JPS5914798A - ヒトインシユリンの半合成法 - Google Patents
ヒトインシユリンの半合成法Info
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- JPS5914798A JPS5914798A JP12391782A JP12391782A JPS5914798A JP S5914798 A JPS5914798 A JP S5914798A JP 12391782 A JP12391782 A JP 12391782A JP 12391782 A JP12391782 A JP 12391782A JP S5914798 A JPS5914798 A JP S5914798A
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- human insulin
- insulin
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトインシュリンの半合成に関すゐ。
史に詳記すれば、少量の有機溶媒をカロえた、または加
えない水を反応溶媒とし、固定化された、才たはされな
い、アクロモバクタ−・リティカス産生りシルエンドペ
プチダーゼ（アクロモバクタ−・プロテアーゼ１）（以
下ＰＬＰという）を触媒として、ブタインシュリンから
ヒトインシュリンな製造する、新規な半合成法に係る。
えない水を反応溶媒とし、固定化された、才たはされな
い、アクロモバクタ−・リティカス産生りシルエンドペ
プチダーゼ（アクロモバクタ−・プロテアーゼ１）（以
下ＰＬＰという）を触媒として、ブタインシュリンから
ヒトインシュリンな製造する、新規な半合成法に係る。
インシュリンが膵臓から分泌され、血糖降下作用及び糖
代謝に重要な役割を演するホルモン蛋白であること、糖
尿病の治療に必須であること、従来ヒトの糖尿病に対し
ては、副作用を伴うことな承知で、動物由来インシュリ
ンが使用されていて、ヒトインシュリンが容易に経済的
に工業的に製造される□ことが久しく希求されて来たこ
となと、倒れも周知のことである。
代謝に重要な役割を演するホルモン蛋白であること、糖
尿病の治療に必須であること、従来ヒトの糖尿病に対し
ては、副作用を伴うことな承知で、動物由来インシュリ
ンが使用されていて、ヒトインシュリンが容易に経済的
に工業的に製造される□ことが久しく希求されて来たこ
となと、倒れも周知のことである。
インシュリンを構成するアミノ酸の種類と配列とは既に
解明され、ヒトインシュリンとブタインシュリンとの差
異は、Ｂ鎖６−末端のアミノ酸がヒトでスレオニン、ブ
タでアラニンであるだけということは、知られて既に久
しく、ブタインシュリンからヒトインシュリンへの半合
成の試みは幾つか報告され、また遺伝子工学によってヒ
トインシュリンを産生ずる大腸菌が得られたことも報告
されている。これらの製法は従来の化学的な全合成や部
分合成に比べて、画期的に進歩した方法であると認めら
れる。
解明され、ヒトインシュリンとブタインシュリンとの差
異は、Ｂ鎖６−末端のアミノ酸がヒトでスレオニン、ブ
タでアラニンであるだけということは、知られて既に久
しく、ブタインシュリンからヒトインシュリンへの半合
成の試みは幾つか報告され、また遺伝子工学によってヒ
トインシュリンを産生ずる大腸菌が得られたことも報告
されている。これらの製法は従来の化学的な全合成や部
分合成に比べて、画期的に進歩した方法であると認めら
れる。
ブタインシュリンのＢ３０のアラニンな切断除去する工
程を行って、デスＢ３０アラニン・インシュリンを得、
次に第二の工程として、保護されたスレオニンをＢ３０
のアミノ酸として縮合させる工程を行い、終にはひとイ
ンシュリンヲ得る方法は、日時開昭５４−１３５７８９
、同５５−１３８３９、特開公昭５７−１８７９８、同
５７−１８７９９等に示され、またブタインシュリンを
トリプシンの存在で、保護されたスレオニンをＢ３０に
置換する方法は、日特開昭５６−１３５４５２等に見ら
れる。
程を行って、デスＢ３０アラニン・インシュリンを得、
次に第二の工程として、保護されたスレオニンをＢ３０
のアミノ酸として縮合させる工程を行い、終にはひとイ
