JPS59170770A - 非抗体リガンドを用いるプレ−ト上での細胞分離 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

直ＬＬ１ 本発明は一化学・生物学・生化学の分野である。 背景技術 ある種のタン・ξり宵は、高度な特異性で一般にリガン
ドと称されて℃・る他の分子と非共有結合的に結合する
能力を持つ。術語゛°リガンド゛は無定見に使用されて
おり、多くの異った意味を持つ。 ここで用いているごとく、術語°′リガントゝ″′は抗
体以外で以下の特徴を持つ分子または物惜を意味するも
のとして使用される； ■　リガンドは抗体、酵素、または細胞の表面に通常存
在するレセプターの如き、ある種のタンパク質性分子と
結合できなければならない。その結合は非共有結合であ
る。 ２、前記結合は相対的に高度の特異性を持たなければな
らない；　他の言葉でいえば−　リガンドは他の型のレ
セプターに対するより、そのレセプターに対しより高い
親和性を持つ。例えば−インシュリン分子はインシュリ
ンレセプターに結合するが−ヒスタミンレセプターには
尖角的には結合しない。 リガンド結合の一つの型には細胞表面のレセプターに対
するものがある。咄乳類の細胞はその表面に、インシュ
リンレセプターおよびヒスタミンレセプターの如き種々
のレセプターを持つ。ヒスタミンレセプターの如き多（
のレセプターはタンパク質性分子である。他の型のレセ
プターは炭化水素−レクチン糖タンパク質その他からな
る。 ヒスタミン分子が細胞と接触した場合−ヒスタミンレセ
プターと接触するまでは細胞と結合を起こさない。もし
それが起こると、ヒスタミンはりガント９どして働き−
　ヒスタミンレセプターに結合される。この結合反応が
、細胞内で起こる一つまたはそれ以上の生化学過程を活
性化または誘導する。細胞内過程が始まった後はリガン
ドはレセプターから離れ−　レセプターを他のリガント
８分子か続いて結合できるようにする。 ここで用いた如く、術語°°活性剤パは細胞表面上のレ
セプターに結合するリガンドを配述才るものとして使用
する。しかしながら、この術語は細胞内の生化学過程を
活性化するリガンドにのみ制限されるものではない；　
術語゛活性剤”はアンタゴニストおよびアゴニストを包
含し−これらの術語は以下に記述する。さらに−術語「
活性剤」は細胞レセプターに結合し、細胞過程を終了さ
せまたは抑制するリガンドも包含する。 ヒスタミン ヒスタミンは以下の構造配簡を持つ生命活動に必要なア
ミンである： ヒスタミンは種々の型の細胞から分泌され、他の細胞の
膜上のレセプターに付着する。ヒスタミンレセプターへ
のヒスタミンの付着により、１′ＩＩＩ管拡張、気管支
狭窄、胃酸の分泌およびじんましんなどを含む広範囲な
種々の生理的反応を起こしまたは悪化させる〔１〕。　
ここで用いる術語′°ヒスタミン”はメチルヒスタミン
の如き、ヒスタミンの尚換体も包含される。 ヒスタミンの効果はアゴニストに属する化合物により模
倣される［２〕。　　　ヒスタミンアゴ゛ニストとして
は２（２−ピリジル）エチルアミン、シマブリット４−
メチルヒスタミンの如き、種々の名換ヒスタミンカする
。ヒスタミンアコ゛ニストはヒスタミンレセプターに結
合する事によりヒスタミンの効果を模倣する。 ヒスタミンの効果はアンタゴニストに属する化金物によ
゛リズロックされる〔３〕。　　ヒスタミンアンタゴニ
ストにはジフェンヒドラミンおよ々シメチジンがあり、
それらはヒスタミンにより起こされる生理的効果を誘導
する事なくヒスタミンレセプターに付着し、ヒスタミン
の種々の効果をブロックする。しかしながら、高い投薬
量段階においては、イムプロミジンの如きある種のアン
タゴニストはある種の細胞にアゴニスト様効果を引き起
こす。 ヒスタミンレセプターは分子量が４０，０００から５０
．０００ダルトンの範囲のタンパク雀性分子であると信
じられている。それは２つの範噴に分割され、Ｈｌレセ
プターおよびＨ２レセプターと称される〔４〕。　　ヒ
スタミンは両方の型のレセプターに結合する。ジフェン
ヒドラミンの如きあル種ノアンダゴニストは結果として
Ｈ２レセプターをグロックするより強＜Ｈｌ　レセプタ
ーをグロックする。シメチジンなどの他のアンタゴニス
トはＨｌレセプターに結合するより強くＨ２レセッター
に、　結合する。胃酸の分泌の活性化にヒスタミンがＨ
２レセプターに結合する事が重要な役割を果たしている
と信じられている。それ故−シメチジンの如きＨ２アン
タゴニストは通常胃酸の分泌を減少させる事による潰瘍
の治療に使用される［５〕。　ヒスタミンのＨｌレセプ
ターへの結合が皮膚じんましんおよび気管支狭窄に重要
な役割を果たしていると信じられている［６〕。　　Ｈ
１遮断薬またはＨ２遮断薬でブロックされない他の範−
〇ヒスタミンレセプターの存在が推定されている。便宜
上、その様なレセプターをここではＨ３レセプターと称
する。 ヒスタミン、ヒスタミンアゴニストまたはヒスタミンア
ンタゴニスト分子がヒスタミンレセプターに結合した場
