JPS5936961B2 - 選択特異的細胞吸着剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、水不溶性固体物質の表面にカルボキシル基を
有することを特徴とする吸着剤および、この分離剤を用
いて、白血球亜分画を分離する方法に関するもので、さ
らに詳しくは、水不溶性固体物質の表面にｌｍｌ容積あ
たり１００Ｉｔｅｑ以下のカルボキシル基を有する吸着
剤を使用して、選択特異的Ｉζ白血球群中のＴリンパ球
、顆粒球、単球を吸着させ、Ｂリンパ球のみを吸着させ
ないで回収する方法に関するものである。

ここで、Ｔリンパ球（胸腺由来リンパ球）は、ノイラミ
ニダーゼ処理したヒツジ赤血球と口ゼットを形成する細
胞とし、Ｂリンパ球（骨髄由来リンパ球）は、細胞表面
に、補体レセプター、抗体のＦｃ部分に対するレセプタ
ー、免疫グロブリンを有する細胞とし、単球、顆粒球群
は、ペルオキシダーゼ染色に陽性となる細胞として、そ
れぞれ定義する。

従来、白血球中の顆粒、単球群とリンパ球群とを分離す
る方法としては、両群間の密度、大きさ、形態の違い、
顆粒、単球群の貧食能、粘着能の性状を利用する方法、
および、これらを組み合わせて分離する方法が知られて
いる。

しかしながら、密度、大きさ、形態、粘着能の違いは、
互いの群に重なる分画があるために定量性に乏しく、貧
食能の違いによる分離は、細胞障害が避けられない。

一方、リンパ球群の亜分画であるＴリンパ球とＢリンパ
球とを分離する方法としては、大きく分けて２種類の分
離方法が知られている。

すなわち、１つは、Ｔ、Ｂリンパ球の物理化学的性状の
違いを利用して分離する方法で、粘着能、表面荷電、大
きさ、密度、免疫抑制剤やステロイドホルモンやＸ線に
対する感受性の違いを利用するものである。もう１つは
、Ｔ、Ｂリンパ球の生物学的（免疫細胞学的）違いを利
用して分離する方法、すなわち、Ｔ、Ｂリンパ球細胞膜
表面にあるそれぞれに特異的な抗原、レセプターおよび
免疫グロブリンの存在を指標にして、それらに対する特
異抗体または、特異抗血清を利用して分離する方法で、
具体的には、口ゼット形成反応法と遠心分離法との組み
合せ、膜免疫螢光抗体法とレーザー光線を使用する分離
器との組み合せ、特異抗血清と補体を使つての細胞障害
性の利用、抗血清を担体に固定化した免疫特異的吸着剤
の利用などがある。しかしながら、Ｔ，Ｂリンパ球の物
理化学的性状の違いは、わずかであるために、定量的に
分離することは、困難である。一方、生物学的（免疫細
胞学的）違いを利用する方法は、試料の作製および操作
手順が繁雑であり、かつ、一般に、試料および分離機器
が高価になる。さらに、試料が生物体のために、一定の
活性を持つものの作製、および、活性の維持が困難であ
り、やはり定量性に難点が生じる。以上述べたことから
明らかな様に、白血球群から、ＴまたはＢリンパ球を、
一段階で分離することは、一層困難である。

特に、単球とＢリンパ球とは、その物理化学的、生物学
的性状が似ている点が多く、分離は難しいとされている
。本発明者らは、白血球浮遊液を用いて、リンパ球群中
のＴリンパ球とＢリンパ球とを細胞膜および細胞機能を
損なうことなく分離することを目的にして、選択特異的
な細胞吸着剤について鋭意研究を重ねた結果、リンパ球
群に優る単球、顆粒球群の粘着性を利用して、リンパ球
群が吸着しにくい条件下で実施することにより、表面に
１ｍ１容積あたり１００μＥｑ以下のカルボキシル基を
有する水不溶性固体物質が、おどろくべきことに、単球
、顆粒球群のみならず、Ｔリンパ球をも効率よく吸着す
ることを見出し、本発明を完成するに至つた。