ンシュリンヲ得る方法は、日時開昭５４−１３５７８９
、同５５−１３８３９、特開公昭５７−１８７９８、同
５７−１８７９９等に示され、またブタインシュリンを
トリプシンの存在で、保護されたスレオニンをＢ３０に
置換する方法は、日特開昭５６−１３５４５２等に見ら
れる。
しかしこれらの記載をつぶさに検討すると、反応溶媒量
に対してインシュリン類の湿度か商く、反応に必須の反
応液の流動性は極めて乏しく、特に固定化酵素を利用す
る工業的生産の規模に、反応な拡大することは全く不可
能である。また水の量に対して圧倒的に多い量の有機溶
媒の使用を不可欠とするそれら従来法では、有機浴媒に
よってインシュリン類の溶解を助けようとするものであ
るが、酵素の作用を大巾に阻得るという不利を招いてい
る。実際に、水に同蛍以上の有機溶媒な混合すると、酵
素の性能は１／１０〜１／１００にも低下し、高価な酔
索を大過剰に使用することを余儀なくされる。而もその
場合、従来は使用された酵素は、その都度発棄されると
いう不利益な伴っていた。
に対してインシュリン類の湿度か商く、反応に必須の反
応液の流動性は極めて乏しく、特に固定化酵素を利用す
る工業的生産の規模に、反応な拡大することは全く不可
能である。また水の量に対して圧倒的に多い量の有機溶
媒の使用を不可欠とするそれら従来法では、有機浴媒に
よってインシュリン類の溶解を助けようとするものであ
るが、酵素の作用を大巾に阻得るという不利を招いてい
る。実際に、水に同蛍以上の有機溶媒な混合すると、酵
素の性能は１／１０〜１／１００にも低下し、高価な酔
索を大過剰に使用することを余儀なくされる。而もその
場合、従来は使用された酵素は、その都度発棄されると
いう不利益な伴っていた。
また、遺伝子工学により、ヒトインシュリンを産生する
大腸菌が作り出され、商業ペースに乗るかの如く喧伝さ
れているが、識者はこれを疑問としている（例えば東京
化学同人発行、現代化学１９８１年１１月号２０頁左欄
）。遺伝子工学で得られた該大腸菌が、インシーリンを
体外酵素として産生するのでなく、体内酵素として産生
するだけであるので、その産生収量が極めて少量且つ低
効率であること、変異株は殆ど例外なしに母株よりひ弱
であって、生存競争に劣ることから推しても、この技術
もまた、混しく工業的生産を担うことはないといっても
過言ではない。
大腸菌が作り出され、商業ペースに乗るかの如く喧伝さ
れているが、識者はこれを疑問としている（例えば東京
化学同人発行、現代化学１９８１年１１月号２０頁左欄
）。遺伝子工学で得られた該大腸菌が、インシーリンを
体外酵素として産生するのでなく、体内酵素として産生
するだけであるので、その産生収量が極めて少量且つ低
効率であること、変異株は殆ど例外なしに母株よりひ弱
であって、生存競争に劣ることから推しても、この技術
もまた、混しく工業的生産を担うことはないといっても
過言ではない。
本発明者らは、確実に工業的生産さを担い得る方法法に
ついて鋭意研究を重ね、１−トリプシンこ比べて合成活
性が２桁おおきく、トリプシンがポリペプチド鎖中に存
在する塩基性アミノ酸の、カルボキシル基側の酸ペプチ
ド結合を全て切るのに比べて、リジンのカルボキシル基
側の酸ペフナド結合たけな特異的に切るという、瞠目す
べき１利性なもつＰＬＰを用い、ブタインシュリンから
、保護基をもつスレオニンをＢ３０に有するヒトインシ
ュリン誘導体を、一挙に得る新規有用な方法を開発、本
発明を完成した。
ついて鋭意研究を重ね、１−トリプシンこ比べて合成活
性が２桁おおきく、トリプシンがポリペプチド鎖中に存
在する塩基性アミノ酸の、カルボキシル基側の酸ペプチ
ド結合を全て切るのに比べて、リジンのカルボキシル基
側の酸ペフナド結合たけな特異的に切るという、瞠目す
べき１利性なもつＰＬＰを用い、ブタインシュリンから
、保護基をもつスレオニンをＢ３０に有するヒトインシ
ュリン誘導体を、一挙に得る新規有用な方法を開発、本
発明を完成した。
本発明の特徴は、水を反応溶媒に選び、固定化 された
。またはされないＰＬＰの酵素作用を利用して、−挙に
所望のペプチド交換を行わせる処にあり、また使用する
水に対し、それと同容緻以下の、水と混する有機溶媒の
一種または二種以上を、添加併用することも可能たらし
