JPS59160759A - 液体クロマトグラフイにおけるグラジエント装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体クロマトグラフィにおけるグラジェント
装置に係り、特に略１ｍβ／分以下の流量において実施
されるセミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィにおいて
、相異なる溶媒の濃度が経時的に変化する溶離液を効果
的に調整し得る装置に関するものである。

近年、化学、生物、医学等の分野において、注目を浴び
ている分離、分析手段の一つとしての液体クロマトグラ
フィにおいては、分離カラムから目的とする物質を効果
的に溶出せしめるために、／８離液として一種類の溶媒
より、相異なる２種或いはそれ以上の溶媒を用いる手法
が採用されてきており、特にその一つとして、相異なる
溶媒を混合せしめ、且つその混合比率を経時的に変化せ
しめて分離カラムに供給する勾配溶出（グラジェント）
法が注目を浴びている。また、一方では、かかる液体ク
ロマトグラフィは、その用途上の要請から、５０ｋｇ／
ｃｎ＋以上の、更には１００　ｋｇ／　ｃｒｌ＋を超え
る高圧下で溶離液を迅速に分離カラムに流して、微量の
試料を効果的に高速分離せしめる高速液体クロマトグラ
フィ　（ＨＰＬＣ）として開発されてきている。

ところで、このような液体クロマ１−グラフィ、特に高
速液体クロマトグラフィにおける勾配溶出を行うために
従来から用いられているグラジェント装置には、高圧混
合型のものと低圧混合型のものとがあるが、これらば１
町れも溶離液流量がほぼ１　ｍ　ｌ　／分易上の場合を
対象とするものであって、セミ・ミクロ高速液体クロマ
トグラフィのように、溶離液流量が１ｍβ／分以下、更
には３００μβ／分以下の場合には、何れのタイプの装
置においても実用にならないほど大きな問題を生ずるこ
ととなる。

すなわち、高圧混合型の場合には、例えば特公昭５０−
１９９５９号公報等に示されている如く、２台のポンプ
の流量比を変化させｔ勾配溶出を行うものであるが、こ
の方式では溶媒混合比が大きい場合、例えば１００μβ
／分で９９：１の混合比を採用するとき、ポンプの、ｖ
、、Ｍ比は９９μｐ、／分：１μｌ／分となり、このた
め超低流量を正確に送液するポンプが必要となるのであ
って、これは技術的には非常に困難なことから、システ
ムとしてば経済的ではなかったのである。

また、他方の低圧混合型の装置においては、例えは特公
昭５６−’３３６６４号公報等に示される如く、１台の
ポンプと混合用比例バルブを使用して勾配溶出を行うも
のであるが、かかる混合用比例バルブからポンプを含め
たデッド・ボリュームは可及的に小さく為され得たとし
ても、２〜３ｍｐ程度の存在は避けられず、このままで
はグラジェントプログラムを開始してから分離カラムに
プログラムされた混合溶媒が達するまでに、２０〜３０
分も時間がかかることとなることから、全く実用的では
なかったのである。しかも、この種のタイプのデッド・
ボリュームを実用上許容し得る２〜３分の遅れに対応す
る２００〜３ｆ００μｇ以下とすることは、そこで用い
られるポンプの構造」二極めて困難であるのであり、ま
たポンプのワンス１〜ローク当りの吸引量が５０〜１５
０μｌであることを考えると、スムーズなグラジェント
曲線が描かれるように２種の溶媒を混合することは、不
可能であったのである。けだし、比例バルブでグラジェ
ント混合される溶媒は、ポンプに５０〜１５０μｌの分
だけ溜め込まれて徐々、に送液されることとなるので、
実際には滑らかなグラジェント曲線を描くのではなくて
、５０〜１５０μβ毎のステップ状のグラジェント曲線
を与えることとなるからである。