すなわち、水不溶性固体物質の表面に存在するカルボキ
シル基を持つ分子（カルボキシル基とそれに続くいくつ
かの分子部分とを合わせた構造）が、実施条件下で、Ｂ
リンパ膜上には存在しないで、Ｔリンパ球膜上だけに存
在するレセプタ一部分と親和力を持つことにより、Ｔリ
ンパ球のみが吸着するようになると考える。

しカルながら、リンパ球に対するカルボキシル基濃度が
１７ｎ１容積当たり１００μＥｑより多くなるとリンパ
球表面膜上の陰電荷との反発力の方が優り、Ｔリンパも
吸着されにくくなる傾向がある。従つて、１ｍ１容積当
たり１００μＥｑ以下のカルボキシル基を表面に有する
水不溶性固体物質を充填した、液の出入口を有するカラ
ムを作製し、血液から分離した白血球浮遊液をこのカラ
ムに注入し、所定の時間と温度で静置した後、洗滌液に
より洗い出す操作を行なえば、選択的にＢリンパ球浮遊
液を得ることができる。

本発明において、表面にカルボキシル基を有する水不溶
性固体物質とは、粒状、膜状、繊維状の水不溶性固体物
質の表面にカルボキシル基が存在しているものとして定
義される。

具体的には、カルボキシル基を持つ分子を、少なくとも
１個以上のカルボキシル基が残存するように、水不溶性
固体物質に固定化したもので、水不溶性固体物質として
は、アガロース誘導体、デキストラン誘導体、セルロー
ス誘導体、ポリアクリルアミド誘導体、ポリアミド誘導
体、ガラス質物質などがあり、固定化法としては、ブロ
ムシアン法、カルボジイミド法、エステル化法などによ
る共有給合法、または、イオン結合法、包理法、もしく
は、物理吸着法などがある。

また、アクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸、マレイ
ン酸、フマル酸、ブタジエン−１−カルボン酸、カルボ
キシル化スチレン、イミノジ酢酸型スチレンなどのモノ
マーを使つての共重合体、さらに、アクリル酸、メタク
リル酸のクロリドまたはエステル化合物とカルボキシル
基をもつ分子とより合成したカルボン酸ビニルモノマー
を使つての共重合体、多糖類誘導体（アガロース誘導体
、デキストラン誘導体、セルロース誘導体）などの親水
性高分子化合物を用いた場合が、比較的選択特異性の高
い結果が得られる。本発明におけるカルボキシル基の濃
度としては、１ｍ１の水不溶性固体物質当たり、１００
μＥｑ以下の範囲が、極めて望ましくは５０μＥｑ以下
の範囲が性能を発揮するのに適しており、１００μＥｑ
より多い吸着剤は、Ｔリンパ球が吸着しないで、洗浄液
中に回収されてくる割合が増加する傾向にある。

白血球分離器は、白血球浮遊液並びに洗浄液を注入する
入口１と、浮遊液並びに洗浄液を流出させる出口５とを
持つた容器に、出口の所に充填剤が流出しないで、細胞
のみが流れ出る程度の孔径を持つたフイルタ一３と、液
の流出を止めることができるストツパ一４とを取り付け
たカラムに、前記で記した１ｍ１の水不溶性固体物質当
たり１００μＥｑ以下のカルボキシル基を表面に有する
吸着剤を充填することにより作製する。

（図面参照）白血球分離器を用いてのＴリンパ球、顆粒
球、単球群の吸着とＢリンパ球の回収方法は、血液から
比重遠沈法などの方法により分離した赤血球の少ない白
血球群を浮遊させた液を、分取器に注入し、浮遊液が浸
透し終つた時点で、流出を止めて、一定温度の下、一定
時間静置し、その後、洗浄液を流して、未吸着細胞を洗
い流すことにより行う。白血球群を浮遊させる液、およ
び、未吸着細胞を洗い流す液としては、タンパク含有液
、望ましくは、自己血清、または、γグロブリンの少な
い動物血清例えば牛脂児血清、もしくは、これらの血清
を含む培養液または緩衝液が用いられる。また、白血球
を障害しないために、液のＰＨは、６〜８で、浸透圧は
、白血球と等張であることが望ましい。吸着および洗い
流す操作の際の温度は、室温（２０℃〜２５℃）からＯ
℃までの範囲、望ましくは、４℃からＯ℃までの範囲が
適している。