合−そのような反応をここでは特異的結合と称する。そ
れと比較して、もしヒスタミン（それはある程度反応活
性な分子である）が細胞の他の部分、試験管フィルター
またはその他の表面にくっついたり、結合した場合−そ
のような反応をここでは非特異的結合と称する。 ここで使用するヒスタミン遮断薬とは、ヒスタミンアゴ
ニスト、ヒスタミンアンタゴニストおよびヒスタミンレ
セプターに特異的に結合でき、それによりグロックされ
たレセプターへのヒスタミン分子の特異的結合を防げる
他の分子からなる原基である。Ｈ２レセプターに結合す
るより高い親和性でＨｌレセプターに結合するヒスタミ
ン遮断薬を゛’Ｈ１遮断薬”と称し、例えばジフェンヒ
ドラミン（Ｂｅｎａｄｒｙｌなる商標（Ｐａｒｋｅ−Ｄ
ａｖｉｓ　。 Ｍｏｒｒｉｓ　Ｐｌａｉｎｓ、ＮＪ）で市販されている
）がＨ１遮断薬である。さらに、シメチジンの如きＨ２
遮断薬（Ｔａｇａｍｅｔなる商標（Ｓｍｉｔｈ　Ｋ１１
ｎｅ　ａｎｄＦｒｅｎｃｂ　Ｃｏ、　、　Ｐｈ１ｌａｄ
ｅｌｐｈｉａ　、　ＰＡ）市販されている）はＨ２レセ
プターと好んで結合する。 ある種の疾病はリンパ球および他の人間の細胞上のＨｌ
およびＨ２レセプター密度の不均衡により、特徴付けら
れまたそれにより引き起こされ、あるいは悪化する。そ
の様な疾病には〜アトピー性疾病〔７〕、腫瘍性疾病〔
８〕、組織球増殖症−Ｘ

〔９〕、自己′免疫疾病（１，
０）、および他の疾病〔１１〕がある。診断研究および
そのような疾病の治療の為、種々の型の人細胞上のＨｌ
およびＨ２レセプターの存在、濃度および生化学的親和
性を決定するのは有益である。 １９１０年からヒスタミンが種々の生理的反応を起こす
事は−められていたが、ヒスタミンレセプターに関する
研究はあまり進展しなかった。組織がヒスタミンと接触
した時に起こる筋収縮、血管拡張の如き生理的応答の検
出で多くのヒスタミン研究が行われた［１２〕。いくつ
かの研究は細胞のヒスタミンとの接触により生じるサイ
クリックアデノシンモノホスファート（ｃ　ＡＭＰ）　
　の如キする種の分子の生化学的産生を検討した［１３
〕。１９６６年に−メピラミンを組織とインキュベート
するとある型の生理的応答をブロックするが、続いてヒ
スタミンと組織を接触させると他の型の応答はグロック
しない事が認められた。その結果に基づき、科学者は少
くとも２つの型の細胞膜レセプターが存在する事を示唆
し、Ｈｌおよび非−Ｈｌレセプターと称した〔■４〕。 　１９７２年に−ズリマミドがブロックするいくつかの
応答がメピラミンによりズロックされる応答と異なる事
が発見さ、ｈｊ、、＝；　　こ才１．が■−１２レセプ
ターと称される〔１５〕。　１９７２がも１９７７年の
間のほとんどの研究は生理的応答またはＣＡＭＰ刺激に
焦点をあてていた［１６］。 １９７７から研究結果は生化学的結合反応を利用するヒ
スタミンレセプター分相にっ℃・て記載するようになっ
た［１７〕。　１９７９年−０ｓｂａｎｄらばＨルセプ
ターのＤＥＡＥ−セルロースへ結合才ろ能力およびＨ２
レセプターのリン酸セルロ＝スｌ＼結合する能力に基づ
きＨｌおよびＨ２レセプターの分離および部分的な特徴
付けを報告して℃・るシ１８〕。 １９８０年、０ｓｂａｎｄらは蛍光ヒスタミン複合体お
よびフローザイトメーターを用い−（１）　　細胞が含
むＨｌおよび／または圧２レセノタ−の本η的な数−お
よび（２）　　Ｈ＋　　および／まプこはＨ２レセプタ
ーの本質的な数を含む母集団内での細胞の・ξ−セント
を決定するための方法を報告した〔１９〕。 １９８１年−０ｓｂａｎｄらはトリチウム化ヒスタミン
（放射活性がある）を用（・、レセプターを持った細胞
上のＨｌおよび／またはＨ２レセプターの数を示す方法
を報告した［２０〕。 リガンド結合 リガンド結合はアフイニテイクロマトグラフイ−を含む
種々の精製技術の基礎となるものでル〕る。 この技術におし・ては、リガンド分子は固体粒子の表面
に固定され、カラム内に充てんさ牙１ろ。タンパクａの
混合物はカラ入内の多孔性物ａを通過させる。結合した
りガントに対し特異的な親和性を持つタン・ξり憫がカ
ラノ・内に残る；他の夕：７パク（鉤はカラムを通過す
る。例えば−　ヒスタミン分子はアガロニスまたはセフ
ァロースビーズにくっつける事ができる。被覆したビー
ズをカラムに充てんし−ヒスタミンレセプターを含有″
４゛る水溶液をカラムを通す。もしくは−被覆したビー
ズを溶液と混合し細胞とインキュベーションする。溶液
中のヒスタミンレセプターがヒスタミン−被覆ビーズに
結合するようになり、一方一他のレセプターおよび他の
分子は付着しない。洗浄および／またはｐ過法により一
非結合（非ヒスタミン）レセプターをビーズおよび結合
レセプターから分離できる。 ビーズ利用法は前もって細胞膜から離さハたまたは細胞
臆断ノ１を含有する溶液に混合さ牙］て℃・ろ種々のレ
セプターの濃縮−分離またはその他の研究に使用されて
きた〔２１〕。　さらに、ビーズ利用法はその膜上にヒ
スタミンレセプターを含有する生長しうる細胞の濃縮−