また、特公昭５４−２０１５７号公報には、移動相（溶
離液）の吐出・流量が約１０μｐ／分程度或はそれ以下
の、流量の極めて少ない領域で行われるマイクロ高速液
体クロマトグラフィに用いられる勾配溶出方式として、
所定の勾配管内に所定の濃度勾配をもった溶離液を収容
せしめた後、かかる勾配管を分離カラムに接続せしめて
、該勾配管内に保持されている、濃度勾配を有する溶離
液を、該カラムに供給しようとするバ・ノチ式手法か明
らかにされているが、このような方式は流量の少ないマ
イクロ高速液体クロマトグラフィでは可能であるものの
、それよりも多量の流量、換言すれば溶離液量の必要な
セミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィでは技術的にみ
て非常に困難であり、また溶離液の濃度勾配の正確性に
問題を生じ、しかも′勾配管内に所定の濃度勾配を有す
る溶離液を収容するための時間が必要となり、これが分
析時間が長くなる問題を派生し、更に、勾配管と分離〜
カラム等との接続、分離操作を頻繁に行わなければなら
ないことから、操作が極めて面倒となる問題も内在して
いるのである。

ここにおいて、本発明は、かかる事情に鑑みて為された
ものであって、その目的とするところは、液体クロマト
グラフィにおけるグラジェント装置、特に、セミ・ミク
ロの領域における液体クロマトグラフィのためのグラジ
ェント装置を提供することにある。

また、本発明の目的は、相異なる溶媒の混合率を経時的
に変化せしめて、所定の液体クロマトグラフィ装置の分
離カラムに連続的に供給し得る、簡単な構造のグラジエ
ンｌ−装置を経済的に、安価に提供することにある。

そして、これらの目的庖達成するために、本発明に係る
グラジェント装置は、ｆａ）グラジェント開始時の開始
溶媒を収容する第一の貯槽と、（ｂ）グラジェント終了
後の終了溶媒を収容する第二の貯槽と、（Ｃ１前記第−
及び第二の貯槽から、それぞれ開始溶媒及び終了溶媒を
吸引し、所定の液体クロマトグラフィ装置の分離カラム
に接続された流路に吐出せしめるポンプ手段と、（ｄ）
該ポンプ手段の上流側の流路に設けられ、該ポンプ手段
によって前記第−及び第二の貯槽から吸引される開始溶
媒及び終了溶媒のうち何れか一方のみを該ポンプ手段側
に導くように切り換える切換バルブ手段と、（ｅ）前記
ポンプ手段の上流側若しくは下流側の流路上に設けられ
、収容された前記開始溶媒に対して前記終了溶媒を混入
せしめて経時的に濃度変化する溶離液を形成する、攪拌
機構を備えた溶離液溜とを、含むことを特徴とするもの
である。

従って、かくの如き本発明によれは、溶離液溜に予め開
始溶媒が収容され、これがポンプ手段６巴よって供給さ
れる終了溶媒の継続的な導入によって順次稀釈されるこ
とによって、経時的に濃度変化する溶離液と為され、そ
してこの溶離液が連続的に流路を通じて液体クロマトグ
ラフイ装置の分離カラムに給送されるようになるため、
極めて簡単に所定の濃度勾配の溶離液を作製することが
可能となるのであり、またかかる溶離液の調製が連続的
に行い得ることとなったのである。しかも、かかる溶離
液溜における溶離液の形成が、単に切換バルブ手段によ
る流路の切換操作によって簡単に行われ得るため、構造
、上は勿論、操作上においても著しく中純化され得たの
であり、また分離カラムへの溶離液の供給流量が略１ｍ
６／分以下、好ましくは３００μβ／分以下の量となる
セミ・ミクロ高速液体クロマトグラフィにおいても、そ
の勾配溶出操作を連続的に行い得ることとなったのであ
る。更に、本発明によれば、セミ・ミクロ１覇速液体ク
ロマトグラフィにおいて、１つのポンプを用いてグラジ
ェント溶出手法が可能となることば勿論、切換バルブ手
段による切り換えによって、溶離液溜には開始溶媒並び
に終了溶媒が任意に導入され得ることとなり、グラジェ
ント分析操作のスタートと分析終了後の開始溶媒への／
８離液の置換が容易に行われ得て、その操作性が著しく
向上され得ることとなったのであり、また経時的に濃度
勾配を有する溶離液の調製サイクルを繰り返し自動的に
行い得て、勾配溶出操作を連続的に実施することが可能
となったのである。