吸着時間は、吸着しないで流れ出てくるＴリンパ球の割
合を少なくするために、１時間以上静置することが望ま
しい。このようにして得られたＢリンパ球およびカラム
内より取り出した充填剤の洗浄により回収したＴリンパ
球について、それぞれ、幼若化能、抗体産生能、抗体産
生調節作用などの免疫学的機能検査を行なつた結果、分
離器に注入する前の白血球群中のリンパ球の機能と変わ
らない程度に機能を保持していた。

以上、詳細に述べてきた、水不溶性固体物質の表面に１
ｄ容積あたり１００ｔｔｅｑ以下のカルボキシル基を有
する吸着剤をカラムに充填した分離器を用いることによ
つて、白血球群から、Ｂリンパ球のみを回収することが
でき、従来の白血球群分離法に比べて下記の効果を持つ
。

（１）白血球群から、Ｂリンパ球を分離するまでの操作
が一段階で済む。

すなわち、白血球浮遊液を分離器に注入し、一定条件の
もとで静置後、洗浄液を流すだけの操作で済む。（２）
分離する際に、白血球の酵素処理などする必要がなく、
また、分離後も元の性状と異なることもないので、機能
変化、低下が起こらない。

（３）分離器の作製が、従来のＢリンパ球分離用試料お
よび分離機器の作製に比べて、容易でしかも安価である
。（４）充填剤は、有機合成物質であるので、一定の活
性を持つ吸着剤の作製および活性の維持が容易にでき、
また、滅菌操作も簡単にできる。

次に、実施例によつて本発明をさらに詳細に説明する。
実施例 １ カルボキシル基を有する水不溶性固体物質の作１；ＣＮ
Ｂｒにより活性化した粒度分布として、１００〜３００
μｍのアガロースゲル４０ｍ１を、０．１ＭＮａＨＣ０
３１１で洗浄し、これに、６−アミノヘキサン酸（ＮＨ
２（ＣＨ２）５Ｃ００Ｈ）４０ｍｍ０１を溶かした０．
１ＭＮａＨＣ０３１００ｄ（５ＮＮａ０ＨでＰＨ＝１０
に調節した溶液）を加えた。

これを、２５００Ｃで２０Ｈｒ振とうし、次いで、済過
後、得られた反応物を１ＭＮａＣ１５０ｍ１中に懸濁し
、２５℃で３０ｍ！振とう後、再び済過し、１ＭＮａＣ
１２００ｍ１および水２００ｍ１で交互に４〜５回洗浄
した。以上の方法によつて、固定化量１０μＥｑ／ｍｌ
のω一カルボキシペンチルアミンーアガロースを得るこ
とができた。このものを、０．０２（：ｆｌ）ナトリウ
ムアザイドを含む水中に懸濁して、８℃以下で保存して
おく。分離器の作製；作製したω一カルボキシペンチル
アミンーアガロース２７ｎ１を隣酸緩衝液、次いで牛脂
児血清で充分洗浄後、このゲルを底面に８０μＭｍｅｓ
ｈのナイロンネツトのフイルタ一を引いた液入口と出口
とを持つた内径１０１１のプラスチツク製カラム（図面
参照）に、気泡が入らないように注意しながら充填する
ことにより作製した。Ｊ？Ｉム区丘別幻？且；ヒト末梢
血液からソデイウムメトリゾエイトーフイコール混液（
ｄ二１．０７７，２００Ｃ）を使つて、比重遠沈法によ
り分離し隣酸緩衝液で洗浄した白血球分画を４×１０６
／ｍｌの濃度に、牛脂児血清に浮遊させた液０．５Ｔｆ
１１を、作製した分離器の入口より、静かに流し込み、
液が充分に充填剤に浸透し終つた時点で、ストツパ一で
流出を止めた。その後、４℃で２Ｈｒ静置後、ストツパ
一を開けて、冷（０〜４℃）牛脂児血清４ｍ１を、カラ
ム入口から徐々に流し込み、自然落下の流速で、ゲルに
吸着していない白血球を洗い出して回収した。分析結果
；自動血球計数器、または、血球計算盤を使つての顕微
鏡観察により求めた、全白血球回収率は、４５．２（ｆ
ｌ）であつた。

