JPS59198996A - 亜硫酸塩の酵素測定法及び測定試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はスルフイツトの酵素測定法及びその試薬に間予
ろ。

食品技術にオｄいてはスルフイツトはその殺菌及び殺ｈ
ビ作用により、その酵素特性により非常にしば（−は使
用されろ。果物及び野菜製品において、及び果汁におい
て、これは保存剤として使用される。更に、スルフイツ
トはマイラル１’　（Ｍａｉｌｌａｒｄ　）−反応を阻
害し、従ってポテト製品の製造の際に褐色に変色するこ
とを阻止するために使用されろ。ワイン製造の際に、こ
のゝ加硫“ばすでに昔からのワイン醸造業におげろ処置
であり、この処置は褐色になる前、及び病原微生物が発
生する前にワインを保護し、生［′：たアセトアルデヒ
ドを捕捉ｌ、て酢酸形成を回避するために行なわれる。

更に、スルフイツトは多くの酵素に対して阻害剤として
働き、不所望な酵素反応を阻止する。

このようにスルフイツトの科学技術−にの意味は、特に
食品分野において、非常に太きいにもかかわらず、これ
らの物質の一般的な使用はその毒性により限定される。

スルフイツトの健康を害する性質はそれぞれの食品にお
けるスルフイツト量の正確なコントロールを必要とする
。

この健康を害する性質のために、食品中のスルフイツト
の量には一定の上限がもうけられている。従って、多く
の食品においてスルフイツト濃度を測定することが必要
である。

従来公知のスルフイツト、特に食品中のスルフイツトの
測定法は非常に不十分である。食品化学実験室において
、簡易テストとしては沃素滴定法が実施されるが、この
方法ではスルフイツトだけではなくすべての還元物質が
一緒に測定されてしまう。この方法は非常に非特異的で
あるが、比較的短時間を必要とし、従って慣用試験にお
いては優れている。ドイツ連邦共和国においてワインの
試験のための官公庁の方法として記載されているスルフ
イツト測定はより特異的であり、この方法においては燐
酸と共に加熱することにより亜硫酸を遊離させ、過酸化
水素溶液を入れた受器中に蒸留すると、亜硫酸はスルフ
ェートに酸化サレ、このスルフエートヲ測定する。を−
かしながら、この方法は非常に長い時間を必要とする。

従って、本発明の課題はスルフイツトに対して特異的で
あり、短時間で実施することができるスルフイツトの測
定法を達成することである。

この課題は、スルフイツトを緩衝溶液中でスルフイツト
オキシダーゼを用いて酸化してスルフェートとし、この
除虫じた■■２０２をＮＡＤ及びＮＡＤＨの存在下にＮ
　Ａ　Ｄ　Ｈ−ペルオキシダーゼで還元し、ＮＡＤＨの
使用量を光学的に測定するということを特徴とするスル
フイツトの測定法により解決する。

一方では、レドックス反応において生じたＨ２Ｏ２が溶
液中になお存在ずイ）還光的に作用するスルフイツトと
すぐに反応し、結果を誤まらせろという危険があり、他
方ではスルフイツトの特性は酵素阻害であることは公知
であるので、生じたＨ２Ｏ２の酵素測定は実施すること
ができないのではないかと思われたために、スルフィッ
トの測定のための酵素法が見い出されたということは意
外であった。　更に、酸化型で存在する色素がなお存在
するスルフイツトと共に反応し、還元型で存在するロイ
ユ色素となり、かつペルオキシダーゼをスルフイツトは
抑制するので、生じたＨ２Ｏ２の検出を常法でペルオキ
シダーゼの存在下に色素形成により行なうことは不可能
と思われた。