める処にある。
。またはされないＰＬＰの酵素作用を利用して、−挙に
所望のペプチド交換を行わせる処にあり、また使用する
水に対し、それと同容緻以下の、水と混する有機溶媒の
一種または二種以上を、添加併用することも可能たらし
める処にある。
本発明の特徴、ペプチド交換は、一見まずブタインシュ
リンが加水分解してＢ３０のアラニンがはすれ、然る後
に保護されたスレオニンかカップリンクするという、二
段階の過程を想わせるが、必要な条件下て酵素の作用を
利用するとき、即ち本発明の酵素反応もそれであるが、
直接にペプチド交換が、カルボキシ転移で達成されるの
である。
リンが加水分解してＢ３０のアラニンがはすれ、然る後
に保護されたスレオニンかカップリンクするという、二
段階の過程を想わせるが、必要な条件下て酵素の作用を
利用するとき、即ち本発明の酵素反応もそれであるが、
直接にペプチド交換が、カルボキシ転移で達成されるの
である。
（例えば、蛋白質・核酸・酵素、第２６巻（１９８１年
）１９８１項右欄上部） 反応溶媒とされろ水または水性媒体の量は、反応混合物
が反応進行に必要な流動性をもったり、インシュリン類
を含有する液層が固定化されたＰＬＰの層な容易に流動
したりする程度に使用されればよい。従来のように、攪
拌も流動もできないような筒濃度に固執する必要はない
。本発明方法は、操作の容易、反応の円滑、収率の向上
に著しい進歩なもたらした。特に固定化ＰＬＰの使用は
、酵紫の損失を極度に抑えるという利点がある。
）１９８１項右欄上部） 反応溶媒とされろ水または水性媒体の量は、反応混合物
が反応進行に必要な流動性をもったり、インシュリン類
を含有する液層が固定化されたＰＬＰの層な容易に流動
したりする程度に使用されればよい。従来のように、攪
拌も流動もできないような筒濃度に固執する必要はない
。本発明方法は、操作の容易、反応の円滑、収率の向上
に著しい進歩なもたらした。特に固定化ＰＬＰの使用は
、酵紫の損失を極度に抑えるという利点がある。
使用される有機溶媒は、水と混じ得るものなら特に制限
はなく、メタノール、エタノール、インプロパツール、
エチレンクリコール、メチルセロソルブ、アセトン、ジ
オキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルホルホキン
トなとか、通常のものとして挙けられる。これら有機溶
媒は、一種または二種以上の混合の合計容量が、水と同
容量以下併用される、乃至は全く使用されない処に、本
発明方法の特徴がある。更に、水と混じ得る有機溶媒と
併用する結果、全体として水と混じ得る程度に、元来は
水と混じない有機溶媒が使用されることを妨げるもので
はない。
はなく、メタノール、エタノール、インプロパツール、
エチレンクリコール、メチルセロソルブ、アセトン、ジ
オキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルホルホキン
トなとか、通常のものとして挙けられる。これら有機溶
媒は、一種または二種以上の混合の合計容量が、水と同
容量以下併用される、乃至は全く使用されない処に、本
発明方法の特徴がある。更に、水と混じ得る有機溶媒と
併用する結果、全体として水と混じ得る程度に、元来は
水と混じない有機溶媒が使用されることを妨げるもので
はない。
保護されたスレオニンは、Ｔｈｒ−ＯＲで表わされる。
即ち保護基はスレオニンのカルボキシル基を保護するも
のである。他の官能基を同時に保護することを妨げない
が、例えばその水酸基なも同時に保護したものを使用す
る場合、目的のヒトインシュリンを得る為には、更に一
工程を必要とする不利を伴う可能性があるだけである。
のである。他の官能基を同時に保護することを妨げない
が、例えばその水酸基なも同時に保護したものを使用す
る場合、目的のヒトインシュリンを得る為には、更に一
工程を必要とする不利を伴う可能性があるだけである。
Ｔｈｒ−ＯＲのＲは、置換された、または置換されない
、アルキルまたはアラルキルであり、メチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、ターシャリイブチル、クロロ
エチル、ペンチル、オクチル、、２−（フロビルスルホ
