JPS5939299A

JPS5939299A - Steroid converting process

Info

Publication number: JPS5939299A
Application number: JP13453683A
Authority: JP
Inventors: レオ・アロイシイウス・コミネク; ホリ−・ジヨ−・ウルフ; テイモシイ・ウエンデル・エバンス
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1982-07-30
Filing date: 1983-07-25
Publication date: 1984-03-03
Anticipated expiration: 2009-03-02
Also published as: CH657871A5; JPH06225792A; NL8302596A; GB2123833A; GB8317422D0; FR2531101A1; IE831767L; DD213242A5; GB2131811A; JPH0614874B2; IE55533B1; JPH0824596B2; DE3322120C2; GB2123833B; GB8402640D0; GB2131811B; DE3322120A1; FR2531101B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.

Description

[Detailed description of the invention]

コーチゴステロイド類が治療に初めて使われた実例は１
９５０年代で、リューマチ様関節炎にコーチシンアセテ
ート処置を導入した。その後の研究で、ハイドロコーチシンとコーチシンの１
．２−位置へ不飽和を挿入すると、生ずるステロイ、ド
のプレドニソロン及びプレドニゾンの効果が高くなり、
薬剤で誘発される塩の滞留が少なくなることが立証され
た。コーチコステロイドに応答する病気の処置用に使わ
れるほとんどのその他のステロイド類はそれ以後、ステ
ロイド分子の１，２−位置に二重結合を含むものが合成
さｈるようになった。１９７７年に、ステロール前駆物
質からコーチゴステロイド類を合成する新しい方法を示
す二つの米国特許が発行された。合衆国特許第４．０３
５，２３６号は、シトステロール、スチグマステｏ−ｚ
ｎ４ハコレスチロールの発酵を通して９α−ヒドロキシ
アンドロステノジオン金つくる方法を記述している。合
衆国特許第４，０４１，０５５号はこのアンドロステン
から医学的に有用なコーチコステロイド類を合成する一
般的方法を明らかにしている。この化学で扱われる中間
体類は３−ケト−か、Ｇｌ（１１）立体配置をもちつる
。以下は、１．２−飽和ステロイドから対応する１、２−
デヒドロステロイドへの生物学的転化を明らかにした先
行技術の方法である。・合衆国特許第２．８３７．４６４号［コリネバクテ１
）ラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）によるジ
エン類の雰り造法−１アルトロバクター（コリネバクテ
リウム）・シンプレックスによる発酵液中のステロイド
類の１−脱水素の記述。［１−デヒドロステロイド類の製法］と顧する合衆国特
許第３　、３６０　、４３９号。基質及び水素キャリヤーと混合する前に、低級アルカノ
ール又はアセトンのような低級アルカノンで事前処理さ
れたＡ、シンプレックス菌体の使用によるステロイド類
の１−説水素の記述。・チャーネイ・ダブリュー　（Ｃｈａｒｎｅｙ、　Ｗ、
）及びハーゾグ・エッチ（ＨｅｒｚＯｇ、Ｈ，）、１９
６７年、ステロイドの微生物的転化。アカデミツク・プ
レス社、ニューヨーク、４〜９頁、２３６〜２６１頁。ステロイドの生物転化に関する歴史的背景、及び１−説
水素を行なうことで知られている微生物の分類学的一覧
表。・Ｔ、ヤマネ、Ｈ，ナカタニ、Ｅ、サダ、Ｔ、オマタ、
Ａ、タナ力及びｓ、７クイ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　　２１巻１
９７９年。この著者らは５０チベンゼンーヘブタンからなる混合物
中で、ノカルジア・ロドグラス（Ｎｏｃａｒｄｉａ　ｒ
ｈｏｄｏｃｒｏｕｓ　）による４−アンドロステン−３
，１７−ジオンの１＝膝水素の研究を行なった。生物転
化混合物にこの溶媒を加える既報の利点は、反応速度を
１８０の係数で増加させるにあった。しかし、ベンゼン
は知られた発がん物質である。ノカルジア・ロドクラス
の活性に好ましい電子受容体はツェナ微生物活性を冥用
的又は有用にはできないうノカルジ了・ロドクラスの酵
素は、アルトロバクター・シンプレックス用に選ばれる
電子受答体のメナジオンの存在下に活性を持たない、、
Ｎ、ロドクラス中の酵素はＡ、シンプレックスでつくら
れるものとは異なっているに違いない。反応は、ステロ
イドでわずか２ｆｌ’ｌ飽和された有機溶媒水準で進め
られた、ステロイド濃度を高めると反応速度が低下する
ことが示された。酸素け１−脱水素反応の必須試薬であ
る。溶媒０Ｉベンゼン−ヘプタン）は酸素の存在下に可
燃性であるう爆発的表環境を作らずに反応器へ酸素を導
入する方法は論じられなかった。・Ｋ、ソノモト、■、レジンＡ、タナ力及びＳ、フクイ
。Ａｇｒｉｃ、　Ｂｉ’ｏ１．　Ｃｈｅｍ、　、１４巻１
１１９−１１２６頁、１９８０年。同じ研究室がＡ、シンプレックスによるノ・イドロコー
チゾンの１−脱水素を研究した、水と混ざらないｎ−ブ
タノールとｎ−アミルアルコールの２溶媒を試験したが
、これらの溶媒の存在下に生物転化反応は進行しなかっ
た。１０％メタノール−水や１０　％プロピレングリコール
ー水のような水と混ざる溶媒が好捷しい溶媒として選ば
れた。先行技術は本改良法を開示又は示唆The first example of corchigosteroids being used for treatment was 1.
In the 1950s, corchicin acetate treatment was introduced for rheumatoid arthritis. Subsequent research revealed that hydrocortiscin and cortiscin
．． Insertion of unsaturation at the 2-position increases the effectiveness of the resulting steroids, prednisolone and prednisone,
It has been demonstrated that drug-induced salt retention is reduced. Most other steroids used for the treatment of diseases that respond to coachosteroids have since been synthesized containing a double bond in the 1,2-position of the steroid molecule. In 1977, two US patents were issued showing new methods for synthesizing corchigosteroids from sterol precursors. U.S. Patent No. 4.03
No. 5,236 is sitosterol, stigmaste oz
A method for producing 9α-hydroxyandrostenodione gold through fermentation of n4 hacholestyrol is described. US Pat. No. 4,041,055 discloses a general method for synthesizing medically useful corchicosteroids from this androstene. The intermediates handled in this chemistry have either a 3-keto- or Gl(11) configuration. Below, from the 1,2-saturated steroid to the corresponding 1,2-
Prior art methods have demonstrated biological conversion to dehydrosteroids.・US Patent No. 2.837.464 [Corynebacterium 1
) Method for producing dienes using Corynebacterium - 1 Description of 1-dehydrogenation of steroids in the fermentation broth using Corynebacterium simplex. [Process for the preparation of 1-dehydrosteroids] and US Pat. No. 3,360,439. 1-Hydrogen description of steroids by the use of A. Simplex cells pretreated with lower alkanols or lower alkanones such as acetone before mixing with substrate and hydrogen carrier.・Charney W.
) and HerzOg, H., 19
1967, Microbial transformation of steroids. Academic Press, New York, pp. 4-9, 236-261. Historical background on biotransformation of steroids and a taxonomic list of microorganisms known to perform 1-hypothesis hydrogenation.・T, Dormouse, H, Nakatani, E, Sada, T, Omata,
A, Tana Power and S, 7 Kui, Biotechnolog
y andBioengineering Volume 21 1
979 years. The authors tested Nocardia rhodograss in a mixture consisting of 50 thibenzene-hebutane.
4-androstene-3 by Hodocrous)
, 17-dione with 1=knee hydrogen. A reported advantage of adding this solvent to the bioconversion mixture was to increase the reaction rate by a factor of 180. However, benzene is a known carcinogen. The preferred electron acceptor for the activity of Nocardia rhodocras is the enzyme that does not make the microbial activity subdued or useful. has no activity,