本発明による方法を用いて、スルフイツト特異性であり
、迅速に測定できるスルフイツトの酵素測定法が意外に
も可能となった。

本発明方法は二工程で進行する。

先ず、緩衝溶液中に存在するスルフイツトをスルフイツ
トオキシダーゼ（５ｏ２−ＯＤ　）　ＥＣ１゜８．３．
１．を用いて酸素の存在下に式１）によりスルフェート
に酸化する： １）Ｓ０３−＋０２＋Ｈ２Ｏ５０２−ＯＤＳＯ−＋Ｈ２
Ｏ２ この生じた過酸化水素はＮＡＤの存在下にすぐにＮ　Ａ
　Ｄ　Ｈ−ペルオキシダーゼＥＣ１，１１，１゜１と共
に水の形成下に式２）により反応する：→− ２Ｈ２０＋ＮＡＤ この際、Ｎ　Ａ　Ｄ　）（は還元剤として作用し、ＮＡ
Ｄ＋に酸化される。ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋は異なる波長
で吸収し、Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの減少を光学的に測定する。

反応に使用したＮ　Ａ　Ｄ　Ｈ−量は試量溶液中のスル
フィノｉ・量と当量である。ＮＡＤＴ（ばその吸収、例
えば３６５．３４０又は３３４゜ｍにおける吸収により
容易に定量的に測定されろ。

この反応は緩衝溶液中で実施され、そのＰＨは７５〜８
５の範囲にある。７．８〜８２のＰＨ−範囲が有利でｆ
３）ろ。

スルフイツト測定のためにはいろいろな緩衝物質が好適
である。グリシルグリシン−、イミダグールー、トリス
−及びトリエタノールアミン−緩衝剤が有利である。特
に有利であるのはトリエタノールアミン緩衝剤である。

緩衝剤の濃度はテスト経過に大きな影響を与えない。特
に好適であるのは緩衝剤濃度０．０５〜０．４ｍ０１／
ｌの範囲である。この際、０．１〜０．３　ｍｏ　１／
　１の範囲は特に有利である。

測定に必要なＮＡＤＨＯ量は、開始値の吸光が十分に測
定可能でなければならないので高すぎてはいけないし、
他方では反応が定量的に進行しなければならないので低
すぎてもいけない。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈの濃度が１００〜５００μｍｏ１７７の
範囲であるのが有利である。ＮＡＤＨ１２５〜２２５μ
ｍｏｌ／ｌの量が特に好適である。

更に試料溶液にＮＡＤを添加する。ＮＡＤｏ。

５〜２、Ｑｍｍｏｌ／Ｌの量が十分であるが、これ以」
−使用することも可能である。ＮＡＤＱ、７５〜１、　
ＯＯｍｍｏｌ　／ｌの添加が特に好適である。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−ペルオキシダーゼの量は厳密ではない
。しかしながら、活性が僅かすぎる場合には反応時間が
長く、スルフイツトの再現性が時々小さすぎる。従って
、試料溶液中に少なくともＮＡＤ）（−ベルオキシダー
ぜ１０　Ｕ／Ｌを使用するのが有利である。ＮＡＤＨ−
ペルオキシダーゼ１００　Ｕ／ｌを越える量はそれ以上
の反応時間の減少に導びかないので不経済である。従っ
て、ＮＡＤ−ペルオキシダーゼ１０〜１００　Ｕ／ｌの
濃度が有利である。ＮＡＤＨ−ペルオキシダーゼを４０
〜８０ＴＪ／ｌの量で使用するのが特に有利である。

スルフイツトをスルフェートに酸化するために必要な酵
素であるスルフイツトオキシダーゼの油も厳密ではない
。しかしながら、反応時間が長（なり、再現性が低下す
るので、スルフイツトオキシダーゼの活性が２．５Ｕ／
ｌより低くなるの（・主有利ではない。従って、スルフ
イツトオキシダーゼは２５〜７５Ｕ／７の量で使用する
のが有利である。スルフイツトオキシダーゼの高い活性
は可能であるが、更に改良されることがないので不経済
である。スルフイツトオキシダーゼは３５〜６０　Ｕ／
ｌの範囲で使用するのが有利である。

