JPS59135360A - 酵素電極 - Google Patents
酵素電極Info
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- JPS59135360A JPS59135360A JP58008728A JP872883A JPS59135360A JP S59135360 A JPS59135360 A JP S59135360A JP 58008728 A JP58008728 A JP 58008728A JP 872883 A JP872883 A JP 872883A JP S59135360 A JPS59135360 A JP S59135360A
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- membrane
- electrode
- urease
- glass plate
- solution
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/001—Enzyme electrodes
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の利用分野〕
本発明は、血液緊急検査装置などの生化学自動分析装置
を用いて行う血液検査の一検査項目である血中尿素窒素
の測定に用いる電極（以下ＢＵＮ嘔極と呼ぶ）に・糸る
ものである。
を用いて行う血液検査の一検査項目である血中尿素窒素
の測定に用いる電極（以下ＢＵＮ嘔極と呼ぶ）に・糸る
ものである。
血中尿素窒素＜ Ｂ Ｕ Ｎ ）の測定には、従来ウレ
アーゼ・インドフェノール法などの比色法が生として用
いられて＠たが、近年固足化ウレアーゼ膜とアンモニウ
ムイオン電極、アンモニアガス祇極又は炭酸ガス１極を
組み酋ゎせた畦・匣法が提案さＺＬＸ実用の域に通して
いる。アンモニアガス岨ｍ及び炭酸ガス亀５点を用いる
ＢＵＮ眠極は選択性に優れているが、−分析サイクルに
比較的長時間を安し、またガス１極の高感度１）Ｈ＝唄
域が、酵素の至適ｐＨ唄域と大巾に異なるなどの欠点が
あるとされている。こｎにＸ寸しアンモニウムイオンｔ
ａを用いるＢＵＮ眠極は、Ｋ”、Ｎａ＋などの−価陽イ
オンの妨害は受けるが、前記の欠点は比較的小さいと考
えられる。しかしながら、この−極も分析時間に関しな
お不満足である。
アーゼ・インドフェノール法などの比色法が生として用
いられて＠たが、近年固足化ウレアーゼ膜とアンモニウ
ムイオン電極、アンモニアガス祇極又は炭酸ガス１極を
組み酋ゎせた畦・匣法が提案さＺＬＸ実用の域に通して
いる。アンモニアガス岨ｍ及び炭酸ガス亀５点を用いる
ＢＵＮ眠極は選択性に優れているが、−分析サイクルに
比較的長時間を安し、またガス１極の高感度１）Ｈ＝唄
域が、酵素の至適ｐＨ唄域と大巾に異なるなどの欠点が
あるとされている。こｎにＸ寸しアンモニウムイオンｔ
ａを用いるＢＵＮ眠極は、Ｋ”、Ｎａ＋などの−価陽イ
オンの妨害は受けるが、前記の欠点は比較的小さいと考
えられる。しかしながら、この−極も分析時間に関しな
お不満足である。
水溶性の酵素を不溶化処理、すなわち固定化、して用い
ようとする研究は１９５０年代より始められ、こルまで
に極めて多数の方法が提案されている。酵素の固定化法
の進歩に伴い、固定化酵素を用いた酵素電極も次々と開
発されてきた。しかし実用化されたものは少なく、グル
コース測定用電極など数種類に過ぎない。現在電極用固
定化酵素膜は、セルロースアセテート非対称膜のスポン
