JPS5926112A - 急速濾過装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、濾過操作が最小の時間で実施されるのを可能
にする濾過装置に関する。この急速濾過装置は、生物学
的な分野、特に、生物化学および生物エネルギ論に広く
使用される２つの型式の研究、即ち酵素の機構と、細胞
膜を通るイオン流量の測定との研究に特に適用可能であ
る。

イオン流量を制御する酵素の反応および機構の詳細な研
究は、調査される過程の遷移事象を解明するのを可能に
する特別な描造の改良された装置を必要とする。通常、
酵素による触媒の反応は、非’ｒｒｔに早い速度で生じ
、は”：ｆｉ＆ミリ秒の時間分解能を可能にする方法を
必要とする。従来、酵素反応の機構に関する進歩は、一
般に、使用される方法の改良、特に、得られる時間分解
能の改良を伴った。

従つ°Ｃ１酵素サイクルの持続時間が一般に１秒よりも
遥かに短いことは、公知である。通常、１つのサイクル
中で比較的多数の中間状態を同定することは、可能であ
る。急速混合ないし多重混合の方法は、これ等の遷移状
態を調査することに鑑み過去において開発された。実際
上、これ初−の方法は、比軟的＊’ｉｒｊ単であり、酵
素′ｆｆ、（ま、分子ないし基質Ｓに非常に急速に（数
ミリ秒）混合され、次に、反応は、その過程をたどり、
生成物Ｐの解放の際に完了する。即ち、 Ｅ”Ｓ　’Ｑ安定化する反応物質Ｑとの第２急速混合（
最初の混合後、数ミＩＪ秒から数秒）を実施することで
行われる。次に、Ｅ＋Ｓは、通常の屡々遅い化物化学的
方法で分析される。酵素は、その改質物を生じる以前に
化合を要する分子ないし基質に非常に急速に混合される
。この目的は、反応（１）を調査することである。

酵素は、調査すべき分子（ないし基質Ｓ）との接触にも
たらされる。第２段階では、酵素と分子ないし基質とは
、化合した後、酵素による分子の改質が生じる。該反応
は、反応物質Ｑの扶助によりこの段階で阻止される。従
って、上述の急速混合の様な通常の生物化学的方法によ
り、阻止されたＥ＋Ｓを分析することは、可能である。

適当な反応物質があれば、総ての段階（”ｓ　’ｉＥ”
Ｐ、−Ｅ＋Ｐ）で反応を阻止することは、可能である。

他の方法は、時間の関数として反応（１）の進行をたど
るのを可能にする化学的な類似体（同様な化学的特性を
有するが、視覚的に追縦可能の特別な物理特性、例えば
、螢光発光および吸収率を有する分子）で天然基質Ｓに
置換えることから成る。急速混合方法および光学的方法
の時間分解能は、約１０ミリ秒である。

イオン流量測定（分子に入って出る分子、イオン等の流
量の測定）は、ｄｄ過方法、例えば、ミリポアフィルタ
を使用することで、過去において殆んど排他的に実施さ
れた。要約すると、これ等の測定の原理は、次の通りで
ある。膜状小胞ないし細胞の懸濁液は、細胞内に移行さ
れるイオン流量を０１２査するのが所望の基質ないし分
子を含有する媒体で希釈される。通常、基質は、放射性
アイソトープで置換して識別される。種々な長さの保持
時間の後、懸濁液は、濾過される。膜ないし細胞は、フ
ィルタで支持され、移行は、シンチレーション計数器の
扶助でフィルタの反応率を測定することで評価される。

この方法は、比較的遅い（最短で２秒）が、現在利用可
能な唯一の方法である。

従って、該方法は、流量測定が分子薬理学と同様に、細
胞の生理学およびエネルギ論での研究に非常に重要なた
め、広く使用される。

本発明の装置は、非常に急速な濾過を可能にし、これは
、生’ＩｔＪ学的液体内の反応、１１’ケに、生物化学
および生物エネルギ論における反応の異なる段階をたど
るのを可能にする０ この目的のため、本発明は、 −その底が多孔質ペレットで密封され、その上部が適当
な機械的装置によりその中を並進して変位可能なピスト
ンで密封され、濾過ずべき液相を収容するタンクを有す
る注入装置と、−実際の濾過材料のサポートとして作用
する多孔質ペレットでその上部を密封され、その中に真
空を生じるのを可能にするボンフ０装置にその基部で結
合されるチャンバを有するフィルタ支持装置と、 一前記注入装置と、該フィルタ支持装置との急速で一時
的な接触を保証する装置と、 −該接触用装置と、ピストンの機械的な並進装置とに同
時に作用した後、注入の中止と、該注入装置と該フィル
タ支持装置との分離とを所望の際にもたらすことにより
、各濾過操作を制御する電子式制御組立体と を備える濾過装置を提供する。