本発明による方法はスルフイツトに特異的である。試料
材料中の多量のアスコルビン酸はこのテストを妨害する
。果物及び野菜製品及び果汁中のスルフイツトを測定し
なければならないので、アスコルビン酸は多かれ少なか
れ多量に含有されており、分析の前にアスコルビン酸を
除去するのが有利である。好適なアスコルビン酸の除去
法は西ドイツ国特許公開第２６２５８３４．４．号公報
によるアスコルビン酸オキシダーゼの添加である。

本発明のもう１つの課題はスルフイツトの測定試薬であ
り、この試薬はスルフイツトオキシダーゼ、ＮＡＤＨ−
ペルオキシダーゼ、ＮＡＤ　。

ＮＡＤＨ並びに緩衝剤を含有する。

この試薬はスルフイツトの簡単で、特異的な迅速検出法
を可能とする。

この試薬は使用可能な状態（調剤済）で、有利にＰＨ値
範囲７．５〜８．５の緩衝剤０．０５〜０．４ｍｏｌ　
／Ｌ　５ＮＡＤＨ１００＝　５００　／４ｍｏｌ　／Ｌ
、　ＮＡＤｏ、５〜２．０ｍｍｏｌ　／　Ｌ　、　ＮＡ
ＤＨ−ペルオキシダーゼ１０〜１００　ｕ／ｚ及びスル
フイツトオキシダーゼ２５〜７５　Ｕ／ｌを含有してい
るか、もしくは乾燥試薬中に相当量を含有している。

アスコルビン酸含有試料溶液は更にアスコルビン酸オキ
シダーゼ１Ｏ−５０Ｕ／７を含有しているのが有利であ
る。

この試薬が、調剤済溶液１１に対し緩衝剤０゜１〜０．
３　ｍｏｌ、ＮＡＤＨ１２５〜２２５μｍｏｌ、ＮＡＤ
　０．７５〜１．０　ｍｍｏｌ　、　　ＮＡＤＨ−及／
Ｉ／　オキシダーゼ＋Ｏ〜８０　Ｕ及びスルフイツトオ
キシダーゼ３５〜６０　Ｕを含有するのが良い。

本発明によるスルフイツトの測定法及び試薬（主そのス
ルフイツトに対する特異性、簡単な実験法及び短かい実
施時間によりすぐれている。こうして他の還元物質によ
り結果を誤まることな（スルフイツト含量を迅速に、か
つ定量的にホ１１定することが可能である。この本発明
による方法及び試薬は慣用分析に特に好適である。この
方法及び試薬は食品中のスルフイツトの測定のためにも
、廃水又は空気中のスルフイツトの測定のためにも好適
である。これは相持材料と一緒に、例えば試験紙の形で
使用することもできる。

次に実施例につき本願発明を詳説する。

例１ 種々の食品中のスルフイツトを測定した。このために層
厚１ｗのガラスキュベツト中に次の成分をぎペットで入
れる： 成分１：ｐＨ８，０を有するトリエタノールアミン緩衝
剤１７！中に溶かしたＮＡＤ２Ｔｎｇ、ＮＡＤＨＯ１４
■； 成分２：ＮＡＤＨ−ペルオキシダーゼ０．ＩＵを含有す
る酵素懸濁液　　　　　０．０１−二面蒸留水　　　　
　　　　１．９　ｍｌ及び試料　　　　　　　　　　　
０．１− 第２のキュベツト中には成分１及び２及び二面蒸留水を
第１のキュベツトと同じ量でピペットで加え、更に試料
のかわりに二面蒸留水０．１ｍｌを加えろ。