ジ層に酵素を圧入し、グルタルアルデヒドで酵素分子を
互いに架橋して固定する方法が一般に採られているが、
ウレアーゼを固定化して用いるＬＩＵＮ電極においては
、この方法はアンモニウムイオンの透過性が不十分で、
好ましくない。
ようとする研究は１９５０年代より始められ、こルまで
に極めて多数の方法が提案されている。酵素の固定化法
の進歩に伴い、固定化酵素を用いた酵素電極も次々と開
発されてきた。しかし実用化されたものは少なく、グル
コース測定用電極など数種類に過ぎない。現在電極用固
定化酵素膜は、セルロースアセテート非対称膜のスポン
ジ層に酵素を圧入し、グルタルアルデヒドで酵素分子を
互いに架橋して固定する方法が一般に採られているが、
ウレアーゼを固定化して用いるＬＩＵＮ電極においては
、この方法はアンモニウムイオンの透過性が不十分で、
好ましくない。
Ｂ［ＪＮ電極用固定化ウレアーゼ膜は、ウレアーゼの活
性が高く、且つアンモニウムイオンの透過性が高いもの
でなければならない。この要求を満たすためには、単位
容積当シに固定化されたウレアーゼ分子数が多く、且っ
膜厚が薄く、膜構成分子間の間隙が実質的に大きいこと
が望ましい。
性が高く、且つアンモニウムイオンの透過性が高いもの
でなければならない。この要求を満たすためには、単位
容積当シに固定化されたウレアーゼ分子数が多く、且っ
膜厚が薄く、膜構成分子間の間隙が実質的に大きいこと
が望ましい。
上記の如き安水を満たすものとして、酵素を他の蛋白質
に混会し、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドで架
橋不溶化することが考えられる。
に混会し、グルタルアルデヒドなどのジアルデヒドで架
橋不溶化することが考えられる。
実際この種の膜が研究されている。例えば、’ｐ １
ａｎ −Ｍ ｉｎｈとＢｒｏｕｎ はウレアーゼと牛
アルブミン及びグルタルアルデヒドより成る浴液中にガ
ラスルＨ醒極を浸漬して酵素電極を作成した（Ｃ。
ａｎ −Ｍ ｉｎｈとＢｒｏｕｎ はウレアーゼと牛
アルブミン及びグルタルアルデヒドより成る浴液中にガ
ラスルＨ醒極を浸漬して酵素電極を作成した（Ｃ。
’ｌ’ｒａｎ−Ｍｊｎｈ ａｎｄ Ｑ、１３ｒ
ｏｕｎ 二 Ａｎａｌ 、 ｃｈｅｍ。
ｏｕｎ 二 Ａｎａｌ 、 ｃｈｅｍ。
す、１３５９（１９７５））。彼等も応答速度を改善す
るために膜厚を薄くする必斐性に言及しているが、３０
μｍ以下の膜を得ること、るるいは１５μｍ以ドの厚さ
に塗布することは困難でるると述べている。また’Ｉ’
ｒａｎ−ＭｉｎｈとＢｅａｕＸ はウレアーゼとヒト血
清アルブミンを炭酸ガス電極を構成するシリコーン膜に
付着させ、さらにグルタルアルデヒドをヒト血清アルブ
ミンに溶がして上記シリコーン膜上に塗布して電極を作
成した（Ｃ。
るために膜厚を薄くする必斐性に言及しているが、３０
μｍ以下の膜を得ること、るるいは１５μｍ以ドの厚さ
に塗布することは困難でるると述べている。また’Ｉ’
ｒａｎ−ＭｉｎｈとＢｅａｕＸ はウレアーゼとヒト血
清アルブミンを炭酸ガス電極を構成するシリコーン膜に
付着させ、さらにグルタルアルデヒドをヒト血清アルブ
ミンに溶がして上記シリコーン膜上に塗布して電極を作
成した（Ｃ。
’Ｉ’ｒａｎ−Ｍｉｎｈ ａｎｄ Ｊ ４３’ｅａｕ
ｘ ： Ａｎａｉｃｈｅｍ、。
ｘ ： Ａｎａｉｃｈｅｍ、。
５１．９１ （１９７９））、彼等はコノ方法テロ。
乏１２０μｍの酵素層を作成した。Ｌｕｂｒａｎｏ と
Ｇ旧１ｂａｕｌ ｔはグルコースオキシダーゼ又はＬ
−アミノ酸オキシダーゼと牛血清アルブミンの混合物全