本発明の第１実施例によると、多孔質ペレットは、フリ
ットガラスのものである。

本発明の第２実施例によると、並進してピストンを変位
する機械的装置は、ステッピングモータで構成される。

最後に、本発明の最後の実施例によると、注入装置と、
フィルタ支持装置との急速で一時的な接触用装置は、電
子式制御組立体で電気的に付勢されフィルタサポートを
注入装置に向いまたは離れる様に移動することでフィル
タ支持装置の垂直方向の並進を発生可能なレバーを作動
するソレノイドを備えている。

本発明は、その実施例に関し添付図面を参ｊ（αして下
記に詳細に説明される。

第１図は、底を多孔質ペレット５で密封され締付けねじ
３でサポートに維持される円筒形夕７ンク４を０ｔｆｆ
える注入装置１を示す。円筒形タンク４の上部は、円筒
形タンク４内を垂直方向に並進して変位可能なピストン
６で密封され、該ピストンの変位は、ピストン６のヘッ
ド８に直接に作用するステッピングモータ７で：ｌ７１
Ｊ　ｍｌ　２れる。

木兄７明の急速濾過装置は、円筒形チャンバ１゜をその
中心に有しその上部が他の多孔質ペレット１１で密封さ
れるフィルタ支持装置９をも備えている。多孔質ペレッ
ト１１は、実際の濾過材料１２のサポートとして作用し
、それ自体公知の態様でフィルタ、ケ１ル、力゛ラスの
微小球体または任意のその他の合成物質のサポートによ
って形成される。ポンｆ１３は、適当なときに、円筒形
チャンバ１０に真空を生じるのを可能にする。それ自体
公知の並進案内装置１４は、フィルタ支持装置９を急速
な一時的接触用装置１５の作Ｊｆ”Ｊの下で注入装置１
の軸線における軸方向の並進で可動にするのを可能釦す
る。装置１５は、例えば、電磁作用でレバー１６に遠１
６シて作用可能であり、レバー１Ｇは、水平なｆｆｑＩ
ｒ　１７のまわりに移動可能であり、その端部１８は、
ボール継手１９を介してフィルタ支持装置９のその軸線
に沿う並進運動を制御する。電子式ｆｆｒ１．Ｉ　＃組
立体２ｏは、線路２１および線路２２．２３によりステ
ッピングモータ７および急速接触用装置１５での同時作
用を可能にする。

第１図の実施例では、急速な一時的接触用装置１５は、
電子式制御組立体２ｏで電気的に付勢されるソレノイド
を有し、該ソレノイドは、強磁性接極子２４の吸引と、
矢印ＦＦ’で示す如くレバー１６のその軸１７のまわり
の旋回とを生じさせるのに充分な強さの磁場を発生可能
である。

急速濾過装置腎の作用は、次の通りである。

濾過を所望の液相は、注入装置１の円筒形タンク４へ予
め導入される。濾過材料、例えば、ミリポアフィルタは
、多孔質ペレット１１の表面に置かれ、濾過装置は、い
つでも運転できる。電子式制御装置２０の作用の下で、
注入装置１と、フィルタ支持装置ｆ　９との急速な一時
的接触用装置１５は、レバー１６に作用し、レバー１６
は、その軸１７のまわりに旋回し、注入装置１へ向いフ
ィルタ支持装置９の急速な運動を生じさせ、注入装置１
は、並進案内装置１４の扶助で固定されたま＼である。

濾過装置の上述の２部分間に接触が設定されると、図示
されない検出器は、制御装置２０へ接触情報を直ちに伝
達し“、制御装置２０は、所定の蛍だけタンク４にピス
トン６を導入して、タンク４に収容される液相の一部の
非常に急速な濾過が２つの多孔質ペレツ）５．１１と、
濾過材料１２どを介して行われる如く線路２１によって
ステッピングモータ７に直ちに作用する。これと同時に
、ポンプ装置１３は、電子式制御組立体２０によって運
転状祁になり、円筒形チャンバ１０に真空を発生するこ
とで濾過の増速と共に、フィルタを通過した液相の排出
に役立つ。

所定の時間の終りに、または液相の所望の量が急速濾過
装置で４６１過されると直ちに、制御組立体２０は、注
入装置１と、フィルタ支持装置９とで構成される濾過装
置の２つの半分を再度分離する如く一時的接触用装置１
５に逆方向に作用する。

この進行の態様は、特に、濾過すべき製品が放射性であ
るとき、フィルタの汚染時間を厳密な最小に制限するこ
とを可能にする。

−例として、本発明の急速濾過装置の適用を下記に説明
する。蛋白質または膜状小胞（神経線維または筋肉膜の
断片）は、過剰な水の除去の後、これ等を支持するのに
適当な府外を有するミリポアフィルタに載せられる。次
に、生物学的物質（膜または蛋白質）を有するフィルタ
は、放射性基質、即ち、フィルタに支持される蛋白質ま
たは膜に結合すべき分子を含有する溶液で急速に洗滌さ
れる。該分子ないし基質との反応と、濾過媒体との交換
とは、濾過時間の全体にわたって継続する。濾過は、所
望の時間に中止され、フィルタは、反応する物質から分
離され、フィルタに含まれる放射能は、測定され、濾過
の中止の際における反応状態の情報を得るのを可能にす
る。開発された装置は、濾過量と共に、液体の通過時間
を非常に正確に調節するのを可能にする。数十ミリ秒の
様な短い濾過時間、即ち、通常の濾過方法で得られるも
の（少くとも２秒から５秒）に比し２桁以下の時間分解
能を得るのが可能である。