分離またはその他の研究に使用されてきた〔２２〕。　
しかしながら、ビーズまたは他の小さな粒子を利用１−
ろアフイニテイクロマトグラフイーおよび他のリガンド
−結合法はプレートと比較するといくつかの欠点がある
。 ここで用℃・る術語゛′プレート″゛または゛′プレー
ト表面゛′は特別の拘留ではないどんな固体表面をも意
味才ろ。プレート表面は平面またはわん曲しており、表
面の生目は滑らかまたは不規則である。 プレート表面は見えろ程度の大きさでなくてはならず（
例えば−直径１ｃｒｎまたはそれ以十）また題微鏡の如
き特別な令１属品を用（・ずに操作できろ。 一つのプ□レ−１・または他の器具上または内に多数の
プレー　ト表面が存在しなければならない。例えば、ミ
クロ滴定プレートにお（・では各々のミクロ滴定ウェル
がプレート表面とみなされる。 一般に、プＬ−−−１−（培養皿およびミクロ滴定プレ
ー　トの如きもの）はビーズまたは充てんカラムより簡
単に操作、滅菌および調節しやすい。プレート結合分析
はビーズを用いろ分析より通常より速かに実施できる。 プレートからよりビーズから結合細胞（それは通常最も
興味ある細胞）を除去する事がより困難である。これら
およびその他の理由から、細胞を分離する為には−ビー
ズよりむしろプレートを利用する方が非常眞著しい利点
がある。 プレートに抗体を結合させて平らなプレート上で細胞を
分離する努力がなされてきた〔２３〕。抗体は細胞の表
面上で抗原と結合するように産生または分泌される。細
胞の懸濁液を抗体＝被覆プレートと接触させると、適切
な抗原を持つ細胞がプレート上の抗体に結合するよう如
なる。 しかしながら−抗体およびレセプターアクチベータの間
には重要な相違がある。抗体は分子量が１万から１０万
ダルトンの大きなタンパク雀性分子であり；　反対に、
ヒスタミンは分子量１８４ダルトンのみの小さな分子で
ある。それ故−ヒスタミンの如き小さなリガンドは溶液
中で細胞と接触できるように固体表面から十分離れて広
がる事ができない。この問題はしばしばビーズおよびリ
ガンドの間にパス−投−サー”分子を使用する事により
軽減さ武る［２４〕。 抗体結合およびリガンド結合の他の相違は抗体は抗原に
非常に堅固に結合する傾向がある事に関連する；　抗原
−抗体複合体は通常その成分が１ヱ、二弘で生分解され
るまでは分離されず、また４ｙ　ビトロ　で化学または
物理的手段により分離される。反対に、しぜブタ−活性
剤はレセプターにほんの短い期間（数秒またはそれ以下
の如＜）シか結合しない。多くの活性剤は細胞分離分析
が完了する前に−かなり速かにそのレセプターから解離
する。この問題はヒスタミンおよびアセチルコリンの如
き小さな活性剤に関しては特にきびしく、インシュリン
の如きタンパク負性レセプクーの如き大きなものに関し
てはあまりきびしくないと信じられている。 これらのおよびその他の理由のため一抗体を利用する細
胞−結合プレート技術をプレートに結合したヒスタミン
または他の小さな活性剤を用いる同様の技術には簡単に
変換できない。 光１１四ｉか一 本発明は細胞が小さな分子リガンドを結合するレセプタ
ーを含有するかどうかに依存し、プレートを利用して細
胞を種々の範噴に分離する方法−および本発明の方法を
利用するアッセイキットに関連する。簡単には、この方
法は以下の段階から成る： ａ、適当な数のヒスタミンまたはヒスタミン遮断薬の如
きリガンドをここで゛′キャリア″と称する相対的に大
きな分子と結合してリガント複合体を形成し； ｂ、プレート表面に適当な数のりガント複合体を固定し
： Ｃ０ＩＪガント特異性レセプターを持つ細胞がプレート
上に被覆したリガンド複合体と結合するような条件下、
被覆プレートを細胞の懸濁液と接触させ； ｄ、すべての結合細胞を実質的に除去する事なく非結合
細胞を除去するのに十分強い力で非結合細胞を除去する
。 もし望むなら一結合細胞は更に分析の為いくぶん強い力
で続いて除去できる。本発明の検定用キットは前に記載
したりガント複合体で被覆したプレートから成る。 本方法の有用性を確認する為、レセプター陽性または陰
性に分類された種々の細胞集団をより精巧な技術である
フローサイトメーターを用いレセプター含量を分析した
。どれらの実験の結果は（１）本発明の方法はすべての
型のレセプターの分析で、５％またはそれ以下のレセプ
ター陰性細胞を含む細胞の集団までレセプター陽性細胞
を分離する事かでき−および 」− （２）本発明の方法はＨｔＲまたはＨ２Ｒ＋細胞の集団
を少くとも４倍の率で濃縮できる。 本発明は℃・くつかの重要な利点を持つ＝１、小さいビ
ーズまたは粒子を使用する充てんカラムまたは他の器具
よりむしろプレートを用いて細胞を分離する事ができる
。 ２、そのレセプターに強く結合しない小さな分子リガン
ドを利用する事ができる。 ３、　レセプターを持たない細胞から分離した後のレセ
プターを持った細胞は生存できる。 固体表面から分離した後それらは生存でき、しかも機能
的でブロックされていないレセプターをたくさん保持し