N. The enzyme in Rhodoclas must be different from that produced in A. Simplex. The reaction was carried out at an organic solvent level saturated with only 2 fl'l of steroid, and it was shown that increasing the steroid concentration decreased the reaction rate. It is an essential reagent for the oxygen-dehydrogenation reaction. Since the solvent (0I benzene-heptane) is flammable in the presence of oxygen, a method of introducing oxygen into the reactor without creating an explosive surface environment was not discussed.・K, Sonomoto, ■, Resin A, Tana Chikara and S, Fukui. Agric, Bi'o1. Chem, , vol. 14, 1
pp. 119-1126, 1980. The same laboratory studied the 1-dehydrogenation of no-hydrocortisone by simplex A. They tested two solvents, n-butanol and n-amyl alcohol, which are immiscible with water, but no bioconversion occurred in the presence of these solvents. The reaction did not proceed. Water-miscible solvents such as 10% methanol-water and 10% propylene glycol-water were chosen as preferred solvents. Prior art discloses or suggests the improved method

【−なかった。ステロイドの１−脱水素全触媒できる空気乾燥又は加熱
乾燥された微生物の菌体を使用して、水性環境で、特に
外因性の電子受容体の存在下に、最もよく知られた先行
技術の方法で得られるよりも、１．２−飽和ステロイド
から対応する１、２−デヒドロ誘導体への能率的な転化
が得られる。また、Ａ、シンプレックス菌体と外因性電子受容体及び
脱水素化されるステロイドから力る水性スラリーに、水
と混ざる溶媒として芳香族炭化水素を添加することを伴
う方法が開示され特許請求されている。スラリーをかき
まぜ、気体空洞の酸素含有蓋が酸素の最少燃焼量より低
くなる程度に酸素を供給するか、又は肩機溶媒の引火点
より低温で反応を行なう。これらの手順は以下の理由から、微生物による先行技術
のステロイド脱水素技術よりすぐれている、１ａ）この生物転化では、未転化ステロイド某質水準が低
くなる。ｂ）この方法は、より高いステロイドη、゛す午で実施
できる。Ｃ）所定量のステロイドを転化するのに、微生物菌体、
例えばＡ、シンプレックスの量が少なくて済む。ｄ）本方法は、ステロイド中に存在する有機可溶性不純
物、微生物菌体内に存在する不純物、又は菌体によって
ステロイドからつくられる不純物に対する耐性が大きい
。ｅ）微生物菌体内に存在するステロイド分解酵素を減少
又は全面的に排除するため、望んでいる生成物の上り冒
収量が得らり、る。更に、ノカルジア・ロドクラスのようなその他の微生物
活性でステロイドを脱水素させる先行技術より溶媒手順
がすぐれている。というのは、Ａ。シンプレックスで触媒される反応はメナジオンのような
安定で安価な電子受容体で実施で鳶るから微生物本方法に使用できる微生物は１−説水素菌として知られ
る周知の多数微生物の任意のものである。このような微生物は、チャーネイ・ダブリユウ（Ｃｈａ
ｒｎｅｙ、Ｗ、　）及びハーゾグ・エッチ（Ｈｅｒｚｏ
ｇ、Ｈｏ）、１９６７年、［ステロイド類の微生物転化
］（アカデミツク・プレス社、ニューヨーク）、に名前
をあげである。ステロイドの１−説水素を行なう細菌は、「パーギーズ
マニュアルオプデターミネーテイプパイオロジー」第８
版で確定された２群に分けられる。本明細書に記載の手順は、「第１７部・放線菌及び関連
生物」に含まれるアルトロバクター属とコリネバクテリ
ウム属からの種に対して実証することに成功した。ノカ
ルジア、ミコバクテリウム、ストレプトミセス及びバク
テリウムのような第１７部のその他幾つかの属の１−脱
水素種も恐らく有用である。ステロイド類の１−説水素を行なうことが知られている
一般に入手可能な二つの微生物が、この種の方法に役立
つことが示さハ、た。合衆国特許第３．０６５，１４６
号に１−脱水素菌−ＡＴＣＣＦＪ１１．１２６７：（七
して包含されるバクテリウム・シクロオキシダンスは、
有用な微生物セして検査さ台た。ステロイドの１−説水
素にもつと広範囲に使われた細菌はアルトロバクター・
シンプレックス　ＡＴＣＣ６９４６であり、これは合衆
国特許第２，８３７．４Ｆ、４号に明らかにされている
。このため、以下の多くは本方法を例示するのにこの微
生物を使用している。［７か１７、本方法が任意の１−
脱水素微生物の使用を含めることを理Ｍ−１−べきであ
る。微生物の生育微生物は以下のものを含有する水性栄讐培地巾で生育す
る。（ａ）生育に必要な突素を供給する硝酸塩又はアンモニ
ウム塩のような無機化合物又は有機９素化合物（酵母エ
キス、はフトン、コーンスチーテリカー等）。（ｂ）　　炭素・エネルギー源、例えば炭水化物と糖誘
導体、油、脂肪酸、及びそれらのメチルエステル、アル
コール、アミノ酸又は有接酸類。（Ｃ）　　イオン及び微量元素、例えば水道水又Ｆｉ（
コーンスチーゾリカーのような）精製変の低い培地成分
によって供給される水準のナトリウム、カリウム、マグ
ネシウム、燐酸塩、硫酸塩、マンガン、銅、コバルト、
モリブデン筒。生物は生育のため大気中に存在する酸素を必要とする。生育温度の範囲は１０〜４５°Ｃであり、Ａ、シンプレ
ックスについては２８〜３７°Ｃが最適である。生育の最適ｐＨは中性付近である。ステロイド−１−脱水素酵素の産生アンドロスタ−４−エン−３，１７−シオン又ハコーチ
ゾンアセテートのような１．２−飽和３−ケトーステロ
イド化合物を培地の０．００５％（Ｗ／Ｖ　’）又はそ
れ以上の水準で加えることによって、菌体のステロイド
−１−脱水素酵素活性が誘発される。誘発物質の存在下に培養を少なくとも６１向間続けてか
ら、歯体を乾燥のため取り入れる。誘発物質を生育周期の任意の点で添加できる。ラード油のような栄養素で生育する培養基はステロイド
−１−脱水素酵素の合成を急、速に開始するが、グルコ
ースで生育する培養基は酵素合成が起る前に基質の消耗
が必要である。誘発物質を加えてから６時間ないしそれ
以上にわたって培養を続け、次に溶媒手順用又は乾燥用
に菌体をｍり入れる。乾燥用菌体回収手順菌体は、栄養培地から分離し、遠心４＋離又１寸凝集、
ろ過、限外ろ過のような慣用手段によって濃縮する。分
離された菌体は約１ないし約１０係の範囲の含水量まで
、１〜８５°Ｃ（５５〜７５°が好適）で減圧下におく
か、加熱しながら空気乾燥、又は噴霧乾燥又はタンブル
乾燥によって乾燥される。約５チの含水量が好ましい。菌体を生物転化に使用するまで５°Ｃで保存する。乾燥
した活性菌体は、陣素学の方法Ｊ　Ｘｈ■巻、１９７６
年、（アカデミツクブレス社、ニューヨーク）、１１〜
３１７頁に４己截のよ結合により、乾燥菌体を固定する
ことによってもつくられる。生物転化法生物転化は、調製された菌体をステロイド基質に露出す
ることによって達成される。典型的には、６〜１０のｐ
Ｈ（最適ｐＨ７，２５〜８．５）を本つ弱い緩衝−の水
溶液に菌体とステロイドを懸濁させるへ菌量はｔ当り０
．１〜■ｆの範囲であり、ステロイドを０．０５ないし
５．０（ステロイド：菌ａ）の重量比で加える。水性環
境で生物転化を行なう時け、を尚り５〜１０　ｆのステ
ロイドにｔ当り８〜１０　ｆの菌量が好ましい。反応を
刺激するために、触媒量（例えば５　Ｘ　１０”−’　
Ｍメナジオン）の外因性電子キャリヤーを加える。有用
な化合物はメナジオン（２−メチル−１，４−ナフトキ
ノン）、フェナジンメトサルフェート、ジクロロフェノ
ール−インドフェノール、１．４−ナフトキノン、メナ
ジオン重亜硫酸塩、ユビキノン類（補酵素Ｑ）及びビタ
ミンに型化合物を包含する。混合物を５〜４５°Ｃの温
度範囲で０〜１４日間培養する。培養中、混合物を分子
状酸素に接触させ、好ましくはかきまぜる。１−脱水素率は典型的には時間と共に減少する。生物転化は、Ｌ当たり１０　ｆの基質を使用して、２４
時間に満たないうちに完了率９８〜１００係１で進む。使用できる種々の手順の例は以下を句含する。（ａ）　　弱い緩衝度の水溶液にステロイドとメナジオ
ンを懸濁し、続いて乾燥菌体を添加する。ツウイーン＆
）のような表面活性剤を低濃鷹、例えば０〜５チで添加
し、ステロイドを懸濁しやすくさせる。（１））　　水性緩衝液系に菌体を懸濁させ、続いてエ
タノール、メタノール、アセトン中に溶Ｈされた電子キ
ャリヤーを添加する（岐路容積の５％まで）。ステロイ
ド基質を乾燥粉末として添加するか、又はジメチルホル
ムアミド、エタノール、メタノール、アセトン、ジメチ
ルスルホキシドのような水と混ざる有機溶媒、又はトル
エンのような混ざらない有機溶媒中に溶解（懸濁）でき
る。（Ｃ）　　乾燥菌体を少量の緩衝液に再水和し、続いて
緩衝液や有機溶媒を更に加える。エタノール、アセトン
、キシレン、酢酸ブチル、塩化メチレン又はトルエン等
を加えると、０〜９５チ（容量／容量）の最終有機溶媒
含有量が得られる。芳香族炭化水素の使用量は、出発ス
テロイド又は生成物ステロイドの最も易溶のものを溶解
するのに必要な量の約半量から、出発ステロイド又は生
成物ステロイドの最も難溶のものを溶解するのに必要な
量の約４倍までの範囲如ある。ステロイドと電子キャリ
ヤーは反応を開始するために加えられる。ステロイドと
共に芳香族炭化水素７加えるのが好ましい。しかし、こ
れ？緩から、又はもつと早い時期に加えてもよい。（ｄ）　　湿った菌体ケーキを弱い緩衝度の水溶液に懸
濁させるか、発酵液を同水溶液で希釈Ｌ７、続いて外因
性電子キャリヤー、ステロイド及び芳香族炭化水素を添
加する。基質範囲本発明の実施に有用な化合物類は、３−ケ）−Δ４−ア
ンドロステン及び３−ケト−へ４−プレグネン系のステ
ロイドに属している。ステロイド−１−脱水素酵素用の
基質はＡ環の炭素Ｃ１とＣ２との間に飽和をもち、Ａ環
の３位１ｉ４，１にヒドロキシル又はケト基をもつこと
が認められる。アンドロステン系の成員は以下を包含す
る。１）アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン２）ア
ンドロスタ−４，９１１１）−ジエン−３，１７−ジオ
ン及びその６α−フルオロ、６α−メチル又は１６−メ
チル誘導体３）　　＋１β−ヒドロキシアンドロスタ−４−エン−
３，１７−ジオン及びその誘導体イ「、ｔｔ用できる３−ケトーΔ４−プレグネン系のス
テロイドには次のものがある。１．１７α−ヒドロキシデレグネー４−エン−２０−イ
ン−３−オン及びその１６−メチル誘導体２．１】β、
２１−ジヒドロキシープレグナ−４，１７ｆ’ノＩＩ）
−ジエン−３−オン及びその６σ−メチル誘導体３．２
０−クロロ−プレグナ−４，９１１１１，１７ｆ２１１
）　　トリエン−２Ｊ−アール−３−オン４、以下を含めた３、２０−ジケト−Δ４−プレグネン
の幾つかの群。ａ）　　１１　＄１７．２１−　）ジヒドロキシ化合物
、例えばハイドロコーチシンとその６α−メチル誘導体ｂ）　　ｇβ、１】β−エポキシ−１７、２１−ジヒド
ロキシ化合物、例えば９β、１１β−エポキシ−１７、
