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Die
Erfindung betrifft ein Analyseverfahren unter Einbeziehung enzymatischer
Biosensoren, mit dem Toluol in geringen Konzentrationsbereichen
selektiv gemessen werden kann. Mit der entsprechenden Vorrichtung
erfolgt die Realisierung des Analyseverfahrens. Die Vorrichtung
ist unter Verwendung von Teststreifen einfach zu handhaben.
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Heutzutage
sind gasförmige
Schadstoffe allgegenwärtiger
Bestandteil der Umgebungsluft urbanisierter Gebiete. Dabei sind
nicht nur industrienahe Bereiche kontaminiert. Durch die große Vielfalt
von Syntheseprodukten im Haushalt in Form von Baustoffen, Raumtextilien,
Verbund- und Kunststoffen u. a. m. existiert auch eine Vielzahl
von Schadstoffemittenten vor allem von organischen Löse- und
Konservierungsmitteln.
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So
bildet z. B. Toluol eine wesentliche Leitkomponente bei Raumluftkontaminanten.
Es wird als Lösungsmittel
für Firnisse,
Lacke, Druckfarben, Fette, Öle
und Harze eingesetzt und ist Ausgangsstoff für sehr viele Zwischen- und
Folgeprodukte. Hauptemittenten sind Kraftfahrzeuge, Farb- und Deckanstriche,
großflächig aufgebrachte
Klebstoffe, Mineralölindustrie,
industrielle Toluolverwendung und Holzfeuer.
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Die
Immissionskonzentrationen in Ballungsgebieten liegen bei 0,08 mg·m–3 und
in Reinluftgebieten bei bis zu 0,01 mg·m–3 . Im Wohnbereich (Innenraumbereich) können Werte
von 0,1 bis 0,2 mg·m–3 und
mehr auftreten. Für
die Allgemeinbevölkerung wird
die tägliche
Aufnahme mit 0,2 mg pro Einwohner angenommen. Obwohl die resultierenden
Konzentrationen oft weit unter den gesetzlich verankerten Grenz-
und Richtwerten liegen und damit direkte gesundheitliche Risiken
eher gering sind, werden durch Geruchsbeeinträchtigungen Einschränkungen
im Wohlbefinden, zum Teil psychosomatisch hervorgerufen, genannt.
Die Probleme liegen nicht in akuten toxischen Wirkungen, sondern
in der Langzeitexposition begründet.
Stoffe wie Toluol können
sich zudem in lipophilen Lebensmitteln anreichern und somit in erhöhten Konzentrationen über die
Nahrung aufgenommen werden.
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Andere
Beispiele für
organische Schadstoffe im Innenraumbereich sind Aldehyde (z. B.
Formaldehyd, Acetaldehyd), Weichmacher in Kunststoffen (z. B. PCB’s) oder Holzschutzmittel
(z. B. halogenorganische Komponenten wie PCP). Weiterhin sei auf
mikrobiell hervorgerufene flüchtige
Verbindungen, sog. MVOC’s
(Microbial Volatile Organic Compounds) hingewiesen, wie sie z. B.
durch versteckten oder offenen Schimmelpilzbefall freigesetzt werden.
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Durch
die erhöhte
Sensibilisierung der Bevölkerung
gegenüber
schädigenden
Umwelteinflüssen
und dem gesteigerten Gesundheitsbewusstsein besteht ein zunehmendes
Interesse an einfach handhabbaren, preiswerten und selektiven Messsystemen.
Dabei liegt das Bestreben darin, eine sofortige Ergebnisanzeige
zu erhalten. Langfristige Laboruntersuchungen in Verbindung mit
einer professionellen Probenahme vor Ort sind zwar aussagekräftig, aber sehr
kostenintensiv und deshalb von der Bevölkerung nur wenig akzeptiert.
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Zur
Eigenkontrolle im Verdachtsfall sind preiswerte Einmal-Teststreifen
in Verbindung mit einem elektronischen Meßgerät ein Mittel der Wahl, wobei
letzteres als Leihgerät
z. B. in Apotheken oder Drogerien zur Verfügung gestellt werden kann.
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Die
Nutzung von Enzymen als biochemische Erkennungssysteme in Biosensoren
ermöglicht
die selektive Bestimmung einer großen Zahl von organischen Stoffen.