ている。 本発明の一つの良好な具体例においては一ヒスタミンお
よび２つのヒスタミン遮断薬を使用し細胞を以下の範噴
に分離する： ＨＲ＋細胞：ヒスタミンレセプターを持つ細胞ＨＩＲ＋
細胞：Ｈルセプターを持つ細胞Ｈ２Ｒ＋細胞：Ｈ２レセ
プターを持つ細胞これらはほとんどの研究者にとって最
近最も興味ある範晒である。以下に議論するりガント複
合体を用い以下の範墳に細胞を分離または同定する事も
また可能であろ： ＨＦ１−　細胞：ヒスタミンレセプターを持たない細胞
ＨＩＲ−細胞：ヒスタミンレセプターを持つがＨｌレセ
プターを持たない細胞 Ｈ２Ｒ−細胞：ヒスタミンレセプターを持つがＨ２レセ
プターを持たない細胞 ＨＩＲ２Ｒ−細胞：ヒスタミンレセプターを持つがＨｚ
、またはＨ２レセプターを持 たなし・細胞 リガント９複合体はヒスタミン、ジフェンヒトゝラミン
（Ｈｌ　遮断薬）またはシメチジン（Ｈ２遮断薬）をキ
ャリア分子（ヒト　アルノミン（ＨＡ）　）に結合して
製作する。約５−〇から１’００のヒスタミンまたは遮
断薬分子を各々のキャリア分子に加える。 ここで用いる°゛キヤリアまたは′°キャリア分子″は
約１０．０００ダルトン以上の如き相対的に大きな分子
量でそれに対し多数のりガント分子か結合するような分
子を称する。キャリア分子はアルノミンーホリリジンま
たはポリメチルメタアクリラートの如き、タンノξり個
性−ポリベプチドまたは１合体分子である。 リガンド複合体をリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）に希釈し
、プラスチック（ポリスチレン）プレートと接触させ、
−夜インキユベートする。過剰の液体は注いで除く；そ
れは貯蔵および再使用できる。 プレートは２度ＰＢＳで洗浄すると即座に使用可能であ
る。もし望むならそれを乾燥１．、も（−望むなら凍結
して後での使用のため貯蔵する。もし望むならゼラチン
の如き物置と接触させ一非特異的結合の量を減少させる
事ができる。 細胞の懸濁液をプレートと接触させる。細胞はＰｂＳま
たはＲＰＭＩ　１６４０の如き種々の培養培地の如き種
々の液体に懸濁できる。もし望むなら牛胎児血清（ＦＢ
Ｓ）の如き一つまたはそれ以上の血液成分如き種々の物
質で液体は補われる。本発明に使用する液体または液体
補充物の適性は当事者によるルーチンの実験を通して決
定される。 細胞は適当な温度で適当な期間被覆したプレートとイン
キュベートして接触させる。以下に記載する実験におい
ては、５７℃で１時間インキュベルジョンを実施する；
もし望むなら両方の・ミラメータを変化さぜる事ができ
る。もし多量の懸濁液を用いるならばインキュベーショ
ン期間を延長し一細胞がプレートと接触できるようにす
る。 プレートはその後ＰＢＳの如き適当な液体で洗浄し、細
胞を除去する。典型的な洗浄系は以下の如〈実施する。 ３７℃のＰＢＳをプレー　１・に緩かに加える。もし望
むなら、レセプター陽性細胞のリガンドへの結合を促進
すると信じられて℃・るカルシウムおよびマグネシウム
をＰＢＳに含ませろ。 プレートを緩かに渦を巻くように動が才。　ＰＢＳを７
４Ｅいで除く；　この洗液中の大多数の細胞はヲル−ト
士のリガンドの型に★１して髄異的なレセプターを尖角
的に持だな（・。例えば−もしプレー　トがヒスタミン
−〇Ａ複合体で被覆されてい北は一第一の洗浄で除去さ
ｆする細胞はＨＲ−細胞てホ）ろうし；もしプレー１・
がジフェンヒ）パラミ／複合体で被覆されていれは、第
一の洗浄で除去される細胞はＨｌ、Ｒ−細胞であろう。 もし望むならこれらのａ胞は更に分析できる。 ＣａおよびＭｇ含有温ＰＢＳでの続いての洗浄はもし望
むなら実行する。　ＰＢＳをプレート上で渦巻くように
した後注いで除き一細胞計数器で分析し、どの程度の数
の細胞を含んで℃・るか決定する。 割数細胞数がプレートと接触させた細胞の数の約５％の
ような前もって決定されていた値以下に落ちたら、この
一連の洗浄を中止する３、もしくは、固定回数の洗浄を
実施する。前もって決定才る値または洗浄の回数は細胞
に意図寸ろ次の使用または分析に依存才ろ；　例えば−
もし分離の目的か比較的純粋なレセプター陽性細胞を得
る事であＪｌば、多数回の洗浄を実施する。前記の一連
の洗浄が完全となった後−その洗浄中プレートに結合し
て残っていた細胞を除去する。こねは、軟かい端（例え
はゴムスパテル）を持つ器具でプレートを緩かにかきと
るようないくつかの手段により達成される。Ｃａまたは
Ｍｇを含有しない冷（４°Ｃ）ＰＢＳを使用する。渦巻
きを起こすかまたは液体をジェット気流で噴射するよう
な激し℃・かきませを用いる。良好な方法は細胞に意図
する次の使用または分析に依存する。 本発明の精度は一目的の集団中の非均−な細胞の分画ま
たは数に相関している（例えは、ＨＲ’集団中のＨＲ−
細胞の分画または数）。より太きがな程度では、本発明
の精度はまた廃棄される洗液中にあり洗浄で捨てられる
目的の細胞の数にも関連する。両方の因子に関して、本
発明の精度はカラム分離またはＦＡＣ８の如きより複雑