また、Ｔり７ペ球、Ｂリンパ球、顆粒、単球群を、それ
ぞれ、ノイラミニダーゼ処理羊赤血球、羊赤血球−１ｇ
Ｍ−ヒ卜補体複合体または表面免疫グロブリンに対する
螢光抗体法、ペルオキシダーゼ染色により分析した結果
、最初に入れた白血球群は、Ｔ＝５５．５％、Ｂ＝３７
．０％、顆粒、単球群＝７．５％であつたのに対して、
回収された白血球群は、Ｔ＝１６．３％、Ｂ二８１．６
％、顆粒、単球群＝０．９％であつた。従つて、Ｂリン
パ球の回収率は、９９．７０Ｉ）である。比較実施例実
施例１と同じ組成の白血球群を使つて、１００〜３００
μｍのアガロースゲルそのものを吸着剤として用いた場
合の分析結果は、全白血球回収率は、６５．１％で、回
収液中組成は、Ｔ＝５８．３％、Ｂ＝４０．０％、顆粒
、単球群＝０．３％であつた。

従つて、Ｂリンパ球の回収率は、７０．４％である。実
施例１と比較実施例とを比べて、本発明でいうところの
選択特異的吸着剤とは、回収液中のＢリンパ球組成（純
度）が７０％以上で、Ｂリンパ球回収率が８５〜１００
％になる性能を持つたものであることが明らかである。
実施例 ２，３，４，５，６，７ 実施例１と同様な方法により、種々の長さを持つたω一
カルボキシルアルキルアミン（ＮＨ２（ＣＨ２）ＮＣＯ
ＯＨ；ｎ＝２，４，６，８，１０）並びにＰ−カルボキ
シルアラニン（ＮＨ２ｌ（）←ＣＯＯＨ）それぞれと、
アガロースゲルとを反応させて作製した吸着剤を用いて
実験した結果を、表１にまとめて示す。

実施例 ８ 実施例１と同様の操作で得られた回収液４ｍ１を、２４
０Ｘ９で１５ｍｍ遠心し、上清３．５ｍ１を除去後、沈
渣した白血球のペレツトを、残り０．５ｍ１に充分に浮
遊させたものを、再び、実施例１で記したのと同じ方法
により作製した分離器に流し込み、実施例１と同様の吸
着、回収操作を行なつた。

得られた回収液を、分析した結果は、全白血球回収率は
、３３．２！）で、回収液中組成は、Ｔ＝８．８％、Ｂ
＝９１．５（！）、顆粒、単球群＝ｏ％であつた。ただ
し、最初に入れた白血球群は、Ｔ−５５．４（Ｆｔ）、
Ｂ＝３１．４％、顆粒、単球群二１３．９％であつた。
従つて、Ｂリンパ球回収率は、９６．８％である。実施
例 ９カルボキシル基を有する水不溶性固体物質の作１
；ＣＮＢｒにより活性化した粒度分布として、１００〜
３００μｍのデキストランゲルと、β−アラニン（ＮＨ
２（ＣＨ２）２Ｃ００Ｈ）とを、実施例１に従つて反応
させ、固定化量１４μＥｑ／ｍｌの２−カルボキシエチ
ルアミン−デキストランを得た。

このものを、０．０２％ナトリウムアザイドを含む水中
に懸濁して、８℃以下で保存しておく。分離器の作製、
吸着および回収操作、分析方法は、実施例１と同様に行
なつた。その結果、並びに、比較例として、タウリンぞ
れと、デキストランデルとを反応させて作製した吸着剤
、および、デキストランゲルそのものを用いて、実験し
た結果を、表に示す。