以下、本発明を更に具体的に明らかにするために、図面
に基づいて、本発明の実施例を詳細に説明することとす
る。

まず、第１図において、２は第一の貯槽てあり、その内
部に所定の開始溶媒Ａか収容されている。

また、第二の貯槽４内には終了溶媒Ｂか収容されている
。そして、これら二つの貯槽２，４は、それぞれ流路６
．８を介して切換バルブ機構である三方バルブ１０にそ
れぞれ接続されており、そして該三方バルブ１０が流路
１２を介して定吐出量タイプのポンプ１４の吸引側に接
続されているのである。従って、かかるポンプ１４の吸
引によって、第一の貯槽２及び第二の貯槽４内にそれぞ
れ収容された開始溶媒Ａ及び終了溶媒Ｂは、流路６゜８
を通じてそれぞれ三方バルブ１０に導かれるが、かかる
三方バルブ１０によって、それら二つの溶媒のうち一方
のみが選択され、そして流路１２を通してポンプ１４に
導かれ、そして液体クロマトグラフィ装置の分離カラム
１６に接続された流路１８に吐出せしめられるようにな
っている。

かかるポンプ１４の吐出流路１８上には、溶離液溜２０
が設けられている。そして、この溶離液溜２０は、その
下部にマグネティソクスターラ２２を有している。なお
、このマグネティソクスターラ２２は、よく知られてい
るように、１ｇ離液溜２０内に収容された攪拌子２４を
溶離液溜２０の外部に設置された電磁駆動部２６によっ
て回転せしめることにより、該溶離液溜２０内の液体の
攪拌を行うものである。また、この溶離液溜２０のと部
には、第２図に示される如く、一般に、容量可変機構と
してのピストン２８が、液密に摺接移動し得るように設
けられており、そして該ピストン２８のナンド３０に対
する相対的な回転によって、溶離液溜２０内の容積を任
意に変え得るようになっている。

更に、かかる溶離液溜２０に対して下流側となる流路１
８上には、必要に応じて第２．第３の溶離液溜２０′・
・・２０　が直列に設けられ、そして前例と同様にマグ
ネテインクスターラ２２′・・・２２　が設けられ、そ
れぞれの溶離液溜内に流入する溶離液を該溶離液溜内に
存在する溶離液と混合攪拌せしめ、均一化するように構
成されている。

なお、かかる溶離液溜２ｏの下流側の流路１８部分には
、ドレイン流路３２が接続されており、該ドレイン流路
３２上にバルブ３４が設けられる一方、分離カラム１６
の直前の流路１８上には、公知の如く液体クロマトグラ
フィ装置の試料注入器３６が設けられている。

従って、かかる構成のグラジェント装置にあっては、勾
配溶出に先立って、先ず溶離液溜２ｏ内に第一の貯槽２
内の開始溶媒Ａが供給され、収容されることとなる。こ
の操′作のためには、三方バルブ１０の切り換えによっ
て流路６と流路１２が連通せしめられることにより、ポ
ンプ１４の吸引作用によって該第−の貯槽２内の開始溶
媒Ａが吸引され、そして吐出流路である流路１８に吐出
せしめられることによって、該流路１８上に設けられた
溶離液溜２０内に供給されることとなり、またかかる溶
離液溜２０内の液体、すなわち先の分析サイクル終了時
の溶離液である終了溶媒Ｂはそれによって押し出されて
ドレイン流路３２．バルブ３４を通じて排出されること
となるのである。

このようなドレイン流路３２．バルブ３４の配置は、分
離カラム１６内を液体が高流量で流通せしめられ（４な
いところから、溶離液溜２０内の液体の排出作業におい
て極めて有効であり、これによって分析時間を著しく短
縮せしめるのである。

そして、かかる溶離液溜２０内に開始溶媒Ａが充填され
ると、次に三方バルブ１０が切り換えられ、これによっ
て流路８と流路１２とが連通せしめられて、貯槽４内の
終了溶、媒Ｂがポンプ１４の吸引、吐出作動によって流
路１８内に導かれ、そして溶離液溜２０内に流入せしめ
られるのである１また、この流入する終了溶媒Ｂによっ
て、該溶離液溜２０内の開始溶媒Ａは漸次稀釈されるよ
うになるのであり、そしてマグネチソクスターラ２２に
よる攪拌作用によって経時的に濃度変化する均一な溶離
液と為されて、分離カラム１６に送液されるのである。