ニル）エチル、ベンジル、フェネチル、Ｐ−メチルフェ
ネチル、２，４，６−ドリメチルベンジルなどが、例と
して挙げられる。
、アルキルまたはアラルキルであり、メチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、ターシャリイブチル、クロロ
エチル、ペンチル、オクチル、、２−（フロビルスルホ
ニル）エチル、ベンジル、フェネチル、Ｐ−メチルフェ
ネチル、２，４，６−ドリメチルベンジルなどが、例と
して挙げられる。
反応は５０℃以下で行われるが、実際にはＯ℃以丁では
、実用的な反応の進行は見られない。反応混液のｐＨは
４〜１０、好ましくは中性付近である。ｐＨ４〜１０な
外れると反応は遅く、実用的でなくなる。ＰＬＰは、可
浴形であっても固定化されていてもよい。即ち本発明反
応はバッチ式でもフロー糸でも差支えない。固定化ＰＬ
Ｐは、自体公知の方法で製造されたもの、及び本出願人
の出願に係る、特願昭５７−６８２３８に記載のものが
使用される。セルロース、アガロース、テキストラン、
ガートラン等の多糖類を担体として、プロムンアンで活
性化し固定したもの、陽イオン交換樹脂才たは陽イオン
交換セルロースに固定したもの、シッフ塙基を形成する
クルクルアルデヒド、または分子内に二官能基を有する
架橋剤を用いて固定したものなどが例示される。
、実用的な反応の進行は見られない。反応混液のｐＨは
４〜１０、好ましくは中性付近である。ｐＨ４〜１０な
外れると反応は遅く、実用的でなくなる。ＰＬＰは、可
浴形であっても固定化されていてもよい。即ち本発明反
応はバッチ式でもフロー糸でも差支えない。固定化ＰＬ
Ｐは、自体公知の方法で製造されたもの、及び本出願人
の出願に係る、特願昭５７−６８２３８に記載のものが
使用される。セルロース、アガロース、テキストラン、
ガートラン等の多糖類を担体として、プロムンアンで活
性化し固定したもの、陽イオン交換樹脂才たは陽イオン
交換セルロースに固定したもの、シッフ塙基を形成する
クルクルアルデヒド、または分子内に二官能基を有する
架橋剤を用いて固定したものなどが例示される。
得られたヒトインシュリン誘導体の単離は、自体公知の
法によれはよく、その場合、ＰＬＰが固定化されている
方が、有利であることは通常てある。また保護されスレ
オニンＴｈｒ−ＯＲを、Ｂ３０に置換してもつヒトイン
シュリン誘導体から、保護基Ｒを外してヒトインシュリ
ンに転するのも、自体公知の、例えばトリフルオロ酢酸
法によって行われる。
法によれはよく、その場合、ＰＬＰが固定化されている
方が、有利であることは通常てある。また保護されスレ
オニンＴｈｒ−ＯＲを、Ｂ３０に置換してもつヒトイン
シュリン誘導体から、保護基Ｒを外してヒトインシュリ
ンに転するのも、自体公知の、例えばトリフルオロ酢酸
法によって行われる。
本発明方法によって借られた半合成ヒトインシリンは、
通常の方法で製ハリ化され、必要に応じて投与される。
通常の方法で製ハリ化され、必要に応じて投与される。
極めて効率良くヒトインシュリンを与える本発明方法は
、支障なく工業的に利用でき、斯業に貢献すること大で
ある。以下に実施例を記し、実施態様を例示する。
、支障なく工業的に利用でき、斯業に貢献すること大で
ある。以下に実施例を記し、実施態様を例示する。
実施例１
ブタインシュリン１００ｍｇ（２ｍＭ）と、Ｌ−スレオ
ニン・ターシャリイブチルエステル（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ
）３．０８ｇ（２Ｍ）を、５Ｍ酢酸３．５ｍｌで中和し
た後、ＩＭ酢酸緩衝液を加えて溶解、全容を８、５ｍｌ
（ｐＨ７．０）にする。これにＰＬＰ１ｍｇを含有する
ＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌを加ええて、
３７℃に１晩保つ。高速液体クロマトグラフフイで、目
的化合物であるターンヤリイブチルで保護されたスレオ
ニンをＢ２Ｏにもつインシュリン（［Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ
−Ｂ３０〕−インシュリン）が、６５％収率で生成した
ことが確認されろ。