２１−ジヒドロキシ−１６β−メチル−プレグオー４−
エン−３，２０−ジオンＣ）３．Δ）−ジケト−４，９１１１１−プレグ庫ジエ
ン類、例えば１７σ、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−
４，９ｔｌ１１−シェフ　−３，２０−ジオン及びその
１６α−メチル、１６β−メチル又Ｆｉ’＋６　ｒｒ−
ヒドロキシ誘導体類又は１７α−アセテートエステルｄ
）　　３．２０−ジケト−４，９（ＩＩ）　、　４．９
　（Ｉｌｌ　、　１６−ブレグネトリエン類、例えば２
１−ヒドロキシーゾレグ−１）−−４，９（１１）　、
　１６−　）す：ｃ：ｙ　−３，２０−ジオｙ及びその
６α−フルオロ誘導体２１−ヒドロキシル基（＋２及び＋４）’ｅ金含有るス
テロイド類の２１−エステル訪導体類も基質として役立
つ。好ましい２１−エステル類は低級脂肪酸、例えば酢
酸と単環式カルボン酸、例えば安息香酸のような低級ア
ルキル又はアリール基からかる。生物転化生成物及び未転化基質は慣用手段によって混合
物から回収できる。ステロイド類は典型的には、ろ過に
続いてフィルターケーキをア七トン又は塩化メチレンの
ような有機溶媒で抽出することによって回収できる。そ
の代わりに、酢酸ブチル又は塩化メチレンのよう力水と
混ざらｉい溶媒と混合することによって、全生物転化混
合物を抽出できる、次に生成物は有接溶媒から単離され
る。以下は、先行技術の方法に対する本発明方法の優秀性を
示す異なる生物転化の結果である。生物転化は、上に詳
述された条件を用いて行なわれた。実施例１乾燥菌体の調製セレロース、ベゾトン及ヒコーンスチーゾリカー（各ｈ
　６　ｔｉｔ　）からなるｐＨ７，０の培地を含有する
振とりフラスコ中にバクテリウム・シクロオキシダンス
（ＡＴＣＣ１２６７３）を接種した。路°Ｃの回転振と
り機上で、グルコースの消滅が起るまで培養基を培養し
た。この時点でコーチシンアセテート（０，５ｙｌｔ　
）を加え、フラスコを更に１６時間培養した。菌体を遠
心分離によって採を１７、水で２回洗ってから、乾燥す
るまで４５°Ｃの低真空炉に入れた。６α−メチルハイドロコーチシンの生物転化上記のとお
りに調製された乾燥菌体０．５　Ｐ　’！ｙ−１））１
７．５の５９ｍＭ燐酸緩衝液５０７！にかきオぜながら
再水和したつメナジオンをエタノール溶液（８，ｆｉ■
／ｍ／エタノール）として０．０２５　ｍｌ　／　５０
　ｍ／！の水準で菌懸濁液に加えた。基質をジメチルホ
ルムアミド（ＤＭＦ　）溶液（ＤＭＦ　＠７！当り６α
−メチルハイドロコーチシン１００■）として、０．５
　ｙｌｔの最終生物転化濃度まで添加した。混合物をか
きまぜながら２８’Ｃで培養した。４時間培養後、ステ
ロイドの９１％が転化された。６α−メチルプレドニソ
ロンを慣用手段で回収した。実施例２　７ンドロスター１．４．９１１１１−）リエ
ン−３，１７−ジオン産生ａ）生物触媒の調製グルコース６１１１．コーンス千−デリカー６ｆ／ｌ−
及び噴諾乾燥されたラード２に６ｆ／１．ｆ含有する振
とりフラスコ内の培地中でアルトロバクター・シンプレ
ックス（ＡＴＣＣ６９４６１を生育させた。培養基を回
転振とり機上で、グルコース消滅が起る寸で路°Ｃで培
養した。この時点で、ステロイド−１−デヒドログーノ
ー−ゼ合成を誘発するためにコーチシンアセテート（０
，５ｆｉｔ　）を加えた。−夜培ＩＰ移、低速遠心分離
によって菌体な取り大引た。菌はレット全乾燥のため５
５°Ｃの低真空炉へ２４［キ間入ねたつ冴時間稜、乾燥
済み材料を気密容器に移し、生物きまぜて水和した。次
にメナジオンを乾燥粉末として８６■／１の最終濃度ま
で菌量濁液に加えた。微粉砕したアンドロスタ−４，９
（ｔｌｌ−ジエン−３，１７−ジオンをジメチル糸ルム
アミド中にスラリー化し、を当たりステロイド２．５２
及び２　％　（ｖ／ｖ　）　ＤＭＦの水垢で生物転化混
合物に加えた。混合物？３１°Ｃでかきまぜながら空気
の存在下、Ｕ時間培養した。培養終了後、アンドロスタ−１，４，９１ｌｌ）　−）
ジエン−３，１フジオンを慣用手段によって回収した。実施例３前実旋例記載の条件に従って、下のステロイド化合物類
ｔｌ−Ａ、シンプレックスの乾燥菌体に露出し、対応す
る１、２−デヒドロ誘導体を得た。番号　　　　　　名　　　　前１、　アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン２．
６α−フルオロ−アンドロスタ−４，９１１＋）　−ジ
エン−３，１７−ジオン３．６α−メチル−アンドロスタ−４，９（ＩＩｌ−ジ
エン−３，１７−ジオン４．１６β−メチル−アンドロスタ−４，９１１１１−
ジエン−３，１７−ジオン５、　１７６：−ヒドロキシゾレグネー４−エンー加−
イン−３−オン６、　１７ｄ−ヒドロキシプレグナ−４，９１１１１−
ジエン−か−イン−３−オン７．１７α−ヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ−
４，９Ｈ−ジエン−頭−イン−３−オン８．１１β、２
１−ジヒドロキシ−プレグナ−４，１７（イ）−ジエン
ー３−オン９．２１−アセトキシ−１１β−ヒドロキシ・−プレグ
ナ−４，１７＠Ｊ−ジエン−３−オンｌ０１６α−メチ
ル−１１β、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−４，１７
（２０１−ジエン−３−オンエン−２１−アール−３−
オン１２、　　へイドロコーチゾン１３．６α−メチルハイドロコーチシン１４、　２１−
アセトキシ−１１／、１７−シヒドロキシー１６β−メ
チル−プレグナ−４−エン−３，２ｎ−２４，＼１５、　２１−アセトキシ−９α−フルオロ−１１１１
，１７−シヒドロキシー１６β−メチル−プレグナ−４
−エン−３，２０−ジオン１６、　２１−アセトキシ−９β、１］β−エポキシ−
１７−ヒドロキシ−１６β−メチル−プレグオー４−エ
ン−３，２０−ジオ／１７、　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−プレグ
ナー４，９Ｉ−ジエン−３１題−ジオン１８、　２１−
アセトキシ−１６α、１７−シヒドロギシーゾレグナー
４．９旧）−ジエン−３，頷−ジオン１９、　２１−ア
セトキシ−１７−ヒドロキシ−１６α−メチループレグ
ナー４．９１１１１−ジエン−３，加−ジオン２０、　２１−ベンジロキシ−１７−ヒドロキシ−１６
β−メチル−プレグナ−４，９ｔｌｌｌ−ジエン−３，
２０−ジオン２１、　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６β
−メチルーゾレグナー４．９ｔｌｌｌ−ジエン−３，２
ｎ−ジオン２２、　２１−アセトキシ−プレグナ−４，９１１１１
，１６０η−トリエン−３，加−ジオンハ、２１−アセトキシー６α−フルオロ−プレグ？　−
４，９（ｌｉｔ、１６　−　）リエｙ　−３，２１１−
ジオン転化から得られる対応生成物は次のとおりである
。番号　　生成物ン２ａ　　　６（１−７にオローアンドロスター１　、Ａ
　、９１１１１−トリエン−３，１７−ジオン３ａ　　６ペーメチルーアンドロスター１．４．９１１
１１−トリエン−３，１７−ジオン４ａ　　１６１／−メチル−アンドロスタ−１，４，９
１１１１−トリエン−３，１７−ジオン５ａ　１７α−ヒドロキシ−プレグナ−１，４−ジエン
−加−イン−３−オン６ａ　１７α−ヒドロキシ−プレグナ−１，４，９旧）
−トリエン−２０−イン−３−オン７ａ　１７α−ヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ
−１，４，９１１ｎ−トリエン−加−イン−３−オン８ａ　１】β、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１、４
，１７ｆ鏝−トリエンー３−オン９ａ　　２１−アセトキシ−１】β−ヒドロキシ−プレ
グナ−１，４，１７１劃−トリエンー３−オン及び１】
β、２１−ジヒドロキシープレグナ−１，４，１７（壜
−トリエンー３−オン１０ａ　　６α−メチル−１］β、２１−ジヒドロキシ
−プレグナ−１、４，１７＋２０−トリエン−３−オン
１１１Ｌ　　２０−クロロープレグナ−１，４，９＋１
１）、１７１澗−テトラエン−２１−アール−３−オン１２ａ　　プレドニソロン１３ａ６α−メチルーゾレドニソロン１４ａ　　２１−アセトキシ−１】β、１７−シヒドロ
キシー１６β−メチル−プレグｆ　−１，４−ジエン−
３，２０−ジオン、及び１１β、１７．２１−トリヒド
ロキシ−１６β−メチループ１／グナー１，４−ジエン
−３，２０−ジオン１５ａ　　２１−アセトキシ−９α−フルオロ−１１β
、１７−ジヒドロキシー１６β−メチル−プレグナ−１
，４−ジエン−３，２０−ジオン及び９α−フルオロ−
１１β、１７．２１−）ジヒドロキシ−１６β−メチル
ーゾレグｆ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン１６ａ　　２１−アセトキシ−９β、１１β−エポキシ
−１７−ヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ−１，
４−ジエン−３，加−ジオン及び９β、１１β−エボキ
シ−１７、２１−ジヒドロキシ−１６β−メチル−プレ
グナ−１，４−ジエン−３１題−ジオン１７ａ　　２１−アセトキシ−１７−ヒトロキシーデレ
グナー１．４．９１１１１−　）ジエン−３，２＋）−
ジオン及び１７　、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１
，４，９（Ｉｌｌ　−）リエンー３，２ｎ−ジオン１８
ａ　　２１−アセトキシ−＋６σ、１７−シヒドロキシ
ープレグナー１．４．９　ｆｌｌｌ　−）ジエン−３，
？ｆｌ−ジオン及ヒ１６α、１７．２１−トリヒドロキ
シ−プレグナ−１，４，９＋１１１−トリエン−３，２
０−ジオン１９ａ　　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６
α−メチル−プレグナ−１，４，９Ｉｌｌ　−）ジエン
−３，２０−ジオン及び１７．２１−ジヒドロキシ−１
６α−メチル−プレグナ−１，４，９１１１１−トリエ
ン−３，加−ジオン２０ａ　　２１−ベンジロキシ−１７−ヒドロキシ−１
６β−メチループレグナ−１，４，９ｔｌ１１−トリエ
ン−３，２０−シメン２１ａ２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６β−
メチルーゾレグナー１．４．９　（１１）　−）ジエン
−３，２１１−ジオン及び１７．２１−ジヒドロキ・７
−１６β−メチル−プレグナ−１，４，９１１１１−）
ジエン−３，２０−ジオン２２ａ　　２１−アセトキシ−プレグナ−１，４，９１
１１１，１ｆｉ−テトラエン−３，２０−ジオン及び２
１−ヒドロキシ−プレグナ−１，４，９＋１１１．１６
−テトラエン−３，２０−ジオン２３ａ　　２１−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグ
ナ−１，４，９１１］１．１６−テトラエン−３，２１
１−ジオン及び６α−フルオロ−２１−ヒドロキシープ
レグナ−１，４，９（１１）１１６−ｆ　）　ラ！　７
−３，２１１−ジオン実施例４二つの異なるステロイドを発酵液中のＡ、シンプレック
ス菌体及び乾燥したＡ、シンプレックス菌体によって生
物転化した。各生物転化が終了したと判断されたあと（
残留基質水準がそれ以上減少り。ないことで示される）、混合物のステロイド今抽出、単
離し、各条件に対する収束データを得た。下の表はこの結果をまとめたものである、（ａ）　　有
用ステロイドの定義は、その徒の合成に使用できる／−
１化合物、又は生成物をつくるために別の生物転化に再
循環できる１、２−ジヒドロ基質のいずれかである。（ｂ）　　その他の望ましくないステロイド分子の相当