な方法の精度よりい（らか落ちる傾向である。しかしな
がら。 本発明の利点は一低コスト、より速やかな実施および非
常な簡単さおよび便利さで表現され、わずかに精度が落
ちる欠点を十分に補って余りある。 いくつかのパラメータが本発明の方法の良好な実施には
重要である。それは： １　キャリア分子当りのりガント分子の数。この比は結
合反応の間のりガント分子のキャリア分子に対する比を
変化させ、および結合反応のインキュベーション期間を
変化させるようないくつかの手段で調節する事ができる
。特定の使用の為の理想的なリガンド／キャリア比は〜
　リガンド分子の型、キャリア分子の型、および分析さ
Ｊする細胞の型などのいくつかの因子に依存している。 一般に、もしリガンド／キャリア比が非常に低ければ〜
緩かな洗浄でもレセプター陽性細胞がプレートから離れ
易くなりそれは望ましくない。もしリガンド／キャリア
比が非常に高いと、レセプター陰性細胞がプレートにく
っつき易くなり、それもまた望ましくない。特定の使用
の為の至適リガント９／キヤリア比はルーチンの実験を
通して決定する。記載した実験においては、約５０から
約１００のヒスタミンリガンド分子を各々のアルブミン
キャリア分子に結合した。 ２、　プレート表面の単位面積当りのりガント複合体の
数。もし−濃度が非常に高ければ、レセプター陰性細胞
がプレートに接着し易く一一方もし濃度が非常に低けれ
ば、レセプター陰性細胞がプレートから離れ易くなる。 この濃度は、プレートと接触するリガンド複合体の数を
変化させたり、プレートを注ぎまたはすすぐ前の接触時
間の変化させたりするいくつかの手段で調節する。特定
の使用のための至適濃度はルーチンの実験を通して決定
する。 ３　プレートの組成。多くの型のプラスチックおよび種
々の結合特性を持つ他の化合物は当事者には知られて℃
・る。さらに、種々の官能基を持つ分子でプラスチック
および他の表面を被覆する方法も当事者には機知である
。特定の型のりガントの使用のための至適なプレートの
型および／または被覆はルーチンの実験を通して決定さ
れる。 実施例 実施例１ニリン・モ球の調整と固定 ヒトリンパ球は防腐剤なしのヘパリン中に採取した血液
試料からリンパ球分離培地（Ｂｉ○ｎｅｔｉｃｓＬａｂ
の製品、　Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ　、　ＭＤ）を用（・
遠）し・分離により分離した。Ｔ細胞はリンパ球をヒツ
ジ赤血球とロゼツト形成させて単離した。℃・（つかの
細胞は１％ホルムアルデヒド゛含有リン酸緩衝塩溶液（
ＰＢＳ）中に懸濁して固定した。新鮮な細胞は調整して
６時間以内に使用した；　固定細胞は４℃にて使用する
まで貯蔵した。 ヒトアルブミンを水に溶解しく２５ｇアルスミン７１０
０ｍ１溶液）−０，０２Ｍナトリウムコピリラートおよ
び０．０２．Ｍナトリウムアセチル−ＤＬ−）ＩＪプト
ホナー）　（Ｍａｓｓ、　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ−ｉｅｓ、　Ｂｏ′Ｆ３ｔｏｎ　
ＭＡ）で安定化する。ヒスタミン２塩酸塩（Ｓｉｇｍａ
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　、　Ｓｔ、Ｌｏｎｉｓ　
ＭＯ）オ６よび結合剤、１−エチル−３（３−ジメチル
アミノ−プロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＣＤＩ
）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）の量を変
化させて５ｍｅのアルブミン溶液に加える。この過程の
間−ＥＣＤＩとヒスタミンの比（ｍ９／ｍ９）は約１０
：１に保持する。 ヒスタミン２塩酸塩のアルブミンへの結合は室温で２時
間で進行する。トリチウム化ヒスタミントレーサー（Ｎ
ｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｂｏｓｔｏｎ
ＭＡ）を−アルブミンに結合したヒスタミンの量をモニ
ターする事を可能にする為あるノミッチに加える。結合
反応に続いて一各々の溶液はろ００倍量の水に対して２
度−３００倍量の普辿の生理食塩水に対して１度透析し
一非結合のヒスタミンおよびＥ　Ｃ’、ＤＴを除く。、
すべての透析は撹拌下４℃にて９０分間実施する。溶液
は使用前に生理食塩水中最終アルブミン濃度を３．３　
ｍ９／ｍｉ　Ｋ調整する。もし貯蔵したい時は結合液は
凍結乾燥１２、希望のアルプレ濃度＜２０ｍｇ７ｍ１の
如き）に再び懸濁する。 ヒスチジンまたはヒスチジン遮断薬なしの標章ヒトアル
ブミンはＥＣＤＩと反応し−　ＨＡＣ複合体と同一の方
法で処１里した。 実施例３：アルノミンーゾメヂジン複合体の調整４００
７−’ｌの２５％ヒト血清７　／ｌ、ノミン（１００ｍ
Ｌ？ノアルズミン）を４６ｍ１のＰＢＳに混合する。温
度を４°（じに減少させる。２００ｍ９のＥＣＤＩを溶
液に溶解し、４℃で５から１０分間イン痺ユ挾−トする