両方のキュ４ツト中に反応溶液を混合し、約５分後に溶
液の吸光を測定する。これは吸光値Ｅ、を与える。測定
後； 成分３：スルフィットオキシダーゼ０．１３　Ｕ　ヲ含
有する、乳化懸濁液０．０５　ｍｌ を両方のキュベツト［加えることにより反応を開始する
。再び混合し、約１５〜２０分後に反応が沈静した後、
両溶液の吸光を測定する。吸光値Ｅ２が得られろ。試料
中のスルフイツトの濃度は次の一般式により計算される
： ＸＭＧ ””　　ｇｘｄｘｖｘｌｏｏｏ　　ｘ””””ｔ〕’〔
ここで、■−テスト容量（ｍｌ　）、Ｖ−試料容量（ｍ
ｌ　）、ＭＧ−測定物質の分子量、ｄ一層厚（Ｃｒｎ）
、ε＝ＮＡＤＨの吸光係数及び△ε＝（Ｅｌ−Ｅ２）試
料−（Ｅｌ−Ｅ２）空位である〕。

この測定は種々の波長において実施することができる。

３４０　ｎｍでの測定においてスルフイツトの濃度は次
の式により得られる： △Ｅ Ｃ＝　１．９６０　×ａＴ　［ＳＯ２グ／を試料溶液〕
。

試料製造において希釈を行なった場合は結果を出す際に
このことを考慮しなければならない。

例２ 白ワイン中の全一８０２−含量を測定した。このために
は試験すべき白ワイン０．１ｍｌを試料容量として直接
テスト中に使用する。実験を例１に記載したと同様に行
った。

例３ 赤ワイン中のスルフイツト測定を実施した。

このためには赤ワイン２５−を水酸化ナトリウム溶液（
２ｍｏｌ　／Ｌ　）でＰＨ７，５〜８．○で調節する。

この溶液を二回蒸留水で５０−に希釈し、室温で１０分
間放置する。この溶液から０．１　ｒｎｌ、を試料容量
としてテスト中に添加する。この測定を例１と同様に実
施する。

例４ 果汁中のスルフイツト測定を実施した。この果汁からア
スコルビン酸を除去するために果汁２、　Ｏｍｌを水酸
化すｌ・リウム水溶液（２ｒｒ＋ｏｌ　／ｌ　）でＩ）
ＩＩ５〜６に調節し、アスコルビン酸オキシダーゼ溶液
約２０Ｕを加え、混合し、１０分間放置する。その後、
この試料を水酸化すトリウム溶蔽でｐＨ７５〜８０に調
節する。この溶液を二回蒸留水で＋、　Ｏｍｌ　Ｋ希釈
する。この希釈溶液から０．２　ｍｌを試料としてテス
トに使用する。このテストの実施は例１に記載したよう
に行なった。

例５ 砂糖づけ果物中のスルフイツトを測定した。

このために砂糖づけ果物約１００Ｓｉ’をミキサー中で
３０分間均質にする。この均質にした試料５７をメスフ
ラスコ５０ｍ１中で秤量し、水４０ｍ１で満たす。この
メスフラスコを閉じて、５分間６０’Ｃに加熱した。室
温に冷却した後、二回蒸留水で標線まで満たし、混合し
、濾過する。

この透明溶液から０．２　ｍｌを試料溶液としてテスト
に使用する。この測定は例１と同様に行なった。

例６ 汁？テト製品中のスルフイツトの都１定。

このためには破砕し、粉砕したポテトチップ約５７をメ
スフラスコ中に秤量する。二回蒸留水４−○γｌで満た
す。このメスフラスコを閉じ、５分間約６０℃に加熱す
る。室温に冷却し、二回蒸留水で標線まで満たし、混合
し、遠心分離する。透明溶液０．５　ｍ７！を試料容量
としてテストに使用する。測定は例１に記載したように
行なう。

例７ 香辛料中のスルフイツトを測定 このために香辛料を破砕し、混合した。破砕し、粉砕し
た試料から約１００　ｔｑを５０ｙｄメスフラスコ中に
秤量し、二回蒸留水２０ｍ１を添加する。このメスフラ
スコを閉じ、５分間約６０℃で保持する。室温に冷却し
た後、二回蒸留水で標線まで満たし、混合し、濾過する
。透明な溶液０．１　ｍｌを試料容積としてテストに使
用する。