量も回収された。実施例５アルトロバクター・シンプレックス１ｓｔの［マイクロ
ファー、／、］発酵器で生育させ、ステロイド−１−脱
水素酵素の合成を誘発させ、遠心分離によって収穫した
。回収された菌は−ストの一部を二つの異なる分離方法
にかけた。芭−は木明細書に記載の手順で、減圧下に５
５°Ｃで菌体を乾燥させるものであった。第二の方法は
、アセトン乾燥された菌体のＷＮ製について合衆国特許
第：’（，３６０，４：’（９号で勧告された手順であ
った。両全アセトンと混合し、収穫して減圧下に５°Ｃ
で乾燥した。次に乾燥菌調製剤を使用して、振とりフラ
スコ内でｌ当たり１０　ｆの賄とｔ当たりＩ（ｌ　Ｆの
ステロイドでＲ”１１−アンドロステンジオンヲ′星物
転化した。異なる方法で乾燥させたＡ、シンプレックスアセトン乾
燥　　　　１　　　　　　９８．７　　　　　　　．０
１３４　　　　　　９５．５　　　　　　　．０１１２
４　　　　　　８４．１そ　　　　　　、００７加熱乾
燥　　１　　　８５．１　　　　．１４９４　　　　　
　２３．２　　　　　　　．１９２（→　生物転化活性
を次のように計算した。００生ずる生成物ｔ／培養時間／添加菌体１＝活性←）　残
留水準はそれ以上培養しても低下しなかった。実施例６実施例１の６α−メチルハイドロコーチシン又は実施例
２のアンドロスタ−４，（Ｈｌｌｌ−ジエン−３，１７
−ジオンの代わりに以下に列挙した基質を使用して、対
応する列挙された生成物が得られる。基質１．２１−アセトキシ−９σ−フルオロ−１１１ｉ、１
ｆｉσ、１７−トリヒドロキシ−プレグナー４−エン−
３，２０−ジオン２．２１−アセトキシ−６α、９α−ジフルオロ−＝−
１１β、１６α、１７−）リヒドロキシーデレグナー４
−エン−３，２０−ジオン−１６、１７−７セトニド３
．２１−アセトキシ−６α−フルオロ−１１β−ヒドロ
キシ−１６α−メチル−プレグナ−４−エン−３，２０
−ジオン４．２１−アセトキシ−６σ−フルオロ−１１β、１７
−ヒドロキシ−プレグナー４−エン−３，加−ジオン５．２１−アセトキシ−６α、９α−ジフルオロ−１】
β、１７−シヒドロキシー１６α−メチル−プレグナ−
４−エン−３，′Ａ＋−ジオン６．２１−アセトキシ−９α−フルオロ−１１β、１６
α、１７−ドリヒドロキシーゾレグナー４−エン−３，
２ｏ−ジオン−１６，１７−ア七トニド７．２１−アセ
トキシ−９β、１１β−エポキシ−６α−フルオロ−１
６α、１７−ジヒドロキシ−プレグナー４−エン−３，
２ｎ−ジオン−１６，１７−アセトニド８．２１−アセトキシ−９β、１１β−エポキシ−１６
α−ヒドロキシ−プレグナ−４−エン−３，２Ｉ）−ジ
オン９．２１−アセトキシ−９Ｉ、１１β−エポキシ−１６
α。１７−ジヒドロキシ−プレグナー４−エン−３，２０−
ジオン−１６、１７−アセトニド生成物１．２１−アセトキシ−９α−フルオロ−１１＃　、　
１６α。１７−）リヒドロキシーデレグナー１．４−ジエン−３
，２０−７オン及び９α−フルオロ−１１β。１６α、１７．２１−テトラヒドロキシ−プレグナ−１
，４−ジエン−３，２＋）−ジオン２．２１−アセトキシ−６σ、９ａ−ジフルオロ−１】
β＋１６α、１７−トリヒドロキシープレグナー１．４
−ジエン−３，ム）−ジオン−１６，１７−アセトニド
及び６α、９α−フルオロ−１】β、１６α、　１７　
、２１−テトラヒドロキシープレグナ−１，４−ジエン
−３，２０−ジオン−１６，１７−アセトニド３．２１
−アセトキシ−６α−フルオロ−１１β−ヒドロキシ−
１６α−メチル−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０
−ジオン及び６α−フルオロ−１】β、２１−ジヒドロ
キシー１６α−メチル−プレグナ−１，４−ジエン−３
，２ｎ−ジオン４．２１−アセトキシ−６α−フルオロ
−１１β、１７−ヒドロギシーデレグナー１，４−ジエ
ン−３Ｉ２０−ジオン及び６α−フルオロ−１１β、１
７．２１−トリヒドロキシ−１，４−ジエン−３，７ｆ
）−ジオン５゜２１−アセトキシ−６α、９α−ジフルオロ−１】
β、１７−シヒドロキシー１６α−メチルーゾレグナー
１．４−ジエン−３，２０−ジオン及び６α。９α−ジフルオロ−１】β、１７．２１−）ジヒドロキ
シ−１，４−ジエン−３，２０−ジオン６．２１−アセ
トキシ−９α−フルオロ−１１β、１６α、１７−ドリ
ヒドロキシーゾレグナー１．４−ジエン−３，２０−ジ
オン−１６，１７−ア七トニド７．２１−アセトキシ−
９β、１】β−エポキシ−６α−フルオロー１６α、１
７−ジヒドロキシ−プレグナー１，４−ジエン−３，２
０−ジオン−１６，１７−ア七トニド８．２１−アセトキシ−９β、１１β−エポキシ−１６
−ヒドロキシ−プレグナー１．４−ジエン−３，２０。 −ジオン及び９β、１１β−エポキシ−１６σ、２１−
ジヒドロキシ−プレグナ−１，４−ジエン−３，２０−
ジオン９．２１−アセトキシ−９β、１】β−エポキシ−１６
α、１７−ジヒドロキシ−プレグナー１．４−ジエン−
３，２０−ジオン−１６，１７−アセトニド実施例７　
１１β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−３，１
７−ジオンの生物変換実施例２に記載のようにつくられ
たＡ、シンプレックス乾燥菌体１ｔをｐＨ７，５の５０
ｍＭ燐酸緩衝液１００−に再懸濁した。３Ａエタノール
に溶解したメナジオンヲ８６〜／ｌの最終濃度に加えた
。１】β−ヒドロキシ−アンドロステンジオン０．！Ｍ
ｆｆｉフラスコに加えた。混合物ヲ３１°Ｃの回転振と
り機上で培養した。１日の培養後採取するシ、塩化メチ
レン抽出物の薄層クロマトグラフィによって２生成物が
得られた。ステロイドの約９５幅は１１β−ビトロキシ
−アンドロスタ−１１４−ジエン−３，１７−ジオンと
して存在した。残りは未転化基質であった。実施例８実施例７の条件に従って、Ｃ−１１位ｆ＃が変更された
次のアンドロステンジオン誘導体が、ド配生成物へ１−
脱水素化できる。基　質　→　生成物＋１１　１１β−ヒドロキシ−１６β−メチル−アンド
ロスタ−４−エン−３，１７−シオンー→ｌ】β−ヒドロキシ−１６β−メチル−アンドロス
タ−１，４−ジエン−３，１７−ジオン＋２１　１１β
−ヒドロキシ−１６α−メチル−アンドロスタ−４−エ
ン−３，１７−ジオン →１１β−ヒドロキシ−１６α−メチル−アンドロスタ
−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（３１６α−フル
オロ−１１β−ヒドロキシ−アンドロスタ−４−エン−
３，１７−ジオン →６α−フルオロー１］β−ヒドロキシ−アンドロスタ
−１，４−ジエン−３，１７−ジオン（４１６α−メチ
ル−１１β−ヒドロヤシ−アンドロスタ−４−エン−３
，１７−ジオン →６α−メチルー１１β−ヒドロキシ−アンドロスタ−
１，４−ジエン−３，１７−ジオン（５１１１α−ヒド
ロキシ−アンドロスタ−４−エン−３，１７−ジオン →１］α−ヒドロキシーアンドロスタ−１，４−ジエン
−３，１７−ジオン（６）　　アンドロスタ−４−エン−３，１１，１７−
トリオン →アンドロスター１，４−ジエンー３．１１．１７−　
）ジオン実施例９１）反応容器（Ｉｔのもの）内で次のものを一緒にする
。ａ　）　　　５ＱｍＭ　　ＫＰＯ，緩　イ廚液　（ｐ）
Ｉ　　７．５　　　）　　０．９　１ｂ）　　Ａ、シン
ゾレックス乾燥菌体３．６６　ｆＣ）メナジオンｏ、ｏ
ｓ　ｔｄ）２１−アセトキシ−プレグナ−４，９１１１１，１
６−）ジエン−３，２０−ジオン８ｆｅ）トルエン１００　ｒｎｔ２）　　１５　ｃａ’ｉ７ｚ　ｍｉｎでかきまぜる。３）反応容器のガス空間で酸素を約３〜６チに保つため
に、必要に応じて空気を送る。４）温度を公°Ｃ￥１　”Ｃに保持する。５）５時間後、トルエン相を集める。本実施例でトルエン相のステロイドは次のとおりであっ
た。９４．３俤２１−アセトキシ−プレグナ−１，４，９ζ
１１１．１６−テトラエン−３，２０−ジオン４．２チ２１−ヒドロキシーデレグプ−１，４，９１１
１１，１６−テトラエン−３，２０−ジオン１．５％２１−アセトキシープレグナ−４，９１１１，
１６−ドリエンー３，２０−ジオン上の段階に対して次の範囲の変数を使用できる。段階１）ａ）緩衝液ｐｇは６〜ｉｏの範囲にありうる。ｔ））　　Ａ、シンプレックス量を、反応終了に導くの
に十分なだけの水準に減少させる。典型的な水準は、ス
テロイドｇ当たり０．０５ないし１．０２である。酵素の微生物給源はアルトロバクター（コリネバクテリ
ウム）シンプレックス（ＡＴＣＣ６９４６）又はバクテ
リウム・シクロオキシダンス（ＡＴＣＣ１２６７３）で
ある。微生物の調製：Ａ、シンプレックスの菌体を、この技術
で周知のように発酵液中で使用するか、又は菌体を集め
乾燥し、アセトン処理又は固守によって変更する。Ｃ）電子受容体を次のものから選択でへる。メナジオン
（２−メチル−１，４−ナフトキノン）、メナジオン重
亜硫酸塩、１，４−ナフトキノン及びその他のビタミン
に型化合物類電子受容体水準は価格と反応速度に対する配慮によって
決まる。反応速度はメナジオン濃度に直線的に比例して
いる。典型的な水準はステロイドにｇ当たり約５ないし
約４０２である。ｄ）ステロイド濃度は、効率的な転化がある限リ、でき
るだけ高くすべきである。ステロイドは３−ケト−へ一アンドロステン又は３−ケ
トーｇ−ルグネン系に属し、好ま；〜〈は有機溶媒中で
５９７１．以上の溶解度全もつ。ｅ）芳香族炭化水素はトルエン、ベンゼン又はキシレン
から選ばれる。これらの溶媒は一緒に使用してもよいし
、ヘプタン又は塩化メチ１／ンのような水と混ざらない
別の溶媒で希釈してもよい。芳香族炭化水素量は、出発ステロイド又は生成物ステロ
イドの最も易溶のもの全溶解するのに必要な量の約半量
から、出発ステロイド又は生成物ステロイドの最も難溶
のものを溶解するのに必要な量の約４倍までの範囲にあ
る。本笑施例では、反応終了時にステロイドを溶解するのに
十分なだけの水準のトルエンを添加した。芳香族炭化水素をステロイドと一緒に加えるのが好まし
い。しかし、芳香族炭化水素ｆ後から、又は早い時期に
添加できる、段階２）できるだけ商いかきまぜ力でかきまぜる。反応速度はか
きまぜ力の強い関数である。段階３）反応は、最終水素（電子及び陽子）受容体として酸素を
必要とする。しかし、芳香族炭化水素が存在するため、
反応器のガス空間に爆発環境が存在する。この災害を克
服するため虻、ガス空間の酸素濃度を燃焼用最少酸素量
より十分に低い濃摩に保持するのが有利である。ベンゼ
ンの場合、最少酸素量は１１．２％である。キシレン類
の場合、引火点よシ低温で反応を行なうことも可能であ
る。ｍ−キシレン、Ｏ−キシレン及びｐ−キシレンの引火点
は、それぞれ四、３２及び３９°Ｃである。段階４）反応温度は約０ないし約４５°Ｃでありうる。段階５）反応は典型的には２日間行なわれる。数時間から数週間
まで反応全行なえる。実施例１Ｏトル工ン手順と水性手順の比較に）手順次のものを一緒にする。Ａ、シンプレックス菌体　０，４２５０ｍＭ　ＫＰＯａ緩衝液（ｐＨ７，５）５０ｖ２時間
又は均質スラリーが得らり、るまでか缶まぜる。５−フラクション２本を取す、１２５−フラスコに入れ
る、各フラスコに次のものを加える。３Ａアルコール中の５ｍＭメナジオン　０．２５＋ｄア
ンドロスタ−４，１ｏｎ−ジエン−３，１７−ジオン　
０．２１密栓されたフラスコの一つにトルエン２−を加
える。手首動作（リストナクション）振とう楼ヒで４日間かき
まぜる。４８後トルエンＺ５　ｍｌ、で抽出する。抽出物を分析する。（Ｂ）　　結果手　　　順生成物実施例１１実施例９に記載の条件に従って、Ａ、シンプレックスの
乾燥菌体へ次のステロイド°化合物ｅｌｌ出し、対応す
る１、２−デヒドロ誘導体を得た。番号　　　　名　　　前１、　アンドロスタ−４−工７−３．１７−ジオン２．
６α−フルオロ−アンドロスタ−４，９１１１）−ジエ
ン−３，１７−ジオン３．６α−メチル−アンドロスタ−４，９（Ｉｌｌ−ジ