なお、′かかる溶離液溜２０内で形成される溶離液の濃
度は、該溶離液溜２０に流入する終了溶媒Ｂの流入量、
換言すればポンプ１４の吐出流量や溶離液溜２０内の容
積に影響されるものであるが、何れにしても時間の経過
に従って開始溶媒の組成から終了溶媒の組成に漸次変化
せしめられ得るのである。そして、形成される溶離液の
濃度勾配の傾斜を制御するために、一般に、第２図の如
き溶離液溜２０内の容積を変化せしめ得るような容量可
変機構（２８，３６）が設けられているのである。尤も
、かかる容量可変機構のピストン２８の位置を固定して
ポンプ１４を、定吐出量ポンプから可変吐出量ポンプに
変えて、溶離液濃度の勾配傾斜を制御するようにするこ
とも可能である。また、第１図に示されるように、溶離
液２０の複数を重列に接続することにより、形成される
溶離液のグ・ノソエント曲線は、更に種々変化せしめら
れ得ろこととなる。

そして、このようにして溶離液溜２０内で形成される溶
離液ば、流路１８を通して分離カラム１６へと送液され
ることとなるのである。なお、流路１８を通じて送液さ
れる経時的に濃度変化する／８離ｌｒνは、よく知られ
ているように、試料注入器３６を通じて抑大された試料
を分離カラム１６内で展開し、それぞれの成分に分離せ
しめた後、その分８１１成分が所定の検出器にて検出さ
れることとなる。

このように、かかる構成のグラジェント装置によれば、
溶離液溜２０内で形成される経時的に濃度勾配を有する
溶離液か、単に三方バルブ１０の切り喚えのみによって
、極めて簡単に形成され（Ｍることとなったのであり、
゛これによって略１０μｌ乃至１ｍｎ／分、特に３００
　ｐ　１　／分以下のセミ・ミクロの領域における高速
液体クロマトグラフィにおける勾配溶出操作の実施を効
果的に為し得ることとなり、以てその実用化が可能とな
ったのである。

しかも、勾配溶離液の調製が、従来の如く二つのポンプ
を利用したり、或いは比例バルブを使用したりする方式
とは異なり、単に溶離液溜２ｏ内への終了溶媒Ｂの流入
のみによって効果的に形成されることとなるため、華に
ポンプ１４の一台のみの使用で済む効果に加えて、装置
的にも簡単な構造と為し得たのである。

また、かくの如き構成の実施例によれば、溶離液の調製
操作は、単に終了溶媒Ｂを該溶離液溜２０内に流入せし
めれば足りるため、ポンプ１４等におけるデソドホリュ
ームの存在をほとんど無視することが可能である。

更に、上側の装置によれば、単に三方バルブＩＯの切り
換えのみによって、溶離液溜２ｏ内には第一の貯槽２内
の開始溶媒Ａや第二の貯ｊＷＡ内の終了溶媒Ｂが任意に
導入され得るので、グラジェント分析のスタートと分析
終了後の開始溶媒Ａへの溶離液の置換が容易に行われ得
、操作性の向上か達成されると共に、勾配溶出操作を自
動的に且つ連続的に行い得る大きな特徴も有しているの
である。特に、分離カラム１６内の溶媒（溶離液）が開
始溶媒Ａから終了溶媒Ｂへとスムーズに変化する状態は
、第３図から明白に認められろところである。すなわち
、第３図において、開始溶媒Δから終了溶媒Ｂへの濃度
変化に対する理論曲線４０に対して、実際の測定曲線４
２は極めて類似したカーブを描いているのである。なお
、実験は、１、３　ｒｎ　１の内容積を有する溶離液溜
２０の一個を用い、１００μρ／分の流速にて行われた
ものである。