テストの実施は例１に記載したように行なう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　スルフイツトを緩衝溶液中でスルフイツトオキシ
   ダーゼを用いてスルフェートに酸化し、この際生じたＨ
   ２Ｏ２をＮＡＤ及びＮＡＤＨの存在下に酵素ＮＡＤＨ−
   ベルオキシダーゼヲ用℃・て還元し、ＮＡＤＨの使用量
   を光学的に測定することを特徴とするスルフイツト酵素
   測定法。 ２、　　ＰＨＨＩ３５〜８５の緩衝溶液を使用する特許
   請求の範囲第１項記載の方法。 ３、　　ｐＨＨＩ３８〜８．２の緩衝液を使用する特許
   請求の範囲第２項記載の方法。 屯トリエタノールアミン緩衝液を使用する特許請求の範
   囲第１項から第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５　緩衝液を０．０５〜０４モル／ｌの濃度で使用する
   特許請求の範囲第１項から第４項のいずれか１項に記載
   の方法。 ５、　　ＮＡ、ＤＨを１００〜５００　Ｉｔｍｏｌ　／
   ｌの濃度で使用する特許請求の範囲第１項から第５項の
   いずれか１項に記載の方法。 ７、　　ＮＡ　Ｄ　Ｏ，５〜２．０　ｍｍｏｌ　／　ｌ
   を使用する特許請求の範囲第１項から第６項のいずれか
   １項に記載の方法。 ８、　　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ−ペルオキシダーゼ１０〜１０
   ０Ｕ／ｌを使用する特許請求の範囲第１項から第７項の
   いずれか１項に記載の方法。 ９　スルフイツトオキシダーゼ２５〜７５Ｕ／ｌを使用
   する特許請求の範囲第１項から第８項のいずれか１項に
   記載の方法。 １０、　　スルフイツト測定の実施の前に試料溶液から
   アスコルビン酸を除去する特許請求の範囲第１項〜第９
   項のいずれか１項に記載の方法。 １１　　アスコルビン酸の除去のために、アスコルビン
   酸オキシダーゼを使用する特許請求の範囲第１０項記載
   の方法。 １２、　　スルフイツトオキシダーゼ、ＮＡＤＨ，ＮＡ
   Ｄ。 ＮＡＤＨ−’？ルオキシダーゼ及び緩衝剤を含有するこ
   とを特徴とするスルフイツトの酵素測定試薬。 １３、調剤済試薬溶液１１に対し、緩衝剤０．０５〜０
   ．４　ｍｏｌ、　ＮＡＤＨ１００〜５００μｍ０１１Ｎ
   ＡＤＯ，５〜２．０　ｍｍｏｌ、ＮＡＤ）（−ベルオキ
   シダーゼコ０〜１００Ｕ及びスルフイツトオキシダーぜ
   ２５〜７５Ｕを含有する特許請求の範囲第１２項記載の
   測定試薬。 １４、　１−　ＩＪエタノールアミン緩衝剤を含有する
   特許請求の範囲第１３項記載の試薬。 １５、調削済試薬溶液ｌｔに対し、緩衝剤０．１〜Ｑ、
   ３　ｍｏｌ、　ＮＡＤＨｌ　２５〜２２５　μｍｏｌ／
   ｌ。 ＮＡＤｏ、７５〜１．○ｍｍｏｌ、ＮＡＤＨ−ペルオキ
   シダーゼ４０〜８０Ｕ及びスルフイツトオキシダーゼ３
   ５〜６０Ｕを含有する特許請求の範囲第１３項又は第１
   ４項に記載の試薬。 １６、付加的にアスコルビン酸オキシグーゼを含有する
   特許請求の範囲第１３項から第１５項のいずれか１項に
   記載の試薬。