Bislang konnten sich Biosensoren aber lediglich für einige
wenige ausgewählte
Messaufgaben durchsetzen, und dann meist nur für flüssige Proben (z. B. Blutzuckermessung).
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Für die Messung
organischer flüchtiger
Stoffe existieren verschiedene Detektionsprinzipien. Arbeitsmedizinisch
relevante Toluolkonzentrationen (0,1 bis 2 MAK bzw. 19 bis 380 mg·m–3)
werden hauptsächlich
mit Prüfröhrchen bestimmt,
wobei nach dem Ansaugen der Luft eine Farbänderung im Röhrchen eintritt,
wenn der gesuchte Schadstoff in der Luft vorhanden ist. Diese Röhrchen werden
ab einem Messbereich von 5 ppm angeboten.
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Geringe
Konzentrationen können
nur durch eine Probenanreicherung mittels Passiv- oder Aktivsammlern
(z. B. Aktivkohle, Tenax) und anschließender GC-Analyse bestimmt
werden. Diese Methode ist etabliert und wird von einigen Firmen
professionell durchgeführt.
Jedoch bedarf es hierbei einer vergleichsweise aufwendigen Probenahme
und Labortechnik verbunden mit einem nicht unerheblichen Zeitaufwand
und hohen Kosten.
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Im
industriellen Bereich sind stationäre Messsysteme etabliert, die
mit verschiedenen Sensoren für
die Permanentüberwachung
ausgestattet und aus diesem Grund sehr kostenintensiv sind.
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In
den meisten Fällen
werden BTEX-Aromaten als Summenparameter über PID- oder FID-Detektoren bestimmt.
Auch hier handelt es sich in der Regel um industrielle Anwendungen.
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Für die Beurteilung
von Raumluft treten in zunehmendem Maße auch die sog. „Elektronischen Nasen” ins öffentliche
Interesse. Diese Systeme basieren auf der Anordnung vieler Einzelsensoren
mit variablen Eigenschaften und sind für die Erfassung sehr geringer
Konzentrationen prädestiniert.
Die Sensoren sind jedoch unspezifisch und eine Zuordnung zu bestimmten
Analyten kann erst durch das Hinzuziehen komplexer heuristischer
Algorithmen erfolgen.
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Im
Rahmen der dazu veröffentlichten
Literatur wird auch die Detektion von Toluol beschrieben [1], wobei
das Detektionsprinzip auf der Wärmegenerierung
infolge der Absorption und Desorption von Analyten an dünnen Polymerschichten
oder organischen Clathratbildnern beruht. Das Wärmeleistungssignal wird mit
Hilfe von Thermosäulenchips
in ein Spannungssignal umgewandelt, aus dem ein demoduliertes Ausgangssignal
berechnet wird. Im Gesamtsystem ist diese PC-gekoppelte Technik
recht komplex und vom einfachen Anwender noch nicht praktikabel
und ökonomisch
einsetzbar.
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MAUTE
et al. [2] nutzen die durch die Absorption von Gasen hervorgerufene
Veränderung
der Resonanzfrequenz polymerbeschichteter Konsolen, um Octan, Toluol
oder Butanol zu detektieren.
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Für den Einsatz
von Biosensoren in der Gasanalytik gibt es nur wenige Hinweise.
GIL et al. [3] beschreiben einen Gas-Biosensor zur Bestimmung der Toxizität leicht
flüchtiger
Komponenten wie Benzol, Toluol, Ethylbenzol oder Xylol. Dabei werden
Bakterien immobilisiert, die eine Biolumineszenz aussenden. Unter
Einwirkung von Schadstoffen verändert sich
diese Biolumineszenz.
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Literatur:
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- [1] LERCHNER, J., CASPARY, D., WOLF, G.; Sens. Act.
B 70(1–3),
2000, 57.
- [2] MAUTE, M., RAIBLE, S., PRINS, F. E., KERN, D. P., ULMER
H., WEIMAR, U. AND GÖPEL,
W.; Sens. Act. B: 58(1–3),
1999, 505.
- [3] GIL, G. C., KIM, Y. J., GU, M. B.; Biosens. Bioelectron.