グルタルアルデヒドで架橋して酵素膜を作力これを用い
てグルコース成極及びＬ−アミノ電電・臘を１乍成した
（ Ｇ、 Ｊ 、 Ｌｕｂｒａｎｏ ａｎｄ Ｇ、
Ｇ。
Ｇ旧１ｂａｕｌ ｔはグルコースオキシダーゼ又はＬ
−アミノ酸オキシダーゼと牛血清アルブミンの混合物全
グルタルアルデヒドで架橋して酵素膜を作力これを用い
てグルコース成極及びＬ−アミノ電電・臘を１乍成した
（ Ｇ、 Ｊ 、 Ｌｕｂｒａｎｏ ａｎｄ Ｇ、
Ｇ。
Ｑｕｉｌｌ）ａｕｌｔ ： Ａｎａｌ 、 Ｃｈｉｍ、
Ａｃｔａ、 ９７．２２９（’１９７８））。彼等の
酵素膜の厚さは明確にされていない。上記以外にも酵素
と生理的不活性蛋白質とをグルタルアルデヒドで架橋不
溶化した例が報舌されている（ Ｑ、Ｂｒｏｕｎ、 ｅ
ｔａｌ 、 ：１３１ｏｔｅｃｂ 。
Ａｃｔａ、 ９７．２２９（’１９７８））。彼等の
酵素膜の厚さは明確にされていない。上記以外にも酵素
と生理的不活性蛋白質とをグルタルアルデヒドで架橋不
溶化した例が報舌されている（ Ｑ、Ｂｒｏｕｎ、 ｅ
ｔａｌ 、 ：１３１ｏｔｅｃｂ 。
ＢｉＯｅｎｇ、 、 １５．３５９ （１９７３） ；
Ｄ、ＴｈＯｍａＳａｎｄ Ｑ４３ｒＯｕｎ ＨＭｅ
ｔｈｏｄｓ Ｂｎｚｙｍｏｌ 、、 ４４゜９０１ （
１９７６） ； Ｇ、 Ｂｒｏｕｎ ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙ−ｍｏｌ、、 ４４．２６３ （１９７６）
） 。上記の例はいずれも酵素膜として蛋白質膜を用
いているが、なお膜厚が犬′きく、分析サイクルを短縮
するためには不十分である。
Ｄ、ＴｈＯｍａＳａｎｄ Ｑ４３ｒＯｕｎ ＨＭｅ
ｔｈｏｄｓ Ｂｎｚｙｍｏｌ 、、 ４４゜９０１ （
１９７６） ； Ｇ、 Ｂｒｏｕｎ ：Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｅｎｚｙ−ｍｏｌ、、 ４４．２６３ （１９７６）
） 。上記の例はいずれも酵素膜として蛋白質膜を用
いているが、なお膜厚が犬′きく、分析サイクルを短縮
するためには不十分である。
上記の如き＃素膜の強度を高めるための研究もなされて
いる。高原は酵素とポリペプチドを膜状多孔質高分子担
体に含浸、吸収させた後、ジアルデヒド類を卯えて相互
に架橋させ、固定化酵素膜を作成した（特開昭５３−４
４６８７）。また羽藤らは多孔質テフロン膜中に酵素ゲ
ルを充填させている（特開昭５５−１３１３９２）。
しかしこれらの方法では酵素膜の有効表面積が小さく、
また酵素層を薄く出来ない欠点がめる。センイ状担体に
酵素を吸着させた例も幾つが知られている。例えば、山
内らはアミノアセタール化ポリビニルアルコ〜ルと他の
重曾体から−なる複合センイを酵素溶液に浸漬して固定
化酵素を傅ている（特開昭５５−４５８０１）。
いる。高原は酵素とポリペプチドを膜状多孔質高分子担
体に含浸、吸収させた後、ジアルデヒド類を卯えて相互
に架橋させ、固定化酵素膜を作成した（特開昭５３−４
４６８７）。また羽藤らは多孔質テフロン膜中に酵素ゲ
ルを充填させている（特開昭５５−１３１３９２）。
しかしこれらの方法では酵素膜の有効表面積が小さく、
また酵素層を薄く出来ない欠点がめる。センイ状担体に
酵素を吸着させた例も幾つが知られている。例えば、山
内らはアミノアセタール化ポリビニルアルコ〜ルと他の
重曾体から−なる複合センイを酵素溶液に浸漬して固定
化酵素を傅ている（特開昭５５−４５８０１）。
しかしこの種のものは電極用酵素膜に成形するためには
不適当てろる。
不適当てろる。
本発明の目的は、ウレアーゼと他のゲル化し易い蛋白質