ニン・ターシャリイブチルエステル（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ
）３．０８ｇ（２Ｍ）を、５Ｍ酢酸３．５ｍｌで中和し
た後、ＩＭ酢酸緩衝液を加えて溶解、全容を８、５ｍｌ
（ｐＨ７．０）にする。これにＰＬＰ１ｍｇを含有する
ＩＭ酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）０．３ｍｌを加ええて、
３７℃に１晩保つ。高速液体クロマトグラフフイで、目
的化合物であるターンヤリイブチルで保護されたスレオ
ニンをＢ２Ｏにもつインシュリン（［Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ
−Ｂ３０〕−インシュリン）が、６５％収率で生成した
ことが確認されろ。
反応混成を氷酢酸で酸性にした後、超微粒のセファデク
スＧ５０のカラム（４０Ｘ２００ｃｍ）でゲル濾過を行
い、酵素画分、インシュリン画分、Ｔｈｒ−０Ｂｕｔ画
分に分ける。酵素画分は透析後、Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ画分
は濃縮後再利用できる。
スＧ５０のカラム（４０Ｘ２００ｃｍ）でゲル濾過を行
い、酵素画分、インシュリン画分、Ｔｈｒ−０Ｂｕｔ画
分に分ける。酵素画分は透析後、Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ画分
は濃縮後再利用できる。
インシュリン画分は凍結乾煉後、０．０１Ｍトリス緩衝
液（ｐＨ７．６）と７Ｍ尿素で緩衝化したＤＥＡＥセフ
ァデクスＡ２５のカラム（２Ｘ２５ｃｒｎ）にかけ、４
℃て上記緩衝液を８００ｍｇ流した後、食塩濃度を３
Ｍ ７で直線的に濃度勾配をつけた溶出を行い、００８
〜０．０９Ｍ濃度付近の分画Ａと、０．１３〜０．１４
Ｍ濃度付近の分画Ｂを順次得る。も分画を直ちに３〜４
日間冷所で０．０１Ｍ酢酸アンモニウム溶液に対して透
析した後凍結乾燥し、分画Ａから粉末５５ｍｇを、分画
Ｂから粉末３５■を得る。高速数体クロマトグラフイ及
びポリアクリルアミドケル電気泳動により、前者が（Ｔ
ｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０）−インシュリン（収率５５％
）であり、後者が原料であることが確認される。
液（ｐＨ７．６）と７Ｍ尿素で緩衝化したＤＥＡＥセフ
ァデクスＡ２５のカラム（２Ｘ２５ｃｒｎ）にかけ、４
℃て上記緩衝液を８００ｍｇ流した後、食塩濃度を３
Ｍ ７で直線的に濃度勾配をつけた溶出を行い、００８
〜０．０９Ｍ濃度付近の分画Ａと、０．１３〜０．１４
Ｍ濃度付近の分画Ｂを順次得る。も分画を直ちに３〜４
日間冷所で０．０１Ｍ酢酸アンモニウム溶液に対して透
析した後凍結乾燥し、分画Ａから粉末５５ｍｇを、分画
Ｂから粉末３５■を得る。高速数体クロマトグラフイ及
びポリアクリルアミドケル電気泳動により、前者が（Ｔ
ｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０）−インシュリン（収率５５％
）であり、後者が原料であることが確認される。
得られた［Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０）−インシュリン
５０ｍｇに、アニソール０．２ｍｌを含むトリフルオロ
酢酸 中でトリフルオロ酢酸を除き、１Ｎ酢酸２ｍｌ存在下、
エーテル１５ｍｌでアニソールを抽出し、酢酸部を凍結
乾燥し、ヒトインシュリン４３■を得る。
５０ｍｇに、アニソール０．２ｍｌを含むトリフルオロ
酢酸 中でトリフルオロ酢酸を除き、１Ｎ酢酸２ｍｌ存在下、
エーテル１５ｍｌでアニソールを抽出し、酢酸部を凍結
乾燥し、ヒトインシュリン４３■を得る。
水晶はスラブゲル電気泳動、冒速ｄり体クロマトクラム
により、ヒトインシュリンと同定される。
により、ヒトインシュリンと同定される。
史に氷晶を酸加水分解（６Ｍ塩酸使用、１１０℃、２４
時間反応）に付して得たアミノ酸分析値は下記の通りで
、ヒトインシュリンの理論値とよく一致する。
時間反応）に付して得たアミノ酸分析値は下記の通りで
、ヒトインシュリンの理論値とよく一致する。