また、第４図に示したグラフは、溶離液溜２０をｍ個用
いて’、Ｌ７ｊられるグランエンド曲線４４と、溶離液
溜２０を二個用いて得られるグラジェント曲線４６とを
それぞれ示しているが、それより明らかなように、溶離
液溜を二個用いた場合においては、その−個の使用の場
合に比して、特徴ある曲線を陥さ、そしてそのような溶
離液溜（２０）を更に３段、４段と増加せしめることに
より、各種のグラジェント曲線を実現することが容易と
なるのである。なお、グラジェント曲線４４の測定ば、
１．８ｍβの内容積の／８離液溜−個を用い、流　　　
　　□速１００μβ／分で行われ、またグラジェント曲
線４６の測定は二個の／８離液溜を用い、上流側の溶離
液溜の内容積を０．’７５ｍｎとし、下流側の溶離液溜
の内容積を１．０５ｍ１とするとともに、流速１００μ
β／分で行われたものである。

更に、第５図は、かかる実施例の装置を用いて得られた
、ａ；ナフタレン、ｂ；ヒフェニル、Ｃ；フルオレン、
ｄ；アントラセン、ｅ；ピレン。

ｆ；トリフェニレン、ｇ；クリセン、ｈ；ヘンッピレン
を含む試料のクロマトグラフィ その分析結果は下記第１表の通りである。

第　　　１　　　表 ａ　　９．３６０．０８４０．９０ ｂ　　１０．１００．０７８０．７７ ｃ　　、］１．４００゜０８８０．７７ｄ　　１３．１
４０．’０９６０．７３ｅ　　１４．２４．０．１０８
０．７６ｆ　　１４．８００．１０６０．７２ ｇ　　１７．３０−０．１０６０．６１ｈ　　２］、６
２　Ｑ、１５４０．７１（ｎ−６） なお、液体クロマトグラフィ測定条件は以下の通りであ
る。

流量；１５０μｍ２／分 分離用カラム；　ｐ　Ｓ　−ＦＩＮＥＰＡＫ　ＳＩＬ　
Ｃ１８〔日本分光工業■製：オクタデ シル基を化学結合したシリカ ゲル〕を充填した内径１．５ｍｎ。

長さ２５０ｍｍのもの。

紫外分光検出器、　ＪＡＳＣＯｕｖｔｏｉｃ−ｔｏｏ　
−■〔日本分光工業（株製〕 開始溶媒Ａ；　Ｃ）Ｉ、Ｃ，Ｎ　／８２０　　（５０１
５０＞検出波長；　２５４　ｎ　ｍ 終了音離液Ｂ　；ＣＨ３ＣＮ　　（１００）溶離液溜（
２０）の容積ｉ１．７７ｍＡ第５図並びに上記第１表の
結果から明らかなように５本発明に従う装置によって、
優れた分離能が得られ、また優れた再現性が達成される
ことが明瞭に理解されるのである。

更にまた、第６図には、漢方風邪薬について本発明に従
う装置にてグラジェント溶出分析を行なって得られたク
ロマトグラムが示されており、その測定条件は以下の通
りである。

流量；１５０μβ／分 分離用カラム；μＳ　−”ＦＩＮＥＰＡＫ　ＳＩＬ　Ｃ
１８〔日本分光工業■製：オクタデ シル基を化学結合したシリカ ゲル〕を充填した内径１．５鶴。

長さ２５０鰭のもの。

紫外分光検出器、　ＪＡＳＣＯｔｌＶＩＤＥｃ−１００
−Ｖ〔日本分光工業■製〕 検出波長；２５４ｎｍ 開始溶媒Ａ　’；　０．１％　ｌ（、Ｊ’０４水溶液終
了溶媒Ｂ　；　ＣＨ，ＣＮ　／　０．２％）Ｉ、ＰＯ４
水溶液（５０１５０） 溶離液溜（２０）の容積；１．７７ｍβ第６図のクロマ
トグラムから明らかなように、複雑な構造の各種の成分
を有する漢方風邪薬であっても、それらの各成分が良好
に分離されているのである。

また、第７図には、第１図に示すグラジェント装置とは
異なる本発明の他の実施例が示されている。そこでは、
第１図の装置におけるポンプ１４が、溶離液溜２０の下
流側に配置されているのである。換言すれば、三方バル
ブ１０とポンプ１４とをつなぐ流路１２上に溶離液溜２
０が配置されているのである。このように、溶離液溜２
０を介して、ポンプ１４の吸引作用をそれぞれの貯槽２
゜４内に収容された開始溶媒Ａ、終了溶媒Ｂに及ぼしめ
、三方バルブｌＯの切り換えによって、その何れかを溶
離液溜２０内に導くようにすることによっても、前例と
同様な効果は達成されるのである。尤も、前例の構造の
装置の方が、溶離液溜２０内での溶離液からの気泡の発
生の問題がないことを考えると、その点において有利で
あると考えられる。