の混合物を用いて僕めて薄く且つ酵素活性の高い固定化
ウレアーゼ膜を作力、この膜とアンモニウムイオン′を
極とを組み合わせて応答速度の極めて大きいＢＵＮ電極
を提供することにるる。
の混合物を用いて僕めて薄く且つ酵素活性の高い固定化
ウレアーゼ膜を作力、この膜とアンモニウムイオン′を
極とを組み合わせて応答速度の極めて大きいＢＵＮ電極
を提供することにるる。
水溶液中の尿素がウレアーゼに接すると、尿素はアンモ
ニアと二酸化炭素に加水分解され、さらにアンモニアは
水と反応してアンモニウムイオンが生じる。
ニアと二酸化炭素に加水分解され、さらにアンモニアは
水と反応してアンモニウムイオンが生じる。
したがってウレアーゼによってガロ水分解されて生じた
アンモニウムイオンの量を測定すれば、尿素の虚ヲ知る
ことが出来る。ＢＵＮ或極はこの原理に基づいて皿烈中
の尿素窒素を測定する峨惚である。その構成を模式的に
第１図に示す。図において、１は不溶化蛋白質薄膜であ
る固定化ウレアーゼ膜、２はアンモニウムイオン感応膜
、３は電極筒、４はＡｇ−ＡｇＣ，ａ電極、５は内部電
解液である。
アンモニウムイオンの量を測定すれば、尿素の虚ヲ知る
ことが出来る。ＢＵＮ或極はこの原理に基づいて皿烈中
の尿素窒素を測定する峨惚である。その構成を模式的に
第１図に示す。図において、１は不溶化蛋白質薄膜であ
る固定化ウレアーゼ膜、２はアンモニウムイオン感応膜
、３は電極筒、４はＡｇ−ＡｇＣ，ａ電極、５は内部電
解液である。
試料中の尿素が固定化ウレアーゼ膜に接すると、前記の
ようにアンモニウムイオンが生じ、このアンモニウムイ
オンによりアンモニウムイオン感応膜２の膜電位が変化
する。この膜電位の変化量は生じたアンモニウムイオン
量、したがって試料中の尿素量、に依存するので、これ
を測定すれば尿素量が判明する。すなわち、との成極の
感度は固定化ウレアーゼ膜の酵素活性とアンモニウムイ
オンの透過性に依存し、また応答速度はアンモニウムイ
オンの透過性に依存する。さらに分析サイクルを高める
ためには、アンモニウム感応膜に達したアンモニウムイ
オンが消失して感応膜の膜電位が元に戻る必要がある。
ようにアンモニウムイオンが生じ、このアンモニウムイ
オンによりアンモニウムイオン感応膜２の膜電位が変化
する。この膜電位の変化量は生じたアンモニウムイオン
量、したがって試料中の尿素量、に依存するので、これ
を測定すれば尿素量が判明する。すなわち、との成極の
感度は固定化ウレアーゼ膜の酵素活性とアンモニウムイ
オンの透過性に依存し、また応答速度はアンモニウムイ
オンの透過性に依存する。さらに分析サイクルを高める
ためには、アンモニウム感応膜に達したアンモニウムイ
オンが消失して感応膜の膜電位が元に戻る必要がある。
これもまたウレアーゼ膜のアンモニウムイオン透過性に
依存する。
依存する。
本発明省らは広範な実験を行った結果、ウレアーゼ、蛋
白質膜が酵素活性が高く且つアンモニウムイオン透過性
に優れていること、またこの種の固定化酵素膜でも、文
献に記載されているような膜厚の大きなものは高速生化
学自動分析用電極の酵素膜としては十分でないことを見
出した。さらに、これらの酵素膜を機械的強度に優れた
高分子センイよｐなる不織布の間隙に形成せしめること
により、実用性に優れた固定化酵素膜が得られることを
見出した。
白質膜が酵素活性が高く且つアンモニウムイオン透過性
に優れていること、またこの種の固定化酵素膜でも、文
献に記載されているような膜厚の大きなものは高速生化
学自動分析用電極の酵素膜としては十分でないことを見
出した。さらに、これらの酵素膜を機械的強度に優れた