エン−３，１７−ジオン４．１６β−メチル−アンドロスタ−４，９ｔｔ１１−
ジエン−３，１７−ジオン５．１７α−ヒドロキシデレグネー４−エンー加−イン
−３−オン６．１７α−ヒドロキシゾレグネ−４，９＋１１１−ジ
エン−加−イン−３−オン７．１７α−ヒドロキシ−１６β−メチルーデレグナー
４．９（Ｉｌｌ−ジエン−２１）−イン−３−オン８．
２１−アセトキシ−Ｉｌｌ−ヒドロキシ−プレグナ−４
，１７α珍−ジエン−３オン９、　９３）−クロロ−プレグナ−４，９ｔｌｌｌ　、
　１７ｆ堕−トリエンー２１−アール−３−オン１０、　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−プレグ
ナー４，９１１１１−ジエン−３，旬−ジオン１１、　
２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６σ−メチル
−プレグナ−４，９１１１１−ジエン−３，２０−ジオ
ン１２、　２１−ベンゾイロキシ−１７−ヒドロキシ−１
６β−メチル−プレグナ−４，９１１１１−ジエン−３
，２０−ジオン１３、　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６β
−メチルーデレグナー４．９ｆｌｌｌ−ジエン−３，２
０−ジオン１１Ｌ　　２１−アセトギシー！レグナ−４，９ｆｌｌ
ｌ＋１６　１”ジエン−３，２０−ジオン１５、　２１−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグナ
−４，９（ＩＬ　１ｆｉｌ１７１　−　）　リエｙ　−
３，’７）−ジオン転化から得られる対応生成物は次の
とおりである。番号　　生成物１ａ　アンドロスタ−１，４−ジエン−３，１７−ジオ
ン２ａ６ａ−フルオロ−アンドロスタ−１，４，９＋ｌ
１ｌ−トリエンー３，１７−ジオン３ａ　　Ｆ＋ｃｌ−メチル−アンドロスタ−１，４，９
ｔｉｌｌ　−トリエン−３，１７−ジオン４ａ　１６β−メチル−アンドロスタ−１，４，９１１
１１−トリエン−３，１７−ジオン５ａ　１７α−ヒドロキシプレグナ−１，４−ジエン−
λ）−イン−３−オン６ａ　１７α−ヒドロキシプレグナ−１，Ａ、９旧）−
トリエン−加−イン−３−オン７ａ　１７α−ヒドロキシ−１６β−メチル−プレグナ
−１，４，９ｕｌｌ　−）リエンー加−インー３−オン８ａ　２１−アセトキシ−１１β−ヒドロキシ−プレグ
ナ−１，４，１７Ｆ２ｆ）−トリエン−３−オン及びｌ
】β、２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１，４，１７（
イ）−トリエン−３−オン９ａ　　２０−クロロ−プレグナ−１，４，９１１１１
、１７ｍ　−テトラエン−２１−アール−３−オン１０ａ　　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−プレ
グナー１．４．９１１１１−　）リエンー３，２ｎ−ジ
オン及び１７．２１−ジヒドロキシ−プレグナ−１，４
，９０１１−トリエン−３，２０−ジオン１１ａ　　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６
α−メチル−プレグナ−１，４，９１１１１−）リエン
ー３．２０−ジオン及び１７．２１−ジヒドロキシ−】
６α−メチループ宵グナー１．４．９旧；−トリエン−
３，２０−ジオン１２ａ　　２１−ベンゾイロキシ−１７−ヒドロキシ−
１６β−メチル−プレグナ−１，４，９ｔｉｌｌ　−）
ジエン−３，加−ジオン１３ａ　　２１−アセトキシ−１７−ヒドロキシ−１６
β−メチループレグナー１．４，９１１１１−　）リエ
ンー３．２Ｔ３−ジオン及び１７．２１−ジヒドロキシ
−１６β−メチル−プレグナ−１，４，９１１１１−ト
リエン−３，２０−ジオン１４ａ　　２１−アセトキシ−プレグナ−１，４，９１
Ｅ、１６−テトラエン−３，２０−ジオン及び２１−ヒ
ドロキシ−プレグナ−１，４，９１１１１、１６−チト
ラエンー　３．２０−ジオン１５ａ　　２１−アセトキシ−６α−フルオロ−プレグ
ナ−１，４，９（Ｉｌｌ　、　１６−チトラエンー３．
２ｎ−ジオン及び６α−フルオロ−２１−ヒドロキシ−
プレグナ−１，４，９＋１１１．１６−テトラエン−３
，２０−ジオン１．２−デヒドロステロイド類の有用性はよく知られて
いる。例えば合衆国特許第３．２Ｆ１４．４４７号を参
照。この特許は、炭素１６が置換された利尿性コーチコ
ステロイドの合成におけるΔ１．ａ、ｅ（ｘｉ）プレグ
ネトジエン類の有用性を明らか圧している。会衆にして
おり、１．２−デヒドロアンドロステン類の有用性を、
医学的に有用なステロイドの製造における重要な中間体
として示している。 ■４３６５５２＠１９８３年３月１５日Φ米国（ＵＳ）■４７５４３７０発　明　者　テイモシイ・ウエンデル・エバンスアメリカ合衆国ミシガン州スリーリバース・ウェスト・ミシガン１６７１０[-There wasn't. The best known prior art method uses air-dried or heat-dried microbial cells capable of total catalyzing the 1-dehydrogenation of steroids in an aqueous environment, especially in the presence of an exogenous electron acceptor. A more efficient conversion of the 1,2-saturated steroid to the corresponding 1,2-dehydro derivative is obtained than that obtained with Also disclosed and claimed is a method involving the addition of an aromatic hydrocarbon as a water-miscible solvent to an aqueous slurry made from A. simplex cells, an exogenous electron acceptor, and a steroid to be dehydrogenated. There is. The slurry is stirred and oxygen is supplied to such an extent that the oxygen-containing lid of the gas cavity is below the minimum amount of oxygen burned, or the reaction is carried out at a temperature below the flash point of the shoulder solvent. These procedures are superior to prior art microbial steroid dehydrogenation techniques for the following reasons: 1 a) This bioconversion results in lower levels of unconverted steroids. b) This method can be carried out with higher steroid η, ゛゛. C) Microbial cells,
For example, A. The amount of simplex can be small. d) The method is highly resistant to organic soluble impurities present in steroids, impurities present within microbial cells, or impurities produced from steroids by microbial cells. e) The steroid-degrading enzymes present in the microbial cells are reduced or completely eliminated, so that higher yields of the desired product can be obtained. Furthermore, the solvent procedure is superior to prior art techniques for dehydrogenating steroids with other microbial activities such as Nocardia rhodocras. That's because A. Since the simplex-catalyzed reaction can be carried out with stable and inexpensive electron acceptors such as menadione, the microorganisms that can be used in the present method are any of the well-known polymicrobial species known as 1-hydrobacteria. . Such microorganisms are Chaney
Rney, W.) and Herzog H.
G. Ho), 1967, Microbial Conversion of Steroids (Academic Press, New York). Theory 1 of steroids: Bacteria that carry out hydrogenation are described in "Purgy's Manual of Opdeterminant Biology", Part 8.
It is divided into two groups determined by the edition. The procedures described herein have been successfully demonstrated against species from the genera Arthrobacter and Corynebacterium, which are included in "Part 17 - Actinobacteria and Related Organisms". The 1-dehydrogenating species of several other genera of Part 17, such as Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces and Bacterium, may also be useful. Two commonly available microorganisms known to perform hydrogenation of steroids have been shown to be useful in this type of method. U.S. Patent No. 3.065,146
No. 1-Dehydrogenating bacteria-ATCCFJ11.1267: (7) Bacterium cyclooxidans is included in
Useful microorganisms were tested. Theory 1 of steroids: The bacteria that were widely used for hydrogen production were Arthrobacter.