この特徴は、細胞膜を通るイオンの移行の測定に対して
本装置を大きな関心事にする。また、これは、完全に新
奇な酵素の動的測定を意図するのをｎ」能にし、特に、
本装置は、基質、酵素の錯体または非共有原子価分子の
研究を可能にする。該測定は・、）膜状蛋白質に対する
Ｏ　ａ　＋　＋　　イオンの結合（筋小胞体ＡＴＰアー
ゼ−Ｏａ＋＋　）　　の反応速度の測定に関して下記に
詳細に説明される。

この測定は、下記の態様で行われる。

−ミリポアフィルタ（ＨＡＷＰ　Ｑ、４５　ｔ−ｔｍ　
）は、フィルタ支持装置に載せられ、 一蛋白質を含有する膜状小胞は、フィルタに載せられ（
フィルタに対し２［）０ａｇから乙ＯＯμＳの蛋白質）
、 一フィルタ支持装置は、・４５０ａ　　を含有する溶液
を充填された注入装置の下方に置かれ、−反応は、所定
の時間（２０ミＩＪ秒から数秒までの間）にわたりフィ
ルタと、注入装置ａとを接触させる′重子式制御装置で
開始され、該時間中、注入装置は、作動され、４，５１
０ｅ−を含有する溶液は、フィルタを介して注入される
Ｃ０．２ｒｎｌから１ｍｌ　）。

また、濾過される液体の量は、予め定められる。

反応およびン冶過は、フィルタと、注入装置との物理的
な分離によって中止される。フィルタの放射ｈヒは、シ
ンデレージョン６１数器の扶助で測定される。このシー
ケンスは、各々の所望の濾過時間に対して反復され、得
られる結果は、４５Ｃａ２＋　の溶液と、膜状小胞との
接触時間の関数として膜状小ｊ抱で固定される０＆２＋
　のあＡを表示する第２図に示される結合の反応速度で
ある。各点０は、調査すべき蛋白質を有する新しいフィ
ルタの異なる測定、従って、各時間に対応する。点は、
蛋白Ｌ７を含有しないフィルタで実施された測定に対応
し、従って、フィルタ湿潤水で捕捉される放射能の測定
に対応する。

この一連の実験で得られるＣａ２＋　イオン結合の反応
速度は、次に解析され、これは、この蛋白質の特定の作
用の詳細を点検することを可能にする。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の立面図、第２図はＣａ＋“イオ
ンと膜状蛋白質との化合の反応速度の測定１直の線図を
示す。 １・・・注入装置 ４・・・円筒ルタンク ５．１１・・・多孔質ペレット ６・・・ピストン Ｉ・・・ステッピングモータ ９・・・フィルタ支持装置 １０・・・円筒形チャンバ １２・・・う、ｄ過材料 １３・・・ボンフ０ １５・・・接触用装置 １６・・・レバー ２０・・・電子式制御組立体 代理人　浅　利　　　　皓

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　その底が多孔質ペレットで密封され、その上
   部が適当な機械的装置によりその中を並進して変位可能
   なピストンで密封され、濾過すべき液相を収容するタン
   クを有する注入装置と、実際の濾過材料のサポートとし
   て作用する多孔質ペレットでその上部を密封され、その
   中に真空を生じるのを可能にするボン７°装置にその基
   部で結合されるチャンバを有するフィルタ支持装置と、
   前記注入装置と、該フィルタ支持装置との急速で一時的
   な接触を保証する装置と、該接触用装置と、前記ピスト
   ンの機械的な並進装置とに同時に作用した後、注入の中
   止と、該注入装置と該フィルタ支持装置との分離とを所
   望の際にもたらすことにより、各濾過操作を制御する電
   子式制御組立体とを備える特に、生物学的液体の急速濾
   過装置。
2. （２）前記多孔質ペレットが、フリットガラスで作られ
   る特許請求の範囲第１項記載の濾過装置。
3. （３）　　前記ピストンを並進して変位する機械的装置
   が、ステッピングモータを備える１特許請求の範囲第１
   項記載の濾過装置。
4. （４）　　前記注入装置と、フィルタ支持装置との間に
   急速で一時的な接触をもたらす前記装置が、前記電子式
   制御組立体で電気的に伺勢されると共に、該注入装置に
   向いまたは離れる様に移動することで該フィルタ支持装
   置の垂直方向の並進を発生可能なレバーを作動するソレ
   ノイドを備える特許請求の範囲第１項記載の濾過装置。