高分子センイよｐなる不織布の間隙に形成せしめること
により、実用性に優れた固定化酵素膜が得られることを
見出した。
以下、本発明を実施例に基づいて詳しく説明する。
実施例１
ウレアーゼ（東洋紡製酵素標品、酵素活性１８■Ｕ／■
）ｌｏｏｍｙ、牛血清アルブミ：／３０ｍＶを６０ｍＭ
リンｆリンカトリウム緩衝１（ｐＨ７，６）１ｍｌに溶
かし、これに２．５％グルタルアルデヒド水溶液０．３
ｍｌを加え、静かに攪拌した後、その適当量をガラス
板上に流し、空気中に放置、乾燥させた。次いでガラス
板をアセトン中に浸し、再び乾燥させた。このガラスを
酵素膜を上にして静かに水中に浸して膜をガラスよシ剥
離させた。上記のウレアーゼ・アルブミン溶液は速やか
にゲル化するため、溶液調裏抜の時間とガラス板上に流
す量を適当に選ぶことによシ、約５μｍ〜１５０μｍの
５糧類の厚さの固定化ウレアーゼ膜を得た。
）ｌｏｏｍｙ、牛血清アルブミ：／３０ｍＶを６０ｍＭ
リンｆリンカトリウム緩衝１（ｐＨ７，６）１ｍｌに溶
かし、これに２．５％グルタルアルデヒド水溶液０．３
ｍｌを加え、静かに攪拌した後、その適当量をガラス
板上に流し、空気中に放置、乾燥させた。次いでガラス
板をアセトン中に浸し、再び乾燥させた。このガラスを
酵素膜を上にして静かに水中に浸して膜をガラスよシ剥
離させた。上記のウレアーゼ・アルブミン溶液は速やか
にゲル化するため、溶液調裏抜の時間とガラス板上に流
す量を適当に選ぶことによシ、約５μｍ〜１５０μｍの
５糧類の厚さの固定化ウレアーゼ膜を得た。
上記の固定化ウレアーゼ膜をニュートラルキャリア型ア
ンモニウム電極にとシ付は第１図に示すようなりＵＮ電
極を作った。
ンモニウム電極にとシ付は第１図に示すようなりＵＮ電
極を作った。
上記成極の特性を第２図に示した測定系を用いて評価し
た。図において、６はセル、７はＢＵＮ電極、８は比較
電極、９は接地電極、１０は試料注入器、１１は細管、
１，２はポンプ、１３は緩衝液である。
た。図において、６はセル、７はＢＵＮ電極、８は比較
電極、９は接地電極、１０は試料注入器、１１は細管、
１，２はポンプ、１３は緩衝液である。
セルに２ ｍｌ ／ ｍｉｎの速度で緩衝液を流し、こ
れに尿素溶液（窒素量３００■／ｄ７）２０μｔを注入
し、フロ一方式で電極の電位変化を測定した。
れに尿素溶液（窒素量３００■／ｄ７）２０μｔを注入
し、フロ一方式で電極の電位変化を測定した。
電位変化量は、５μｍの膜で７５ｍＶ、２０μｍの膜で
６９ｍＶ、３０μｍの膜で６３ｍＶ、５６μｍの膜で３
６ｍＶ、１５０μｍの膜で２２ｍＶであシ、薄い固定化
ウレアーゼ膜を用いる程・電位変化量が大きかった。電
位変化が始まってから元のベースラインに戻るまでの回
復時間（実際にはそれぞれの電位変化量の１％のレベル
に戻るまでの時間を計測した）も、固定化つＶアーゼ膜
が薄い程短かく、回復時間が２分以内であったのは５μ
ｍ及び２０μｍの膜であった。
６９ｍＶ、３０μｍの膜で６３ｍＶ、５６μｍの膜で３
６ｍＶ、１５０μｍの膜で２２ｍＶであシ、薄い固定化
ウレアーゼ膜を用いる程・電位変化量が大きかった。電
位変化が始まってから元のベースラインに戻るまでの回
復時間（実際にはそれぞれの電位変化量の１％のレベル
に戻るまでの時間を計測した）も、固定化つＶアーゼ膜
が薄い程短かく、回復時間が２分以内であったのは５μ
ｍ及び２０μｍの膜であった。
窒素量ｏ、ｓｍｑ、’ｃｔｚの尿素溶液を上の場合と同
様に注入して、それぞれの膜を用いたときの成極の電極
変化を測定したところ、明瞭なピークが出現したのは、
５μｍ及び２０μｍの膜を用いた電極であった。