Simplex ATCC 6946, which is disclosed in US Pat. No. 2,837.4F,4. For this reason, much of what follows uses this microorganism to illustrate the method. [7 or 17, this method is optional 1-
The use of dehydrogenating microorganisms should be included. Growth of Microorganisms Microorganisms grow in an aqueous nutrient medium containing: (a) Inorganic compounds such as nitrates or ammonium salts or organic 9-element compounds (yeast extract, hafuton, corn tea liquor, etc.) that supply the elements necessary for growth. (b) Carbon/energy sources, such as carbohydrates and sugar derivatives, oils, fatty acids and their methyl esters, alcohols, amino acids or clathrated acids. (C) Ions and trace elements, such as tap water or Fi (
levels of sodium, potassium, magnesium, phosphates, sulfates, manganese, copper, cobalt,
Molybdenum cylinder. Living things require oxygen present in the atmosphere to grow. The growth temperature range is 10-45°C, with 28-37°C being optimal for A. simplex. The optimum pH for growth is around neutrality. Production of steroid-1-dehydrogenase A 1,2-saturated 3-ketose steroid compound such as androst-4-ene-3,17-sion or hacortisone acetate was added to the medium at 0.005% (W/V'). ) or higher, steroid-1-dehydrogenase activity of bacterial cells is induced. Incubation is continued for at least 61 hours in the presence of the inducer before the tooth body is removed for drying. Inducers can be added at any point in the growth cycle. Culture media grown on nutrients such as lard oil initiate synthesis of steroid-1-dehydrogenase rapidly and rapidly, whereas cultures grown on glucose require substrate depletion before enzyme synthesis can occur. Incubation is continued for 6 hours or more after addition of the inducer, and then the cells are plated for solvent procedures or drying. Bacterial cell recovery procedure for drying Bacterial cells are separated from the nutrient medium, centrifuged 4+ dispersion, and agglutinated for 1 inch.
Concentrate by conventional means such as filtration or ultrafiltration. The isolated bacterial cells are air-dried, spray-dried, or tumbled at 1-85°C (preferably 55-75°C) under vacuum or with heating to a moisture content in the range of about 1 to about 10 parts. Dry by drying. A water content of about 5 inches is preferred. Store the bacterial cells at 5°C until use for bioconversion. Dried active bacterial cells are prepared using the methods of Jinzogaku no J, Vol. Xh, 1976.
(Academic Breath, New York), 11-
It can also be produced by fixing dried bacterial cells using a 4-self-cleavage bond (page 317). Bioconversion Method Bioconversion is accomplished by exposing prepared bacterial cells to steroid substrates. Typically between 6 and 10 p
Bacterial cells and steroids are suspended in a weakly buffered aqueous solution containing H (optimal pH 7.25 to 8.5), and the amount of bacteria is 0 per ton.
．． The steroid is added at a weight ratio of 0.05 to 5.0 (steroid:bacteria a). When carrying out bioconversion in an aqueous environment, a bacterial mass of 8 to 10 f/t is preferred, with 5 to 10 f of steroid. To stimulate the reaction, a catalytic amount (e.g. 5 X 10"-'
Add an exogenous electron carrier of M-menadione). Useful compounds include menadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone), phenazine methosulfate, dichlorophenol-indophenol, 1,4-naphthoquinone, menadione bisulfite, ubiquinones (coenzyme Q) and vitamin-type compounds includes. The mixture is incubated for 0-14 days at a temperature range of 5-45°C. During cultivation, the mixture is exposed to molecular oxygen and preferably agitated. 1-Dehydrogenation rate typically decreases with time. Bioconversion was performed using 10 f substrate per L,
Progress with a completion rate of 98-100 and 1 before the time is up. Examples of various procedures that can be used include: (a) Suspend steroids and menadione in a weakly buffered aqueous solution, and then add dried bacterial cells. Tween &
) is added at a low concentration, e.g. 0-5%, to help suspend the steroid. (1)) Suspend the bacterial cells in an aqueous buffer system, then add the electron carrier dissolved in ethanol, methanol, acetone (up to 5% of the crossroads volume). The steroid substrate can be added as a dry powder or dissolved (suspended) in a water-miscible organic solvent such as dimethylformamide, ethanol, methanol, acetone, dimethyl sulfoxide, or an immiscible organic solvent such as toluene. (C) Rehydrate the dried bacterial cells in a small amount of buffer, and then further add buffer and organic solvent. Addition of ethanol, acetone, xylene, butyl acetate, methylene chloride, or toluene, etc., yields a final organic solvent content of 0 to 95 units (vol/vol). The amount of aromatic hydrocarbon used ranges from about half the amount needed to dissolve the most easily soluble starting steroid or product steroid to the amount needed to dissolve the least soluble starting steroid or product steroid. There is a range of up to about four times the amount required for this purpose. Steroids and electron carriers are added to initiate the reaction. Preferably, the aromatic hydrocarbon 7 is added along with the steroid. But this? It may be added gradually or at an early stage. (d) Suspending the wet cell cake in a weakly buffered aqueous solution or diluting the fermentation broth with the same aqueous solution L7 followed by addition of exogenous electron carriers, steroids and aromatic hydrocarbons. Substrate Range Compounds useful in the practice of this invention belong to the 3-ke)-Δ4-androstene and 3-keto-to-4-pregnene series of steroids. It is observed that the substrate for steroid-1-dehydrogenase has saturation between carbons C1 and C2 of the A ring and a hydroxyl or keto group at the 3-position 1i4,1 of the A ring. Members of the androstene family include: 1) Androsta-4-ene-3,17-dione 2) Androsta-4,9111)-diene-3,17-dione and its 6α-fluoro, 6α-methyl or 16-methyl derivatives 3) +1β-hydroxy Androstar-4-en-
3,17-dione and its derivatives 3-keto Δ4-pregnene steroids that can be used in tt include the following. and its 16-methyl derivative 2.1]β,
21-dihydroxy pregnar-4,17f'no II)
-Dien-3-one and its 6σ-methyl derivative 3.2
0-chloro-pregna-4,91111,17f211
) Trien-2J-R-3-one 4, several groups of 3,20-diketo-Δ4-pregnene, including: a) 11 $17.21-) Dihydroxy compounds, such as hydrocortiscin and its 6α-methyl derivatives; b) gβ, 1] β-epoxy-17,21-dihydroxy compounds, such as 9β, 11β-epoxy-17;
21-dihydroxy-16β-methyl-preguor 4-
En-3,20-dione C)3. Δ)-diketo-4,91111-preg dienes, such as 17σ, 21-dihydroxy-preg-
4,9tl11-chef-3,20-dione and its 16α-methyl, 16β-methyl or Fi'+6 rr-
Hydroxy derivatives or 17α-acetate esters
) 3.20-diketo-4,9(II), 4.9
(Ill, 16-bregnetrienes, e.g. 2
1-hydroxyzoleg-1)--4,9(11),
16-)S:c:y-3,20-dioy and its 6α-fluoro derivatives 21-hydroxyl groups (+2 and +4)'e 21-ester derivatives of gold-containing steroids also serve as substrates. Preferred 21-esters are comprised of lower alkyl or aryl groups such as lower fatty acids such as acetic acid and monocyclic carboxylic acids such as benzoic acid. The bioconversion product and unconverted substrate can be recovered from the mixture by conventional means. Steroids can typically be recovered by filtration followed by extraction of the filter cake with an organic solvent such as acetane or methylene chloride. Alternatively, the entire bioconversion mixture can be extracted by mixing with a water-immiscible solvent such as butyl acetate or methylene chloride, and the product is then isolated from the solvent. Below are the results of different bioconversions demonstrating the superiority of the present method over prior art methods. Bioconversion was performed using the conditions detailed above. Example 1 Preparation of dried bacterial cells
Bacterium cyclooxidans (ATCC 12673) was inoculated into a shake flask containing a medium consisting of 6 tit ) at pH 7.0. The cultures were incubated on a rotary shaker at 40°C until glucose extinction occurred. At this point, coachcine acetate (0,5ylt
) was added and the flasks were incubated for an additional 16 hours. The bacterial cells were collected by centrifugation, washed twice with water, and placed in a low vacuum oven at 45°C until dry. Bioconversion of 6α-methylhydrococcicin 0.5 P' of dried bacterial cells prepared as above! y-1))1
7.5 of 59mM phosphate buffer 507! Add rehydrated menadione to an ethanol solution (8, fi■
/m/ethanol) as 0.025 ml/50
m/! was added to the bacterial suspension at a level of Substrate was added to dimethylformamide (DMF) solution (6α per DMF@7!
-Methylhydrococcicin 100■), 0.5
ylt was added to the final bioconversion concentration. The mixture was incubated at 28'C with agitation. After 4 hours of incubation, 91% of the steroid was converted. 6α-Methylprednisolone was recovered by conventional means. Example 2 7ndroster 1.4.91111-) Liene-3,17-dione production a) Preparation of biocatalyst Glucose 6111. Cornus Sen-Delika 6f/l-
and spray dried lard 2 with 6f/1. Arthrobacter simplex (ATCC 69461) was grown in a medium in shake flasks containing f. -1-Dehydrogunose synthesis using cochcinacetate (0
, 5fit) was added. - A large number of bacterial cells were collected by overnight culture IP transfer and low-speed centrifugation. Bacteria is 5 because it is completely dried.
The dried material was placed in a low vacuum oven at 5°C for 24 hours, then transferred to an airtight container and hydrated by mixing. Menadione was then added as a dry powder to the bacterial suspension to a final concentration of 86/1. Finely ground Androstar-4,9
(tll-diene-3,17-dione was slurried in dimethyl threadlumamide and the steroid
and 2% (v/v) DMF scale was added to the bioconversion mixture. blend? Incubation was carried out for U hours at 31°C with agitation and in the presence of air. After culturing, androsta-1,4,91ll)-)
Diene-3,1 fudione was recovered by conventional means. Example 3 According to the conditions described in the previous working example, the following steroid compounds tl-A and simplex were exposed to dried bacterial cells to obtain the corresponding 1,2-dehydro derivatives. Number Name 1. Androster-4-ene-3,17-dione 2.