。 ２５０ｍ９のシメチジｙ　（ｓｍｉｔｈ　、　Ｋｌ〕ｎ
ｅ　ａｎｄＦｒｅｎｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　
、　Ｐｈ１ｌａｄｅ］、ｐｈｉａ　ＰＡ）を７５０＃　
０）　ＩＮ　Ｈ○］ｉＣ溶解し、ＩＮ　ＮａＯＨテ「〕
ト１７４ｉＣ調整″′４′７．）。シ・メヂジンお、に
びアルブミン溶液を室温で混合し７．２時間インギュベ
ートする）。混合物は４℃で蒸留水に対して２度、ふダ
よひＰＢＳに対して透析する。最終溶液は６．５　ｍｌ
の溶液にＩ　Ｑ　Ｑ　ｍ、ｑのアルブミンを含有する。 ヒト血清アルブミン（実施例１に記載した）をＰＢＳで
希釈１．５％アルブミンの溶液をつくる。２ＳのＥＣＤ
Ｉを２ｍｉの５％溶液に溶解する。１ｇの・；エノエ：
６′ヒ）・ゞラミン塩酸塩（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｒｎｉ
ｃａＪＣｏ、　、　ｓ　ｔ、　Ｌｏｕｌｓ　−Ｍｏ）お
よび２ｍｅの生理食塩水を加える。溶液を混合し、室温
で２時間インキュベー１・（〜、その後４℃で蒸留水に
対しで２度透析し、ＰＢＳに対して透析する。最終溶液
（ｊ、約５ｍｌの溶液に約１００ｍ９のアルブミンを含
有する。 ”　流側５　’　：　＋）ガント゛複合体のプレー　ト
ヘノ結合□ リガン）パ複合体は前記実施例２，３および４　Ｋ記載
したように製造する。これらの複合体をポリスｆ　ｌ／
　７　コー＝ンｌ　ｉ　ＯＯｍｍ、Ｍｉ　織培養フレー
ト（Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏ、　、　
Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）と接触させる。プレー　
ト＋ｉ、−夜インギュベ−１−する。過剰の液体は注し
・で除き、ブ１／−トを細度ＰＢＳで洗浄−オる。 もし望むなら、リガンド分子を含有しない０１％ゼラチ
ン溶液または１％牛血清アルブミン溶液の如きタンパク
儒含有溶液とプレートを接触ぜしめろ。この段階の目的
（」１、リガンド複合体で被覆されていないいかなる露
出プラスナック表面をも？ＪＵ８才る事である。こねに
、より）□レー　トへの非特異的結合か減少寸ろ。 実施例６：細胞のプレー　１−への結合実施例１で記載
した如（調整した細胞をＲＰＭ工培養垢地に懸濁し、７
％熱熱情活性化４＝胎血清、２　ｍＭ　　カルシウムお
よγ、）”ｌ　ｍＭ　マグネシウムを補充」゛る。ｌ璧
ｌ蜀液はもし望むな「）希釈またはｐ過に。Ｌり約４ま
たは５百万１細胞／　ｍｅ　ｏ、）　ｇ４度に調整ｌ−
る３゜懸濁液を実施例５に記載ｌ、たりガント゛桟合体
で被〜したブし・−トと１０’Ｏｍｍ、　ｉ１径の一プ
レー１・当り約６から６千力の接触密度て接触ぜしめろ
。プレートは３Ｚ℃で１時間インキュベー　ト寸イ）。 以−トの実施例反応に記載」−ろ如く℃・くつかの拮抗
的結合反応を実施した。Ｈ２レセプターを持つ細胞の数
を決定」〜る為、過剰量のジフェンヒト゛ラミン塩酸塩
（アルブミンの如きタンパク勿に結合しな（・）の如き
Ｈ１遮断薬を細胞懸濁液に混合する。ジフェンヒドラミ
ンは細胞上のほとんど０）Ｈｌレセプターに結合するよ
うになるが−　Ｈ２レセプターは露出して残す。Ｈｌレ
セプターがブロックされてい金ので非−Ｈｌレセプター
（主としてＨ２レセプター）がプレートと結合するよう
に゛なる。 他の実験ではＨｌレセプターを持つ細胞の数を決定する
為過剰のシメチジンの如きＨ２遮断薬を利用する。 もしくは、もしジフエンヒ＋□’ラミンからなるリガン
ド複合体がプレートに結合して℃・るなら−Ｈルセフ゛
ターを持つ細胞のみがリガンド複合体に結合する。 実施例７：プレートからの細胞の除去と分イヲＩＰＢＳ
洗浄により大多数の非結合細胞をプレートから除去し一
一方大多数の結合細胞はプレー　トに結合したま瓦桟る
。典型的な洗浄過程は以下の如〈実施する：　　２ｍＭ
　Ｃａ、　１ｍＭ　Ｍｇおよび７５％牛脂児血清を含む
７ｍｌの暖い（ろ７°Ｃ）ＰＢＳをピペットでプレート
に加える。プレートを渦巻き状に動かし、ＰＢＳは注い
で除く。洗浄を繰返す。各々のりＢＳ洗液中の細胞の数
を細胞割数器で計数する。洗液の細胞数がプレートに接
触させた細胞数の５％以下になったら洗浄を終了する。 洗液により洗い流されたすべての細胞はＨＲ−細胞と見
なされる。細胞はＭ、０ｓｂａｎｄら（Ｂｌｏｏｄ　、
’　Ｖｏ、　５６＋Ｎ０５：９２ろ−９２５（１９８０
））により記載されたフローサイトメトリー法により分
析する。 ＰＢＳ洗浄完了後プレートにに１定さ」を残存して（・
る細胞はプレートをＣａまたはＭｇを含有しなし・冷（
４℃）　ＰＢＳ　　に浸し、載がいゴム製パステルで緩
かにプレートを削る。これらの細胞は前記のフロサイト
メトリー法により分析する。 これらの実験の結果は〜異った種類の細胞上のヒスタミ
ンレセプターの数の間には多くの変化が存在したけれど
も一本発明の方法は分析したすべての型のレセプターに
対し、５％またはそれ以下のレセプター陰性細胞を含有