また、本発明において第一の貯槽２や第二の貯槽４Ｌこ
収容される開始溶媒Ａや終了溶媒Ｂとしては、前記例示
の実験例からも明らかなように、単一の溶媒から構成さ
れるもののほか、複数の溶媒を混合したものであっても
何等差支えないのである。

更に、本発明における切換バルブ手段として、前例では
三方バルブ１０を用いたが、これに変えて、適当な公知
のバルブ手段を採用することも可能であり、更にまたポ
ンプ手段（１４）としても、公知の各種のポンプを使用
することが可能であるが、特に本願出願人の出願にかか
る特願昭５２−７８０７９　（特開昭５４−１２８９０
）等にて提案されている脈動のないポンプを使用するこ
とが特に（庄奨される。

その他、−々列挙はしないが、本発明が当業者の知識に
基づいて種々なる変更・修正等を加えた形態において実
施され得るものであることは言うまでもなく、またその
ような実施形態が、本発明の趣旨を逸脱しない限りにお
いて、何れも本発明の範囲内に含まれることは言うまで
もないところである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明に従うグラジェント装置を備えた液体
クロマトグラフィ装置の一例を概略的に示す系統図であ
り、第２図は第１図の装置における溶離液溜部分の拡大
説明図であり、第３図は第１図の装置を用いて得られる
グラジェント曲線を示すグラフ、第４図は溶離液溜の個
数を変えた場合におけるグラジェント曲線の形態を示す
グラフ、第５図及び第６図は、それぞれ第１図の装置を
用いて得られたクロマトグラムの一例を示すものであり
、第７図は本発明の他の実施例を示す装置を設けたクロ
マトグラフィ装置を示す系統図である。 ２：第一の貯槽　　４；第二の貯槽 ６．８．　１２．１８：流路 １０：三方バルブ　　　１４：ボンプ １６：分離カラム　　　２０：溶離液溜２２：マグネテ
インクスターラ ２４：攪拌子　　　　　２６：電磁駆動部２８：ピスト
ン　　　　３０：ナソト ３６：試料注入器 出願人　日本分光工業株式会社 第３図

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. （１）グラジェント開始時の開始溶媒を収容する第一の
   貯槽と、 グラジェント終了時の終了溶媒を収容する第二の貯槽と
   、 前記第−及び第二の貯槽から、それぞれ開始溶媒及び終
   了溶媒を吸引し、所定の液体クロマトグラフィ装置の分
   離カラムに接続された流路に吐出せしめるポンプ手段と
   、　　− 該ポンプ手段の上流側の流路に設けられ、該ポンプ手段
   によって前記第−及び第二の貯槽から吸引される開始溶
   媒および終了溶媒のうち何れか一方のみを該ポンプ手段
   側に導くように切り換える切換バルブ手段と、 前記ポンプ手段の上流側若しくは下流側の流路上に設け
   られ、収容された前記開始溶媒に対して前記終了溶媒を
   混入せしめて経時的に濃度変化する溶離液を形成する、
   攪拌機構を備えた溶離液溜とを、 含むことを特徴とする液体クロマトグラフィにおけるグ
   ラジェント装置。
2. （２）前記溶離液溜が、容量可変機構を備えた特許請求
   の範囲第１項記載の装置。
3. （３）前記切換バルブ手段が、三方バルブである特許請
   求の範囲第１項記載の装置。
4. （４）前記ポンプ手段が、一定流量の吐出を行う定吐出
   量ポンプである特許請求の範囲第１項記載の装置。
5. （５）前記ポンプ手段の吐出作動によって１．前記分離
   カラムに接続された流路上に略１０μｐ−１ｍｔｔＺ分
   の割合で吐出され、該分離カラム側に送液せしめられる
   特許請求の範囲第１項乃至第４項の何れかに記載の装置
   。