6α-fluoro-androsta-4,911+) -diene-3,17-dione 3.6α-methyl-androsta-4,9(IIl-diene-3,17-dione 4.16β-methyl-androsta- 4,91111-
Diene-3,17-dione 5, 176:-Hydroxyzolegne-4-ene-
In-3-one 6, 17d-hydroxypregna-4,91111-
Diene-ka-yn-3-one 7.17α-hydroxy-16β-methyl-pregnathyl
4,9H-diene-head-yn-3-one 8.11β,2
1-dihydroxy-pregna-4,17(i)-dien-3-one9.21-acetoxy-11β-hydroxy-pregna-4,17@J-dien-3-one l016α-methyl-11β,21-dihydroxy -Pregna-4,17
(201-dien-3-one-21-ar-3-
12, hydrocortisone 13.6α-methylhydrocortiscin 14, 21-
Acetoxy-11/,17-cyhydroxy-16β-methyl-pregnath-4-ene-3,2n-24,\15,21-acetoxy-9α-fluoro-1111
,17-cyhydroxy-16β-methyl-pregna-4
-ene-3,20-dione 16, 21-acetoxy-9β, 1]β-epoxy-
17-Hydroxy-16β-methyl-preguor-4-ene-3,20-dio/ 17, 21-acetoxy-17-hydroxy-pregnar 4,9I-diene-31-dione 18, 21-
acetoxy-16α, 17-cyhydroxysisoregner 4.9)-diene-3, nod-dione 19, 21-acetoxy-17-hydroxy-16α-methyl-pregner 4.91111-diene-3, Added dione 20, 21-benzyloxy-17-hydroxy-16
β-methyl-pregna-4,9tlll-diene-3,
20-dione 21, 21-acetoxy-17-hydroxy-16β
-Methyl-solegner 4.9tlll-diene-3,2
n-dione 22, 21-acetoxy-pregna-4,91111
, 160η-triene-3,added-dione,21-acetoxy6α-fluoro-preg? −
4,9(lit, 16-)riey-3,211-
The corresponding products obtained from dione conversion are: No. Product 2a 6 (1-7 with Oro and Roster 1, A
, 91111-triene-3,17-dione 3a 6p-methyl-androster 1.4.911
11-triene-3,17-dione 4a 161/-methyl-androsta-1,4,9
1111-triene-3,17-dione 5a 17α-hydroxy-pregna-1,4-diene-aryn-3-one 6a 17α-hydroxy-pregna-1,4,9 old)
-trien-20-yn-3-one 7a 17α-hydroxy-16β-methyl-pregna-1,4,911n-trien-aryn-3-one 8a 1]β,21-dihydroxy-pregna-1,4
, 17f Trien-3-one 9a 21-acetoxy-1] β-hydroxy-pregna-1,4,171 Trien-3-one and 1]
β,21-dihydroxy-pregna-1,4,17(bottle-trien-3-one 10a 6α-methyl-1]β,21-dihydroxy-pregna-1,4,17+20-trien-3-one 111L 20- Chloropregnar-1, 4, 9+1
1), 171-tetraen-21-al-3-one 12a prednisolone 13a6α-methyl-zolednisolone 14a 21-acetoxy-1]β,17-cyhydroxy-16β-methyl-pregf -1,4-diene-
3,20-dione, and 11β, 17.21-trihydroxy-16β-methylloop 1/gunar 1,4-diene-3,20-dione 15a 21-acetoxy-9α-fluoro-11β
, 17-dihydroxy-16β-methyl-pregna-1
, 4-diene-3,20-dione and 9α-fluoro-
11β, 17.21-) dihydroxy-16β-methyl-soleg f-1,4-diene-3,20-dione 16a 21-acetoxy-9β, 11β-epoxy-17-hydroxy-16β-methyl-pregna-1,
4-Diene-3, addition-dione and 9β,11β-eboxy-17,21-dihydroxy-16β-methyl-pregna-1,4-diene-31-dione 17a 21-acetoxy-17-hydroxydelegna 1 .4.91111-) diene-3,2+)-
dione and 17,21-dihydroxy-pregna-1
,4,9(Ill-)liene-3,2n-dione 18
a 21-acetoxy-+6σ, 17-hydroxypregner 1.4.9 flll-) diene-3,
? fl-dione and 16α, 17.21-trihydroxy-pregna-1,4,9+111-triene-3,2
0-dione 19a 21-acetoxy-17-hydroxy-16
α-Methyl-pregna-1,4,9Ill-)diene-3,20-dione and 17,21-dihydroxy-1
6α-Methyl-pregna-1,4,9111-triene-3,added-dione 20a 21-benzyloxy-17-hydroxy-1
6β-methyl-pregna-1,4,9tl11-triene-3,20-cymene 21a21-acetoxy-17-hydroxy-16β-
Methyl-solegner 1.4.9 (11)-) diene-3,211-dione and 17.21-dihydrox 7
-16β-methyl-pregna-1,4,91111-)
Diene-3,20-dione 22a 21-acetoxy-pregna-1,4,91
111,1fi-tetraene-3,20-dione and 2
1-Hydroxy-pregna-1,4,9+111.16
-tetraene-3,20-dione 23a 21-acetoxy-6α-fluoro-pregna-1,4,911]1,16-tetraene-3,21
1-dione and 6α-fluoro-21-hydroxypregna-1,4,9(11)116-f) Ra! 7
-3,211-Dione Example 4 Two different steroids were bioconverted by A, Simplex cells in the fermentation broth and dried A, Simplex cells. After each biological transformation is determined to have been completed (
The residual substrate level is further reduced. The steroids in the mixture were now extracted, isolated, and convergent data for each condition was obtained. The table below summarizes the results: (a) Definition of useful steroids that can be used in the synthesis of steroids/-
1 compound, or a 1,2-dihydro substrate that can be recycled to another bioconversion to make a product. (b) Significant amounts of other undesirable steroid molecules were also recovered. Example 5 Arthrobacter simplex 1st was grown in a microferrer to induce synthesis of steroid-1-dehydrogenase and harvested by centrifugation. A portion of the recovered bacteria was subjected to two different separation methods. The leaves were dried under reduced pressure according to the procedure described in the wood specifications.
The bacterial cells were dried at 5°C. The second method was the procedure recommended in U.S. Pat. 5°C under reduced pressure
It was dried. The dry bacterial preparation was then used to transform R''11-androstenedione with steroids at 10 f/l and I(l F/t) in shake flasks. A, simplex acetone drying 1 98.7.0
134 95.5. 0112
4 84.1, 007 Heat drying 1 85.1. 1494
23.2. 192 (→ Bioconversion activity was calculated as follows: 00 product t/incubation time/added bacterial cells 1 = activity ←) The residual level did not decrease with further incubation. Example 6 6α-methylhydrococcicine of Example 1 or androsta-4, (Hllll-diene-3,17
- Using the substrates listed below in place of the dione, the corresponding listed products are obtained. Substrate 1.21-acetoxy-9σ-fluoro-111i, 1
fiσ, 17-trihydroxy-pregnar-4-ene-
3,20-dione 2.21-acetoxy-6α,9α-difluoro-=-
11β, 16α, 17-) lyhydroxyderegner 4
-ene-3,20-dione-16,17-7cetonide 3
．． 21-acetoxy-6α-fluoro-11β-hydroxy-16α-methyl-pregna-4-ene-3,20
-dione 4.21-acetoxy-6σ-fluoro-11β,17
-Hydroxy-pregnar 4-ene-3, addition-dione 5.21-acetoxy-6α,9α-difluoro-1]
β,17-cyhydroxy-16α-methyl-pregna-
4-ene-3,'A+-dione 6.21-acetoxy-9α-fluoro-11β,16
α,17-dryhydroxysoregnar-4-ene-3,
2o-dione-16,17-a7tonide 7.21-acetoxy-9β,11β-epoxy-6α-fluoro-1
6α,17-dihydroxy-pregnar-4-ene-3,
2n-dione-16,17-acetonide 8.21-acetoxy-9β, 11β-epoxy-16
α-Hydroxy-pregna-4-ene-3,2I)-dione 9.21-acetoxy-9I, 11β-epoxy-16
α. 17-dihydroxy-pregnar-4-ene-3,20-
Dione-16,17-acetonide product 1.21-acetoxy-9α-fluoro-11#,
16α. 17-) Lyhydroxydelegner 1,4-diene-3
, 20-7one and 9α-fluoro-11β. 16α, 17.21-tetrahydroxy-pregna-1
,4-diene-3,2+)-dione 2,21-acetoxy-6σ,9a-difluoro-1]
β+16α, 17-trihydroxypregner 1.4
-diene-3,mu)-dione-16,17-acetonide and 6α,9α-fluoro-1]β,16α,17
, 21-tetrahydroxypregna-1,4-diene-3,20-dione-16,17-acetonide 3.21
-acetoxy-6α-fluoro-11β-hydroxy-
16α-methyl-pregna-1,4-diene-3,20
-dione and 6α-fluoro-1]β,21-dihydroxy-16α-methyl-pregna-1,4-diene-3
,2n-dione 4.21-acetoxy-6α-fluoro-11β,17-hydroxydelegner 1,4-diene-3I20-dione and 6α-fluoro-11β,1
7.21-trihydroxy-1,4-diene-3,7f
)-dione 5゜21-acetoxy-6α,9α-difluoro-1]
β, 17-cyhydroxy-16α-methyl-solegner 1,4-diene-3,20-dione and 6α. 9α-difluoro-1]β,17.21-)dihydroxy-1,4-diene-3,20-dione 6.21-acetoxy-9α-fluoro-11β,16α,17-dolihydroxy-solegner1. 4-Diene-3,20-dione-16,17-a7tonide 7.21-acetoxy-
9β,1] β-epoxy-6α-fluoro16α,1
7-dihydroxy-pregner 1,4-diene-3,2
0-dione-16,17-a7tonide 8.21-acetoxy-9β,11β-epoxy-16
-Hydroxy-pregner 1,4-diene-3,20. -dione and 9β, 11β-epoxy-16σ, 21-
Dihydroxy-pregna-1,4-diene-3,20-
Dione 9.21-acetoxy-9β, 1]β-epoxy-16
α,17-dihydroxy-pregner 1,4-diene-
3,20-dione-16,17-acetonide Example 7
11β-hydroxy-androst-4-ene-3,1
Bioconversion of 7-dione One ton of dried A simplex cells prepared as described in Example 2 was added to 50% of pH 7.5.