する集団へレセプター陽性細胞を確実に分離できる事を
示唆した。さらに、本発明の方法は集団中のＨｔＲまた
はＨ２Ｒ細胞の集団を少くとも４倍確実に濃縮できる。 産業上の利用の可能性 本発明は細胞表面上のレセプターを分析し特徴イ」ける
方法を簡素化する産業上の利用の可能性を持つ。 均等の範囲 当部者はルーチンの実験をするまでもなくここに記載し
た特定の装置および過程の多くの均等物を認めまたは確
認才ろ事ができる。そのような均等物は本発明の範囲内
と考えられ、特許請求の範囲に含まれる。 参考文献 ■　例えばＴ、Ｏ，Ｙｅｌｌｉｎ、　　編集−ヒスタミ
ンレセプター、ＳＰ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ａｎｄ　５ｃｉ
ｅｎｔｉｆｉｃＢｏｏｋｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１
９７９）を参照せよ。 ２、例えば　Ｍ、Ｅ、　Ｐａｒｓｏｎｓら−”　３−　
［４（５１−イミダゾリル〕プロピルグアニジン−ヒス
タミンＨ２レセプターにおける部分部アゴニスト″Ａｇ
ｅｎｔｓ　Ａｃｔｉｏｎｓ　５　：４６４（１９７５）
を参照せよ。 ３　例えばＪ、Ｗ、　Ｂｌａｃｋら−“°メチアミド−
経ロ活性を持つヒスタミンＨ２レセプターアンタゴニス
　ト　”　＋　　Ａｇｅｎｔｓ　　Ａｃｔｌｏｎｓ　　
３　　：　　１ろ３−１３７（１９７３）を参照せよ。 ４　例えばＭ、　０ｓｂａｎｄら、°′子牛胸線細胞膜
からのヒスタミンＨ１およびＨ２レセプターの分離と部
分確認”　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４　：　
　９９７０＝９９７２（１９７９）を参照せよ。 ５　例えばＲ，Ｒ，５ｃｈａｄｅ　”医者はどのように
シメチジンを使用するか′″、Ｎ、Ｅｎｇ、Ｊ、Ｍｅｄ
、３０４　：１２８１−１２８４（１９８１）を参照せ
よ。 ６　例えば　Ａ、Ｓ、Ｆ、　Ａｓｈらパヒスタミン℃・
＜つかのレセプター媒介作用”　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｐ
ｈａｒｍａ−ｃｏｌ、　　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐ、　
　２７　　：　　４２７−４６９（１９６６）を参照せ
よ。 ７　例えば　Ｊ、Ｄ、　Ｍａｒｔｉｎｅｚらアトピー性
問題における非特異性抑制細胞機能”　Ｊ、Ａｍ、にｌ
ｉｎ。 Ｉｍｍ、６４　：　４８５（１９７９）を参照せよ。 ８　例えば　Ｂ、　５ｃｈｅｃｈｔｅｒ、　”　腫瘍を
持ったマウスの碑臓内のリンパ球増加′”−１１ｔ、、
Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ２０：２６９（１９７７）を参照せよ
。 ９、　　Ｍ、Ｅ、　０ｓｂａｎｄ、　　”組織球増殖症
−ｘ　”、Ｎ、　　Ｅｎｇ、　　Ｊ、Ｍｅｄ、　　ろ０
４　：　　１４＜Ｓ−１５６（１９８１）。 １０、　Ｗ、ＤｅＣｏｃｋら−゛アレルギー自己免疫症
または回帰感染の患者のヒスタミンレセプターを持つ７
９７２球”、Ｃ１１ｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｉｍｍｕ
ｎ−旺とユニ１１　：　１　（１９７８）。 １１　例えば　Ａ、　Ｇｕｐｔａ、　”−次免疫欠乏お
よびリン・ξ球増殖障害におけるヒトリンパ球皿集団の
マーカー′″、Ｓｅｍ１ｎ、　Ｈｅｍａｔ、　　１７　
：　１　（１９８０）を参照せよ。 ３６−５１　（Ｓ、Ｃａｒｇｅｒ、　Ｂａ５ｅ１．５ｗ
１ｔｚｅ’ｒｌａｎｄ。 １９７８）を参照せよ。 １３例えは−Ｈ，Ｓｈｉｍｌｚｕら“太脳皮儒からのス
ライスにおけるＡＭＰ形成に対するヒスタミンおよび他
の化合物の影響＋＋−Ｊ、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ１７　：　４４１−４４４（１９７０）を参照せよ。 １４．　Ａｓｈらの前記文献６を参照せよ。 １５、　Ｊ　、Ｗ、Ｂｌａｃｋら一′°ヒスタミンＨ２
レセプター＝の定義および拮抗作用”　＝　Ｎａｔｎｒ
ｅ　２５６　：ろ８５−３９０（１９７２）。 １６、　Ｙｅｌｌｉｎの前記文献Ｉを参照せよ。 １７、　Ｓ、Ｊ、Ｈｉ、１１ら−　゛°腸平滑筋のヒス
タミンＨ２レセプターに対する　Ｈ−メピラミンの特異
的結合″、Ｎａｔｕｒｅ　２７０　：　ｐ、　３６１−
３６３（’＋９７７ＧＷ、Ｐ、Ｂｕｒｋａｖｄ　、　”
脳におけろヒスタミンＨ２レセプターと　Ｈ−ンメチジ
ンとの結合゛′−Ｅｕｒｏ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏ１．
５０　：　４４９−４５０（１９７８）。 １８、０ｓｂａｎｄら一前記文献４゜・１．９．　Ｍ、
Ｅ、０ｓｂａ、ｎｄら−°°ヒスタミンレセプターを持
つリンパ球のフローザイトソトリー分析技術″Ｂｌｏｏ