様に注入して、それぞれの膜を用いたときの成極の電極
変化を測定したところ、明瞭なピークが出現したのは、
５μｍ及び２０μｍの膜を用いた電極であった。
上記の結果より、膜厚約２０μｍ以下の固定化ウレアー
ゼ膜を用いた一極が実用上好ましいことがわかった。
ゼ膜を用いた一極が実用上好ましいことがわかった。
実施例２
ウレアーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ
製酵素標品、活性５０ＩＵ／■）４０■、牛血清アル
ブミン８０■を６０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１）
Ｈ７，６）１ｍＪに溶かし、これに２．５％グルタルア
ルデヒド水溶液Ｑ、 ３ ｍｌを添加して、実施例１と
同様にして固定化ウレアーゼ膜を作成した。この膜全ニ
ュートラルキャリア形アンモニウム電極にとり付け、そ
の特性を実施例１と同様にして測定した。
製酵素標品、活性５０ＩＵ／■）４０■、牛血清アル
ブミン８０■を６０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（１）
Ｈ７，６）１ｍＪに溶かし、これに２．５％グルタルア
ルデヒド水溶液Ｑ、 ３ ｍｌを添加して、実施例１と
同様にして固定化ウレアーゼ膜を作成した。この膜全ニ
ュートラルキャリア形アンモニウム電極にとり付け、そ
の特性を実施例１と同様にして測定した。
測定結果は実施例１と誤差範囲で一致した。
実施例３
実施例１の組成のウレアーゼ・アルブミン・グルタルア
ルデヒド混合溶液を作り、これに市販のアンモニウムイ
オン感応性ガラス電極の感応部を浸し、次いで空気中で
ゲル化させてウレアーゼ膜を形成させた。このようにし
て最低膜厚約０．１μｍから約２０μｍまでの固定化ウ
レアーゼ膜を作成した。０．１μｍ未満の膜の被覆は欠
陥が多く発生し、困難であった。
ルデヒド混合溶液を作り、これに市販のアンモニウムイ
オン感応性ガラス電極の感応部を浸し、次いで空気中で
ゲル化させてウレアーゼ膜を形成させた。このようにし
て最低膜厚約０．１μｍから約２０μｍまでの固定化ウ
レアーゼ膜を作成した。０．１μｍ未満の膜の被覆は欠
陥が多く発生し、困難であった。
上記ウレアーゼ膜板□覆ガラス電極の１η／ｄｔ尿素溶
液に対する応答をバッチ方式で調べた。電位変化が平衝
値に達するまでの時間はいずれも２０〜２５８の範囲に
めったっ 実施例４ 日本バイリーン社製のポリエチレンテレフタレート不織
布（公称厚さ３５，６０．８０μｍの３種類）をＩＯＮ
水酸化ナトリウム溶液、６ｏｃ１に浸漬して加水分解し
た。約５分間の処理でセンイ表面は完全に加水分解され
る（染色性で評価）。
液に対する応答をバッチ方式で調べた。電位変化が平衝
値に達するまでの時間はいずれも２０〜２５８の範囲に
めったっ 実施例４ 日本バイリーン社製のポリエチレンテレフタレート不織
布（公称厚さ３５，６０．８０μｍの３種類）をＩＯＮ
水酸化ナトリウム溶液、６ｏｃ１に浸漬して加水分解し
た。約５分間の処理でセンイ表面は完全に加水分解され
る（染色性で評価）。
処理時間を変えて、平均厚さ最低約１０μｍまでの不織
布を得た。これ以下の厚さのものはセンイが崩壊し作製
不可能であったつ布の厚さと重量から算出した空隙率は
５０〜７５％であった。
布を得た。これ以下の厚さのものはセンイが崩壊し作製
不可能であったつ布の厚さと重量から算出した空隙率は
５０〜７５％であった。
実施例１の組成のウレアーゼ・アルブミン・グルタルア