17, 2002, 427
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Zur
Bestimmung leicht flüchtiger
organischer Stoffe auf der Grundlage der chemischen Detektion wird
auf
WO 94/28 408 ,
US 4 003 257 ,
US 4 154 086 und
US 5 435 414 verwiesen. Es sei noch
die
DE 102 56 931
A1 erwähnt,
die sich mit der Immobilisierung von biologisch aktiven Molekülen in Sol-Gel-Matrices zum
Screening flüssiger
Proben befasst, wobei es vor allem darum geht, ein Hochdurchsatz-Screening von
Proben zu ermöglichen.
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Aus
JP 2004-049138 A ist
allgemein der enzymatische Nachweis von monozyklischen Aromaten über NADH
bekannt. Der biochemische Nachweis von Alkoholen und Aldehyden unter
Verwendung von entsprechenden Enzymen und NADH oder NAD
+ Cofaktoren
verkapselt mittels Sol-Gel-Technik ist von Amy K. Williams und Joseph
T. Hupp unter http://chemgroups.northwestern.edu/hupp/Publications/A12.pdf
beschrieben worden („Solution
and Gas Phase Sensing of Alcohols and Aldehyds.”).
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Zusammenfassend
kann bis hierher festgestellt werden, dass zur Ermittlung flüchtiger
organischer Stoffe verschiedene Detektionsprinzipien bekannt sind,
wobei nicht übersehen
werden darf, dass es sich um zeit- und kostenaufwendige Verfahren
in Bezug auf die Probenahme und die Auswertung handelt und dem einfachen
Anwender aus der Bevölkerung
damit wenig geholfen ist.
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Der
Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, unter Verwendung enzymatischer
Sensoren ein Analyseverfahren vorzuschlagen, mit dem Toluol kostengünstig, sehr
selektiv und in niedrigen Konzentrationsbereichen quantitativ gemessen
werden kann.
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Zur
Realisierung des Verfahrens soll eine Vorrichtung unter Verwendung
kostengünstiger
Einmalteststreifen für
Toluol konzipiert werden.
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Die
Vorrichtung als Testgerät
soll auch für den „Nichtfachmann” einfach
zu bedienen sein und soll relativ schnell das Ergebnis anzeigen.
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Erfindungsgemäß wird die
Aufgabe wie folgt gelöst,
wobei hinsichtlich der grundlegenden erfinderischen Gedanken auf
den Anspruch 1 und 4 verwiesen wird. Die weitere Ausgestaltung der
Erfindung ergibt sich aus den Ansprüchen 2 bis 3 und 5 bis 10.
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Zur
weiteren Erläuterung
der Erfindung ist auszuführen:
Die
Erfindung ermöglicht
eine selektive und quantitative Bestimmung von Toluol durch enzymatische
Umsetzung des Analyten unter der Veränderung der Konzentration von
NADH als biochemische Schlüsselkomponente.
Dabei erfolgt eine
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Immobilisierung
der reaktiven Komponenten in nanostrukturierten, optisch transparenten
Schichten, so dass in Verbindung mit Kunststoff- oder Glasträgern kostengünstige Einmalteststreifen
hergestellt werden können.
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Die
Kombination einer biochemischen Schlüsselreaktion mit spezifischen
enzymatischen Rezeptorsystemen ermöglicht die Herstellung von Teststreifen
für den
Analyten Toluol.
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Entsprechend
des Patentanspruches 1 wird eine hohe Selektivität des Messverfahrens dadurch gewährleistet,
dass eine biochemische Rezeptorkomponente als sensitives Element
eingesetzt wird und dadurch ein Biosensor entsteht. Bei den eingesetzten
Biokomponenten handelt es sich um Enzyme des Toluol-Dioxygenase(TOD)-Komplexes,
bestehend aus drei Einzelenzymen, der NADH-Ferredoxin-ReductaseTOL, dem FerredoxinTOL und
einem Eisen-Schwefel-Protein
(ISPTOL), mit denen der Analyt Toluol umgesetzt
wird. Die Enzyme sind in Sol-Gel-basierten nanostrukturierten Schichten
auf optisch transparenten Trägern
(Teststreifen) immobilisiert. Zusätzlich zum spezifischen Enzym
wird je nach Messaufgabe das Coenzym NAD+ oder
seine reduzierte Form NADH in das Immobilisat eingebracht und bildet
die Schlüsselkomponente.