実施例１０，１１，１２および比較例 カルボキシル基を有する水不溶性固体物質の作製：充分
に脱脂した１．３８デニールのセルロースＭＭ（工シフ
ト鋺）１０ｇχ 倫★コハカ酪（ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ
Ｏ）４０９と無水酢酸ナトリウム１０９とを溶かした水
酢酸溶液３００ｍ１に、均一に懸濁させた。

これを、１００℃で４８Ｈｒ振とうし、次いで、沢過後
、得られた反応物を、水、希塩酸水溶液、水、アルコー
ルの順序で充分に洗浄し、室温、真空下で充分に乾燥し
た。以上の方法によつて、固定化量３．０ｍｅｑ／ｇの
半エステル化物であるサクシニル化セルロース繊維を得
ることができた（比較例）。反応物の量関係を変えるこ
とにより、固定化量が、２．０（比較例）、１．０（実
施例１０）、０．５（実施例１１）、０．０５（実施例
１２）Ｍｅｑ／９のサクシニル化セルロースも合成した
。分離器の作製；上記の方法で得られた繊維のいずれが
１種類０．１ｆ！を取り出し、充分にほぐしてから、底
面に８０μＭｍｅｓｈのナイロンネツトのフイルタ一を
引いた液入口と出口とを持つた内径１０１１のプラスチ
ツク製カラム（図面参照）に、１ｍ１の容積になるよう
に軽く充填することにより作製した。

吸着および回収操作；作製した分離器の入口から、隣酸
緩衝液、次いで、牛脂児血清を、除々に滴下して、充分
に、繊維を濡らした。

あらかじめ、ヒト末梢血液からソデイウムメトリゾエイ
トーフイコール混液（ｄ＝１．０７７、２０℃）を使つ
て、比重遠沈法により分離し、隣酸緩衝液で洗浄した白
血球分画を６Ｘ１０６／ｄの濃度に、牛脂児血清に浮遊
させておいた液０．５ｍ！，を、この分離器の入口より
、静かに流し込み、液が充分に繊維に浸透し終つた時点
で、ストツパ一で流出を止めた。その後、４℃で２Ｈｒ
静置後、ストツパ一を流速が０．６ｍ１／Ｍｉｎになる
様に、部分的に開けて、冷（０〜４℃）牛脂児血清４ｍ
１を、カラム入口から徐々に流し込み、ゲルに吸着して
いない白血球を洗い出して回収した。分析結果；分析方
法は、実施例１と同様の方法により行なつた。

５種類の固定化量の違うサクシニル化セルロース繊維の
結果を、まとめて表に示す。

この表から明らかなように、カルボキシル基濃度が、１
００Ｉｔｅｑ／ｄ以下の吸着剤に比較して、２００およ
び３００μＥｑ／ｍｌの吸着剤を使つた場合、Ｔリンパ
球が、回収されてくる割合が増加して特異性能がなくな
る傾向である。実施例 １３ヒト末梢血液に、ペンタカ
ルボニル鉄粉末（製造元；半井化学薬品（株））を５％
およびアラビアゴムを５（！）含む隣酸緩衝液を１／１
０量をえ、３７℃で１Ｈｒの間、途中３〜４回完全にカ
クハンしながら加温した。

しの血液から、ソデイウムメトリゾエイトーフイコル混
液（ｄ＝１．０７７、２０℃）を使つて、比重遠沈法に
より分離し、隣酸緩衝液で洗浄して得た白血球分画を８
Ｘ１０６，Ｚ１の濃度に、牛脂児血清に浮遊させた。こ
の液０．５ｄを使つて、実施例１０と同じ分離器で、同
様の吸着およブ回収操作を実施レ）実施例１と同様の方
法により行ｒ？分析の結果は、全白血球回収率は、３５
．２％であり、最初に入れた白血球群は、Ｔ＝７２．５
％、Ｂ：：２８．０％、顆粒・単球］群＝０．８％であ
つたのに対して、回収された白血球群は、Ｔ？５．０％
、Ｂ−７２．８％、顆粒、単球群＝０％であつた。従つ
て、Ｂリンパ球の回収率は、９１．５％である。また、
繊維に付着した白血球を採取するために、回収操作後の
繊維を取り出し、シヤーレの容器に満たした隣酸緩衝液
の中で、ピンセツトで軽くほぐし、繊維をすすいで白血
球を洗い出し、繊維を除いた隣酸緩衝液を、２５０Ｘ９
で１５ｍ７７！遠心し、白血球を集めた。この付着白血
球の分析結果は、回収率は、３５．６％であり、回収液
中組成は、Ｔ＝９０．２％、Ｂ＝６．５％、顆粒、単球
群＝Ｏ％であつた。実施例 １４ カルボキシル基を有する水不溶性固体物質の作上；γ−
アミノプロピルトリエトキシシランでアルキルアミノ化
した１００〜２００μｍのガラスビーズ１０ｍ１（最密
充填容量）を３０ｍ１００．１Ｍ食塩水溶液中に懸濁し
たものに、無水コハク酸４９を除々に加えながらかくは
んし、２０％ＮａＯＨを用いてＰＨ＝６〜７に保つた。