ルデヒド混合溶液を水冷下で作成し、こ（７）ｉＫ上記
ポリエチレンテンフタレート不織布を浸漬して不織布セ
ンイ間隙にウレアーゼ・蛋白質薄膜を形成させた。この
固定化ウレアーゼ膜の特性を実施例１と同様にして評価
したつウレアーゼ膜の厚みは場所により多少異なってい
たが、蛋白をコーマシューブルーで公知方法で染色し、
ソノ吸光度測定及び断面の電子顕微鏡による観察結果よ
シ、実験の範囲では、６０μｍ以下の厚さの不織布では
常に全面、あるいは部分的に２０μｍ以下の厚さのウレ
アーゼ膜が形成された。不織布の厚さが増すとそれによ
る応答速度の低下が認められ、実用的には５０μｍ以下
であることがＡ１しかった。第３図に２５μｍと６０μ
ｍの２種類の不織布にウレアーゼを固定化したときの結
果を示した。
ルデヒド混合溶液を水冷下で作成し、こ（７）ｉＫ上記
ポリエチレンテンフタレート不織布を浸漬して不織布セ
ンイ間隙にウレアーゼ・蛋白質薄膜を形成させた。この
固定化ウレアーゼ膜の特性を実施例１と同様にして評価
したつウレアーゼ膜の厚みは場所により多少異なってい
たが、蛋白をコーマシューブルーで公知方法で染色し、
ソノ吸光度測定及び断面の電子顕微鏡による観察結果よ
シ、実験の範囲では、６０μｍ以下の厚さの不織布では
常に全面、あるいは部分的に２０μｍ以下の厚さのウレ
アーゼ膜が形成された。不織布の厚さが増すとそれによ
る応答速度の低下が認められ、実用的には５０μｍ以下
であることがＡ１しかった。第３図に２５μｍと６０μ
ｍの２種類の不織布にウレアーゼを固定化したときの結
果を示した。
実施例５
平均厚さ約２５μｍの親水化処理ポリエチレンテレフタ
レート不織布を用いて、実施例４に準じて固定化ウレア
ーゼ膜を作成した。この膜とニュートラルキャリアｉ形
アンモニウム゛電極とを組み合わせ今Ｂ“ＵＮ電砺を作
シ、溶液中の尿素を測定し、検量線を画い尼゛。その結
果を第４図に示した。ここでキャリア緩衝液の流速は２
ｍΔ／朋、試料注入量は２０μｔとした。尿素窒素量１
〜３００η／ｄｔの広い濃度範囲にわたって測定可能で
あった。
レート不織布を用いて、実施例４に準じて固定化ウレア
ーゼ膜を作成した。この膜とニュートラルキャリアｉ形
アンモニウム゛電極とを組み合わせ今Ｂ“ＵＮ電砺を作
シ、溶液中の尿素を測定し、検量線を画い尼゛。その結
果を第４図に示した。ここでキャリア緩衝液の流速は２
ｍΔ／朋、試料注入量は２０μｔとした。尿素窒素量１
〜３００η／ｄｔの広い濃度範囲にわたって測定可能で
あった。
第５図は上記電極を用いて血清試料を長期間にわたって
測定し、その寿命を調べた結果であるっ日々血清試料を
測定し、１日の終わりに窒素量２００ｍｇ／ｄｉの標準
尿素溶液を注入して成極活性を評価した。図には５日毎
の値を示しである。
測定し、その寿命を調べた結果であるっ日々血清試料を
測定し、１日の終わりに窒素量２００ｍｇ／ｄｉの標準
尿素溶液を注入して成極活性を評価した。図には５日毎
の値を示しである。
また６０日間に２５４０の血清検体を測定した。
成極性能は保々に低下するが２力月程度の使用にたえる
ことがわかる。
ことがわかる。
本発明によれば、酵素活性が十分高く、窒素量１〜３０
０■／ｄｔの広い濃度範囲の尿素を定量することが出来
、かつ応答速度が速いＢＵＮ電極が得られるので、緊急
検査をはじめ広く臨床検査に使用出来る生化学自動分析
装置にこれを適用することか可能になる。
０■／ｄｔの広い濃度範囲の尿素を定量することが出来
、かつ応答速度が速いＢＵＮ電極が得られるので、緊急
検査をはじめ広く臨床検査に使用出来る生化学自動分析
装置にこれを適用することか可能になる。