Resuspend in 100-mM phosphate buffer. Menadione dissolved in 3A ethanol was added to a final concentration of 86 ~/l. 1] β-Hydroxy-androstenedione 0. ! M
ffi flask. The mixture was incubated on a rotary shaker at 31°C. Two products were obtained by thin layer chromatography of methylene chloride extracts taken after one day of incubation. Approximately 95 bands of steroids were present as 11β-bitroxy-androsta-114-diene-3,17-dione. The remainder was unconverted substrate. Example 8 According to the conditions of Example 7, the following androstenedione derivatives in which f# at the C-11 position was changed were converted into 1-
Can be dehydrogenated. Substrate → Product + 11 11β-hydroxy-16β-methyl-androst-4-ene-3,17-thion-→l] β-hydroxy-16β-methyl-androst-1,4-diene-3,17- Zeon +21 11β
-Hydroxy-16α-methyl-androst-4-ene-3,17-dione → 11β-hydroxy-16α-methyl-androsta-1,4-diene-3,17-dione (316α-fluoro-11β-hydroxy -androstar-4-en-
3,17-dione→6α-fluoro1]β-hydroxy-androst-1,4-diene-3,17-dione (416α-methyl-11β-hydroyac-androst-4-ene-3
, 17-dione → 6α-methyl-11β-hydroxy-androsta-
1,4-diene-3,17-dione (5111α-hydroxy-androst-4-ene-3,17-dione→1] α-hydroxy-androsta-1,4-diene-3,17-dione ( 6) Androstar-4-en-3,11,17-
trion → androstar 1,4-diene-3.11.17-
) Dione Example 9 1) Combine the following in a reaction vessel (It's). a) 5QmM KPO, mild liquid (p)
I 7.5) 0.9 1b) A, Sinzolex dried bacterial cells 3.66 fC) Menadione o, o
s t d) 21-acetoxy-pregna-4,91111,1
6-) Diene-3,20-dione 8f e) Toluene 100 rnt 2) Stir at 15 ca'i7z min. 3) Blow in air as needed to maintain about 3-6 inches of oxygen in the gas space of the reaction vessel. 4) Maintain the temperature at 1"C. 5) After 5 hours, collect the toluene phase. In this example, the steroids in the toluene phase were: 94.3 yen 21-acetoxy- Pregna-1,4,9ζ
111.16-tetraene-3,20-dione 4.2-21-hydroxydelegup-1,4,911
11,16-tetraene-3,20-dione 1.5% 21-acetoxypregna-4,9111,
The following range of variables can be used for the 16-driene-3,20-dione step. Step 1) a) Buffer pg can range from 6 to io. t)) A. Reduce the amount of simplex to a level sufficient to bring the reaction to completion. Typical levels are 0.05 to 1.02 per gram of steroid. The microbial source of the enzyme is Arthrobacter (Corynebacterium) simplex (ATCC 6946) or Bacterium cyclooxidans (ATCC 12673). Preparation of microorganisms: A. Simplex cells are used in the fermentation liquor as is well known in the art, or the cells are collected, dried and modified by acetone treatment or fixation. C) Select the electron acceptor from the following: Menadione (2-methyl-1,4-naphthoquinone), menadione bisulfite, 1,4-naphthoquinone, and other vitamin-type compounds Electron acceptor levels are determined by cost and reaction rate considerations. The reaction rate is linearly proportional to the menadione concentration. Typical levels are about 5 to about 402 per gram of steroid. d) Steroid concentrations should be as high as possible as long as there is efficient conversion. The steroid belongs to the 3-keto-mono-androstene or 3-keto-g-lugnene series, preferably; It has all the above solubility. e) Aromatic hydrocarbons are selected from toluene, benzene or xylene. These solvents may be used together or diluted with another water-immiscible solvent such as heptane or methane chloride. The amount of aromatic hydrocarbon ranges from approximately half of the amount required to dissolve the most easily soluble starting or product steroid to approximately half the amount required to dissolve the least soluble starting or product steroid. It is up to about 4 times the amount. In this example, toluene was added at a level sufficient to dissolve the steroid at the end of the reaction. Preferably, the aromatic hydrocarbon is added together with the steroid. However, the aromatic hydrocarbons can be added later or earlier.Step 2) Stir with as much stirring force as possible. The reaction rate is a strong function of the stirring force. Step 3) The reaction requires oxygen as the final hydrogen (electron and proton) acceptor. However, due to the presence of aromatic hydrocarbons,
An explosive environment exists in the gas space of the reactor. To overcome this hazard, it is advantageous to maintain the oxygen concentration in the gas space at a concentration well below the minimum amount of oxygen for combustion. In the case of benzene, the minimum amount of oxygen is 11.2%. In the case of xylenes, it is also possible to carry out the reaction at temperatures below the flash point. The flash points of m-xylene, O-xylene and p-xylene are 4, 32 and 39°C, respectively. Step 4) The reaction temperature can be about 0 to about 45°C. Step 5) The reaction is typically run for 2 days. The entire reaction can be carried out from several hours to several weeks. Example 1 (Comparison of Toluene and Aqueous Procedures) Procedure: Combine the following: A, Simplex bacterial cells 0.42 50mM KPOa buffer (pH 7.5) 50v 2 hours or until a homogeneous slurry is obtained, mix in a can. 5- Take two fractions, 125- Place in flasks, Add the following to each flask. 5mM menadione in 3A alcohol 0.25+dandrosta-4,1on-diene-3,17-dione
0.21 Add toluene 2- to one of the sealed flasks. Stir for 4 days using a wrist motion shaking rack. After 48 hours, extract with 5 ml of toluene Z. Analyze the extract. (B) Results Procedure Product Example 11 According to the conditions described in Example 9, the following steroid compound was added to the dried cells of A. Simplex to obtain the corresponding 1,2-dehydro derivative. Number Name 1, Androsta-4-Engineering 7-3.17-dione 2.
6α-fluoro-androsta-4,9111)-diene-3,17-dione 3.6α-methyl-androsta-4,9(Ill-diene-3,17-dione 4.16β-methyl-androsta- 4,9tt11-
Diene-3,17-dione 5.17α-Hydroxydelegné 4-en-yn-3-one 6.17α-Hydroxyzolegn-4,9+111-diene-yn-3-one 7.17α- Hydroxy-16β-methyl-deregner 4.9(Ill-dien-21)-yn-3-one8.
21-acetoxy-Ill-hydroxy-pregna-4
, 17α-dien-3one 9,93)-chloro-pregna-4,9tlll,
17f-triene-21-al-3-one 10, 21-acetoxy-17-hydroxy-pregner 4,91111-diene-3, shun-dione 11,
21-acetoxy-17-hydroxy-16σ-methyl-pregna-4,91111-diene-3,20-dione 12, 21-benzoyloxy-17-hydroxy-1
6β-methyl-pregna-4,91111-diene-3
,20-dione 13, 21-acetoxy-17-hydroxy-16β
-Methylderegner 4.9flll-diene-3,2
0-dione 11L 21-acetogycy! Regnar-4,9fl
l+16 1” diene-3,20-dione 15, 21-acetoxy-6α-fluoro-pregna-4,9 (IL 1fil171 − ) riey −
The corresponding products obtained from the 3,'7)-dione conversion are: No. Product 1a Androsta-1,4-diene-3,17-dione 2a6a-Fluoro-androsta-1,4,9+l
1l-triene-3,17-dione 3a F+cl-methyl-androsta-1,4,9
till -triene-3,17-dione 4a 16β-methyl-androsta-1,4,911
11-triene-3,17-dione 5a 17α-hydroxypregna-1,4-diene-
λ)-yn-3-one 6a 17α-hydroxypregna-1,A,9 old)-
Trien-aryn-3-one 7a 17α-hydroxy-16β-methyl-pregna-1,4,9ull -) Triene-valent-yn-3-one 8a 21-acetoxy-11β-hydroxy-pregna-1,4,17F2f )-trien-3-one and l
]β,21-dihydroxy-pregna-1,4,17(
b)-trien-3-one 9a 20-chloro-pregna-1,4,91111
, 17m -tetraen-21-al-3-one 10a 21-acetoxy-17-hydroxy-pregnare 1.4.91111- ) liene-3,2n-dione and 17.21-dihydroxy-pregnare-1,4
,9011-triene-3,20-dione 11a 21-acetoxy-17-hydroxy-16
α-Methyl-pregna-1,4,91111-)liene-3,20-dione and 17,21-dihydroxy-]
6α-Methyloop Yoigunar 1.4.9 old;-triene-
3,20-dione 12a 21-benzoyloxy-17-hydroxy-
16β-methyl-pregna-1,4,9till-)
Diene-3, addition-dione 13a 21-acetoxy-17-hydroxy-16
β-Methyl-pregnar-1.4,91111-) liene-3.2T3-dione and 17.21-dihydroxy-16β-methyl-pregn-1,4,91111-triene-3,20-dione 14a 21-acetoxy- Pregna-1, 4, 91
E. , 16-chitraene-3.
2n-dione and 6α-fluoro-21-hydroxy-
Pregna-1,4,9+111.16-tetraene-3
, 20-dione 1,2-dehydrosteroids are well known. See, eg, US Pat. No. 3.2F14.447. This patent describes Δ1. a, e(xi) clearly emphasizes the usefulness of pregnetodienes. Congregation and the usefulness of 1,2-dehydroandrostenes,
It has been shown to be an important intermediate in the production of medically useful steroids. ■436552 @ March 15, 1983 Φ United States (US) ■475437 0 Inventor Timothy Wendell Evans 16710 Three Rivers West Michigan, Michigan, United States of America

Claims

[Claims] 1.2-IJ and 3-keto, which consists of exposing 1.2-saturated steroids to air-dried or heat-dried microorganisms having 1.1-dehydrogenating action. 1 steroid
, 2-dehydrosteroids. 2. The air-dried or heat-dried microbial cells have a water content of about 1 to about 10%, Claim 1
Method by term. 3.1-The microorganism with dehydrogenation effect is Arthrobacter.
simplex (Arthrobacterθimpl
ex) or Bacterium cyclooxygen 4E (
4. In the presence of an exogenous electron carrier, air-dried or heat-dried bacterial cells of a microorganism having 1-dehydrogenation action are subjected to 1. 2- Consists of exposing saturated steroids. A method for converting 1,2-saturated steroids to ak 1,2-dehydrosteroids. 5. Claims in which the exogenous electron carrier is menadione, phenazine methosulfate, dichlorophenolindophenol, 1,4-naphthoquinone, menadione bisulfite, ubiquinone @ (coenzyme Q) or vitamin-type compounds Method according to Section 4. 6. The method according to claim 4, wherein the air-dried or heat-dried microbial cells have a water content of about 1 to about 10%. 7. The method according to claim 4, wherein the microorganism having a 1-dehydration effect is Arthrobacter simplex or Bacterium cyclooxidans. 8. Water-immiscible solvents consisting of aromatic hydrocarbons and exogenous IT (in the presence of child carriers, Arthrobacter.
An improved method for converting 1,2-saturated steroids to 1,2-dehydrosteroids, consisting of exposing the 112 P, t<sum steroid to B. simplex or Bacterium cyclooxidans. 9. The method according to claim 8, wherein the electron carrier is menadione, 1,4-naphthoquinone, menadione bisulfite or other vitamin-type compounds, and the aromatic hydrocarbon is toluene or xylene. . 10. Approximately half of the amount of water-immiscible solvent consisting of an aromatic hydrocarbon required to dissolve the most readily soluble steroid substrate or product steroid, or approximately half of the amount required to dissolve the most easily soluble steroid substrate or product steroid; 9. A method according to claim 8, in which about four times the amount required to dissolve the substance is present. 1) A 1,2-saturated steroid is exposed to Arthrobacter simplex or Bacterium cyclooxidans in the presence of a water-immiscible solvent consisting of an aromatic hydrocarbon and an exogenous electron carrier, in which case combustion occurs. 1,2-saturated steroids, which consists of adding oxygen to keep the oxygen concentration below the minimum amount of oxygen required.
Improved method for converting to dehydrosteroids. 12. The electron carrier is menadione, 1,4-naphthoquinone, menadione bisulfite or other vitamin-type compounds, and the aromatic hydrocarbon is benzene, toluene or xylene, according to claim 1O. Method. 13. Expose the 1.2-saturated steroid to Arthrobacter simplex or Bacterium cyclooxidans in the presence of a water-immiscible solvent consisting of an aromatic hydrocarbon and an exogenous electron carrier, in which case the organic solvent Consisting of carrying out the reaction at a temperature below the flash point, 1.
2-Saturated steroid f: Improved method for conversion to 1,2-dehydrosteroid. 14. The 1E child carrier is menadione, phenazine methosulfate, 1,4-naphthoquinone, menadione bisulfite, or other vitamin-type compounds;
Claim 1, wherein the aromatic hydrocarbon is xylene.
Method according to Section 3. 15. A method according to claim @8.11 or 13, in which a water-immiscible solvent is diluted with another water-immiscible solvent.