Während
der Nachweisreaktion ändert
sich die NADH-Konzentration.
Da NADH ein ausgeprägtes lokales
Absorptionsmaximum bei 340 nm hat, lässt sich die Reaktion im langwelligen
UV-Bereich gut detektieren.
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Die
biofunktionalisierten optischen Teststreifen werden für die Messung
in eine Messkammer eines optoelektronischen Readersystems eingesetzt. Die
zeitliche Änderung
der Licht-Absorption
wird bei der entsprechenden Wellenlänge gemessen, während das
Immobilisat mit einem gleichmäßigen Probeluftstrom
beaufschlagt wird.
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Je
nach Konzentration des Analyten erfolgt eine unterschiedlich starke
Absorptionsänderung durch
Verbrauch oder Entstehung von NADH. Die Messung dauert nur wenige
Minuten.
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Die
Teststreifen sind eingeschweißt
bei kühler
Lagerung (< 5°C) mehrere
Wochen haltbar.
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Die
Erfindung wird im Folgenden anhand der beigefügten Zeichnungen und des Erprobungsbeispiels
erläutert.
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Es
zeigen:
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1a eine
Ausführungsform
der Teststreifen in schematischer Darstellung, Vorderansicht,
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1b wie 1a,
jedoch Längsschnitt,
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2 die
prinzipielle Ausführung
der Messvorrichtung,
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3 das
biochemische Reaktionsschema für
den Nachweis des Analyten Toluol.
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Für den kostengünstigen,
einfachen und reproduzierbaren Messbetrieb beinhaltet die Erfindung die
Verwendung von Teststreifen zum einmaligen Gebrauch. Eine Ausführungsform
zeigen die 1a/b. Der Teststreifen besteht
aus einem für
die auszuwertende Wellenlänge
transparenten und mechanisch stabilen Träger (A), vorteilhafterweise
aus Glas oder Polymethylmethacrylat (PMMA). Der Träger wird
in einem eingegrenzten Bereich mit einer bioaktiven silikatischen
Sol-Gel-Matrix (B) beschichtet. In dieser Matrix sind die Enzymmoleküle (C) sowie das
Coenzym NADH (D) eingearbeitet. Alternativ handelt es sich bei der
Komponente (D) auch um die oxidierte Form NAD+.
Um die Löslichkeit
und Aktivität der
Biomoleküle
zu gewährleisten,
ist die Rezeptur der Sol-Gel-Matrix
so optimiert, dass ein Lyogel mit hohem Wasseranteil entsteht. In
der Sol-Gel-Matrix befinden sich zudem stabilisierende Bestandteile
wie Puffer. Eine Aushärtung
zum Xerogel soll vermieden werden, da in diesem Fall die katalytische
Aktivität des
Enzyms verloren geht. Ebenso führt
der Einsatz organischer Lösemittel
sowie das Tempern bei Temperaturen über 40°C in der Regel zur Inaktivierung. Deshalb
werden zweckmäßigerweise
wässrige
Lösemittel
eingesetzt. Die Lyogelbildung erfolgt bei Temperaturen im Bereich
von 4–30°C. Grundlage
für die Sol-Gel-Matrix
bildet ein Precursor aus den Komponenten Tetramethylorthosilikat
(TMOS) und Salzsäure.
Dieser Precursor wird in einem bestimmten Verhältnis mit der wässrigen
Enzym-Pufferlösung
versetzt, welche auch das Coenzym enthält. Das Mischungsverhältnis, der
sogenannte r-Wert, ist entscheidend für die Konsistenz des entstehenden
Gels. Als vorteilhaft für
die Anwendung haben sich r-Werte > 30
erwiesen. Die Einarbeitung der genannten Enzyme in die Sol-Gel-Matrix
ermöglicht
die Herstellung von Teststreifen für die Messung von Toluol.
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Die
Sol-Gel-Matrix (B) wird in der Ausführungsform nach 1a/b
als Guss-Schicht auf den Träger
(A) aufgebracht. Vorteilhafte Schichtdicken betragen 0,3–2,0 mm.
Um reproduzierbare Schichtdicken und die Formgebung zu gewährleisten,
wird eine Kavität
auf dem Träger
hergestellt. Eine Ausführungsform
ist das Aufkleben eines Begrenzungsrings (E) gemäß 1.
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Alternativ
kann die Struktur auch in die Trägeroberfläche eingearbeitet
sein.
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Die
hergestellten Teststreifen können
kühl und
vor Austrocknung geschützt
für mehrere
Wochen gelagert werden.
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Die
Durchführung
der Analyse ermöglicht
die Anwendung einer optoelektronischen Mess-Vorrichtung. 2 zeigt
eine Ausführungsform.
Die Mess-Vorrichtung besteht aus einem Gehäuse (1), in welchem
eine Messkammer (2) sowie eine Gasförderpumpe (3) mit
vorgeschaltetem Filter (12) enthalten sind. In der Messkammer
befinden sich an gegenüberliegenden
Seiten eine Lichtquelle (5), vorteilhafter Weise ausgeführt als
LED mit einem engbandigen Emissionspektrum im Bereich der zu detektierenden
Wellenlänge,
sowie eine Fotodiode als Empfänger
(6). In den Strahlengang wird der Teststreifen (4)
für die
Messung eingeführt
und über
Führungen (7)
mechanisch stabilisiert. Dichtungslamellen (8) mindern
das Eindringen von Fremdlicht und das Austreten der Luftprobe an
der Eintrittsöffnungen
für den Teststreifen. Über die
Gasförderpumpe
(3) wird im Messbetrieb die Luftprobe von der Umgebung
angesaugt und durch den Probekanal (9) geleitet. Zuvor werden
grobe Partikel, Stäube
und Aerosole durch den Filter (12) abgetrennt. Wenn sich
die zu analysierende Verbindung in der Luftprobe befindet, kommt es
zur Wechselwirkung der Analytmoleküle mit der bioaktiven Schicht
(10). Diese dringen in die Schicht ein und werden vom immobilisierten
Enzym biochemisch umgesetzt. Dies führt zum Verbrauch des Coenzyms
NADH. Dadurch wird die Absorption des UV-Lichts im Wellenlängen-Bereich
von 340 ± 30
nm herabgesetzt, was bei konstanter Bestrahlung durch die Lichtquelle
(5) zu einer zeitliche Änderung
der Extinktion und damit des durch den Empfänger (6) ausgegebenen
Signals führt.
Alternativ zum NADH-Verbrauch können
Enzymreaktionen eingesetzt werden, die zur Entstehung von NADH aus
der oxidierten Form NAD+ führen.
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Eine
Steuer- und Auswerteeinheit (11) verarbeitet die Messdaten,
steuert die Aktoren während des
Messverlaufs und bildet das Interface zum Bediener. Die Ergebnisbildung
erfolgt durch Berechnung des Anstiegs der Signalkurve über der
Zeit und Umrechnung in eine Analytkonzentration mittels Kalibrierkurve.
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Erprobungsbeispiel 1
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Zur
Bestimmung der Komponente Toluol in der Luft werden Teststreifen
konfektioniert, die einen Enzymkomplex sowie das Coenzym NADH in
der Sol-Gel-Matrix enthalten. Der Enzymkomplex Toluol-Dioxygenase
(TOD) ist ein intrazellulär
gebildeter Multienzymkomplex aus 3 Komponenten und kann z. B. aus
Bakterienzellen der Gattung Pseudomonas gewonnen werden. TOD katalysiert
die Dioxygenierung von Toluol zu cis-Toluol-Dihydrodiol unter Verbrauch von
NADH entsprechend 3. Die einzelnen Komponenten,
zwei Eisen- und ein Flavoprotein bilden eine Redoxkette. Das Flavoprotein, NADH-Ferredoxin-ReductaseTOL, überträgt ein Elektron
vom Coenzym NADH auf ein kleines Eisen-Schwefel-Protein, das FerredoxinTOL. FerredoxinTOL reduziert
das zweite Eisen-Schwefel-Protein,
das sogenannte ISPTOL, durch Elektronentransfer.
Das reduzierte ISPTOL katalysiert die Bildung
von cis-Toluol-Dihydrodiol unter Anbindung von molekularem Sauerstoff
an Toluol.