第１図はＢＵＮ電極の模式図、第２図は測定系を示す略
図、第３図は測定信号を示す図、第４図は検量線を示す
図、第５図は寿命測定結果を示す図である。 １・・・固定化ウレアーゼ膜、２・・・アンモニウムイ
オン感応膜、３・・・電極筒、４・・・Ａ ｇ −ｈｇ
（＝を電極、５・・・内部電解液、６・・・セル、７・
・・ＢＵＮ電極、８・・・比較電極、９・・・接地成極
、１０．・、試料注入器、■ １ 図 好 ？ 図 ■ ３ 出 第 ４ 図 富・ η ５ 図 ３ρ［ ｔ 晴朗（Ｂ）
図、第３図は測定信号を示す図、第４図は検量線を示す
図、第５図は寿命測定結果を示す図である。 １・・・固定化ウレアーゼ膜、２・・・アンモニウムイ
オン感応膜、３・・・電極筒、４・・・Ａ ｇ −ｈｇ
（＝を電極、５・・・内部電解液、６・・・セル、７・
・・ＢＵＮ電極、８・・・比較電極、９・・・接地成極
、１０．・、試料注入器、■ １ 図 好 ？ 図 ■ ３ 出 第 ４ 図 富・ η ５ 図 ３ρ［ ｔ 晴朗（Ｂ）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ウレアーゼ及びこれと異なる蛋白質の混合物を薄膜
状に成形し、小石化処理して成る厚さ０．１〜２０μｍ
の不溶化蛋白質薄膜とアンモニウム電極とを一体化した
ことを特徴とする水浴液中の尿素測定用酵素′電極。 ２、上記不溶化蛋白質薄膜が平均厚さ１０〜６０μｍ１
空隙率５０〜７５％の表面親水処理化ポリエチレンテレ
フタンート不織布を保持体として、＠記保愕体の空隙に
蛋白質薄膜を形成せしめて成るものである時計６９求の
範囲第１項記載の酵素電極。 ３、上記不溶化蛋白質薄膜が譲アルカリを用いてセンイ
表面を加水分解した親水処理化ポリエチレンテレ７タレ
ート不織布をウレアーゼ及びアルブミン並びにジアルデ
ヒドよシ成る混合溶液に反潰し、次いで空気中で前記蛋
白質をゲル化させることによシ形成せしめてなるもので
ある特許請求の範囲第２項記載の酵索醒極。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58008728A JPS59135360A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | 酵素電極 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58008728A JPS59135360A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | 酵素電極 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59135360A true JPS59135360A (ja) | 1984-08-03 |
Family
ID=11701006
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58008728A Pending JPS59135360A (ja) | 1983-01-24 | 1983-01-24 | 酵素電極 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59135360A (ja) |
-
1983
- 1983-01-24 JP JP58008728A patent/JPS59135360A/ja active Pending
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