Ｔｈｒ−ＯＲのＲを、ターシャリイブチルとする上記例
に替えて、メチル、イソプロピル、、フエネチル、Ｐ−
メチルフェネチルとした場合、同様な推移と結果とが得
られた。
に替えて、メチル、イソプロピル、、フエネチル、Ｐ−
メチルフェネチルとした場合、同様な推移と結果とが得
られた。
実施例２
ブタインシュリン２５０ｍｇ（５ｍＭ）とＴｈｒ−０Ｂ
ｕｔ１ｇ（０，５Ｍ）とを５Ｎ酢酸１．５ｍｌで中和し
た後、２Ｍ酢酸緩衝液とジメチルホルムアミドとの６：
４（容重）混合液を６ｍｌ加えてｐＨを６．５に調整す
る。これにＰＬＰの１■を含有する０．２Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．５）１．５ｍｌを加えて、３７℃で１晩保つ
。高速液体りロマトクラフイで（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ
３０〕−インシュリンが７５％収率で生成したことが確
認できる。以下実施例１とと同様に処理精製して、ヒト
インシュリン１５０ｍｇを得る。収率６０％。
ｕｔ１ｇ（０，５Ｍ）とを５Ｎ酢酸１．５ｍｌで中和し
た後、２Ｍ酢酸緩衝液とジメチルホルムアミドとの６：
４（容重）混合液を６ｍｌ加えてｐＨを６．５に調整す
る。これにＰＬＰの１■を含有する０．２Ｍ酢酸緩衝液
（ｐＨ６．５）１．５ｍｌを加えて、３７℃で１晩保つ
。高速液体りロマトクラフイで（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ
３０〕−インシュリンが７５％収率で生成したことが確
認できる。以下実施例１とと同様に処理精製して、ヒト
インシュリン１５０ｍｇを得る。収率６０％。
Ｔｈｒ、−ＯＲのＲを、ターシャリイブチルとする上記
例に替えて、エチル、２−（エチルスルボニル）エチル
、２．４、６−トリメチルベンジルとした場会、また２
Ｍ酢酸緩衝液とジメチルポルムアミドとの答鼠比を、５
：５、８：２に変更し、更に有機溶剤を、アルコーノペ
タリセロール、ジオキサンに変更しても、同様な推移と
結果とが得られた。
例に替えて、エチル、２−（エチルスルボニル）エチル
、２．４、６−トリメチルベンジルとした場会、また２
Ｍ酢酸緩衝液とジメチルポルムアミドとの答鼠比を、５
：５、８：２に変更し、更に有機溶剤を、アルコーノペ
タリセロール、ジオキサンに変更しても、同様な推移と
結果とが得られた。
実施例３
ブタインシュリン１００ｍｇ（２ｍＭ）とＴｈｒ−ＯＢ
ｕｔ３．１ｇ（２Ｍ）を、５Ｍ酢酸２ｍｌと混じた後、
１Ｍ酢酸を加えて溶解、全容を１８ｍｌ（ｐＨ６．５）
にする。これにシリカゲルに同定したＰＬＰ（酵素活性
から、３■のＰＬＰが固定化）を加え、４０℃、望素雰
囲気中１晩静かに攪拌する。重速液体クロマｔクラフィ
で（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０〕−インシュリンが７０
％収率で生成したことが確認される。
ｕｔ３．１ｇ（２Ｍ）を、５Ｍ酢酸２ｍｌと混じた後、
１Ｍ酢酸を加えて溶解、全容を１８ｍｌ（ｐＨ６．５）
にする。これにシリカゲルに同定したＰＬＰ（酵素活性
から、３■のＰＬＰが固定化）を加え、４０℃、望素雰
囲気中１晩静かに攪拌する。重速液体クロマｔクラフィ
で（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０〕−インシュリンが７０
％収率で生成したことが確認される。
反応混成から遠心分離法で固定化ＰＬＰを回収した後、
上清に冷所で１０倍容量のアセトンな加えてインシュリ
ンを沈諏させる。可溶部は溶媒除去後、Ｔｈｒ−ＯＢｕ
ｔを回収し再利用する。沈殿部は７Ｍ尿素含有の０．０
１Ｍトリス緩衝液に溶解、同じ緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥセファデクスＡ２５のカラム（２×２５ｃｍ）で、
実施例１と同様にして（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０）−
インシュリンな（収率５５％）、更にヒトインシュリン
（収率５０％）を得る。
上清に冷所で１０倍容量のアセトンな加えてインシュリ
ンを沈諏させる。可溶部は溶媒除去後、Ｔｈｒ−ＯＢｕ
ｔを回収し再利用する。沈殿部は７Ｍ尿素含有の０．０
１Ｍトリス緩衝液に溶解、同じ緩衝液で平衡化したＤＥ
ＡＥセファデクスＡ２５のカラム（２×２５ｃｍ）で、
実施例１と同様にして（Ｔｈｒ−ＯＢｕｔ−Ｂ３０）−
インシュリンな（収率５５％）、更にヒトインシュリン
（収率５０％）を得る。
本例上記の担体シリカケルの代り番こ、担体としてＯＨ
−セファロース及びＣＨ−カードランな用いた固定化Ｐ
Ｌ Ｐ ％：使用した場合、同様な推移を以て下記の
結果な得ることができる。
−セファロース及びＣＨ−カードランな用いた固定化Ｐ
Ｌ Ｐ ％：使用した場合、同様な推移を以て下記の
結果な得ることができる。
また本例のペプチド交換の工程（こ於いて、Ｉ Ｍ酢酸
に水と同容量以下のジメチルスルホキント、韮たはイソ
プロパ′ノールを削加併用して、同様の推移と結果とを
得た。
に水と同容量以下のジメチルスルホキント、韮たはイソ
プロパ′ノールを削加併用して、同様の推移と結果とを
得た。
実施例４
ブタインシュリン２５０ｍｇ（５ｍＭ）とＴｈｒ−ＯＢ
ｕｔ１ｇ（０．５Ｍ）な、５Ｍ酢酸１．５ｍｌに混じた
後、２Ｍ酢酸敬衝故とテトラヒドロフランとの７：３（
容量）の今後液を、１６ｍｌ加えてｐＨを６．５とする
。ＰＬＰをグルタルアルデヒドで架橋した固定化ＰＬＰ
（酵系活性から、ＰＬＰ３■を保有）を、２×５０ｃｍ
のカラムに充填し、窒素雰囲気中、室温で、上記ｐＨ６
．５の液を循環させる。
ｕｔ１ｇ（０．５Ｍ）な、５Ｍ酢酸１．５ｍｌに混じた
後、２Ｍ酢酸敬衝故とテトラヒドロフランとの７：３（
容量）の今後液を、１６ｍｌ加えてｐＨを６．５とする
。ＰＬＰをグルタルアルデヒドで架橋した固定化ＰＬＰ
（酵系活性から、ＰＬＰ３■を保有）を、２×５０ｃｍ
のカラムに充填し、窒素雰囲気中、室温で、上記ｐＨ６
．５の液を循環させる。
高速液体クロマトグラフイで、（Ｔｈｒ−Ｏｂｕｔ−Ｂ
３０）−インシュリンが７３％生成したことが確認でき
る。以下実施例１と同様にして、ヒトインシュリンを特
徴する 特許出願人 和元純業工業株式会社 手続袖正書（方式） 昭和５７年１１月２５日 １、事件の表示 昭オ■５７年特許願第１２３９１７号 ２、発明の名称 ヒトインシュリンの半合成法 ３、補正を１−る者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ５４１ 連絡先 特許課（東京） ＴａＯ３−２７０−８５７
１５、補正の対象 明細書。
３０）−インシュリンが７３％生成したことが確認でき
る。以下実施例１と同様にして、ヒトインシュリンを特
徴する 特許出願人 和元純業工業株式会社 手続袖正書（方式） 昭和５７年１１月２５日 １、事件の表示 昭オ■５７年特許願第１２３９１７号 ２、発明の名称 ヒトインシュリンの半合成法 ３、補正を１−る者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ５４１ 連絡先 特許課（東京） ＴａＯ３−２７０−８５７
１５、補正の対象 明細書。
６、補正の内容
明細書の浄書（内容に震央なし）。
Claims (6)
- （１）水な反応浴媒、且つアクロモバクタ−・リティカ
ス産生りシルエンドペブチターゼ（アクロモバクタ−・
プロテアーゼ１）を触媒とすることを特徴とする、ブタ
インシュリンから、カルボキシル基が保護さ孔たスレオ
ニンをＢ３０に有する、ヒトインシュリン誘導体を製造
する、ヒトインシュリンの半合成法。 - （２）水と同容量以下の、水と混じ得る廟機溶剤の一種
または二種以上の混合を添加した、水な反応溶媒、且つ
アクロモバクタ−・リティカス産生りシルエンドペプチ
ターゼ（アクロモバクタ−・プロテアーゼＩ）な触媒と
づ−ることを特徴とする、ブタインシュリンから、カル
ボキシル基が保護されたスレオニンをＢ３ｏ＆こ有する
、ヒトインシュリン誘導体を製造する、ヒトインシュリ
ンの半合成法。 - （３） アクロモバクタ−・プロテアーゼ１な、その
まま、または固定化した形で使用する、特許請求の範囲
第１項又は第２項に記載の、ヒトインシュリンの製法。 - （４） カルボキシル基が保護されたスレオニンがＴ
ｈｒ−ＯＲで表わされるとき、Ｒが、置換されたまたは
置換されない、アルキルまたはアラルキルである、特許
請求の範囲第１項又は第２項に記載の、ヒトインシュリ
ンの製法。 - （５） 反応が、５０℃以下で行われる、特許請求の
範囲第１項又は第２項に記載の、ヒトインシュリン誘導
体の製造。 - （６）反応が、ｐＨ４〜１０で行われる、特許請求の範
囲第１項又は第２項に記載の、ヒトインシュリン誘導体
の製造。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12391782A JPS5914798A (ja) | 1982-07-16 | 1982-07-16 | ヒトインシユリンの半合成法 |
| AT83104036T ATE58174T1 (de) | 1982-04-23 | 1983-04-25 | Verfahren zur halbsynthese von menschlichem insulin und dazu zu verwendende alkalische protease. |
| EP19890123550 EP0367302A3 (en) | 1982-04-23 | 1983-04-25 | Process for semi-synthesis of human insulin, water-soluble cross-linked achromobacter protease i for use therein and a process for preparing the same |
| DK182483A DK182483A (da) | 1982-04-23 | 1983-04-25 | Fremgangsmaade til semi-syntese af humant insulin og alkalisk protease til anvendelse derved |
| DE8383104036T DE3381980D1 (de) | 1982-04-23 | 1983-04-25 | Verfahren zur halbsynthese von menschlichem insulin und dazu zu verwendende alkalische protease. |
| EP19830104036 EP0092829B1 (en) | 1982-04-23 | 1983-04-25 | Process for semi-synthesis of human insulin and alkaline protease for use therein |
| DK152791A DK152791D0 (da) | 1982-04-23 | 1991-08-29 | Fremgangsmaade til semisyntese af humant insulin og achromobacter protease i til anvendelse derved |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12391782A JPS5914798A (ja) | 1982-07-16 | 1982-07-16 | ヒトインシユリンの半合成法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5914798A true JPS5914798A (ja) | 1984-01-25 |
Family
ID=14872538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12391782A Pending JPS5914798A (ja) | 1982-04-23 | 1982-07-16 | ヒトインシユリンの半合成法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5914798A (ja) |
-
1982
- 1982-07-16 JP JP12391782A patent/JPS5914798A/ja active Pending
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