ＰＨ変化が認められなくなつたのち、４℃に５時間放置
した。このようにして得られた固定化量３０μＭＯｅ／
ｍｌ（最密充填）のスクシニル化ガラスビーズ（ガラス
ビーズ一（ＣＨ２）３ＮＨＣ０（ＣＨ２）２Ｃ００Ｈ）
は、水、エタノール、水の順序で充分に洗浄した後、乾
燥させた。１ｍ１（最密充填容量）のスクシニル化ガラ
スビーズを使つて、実施例１と同様の実験を行なつた結
果は、全白血球回収率は、２８．５０！）で、回収液中
組成は、Ｔ＝２５．０％、Ｂ二７２．８％、顆粒、単球
群＝Ｏ％であつた。

ただし、最初に入れた白血球群は、Ｔ＝６４．５％、Ｂ
＝２８．０（！）、顆粒、単球群＝７．８％であつた。
従つて、Ｂリンパ球回収率は、７４．１％である。実施
例 １５ 分離器の作製；スクシニルヒドラジド化ポリアクリルア
ミドゲル（ポリアクリルアミド一ＣＯＮＨＮＨＣＯ（Ｃ
Ｈ２）２Ｃ００Ｈ１カルボキシル基濃度＝１８μＥｑ／
ｍｌゲル、製造元：和光純薬工業（株）、商標名：Ｅｎ
ｚａｆｉｘＰ−ＳＨ）を、隣酸緩衝液で充分に膨潤させ
たもの（ｇ当たり８０ｍ１に膨潤）１ｍ１を、牛脂児血
清で充分洗浄後、底面に８０μ軸Ｅｓｈのナイロンネツ
トのフイルタ一を引いた液入口と出口とを持つた内径１
０ｍ７７！のプラスチツク製カラム（図面参照）に、気
泡が入らないように注意しながら充填することにより作
製した。

吸着および回収操作；作製した分離器を用いて、実施例
１と同様の吸着、回収操作を、ヒト末梢血液から分離し
洗浄した白血球分画を使つて実施した。

分析結果；分析方法は、実施例１と同様の方法により行
なつた。

その結果は、全白血球回収率は、４５．７％であり、最
初に入れた白血球群は、Ｔ５ｌ．Ｏ％、Ｂ＝３８．２％
、顆粒、単球群＝１９．６％であつたのに対して、回収
された白血球群は、Ｔ＝２２．４％、Ｂ＝７７．３％、
顆粒、単球群＝２．８％であつた。従つて、Ｂリンパ球
の回収率は、９２．５％である。

【図面の簡単な説明】

図１は、白血球分離器の断面図を示すものである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 水不溶性固体物質の表面に１ｍｌ容積あたり、１０
   ０μｅｑ以下のカルボキシル基を有することを特徴とす
   る、白血球浮遊液中の、Ｂリンパ球を吸着しないで、Ｔ
   リンパ球、顆粒球、単球を吸着する吸着剤。 ２ 水不溶性固体物質の表面にカルボキシル基を有する
   ことを特徴とする吸着剤を用いて、白血球群を、Ｔリン
   パ球、顆粒球、単球群と、Ｂリンパ球とに分離する方法
   。