５％のＣを含有し、これはこの同位体の天然存在度（１１，１２％１３Ｃ）を基 準にとった場合絶対値で３ ０．２７％の不足を示している。この化合物のＣの相対的欠乏度はしたがって２ ５％である。好ましくはより小さい分子（炭素２０原子未満）について炭素−１ ３１２ ３の全体比を得るために、全燃焼および比Ｇｏ、／　Ｇｏ、（古い手法）の分析 が用いられ、一方より大きな分子については電場脱着質量分析法がより有利であ る。 −”Ｎｏ、３＋エチルアルコールの　−の　−”エチルアルコールは、その由来 の関数として、その重水素比の劇的な変動を示す。異なる生合成由来のこのアル コールを比較したとき、ワインの区別という重要な問題ももたらせられる。現在 までは、アルコールの由来は、重水素と炭素−１３との双方における全同位体比 （パラメーターａ）および位置的同位体比（パラメーターＣ）を同時に用いるこ とによって測定できただけであった。その効果は炭素−１３についてはそれほど 劇的ではないが、環境的変数により敏感ではなアルコールの必須のイソトポマー の比の測定に基づく本発明の方法により、その由来の正確な測定ができ２ る、２　（Ｎ“　＋１）　（Ｎ”＋１）＝２　（３＋１）（，２＋１）＝４８個 のエタノールの可能なイントポマー　Ｎ＝　炭素の２つの等価でない位置、Ｎ’ 　＝メチル水素の３つの等価な位置、Ｎ“°−メチル水素の２つの等価な位置の 中で、交換し得るヒドロキシプロトンを勘定に入れないで、次の６つのイソトポ マーが０．０１％以上の１２　１２　１３　１２ 確率で関与する：　０Ｈ３（Ｊ２０Ｈ，（Ｈ，ＣＨ２０Ｈ１Ｉ３Ｉ３１２１２ １２ｃ＋ｒ３１３ｃＨ２ｏＨ，ｃＨ３ｃＨ２ｏｎ、ＣＨ２ＯＣＨ２０Ｈおよび浄 書（内容に変更なし） ９ 以下の表に、これらイントポマーの比が半定量的に示されている。 ス」Ｌ辺」［製 アルコールはこれを製造しおよび（または）通常の方法によって抽出した（Ｌ、 ガラターマン、Ｈ，ヴイーラント、プラクシスｅデス・オルガニッシェン・ヒミ ケルス、ウォルター・デ・グルイテルーフェアラーグ、ベルリン、Ｉ！３５４． ３５０−１頁）。 ベジールからのＩ　Ｏ’の赤のテーブルワイン、はぼ同一の同位体特性を持つ赤 の１２°アルゲリアンワイン（試料Ｉ）、区分（ｒＢを示す白の１０シルバネワ イン、テンサイ糖から誘導されたアルコール、カンショ糖およびコーングルコー ス（ＴＶ）を用いた。石油製品からのクランキンラグガスであるエチレンをベー スとした人工合成アルコール（Ｖ）も測定した。 ■ 同位体の位置的分布について上に定義し既に用いたシンボルを使って以下の表に 半定量的結果を示す。中間体標準としてコーンスターチの特定標準を用いること によって得た全同位体比（重質同位体欠乏）がＨ，フレイブ、Ｇｅｏｃｈｉｍ、 Ｃ：ｏｓｍｏｃｈｉｍ、Ａｃｔａ　１２，１３３−１４９（１９５７）に定義さ れている国際的な同位体標準に対する％で表示されている。 ｌｌ学的　アルコール（１−ＩＶ）と人工アルコールとの明確な区別が全ての／ ４’ラメーター（：よって明ら力）となっている。 生物学的試料内では、一方（Ｃｓ植物、その光合成の一次生成物は３つの炭素原 子を有する分子である）ではブドウ由来のアルコール（Ｉ、１１）およびテンサ イ地下茎由来のものと、他方（Ｃ４植物、その−次生成物は４つの炭素を持つ分 子である）ではカンショ糖またはコーンに基づくアルコールとの差は非常に明確 である。ここでの基準は炭素−１３の全比である。 また、重水素および炭素−１３双方についてブドウ由来のアルコールとテンサイ 地下茎由来のそれとの間に差が存在する。しかしながら、重水素の比は外的およ び季節的要因に極度に敏感である。それは特に、地理緯度とともに 高さとともに 温度が低下したときに 海の影響から離れて移動したとき 地中海から大西洋を通過する場合に 果実か熟する前に収穫されたとき に低下する。 本発明の方７ノ：は、また、脂肪酸の由来の測定にも適している。他の物質（疎 水および親木特性を持つ基からなる）について上に示した効果に加えて、Ｃ３植 物から誘導された天然脂肪酸では、化学的には同一の炭素（−ＣＨ２−）に関係 しているが疎水性末端の方が親水性末端よりもＣが不足していることが見い出さ れた。 他方、存在度の弱い規則的な変化が観察されており、したがって２つの天然フラ クションからの半合成が本発明に従う方法によって検出できる。 本発明に従う方法は非常に様々な分野において他の用途を持っている。例えば、 本発明の方法は、ある植物の最適成長条件を決定するために用いることができる 。何故なら、植物の生態条件が最適であるならば同位体差異は最小であることが 観察されているからである。木刀法の用途の他の例は、動物からの有機物質を、 それが摂取された様態を検出するために測定することである。ヒトおよび動物に おけるある種の異常代謝が位置的同位体分析によって検出できる。本発明の方法 は数多くの拡張を許容し−１したがって「有機物の真正」のラジオグラフとなる 。 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＦＲ８３１００１４０ 事件との関係　特許出願人 イｌＩ訂　東京都港区虎ノ門１丁目２６番５号　第１７森ピル６　補正の対象 有機物質の生合成もしくは人工合成由来を測定する方法およびその実現手段 本発明は有機物質の生合成および（または）人工合成由来を定性的におよび場合 に応じて定量的に測定する方法に関する２実際、あらゆる種類の有機物質にとっ て、その由来を表示することは、特に化学、生物学、食品化学、医薬、薬学の分 野、および当該物質の由来を購明することが重要である他のあらゆる分野におい て非常に重要である。 有機物質の由来を測定するために知られている種々の方法は、一般に、関係する 有機物質にその合成方法に従って特徴的に付随する１または数種の副生成物もし くは不純物を確定することに基づいている。 検査されるべき物質とは化学的に異なる指示／標識物質を除去または添加する可 能性は、望む方向における見込まれた分析の結果を誤らせ得るという欠点が結果 する。 従って、あらゆる過誤から保護された分析は化学的に純粋な状態における物質そ れ自体に対してのみおこなうことができる。純粋な物質は、その由来が生物学的 であれ、人工的であれあるいは混合であれ特定の化合物にとって同一であるその 化学式によって表示される。 したがって、化学的同一性のなかで特徴的で再現性国際調査報告 ＡＮＮＥＸ　Ｔｏ　Ｔｋ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　５ＥＡＲＣＨＲＥＰＯ ＲＴ　０ＮＴｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　０ｆｆｉｃｅ　ｉｓ　ｉ ｎ　ｎｏ　ｗａｙ　１ｉａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅｓｅｐａｒｔｉｃｕｌａｒｓ 　ｗｈｌｃｈ　ａｒｅ　ｍｅｒｅｌｙ　ｇｉｖｅｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｕｒｐ ｏｓｅ　ｏｆｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ。