JPS59175883A - アルブミン分解物を用いた修飾ウロキナ−ゼ及びその製造法 - Google Patents
アルブミン分解物を用いた修飾ウロキナ−ゼ及びその製造法Info
- Publication number
- JPS59175883A JPS59175883A JP58050533A JP5053383A JPS59175883A JP S59175883 A JPS59175883 A JP S59175883A JP 58050533 A JP58050533 A JP 58050533A JP 5053383 A JP5053383 A JP 5053383A JP S59175883 A JPS59175883 A JP S59175883A
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- Japan
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- urokinase
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- albumin
- human serum
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、分子量５００〜６０，０００のヒト血清アル
ブミン（以下Ｈ８Ａと略称すゐ）分解物を架橋試薬でウ
ロキナーゼに結合させてなる修飾ウロキナーゼに関する
。
ブミン（以下Ｈ８Ａと略称すゐ）分解物を架橋試薬でウ
ロキナーゼに結合させてなる修飾ウロキナーゼに関する
。
従来、タンパク質の性質改善、抗原性消失等の目的でポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）やアルブミンなどの高
分子をタンパク質と化学的に結合させる修飾法が数多く
報告されているが、ＰＥＧは合成高分子であり、アルブ
ミンは直接結合させるには分子量が大きすぎる欠点があ
る。
リエチレングリコール（ＰＥＧ）やアルブミンなどの高
分子をタンパク質と化学的に結合させる修飾法が数多く
報告されているが、ＰＥＧは合成高分子であり、アルブ
ミンは直接結合させるには分子量が大きすぎる欠点があ
る。
本発明者らは、化学修飾材料として公刊１００〜６０，
０００の分子サイズを持つ生体高分子の７ラグメントを
Ｈ８Ａの化学的及び酵素的切断により調製し、これをウ
ロキナーゼ（分子量５４，０００）と化学的に結合させ
たところ、分子量７０，０００以上の複合体が酵素活性
を保持し、かつきわめて血中安定性のすぐれた修飾ウロ
キナーゼであるとと、さらに分子量１７０，０００以上
の複合体は、酵素活性を保持し、かつその抗原性がＨ８
Ａの抗原性に変換されていることを見い出し、本発明に
到達した。
０００の分子サイズを持つ生体高分子の７ラグメントを
Ｈ８Ａの化学的及び酵素的切断により調製し、これをウ
ロキナーゼ（分子量５４，０００）と化学的に結合させ
たところ、分子量７０，０００以上の複合体が酵素活性
を保持し、かつきわめて血中安定性のすぐれた修飾ウロ
キナーゼであるとと、さらに分子量１７０，０００以上
の複合体は、酵素活性を保持し、かつその抗原性がＨ８
Ａの抗原性に変換されていることを見い出し、本発明に
到達した。
即ち、本発明は、「（１）分子量５００〜６０，０００
のヒト血清アルブミン分解物とウロキナーゼを架橋試薬
で結合きせることを特徴とする修飾ウロキナーゼの製造
法。（２）分子量５００〜６０，０００のヒト血清アル
ブミン分解物をウロキナーゼに化学結合させてなる修飾
ウロキナーゼ。」Ｋ関するものである。
のヒト血清アルブミン分解物とウロキナーゼを架橋試薬
で結合きせることを特徴とする修飾ウロキナーゼの製造
法。（２）分子量５００〜６０，０００のヒト血清アル
ブミン分解物をウロキナーゼに化学結合させてなる修飾
ウロキナーゼ。」Ｋ関するものである。
本発明に於いて、分子量５００〜６０，０００のＨ８Ａ
分解物ば、Ｈ８Ａを化学的及び酵素的に分解し、ゲル濾
過及び透析等により所定分子量の分解物を分画して使用
する。
分解物ば、Ｈ８Ａを化学的及び酵素的に分解し、ゲル濾
過及び透析等により所定分子量の分解物を分画して使用
する。
ＨＳ Ａの化学的分解法としては、ブロモシアンによる
メチオニル結合の切断、部分酸加水分解法、２−ニトロ
−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシスティン結合
の切断、Ｎ−ブロモスクシンイミド及び２−（２−ニト
ロフェニルスルフェニル）−３−メチル−３−ブロモイ
ンドールによるトリプトファニル結合の切断など、酵素
分解としては、トリプシン、キモトリプシン、サーモラ
イシン、ペプシン、パパイン、スプチリシンエラスター
ゼなどのいずれの方法を用いてもよい。
メチオニル結合の切断、部分酸加水分解法、２−ニトロ
−５−チオシアノ安息香酸によるアシルシスティン結合
の切断、Ｎ−ブロモスクシンイミド及び２−（２−ニト
ロフェニルスルフェニル）−３−メチル−３−ブロモイ
ンドールによるトリプトファニル結合の切断など、酵素
分解としては、トリプシン、キモトリプシン、サーモラ
イシン、ペプシン、パパイン、スプチリシンエラスター
ゼなどのいずれの方法を用いてもよい。
これらの手法で得られたＨ８Ａ分解物は、分子！５００
〜６０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００
のものが良い。
〜６０，０００、好ましくは１，０００〜１０，０００
のものが良い。
Ｈ８Ａ分解物とウロキナーゼを化学的結合させるには、
種々の架橋試薬が利用出来る。
種々の架橋試薬が利用出来る。
例えば、ビスイミデート類、アンド類、イソシアネート
類ジアルデヒド類など、あるいはＮ−スクシンイミジル
−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートなどの架
橋試薬が利用出来る。
類ジアルデヒド類など、あるいはＮ−スクシンイミジル
−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートなどの架
橋試薬が利用出来る。
一般に、Ｈ８Ａ分解物とウロキナーゼの化学的結合によ
り、新たな抗原決定基が形成されないことが好ましい。
り、新たな抗原決定基が形成されないことが好ましい。
本発明の平均分子量約７０，０００の修飾ウロキナーゼ
１ツが形成されていないことが確認された。
１ツが形成されていないことが確認された。
この複合体のインビボ及びインビトロにおける血漿中で
の安定性をラットを用いて検討したところ、通常のウロ
キナーゼと比較して血漿中のプロテアーゼインヒビター
の影響を受は難く、血中半減期が著しく延長されている
ことが判明した。
の安定性をラットを用いて検討したところ、通常のウロ
キナーゼと比較して血漿中のプロテアーゼインヒビター
の影響を受は難く、血中半減期が著しく延長されている
ことが判明した。
また、平均分子量約１７０，０００の修飾ウロキナーゼ
は抗ウロキナーゼ血清と沈降物を形成せず、抗Ｈ８Ａ血
清と沈降物を形成することから、人に対して免疫原性を
有するタンパク質の抗原性をＨ８Ａの抗原性に変換させ
る修飾法になることが確認された。
は抗ウロキナーゼ血清と沈降物を形成せず、抗Ｈ８Ａ血
清と沈降物を形成することから、人に対して免疫原性を
有するタンパク質の抗原性をＨ８Ａの抗原性に変換させ
る修飾法になることが確認された。
次に実施例をあげて、具体的に説明する。
実施例Ｉ
ＨＳ Ａ ２００ツを含む１０−の８０チギ酸溶液に２
００”／のブロモシアンを加え、４℃で２４時間反応さ
せに。反応後、０．１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，４に対
して２４時間透析後、１３−のトリジンｙ −５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４ Ｂ （５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ
１−あたり１０叩のトリプシンを固定化したもの）を加
え、３７℃で４時間反応後トリプシンー８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂを除去した。
００”／のブロモシアンを加え、４℃で２４時間反応さ
せに。反応後、０．１ＭＩＪン酸緩衝液ｐＨ７，４に対
して２４時間透析後、１３−のトリジンｙ −５ｅｐｈ
ａｒｏｓｅ ４ Ｂ （５ｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｂ
１−あたり１０叩のトリプシンを固定化したもの）を加
え、３７℃で４時間反応後トリプシンー８ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ ４Ｂを除去した。
得られた溶液は、アミコンＰＭＩＯ膜にて分子量・１万
以上のものを除去し、さらに透析にて低分子を除去して
平均分子量約１０，０００の）（ＳＡ分解物を得た。
以上のものを除去し、さらに透析にて低分子を除去して
平均分子量約１０，０００の）（ＳＡ分解物を得た。
実施例２
実施例１で得られたヒト血清アルブミン分解物１０”／
とウロキナーゼ１ツ（１４８，０００国際単位）を含む
３ｒｎｔの０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に、
２．４りのグルタルアルデヒドを加え、４℃で２．５時
間反応後、グリシン３６ツを加えて反応を停止した。残
存活性は、フィブリンプレート法にて３３チであった。
とウロキナーゼ１ツ（１４８，０００国際単位）を含む
３ｒｎｔの０．１ Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）に、
２．４りのグルタルアルデヒドを加え、４℃で２．５時
間反応後、グリシン３６ツを加えて反応を停止した。残
存活性は、フィブリンプレート法にて３３チであった。
生成物の分取は５ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ −１５０を用
いるゲル濾過により行ない、平均分子量約７０．０００
及び１７０，０００の修飾ウロキナーゼがそれぞれ４１
，０００と２，０００国際単位得られた。
いるゲル濾過により行ない、平均分子量約７０．０００
及び１７０，０００の修飾ウロキナーゼがそれぞれ４１
，０００と２，０００国際単位得られた。
実施例３
実施例２で得られた修飾ウロキナーゼ（分子量約７０，
０００）の生理食塩水溶液１ ｍｌ （１ツ／、りとフ
ロイントのコンプリードアシュバンド１−を混和してＷ
１０型エマルジツンとし、ウサギの４足前及びその指裏
等の皮下に注射した。１０日後、２０日後に同様の注射
を行ない、３０日目に２００μ？ ／ ０．２５−生理
食塩水の複合体を静脈注射し、４３日目に採血して、抗
複合体血清を得た。また、抗つロキナーゼ血清抗ＨＳ
Ａ血清、抗Ｈ８Ａ分解物血清もウサギを用いて作製し、
それらすべての抗原液に対してオフタロニー法［０，Ｏ
ｕｅｈｔｅｒｌｏｎｇ。
０００）の生理食塩水溶液１ ｍｌ （１ツ／、りとフ
ロイントのコンプリードアシュバンド１−を混和してＷ
１０型エマルジツンとし、ウサギの４足前及びその指裏
等の皮下に注射した。１０日後、２０日後に同様の注射
を行ない、３０日目に２００μ？ ／ ０．２５−生理
食塩水の複合体を静脈注射し、４３日目に採血して、抗
複合体血清を得た。また、抗つロキナーゼ血清抗ＨＳ
Ａ血清、抗Ｈ８Ａ分解物血清もウサギを用いて作製し、
それらすべての抗原液に対してオフタロニー法［０，Ｏ
ｕｅｈｔｅｒｌｏｎｇ。
Ａａｔａ Ｐａｔｈ、Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、５ｃａｎｄ
、、 ３２ 、２３１（１９５３））を用いて分析した
結果、分子量約７０，０００の修飾ウロキナーゼはウロ
キナーゼ及びアルブミン両者の抗原性を示し、それ以外
の抗原性は示さ力かった。
、、 ３２ 、２３１（１９５３））を用いて分析した
結果、分子量約７０，０００の修飾ウロキナーゼはウロ
キナーゼ及びアルブミン両者の抗原性を示し、それ以外
の抗原性は示さ力かった。
一方、分子量約１７０，０００の修飾ウロキナーゼは、
抗ウロキナーゼ血清と沈降線を形成せず、抗アルブミン
血清と沈降線を形成した。
抗ウロキナーゼ血清と沈降線を形成せず、抗アルブミン
血清と沈降線を形成した。
実施例４
実施例２で得られた分子量約７０，０００の修飾ウロキ
ナーゼの生理食塩水溶液をウィスター系ラット（２５０
ｆ１１０’）に８，０００国際単位／しの割合で大腿部
静脈から注射し、経時的に腹部大動脈から抗凝固剤とし
て３．８チクエン酸ナトリウムを１容用いて、血液をサ
ンプリングした。得られた０ 血液から血漿を分離後、Ｉ Ｎ −ＨＯ２にてｐＨ２，
０とし、室温で３０分放置して残存するプロテアーゼイ
ンヒビターを失活をせ、ＩＮ −Ｎａ０Ｉ（にて、ｐＨ
７゜０にもどした後、フィブリンプレート法にて活性を
測定した。
ナーゼの生理食塩水溶液をウィスター系ラット（２５０
ｆ１１０’）に８，０００国際単位／しの割合で大腿部
静脈から注射し、経時的に腹部大動脈から抗凝固剤とし
て３．８チクエン酸ナトリウムを１容用いて、血液をサ
ンプリングした。得られた０ 血液から血漿を分離後、Ｉ Ｎ −ＨＯ２にてｐＨ２，
０とし、室温で３０分放置して残存するプロテアーゼイ
ンヒビターを失活をせ、ＩＮ −Ｎａ０Ｉ（にて、ｐＨ
７゜０にもどした後、フィブリンプレート法にて活性を
測定した。
対照として、ウロキナーゼ（分子量５４，０００）及び
実施例２のＨＳ Ａ分解物を含まない系で調製したグル
タルアルデヒド処理ウロキナーゼも同様の操作を行った
。経時的な血漿中残存活性（イ）を表１に示す。（ラッ
トは、それぞれの試料に対して４匹用いた。） 表 １ 実施例５ ウィスター系ラットの血漿４４に対して、表１で示した
３種類の試料を４０ ｐｔ加え、終濃度１３５国際単位
／−とする。３７℃でインキュベートして経時的Ｋ Ｏ
，５−をサンプリングし、実施例４と同様の酸処理（ｐ
Ｈ２，０）後、活性測定を行った。
実施例２のＨＳ Ａ分解物を含まない系で調製したグル
タルアルデヒド処理ウロキナーゼも同様の操作を行った
。経時的な血漿中残存活性（イ）を表１に示す。（ラッ
トは、それぞれの試料に対して４匹用いた。） 表 １ 実施例５ ウィスター系ラットの血漿４４に対して、表１で示した
３種類の試料を４０ ｐｔ加え、終濃度１３５国際単位
／−とする。３７℃でインキュベートして経時的Ｋ Ｏ
，５−をサンプリングし、実施例４と同様の酸処理（ｐ
Ｈ２，０）後、活性測定を行った。
経時的な残存活性（％）を表２に示す。
表 ２
特許出願人 わかもと製薬株式会社
Claims (2)
- （１） 分子！！−５００〜６０，０００のヒト血清
アルブミン分解物とウロキナーゼを架橋試薬で結合させ
ることを特徴とする修飾ウロキナーゼの製造法。 - （２） 分子ｔ５００〜６０，０００のヒト血清アル
ブミン分解物をウロキナーゼに化学結合させてなる修飾
ウロキナーゼ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58050533A JPS59175883A (ja) | 1983-03-28 | 1983-03-28 | アルブミン分解物を用いた修飾ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58050533A JPS59175883A (ja) | 1983-03-28 | 1983-03-28 | アルブミン分解物を用いた修飾ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59175883A true JPS59175883A (ja) | 1984-10-04 |
| JPH0218066B2 JPH0218066B2 (ja) | 1990-04-24 |
Family
ID=12861632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58050533A Granted JPS59175883A (ja) | 1983-03-28 | 1983-03-28 | アルブミン分解物を用いた修飾ウロキナ−ゼ及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59175883A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04127577U (ja) * | 1991-05-13 | 1992-11-20 | 株式会社アドバンテスト | 高周波測定プローブ |
-
1983
- 1983-03-28 JP JP58050533A patent/JPS59175883A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04127577U (ja) * | 1991-05-13 | 1992-11-20 | 株式会社アドバンテスト | 高周波測定プローブ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0218066B2 (ja) | 1990-04-24 |
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