ｄ　５６４Ｉ−５：　９２３−９２５（’１９８０）２
０、　’Ｍ、Ｅ、　０ｓｂａｎｄら−　゛す７２球上の
特異的ヒスタミンＨ１およびＨ２レセプターの生化学的
分析°゛、Ｂｌｏｏｄ　５８　ｉ　１　；　８７−９０
（１９８１）。 ２１　例えはＰ、　Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ、　Ｐｒｏ
ｃ、Ｎａｔｌ。 Ａｃｏｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　６９　：　１２７７（
１９７２）を参照せよ。 ２２、　Ｙ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら＋　１小さな内因性
ホルモンの為の特異的白匍球レセプター”　Ｊ、　Ｃ１
１ｎｉｃａｌ工ｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　５２　：　
１３４９−１３６１（１９７３）　；に、Ｌ、　Ｍｅｌ
ｍｏｎら−　゛′不溶化内因性ホルモンへの接着による
特異的抗体〜形成マウス細胞の分Ｎ１”　Ｊ、Ｃ１１ｎ
ｃａｌ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　５ろ：２２−ろ
Ｏ（１９７４）。 ２３例えは、Ｌ、Ｊ　、Ｗｙｓｏｃｋｉら〜・・す、パ
球ｏＨ，：めの１１パニングｌ！：細胞選別の方法”　
　Ｐｒ、ｏｃ。 １’Ｊａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５
　＃６　：　２８４４−２８４８（１９７８）を参照せ
よ。 ２４例えは、Ａ、Ｌ、　Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、生化学　
第２版。 １６９．８２１（Ｗｏｒｔｈ　　Ｐｕｂｌ、、Ｓａｎ　
　Ｆｒａｎｃｉｓ＋ニーｏ　　Ｃ八。 １９７５）を参照せよ。 特許出願人　　トラスティーズ・オノ・ボストン・（外
４名） 手　続　補、正　書（方式） １事件の表示 昭和す年びま詩願第　２Ｓ−２３１＞ｆ号・ＩＬ　才／
ｉ　イ矛　シーＪ７−１−　　丈　７月　い　３　フ゛
　１．、−１〜　上　２　ノン１”！’　１１’２２　
′７ｉ　、雄 ６、補正をする者 事件との関係　　　出　願　人 住所 Ｇ　＜ｉ、’ｒ、　ｌ−ニア１２９＜　−７”−Ａ−７
叶スｈ　ンユニハー〉アイ ４代理人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｉ、　ａ、　リガンド複合体（各々の前記リガンド複合
   体は一つまたはそれ以上のりガントが一つまたはそれ以
   上のキャリア分子に結合している）で被覆したプレート
   表面を細胞懸濁液（少くともそのいくらかは前記リガン
   ドに特異的に結合するレセプターを含有する）と前記リ
   ガンドが前記レセプターに結合するような条件下接触さ
   せ； ｂ、前記リガ／ド複合体妊結合゛しているすべての細胞
   を除去するには十分強くない力を使用し、前記リガンド
   複合体に結合して（・ない細胞を前記プレート表面から
   除去する 以上の段階から成る細胞を分離する方法。 ２　前記キャリア分子がアルゾミンである特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３　前記リガンドが約１，０００未満の分子量を持つ特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ４　前記リガンドがヒスタミンレセプターに特異的に結
   合する特許請求の範囲第１ＪＪｌ記載の方法。 ５４　　前記リガンドが以下の群より選択される特許請
   求の範囲第１項記載の方法： ヒスタミンージ７エンヒトゝラミンおよびシメチジン。 ６　約５０から約１°ＯＯのリガンドが各々のキャリア
   分子に結合している特許請求の範囲第Ｊまたは第５項記
   載の方法。 ７　前記プレート表面をリガンド複合体で被覆し、前記
   プレート表面を細胞と接触させる前に続いてプレート表
   面への細胞の非特異的結合を最小にするような物質と接
   触させる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ８　前記物質が以下の群より選択される特許請求の範囲
   第７項記載の方法： ゼラチンおよびアルノミン。 ９、リガンド複合体（各々の前記複合体は一つまたはそ
   れ以上のリガンドが−っまたけそれ以上のキャリア分子
   に結合している）で被覆したプレート表面を有する細胞
   分離用装置。 １０、　ａ、　リガンド複合体（各々の前記複合体は一
   つまたはそれ以上のりガントゝが一つまたはそれ以上の
   キャリア分子に結合している）で被覆したプレート表面
   ； ｂ、前記リガントゝの一つまたはそれ以上に％異的に結
   合できる一つまたはそれ以上の分子を含む一つまたはそ
   れ以上の溶液 以上の構成要素から成る検定用キット。