JPS59132887A - ヒト血液型抗原kに対して特異的なモノクロ−ナル抗体並びにこれを産生するハイブリド−マ細胞ライン - Google Patents

ヒト血液型抗原kに対して特異的なモノクロ−ナル抗体並びにこれを産生するハイブリド−マ細胞ライン

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JPS59132887A
JPS59132887A JP58252362A JP25236283A JPS59132887A JP S59132887 A JPS59132887 A JP S59132887A JP 58252362 A JP58252362 A JP 58252362A JP 25236283 A JP25236283 A JP 25236283A JP S59132887 A JPS59132887 A JP S59132887A
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JP58252362A
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ハ−・ハ−・ゾ−ネボルン
アルム−ト・ブフエフア−
ゲルトル−ト・シユルテ
ギゼラ・マン
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    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト血液型抗原K (cellan=g )に
対して特異的なモノクローナル抗体すなわちヒト赤血球
の血液型特徴Kに対して特異aを有する抗体表らびに、
このモノクローナル抗体を産生ずるハイプリドーマ細胞
ラインに関する。
抗体は以前から、医学的診断に用いられている。
しかし、均質性抗体を得ることはその複雑性及び多面性
に基づいて困難であるので、その利用性は成る程度限定
されている。抗体はヒトまたは動物全抗原から保護する
ためにヒトまたは動物の免疫系によって産生される複雑
な蛋白質分子または蛋白質ペースの分子である。医学的
用途の抗体は動物の免疫系全刺激する抗原全動物に注入
し、末梢血管血清または腹水液から抗体フラクションを
単離することによって、一般に得られる。
抗体フラクションは注入した抗原または動物が産生ずる
他の多くの抗原に対する特異性を有する抗体全含んでい
る。公知の方法によって、一定の抗原に対して特異性を
有する抗体を実際に単離することが可能であるが、一定
の抗原に対する抗体を単離した場合でさえも、この抗体
は大ていは抗原の種々な抗原決定因子と反応し得る、種
々な抗体の混合物である。
細胞に試験管内で、特異性抗体を多量にかつ長期間にわ
たって産生させようという試みは、細胞が試験管内では
迅速に不活化され、その抗体産生を停止することで、生
新している。
最近、均質な高特異性抗体の製造全可能にするようなモ
ノクローナル抗体製造方法が開発された。一般にこのよ
5力抗体は、動物を抗原で免疫化し、この動物から抗体
産生細胞を得、この抗体産生細胞を腫瘍細胞ライン、例
えば骨髄腫細胞ラインと融合させることによって、ハイ
ブリドーマを得、これを単離し、モノクローナル抗体を
産生させることによって製造される(K+:+hler
、GとMilstein 、 O著Eur、J、Irr
muno16巻511〜51(1頁(1976年) +
 Kohler、 GとMilstein、 0.、 
Nature、 256 、495頁(1975年)参
照〕。
ハイブリドーマ細胞はその一方の「親成分」から、完全
に限られた抗体を産生ずるという可能性をもらっておシ
、他方の「親成分」すなわち骨髄腫から、長期間にわた
って再分裂するという可能性をもらっている。
このハイブリドーマは試験管内でもまた宿主動物におけ
る腫瘍としても増殖する。
各抗体産生細胞(クローン)は唯一の特異性をもつ抗体
のみを形成するので、特異性全有するこのようなりロー
ンから増殖するノ・イブリドーマのモノクローン培養は
その都度均質な抗体を製造するため、このような抗体全
試験管内のノーイブリドーマ培養の培地からもまたは腫
瘍含有宿主動物の細胞、腹水液または血清からも得るこ
とができる。
多くのハイブリドーマは他の抗原に対して免疫化された
動物が産生ずる抗体全も生ずるので、新形成細胞と抗体
産生細胞との融合から生じたハイブリドーマが全て、目
的の抗原に対して特異的であるとは限らない。種々の細
胞からの抗体は同じ分子の種々な抗原決定因子と反応す
ることができるので、特定の抗原に対する抗体さ、tも
がクローンによって異なることがある。そのため、生゛
底する抗体または抗体含有培地、血清または腹水を特定
抗原に対する反応性に関して試験し、またそれが他のい
ずれの抗原と反応するか全調べることによってその反応
性を試験することが必要である。
このようにして製造されたモノクローナル抗体はその均
質性と高い特異性のために、診断用に特に貴重である。
血液型特徴AとBに対する特異性を有するモノクローナ
ル抗体はすでに公知であり、輸血療法内でのこの血液型
特徴の判定および法医学検査に用いられる( Voak
、D、、5acks、8.、Alderson。
T、 、Takei 、F、 、Lennox 、E、
 、Jartyi s 、J、 、Mi 1 ste 
in 。
C0及びDarnborough、J 、 (1980
)著 ハイプリッF骨髄腫からのモノクローナル抗A:
血液型判定試薬としての評価、Vox 8anguin
is 39巻。
134〜140頁参照〕。
しかし、ヒト赤血球の他の血液型特徴に対して特異性金
有する抗体を製造する必要性が生じている。
本発明によって、ヒト赤血球の血液型特徴K(Oel 
1ano )に対して特異性含有するモノクローナル抗
体が今回製造された。血液型特徴に乃至Oe I I 
an 、oの定義に関しては、 0.Prokap、W
C3’;hler著「ヒトの血液型J Gustey 
−Fischer出版にューヨーク)1976年発行、
101〜104頁参照。
血液型特徴Kに対して特異性を有する抗体の産生全刺激
するために、動物にヒトのに一陽性赤血球で免疫化した
。このための動物種属の選択は決定的なものではないが
、動物の種属は発生学的に適切に限界全定めるべきであ
る。例えば。
ラット、マウス等の種々のネズミ種属に対してこのこと
は該当し、種々の新形成細胞がネズミから充分に特徴づ
けられた培養として得られるので、本発明による抗体の
製造にはマウスを用いた。しかし、他の動物もこの目的
に使用可能である。
BALB10マウスをヒトのに一陽性赤血球の静注によ
って免疫化した。最後の注入後にマウス全般し、融合実
験のために膵臓細胞を採取した。
この後、膵臓細胞懸濁液を製造した。次に膵臓細胞懸濁
液全バンク媒質中での遠心分離によって洗浄する。この
ようにして得られた抗体産生細胞を新形成細胞と融合さ
せる。幾つかの腫瘍細胞、特に骨髄腫細胞は抗体産生細
胞と有利に融合し、ハイブリドーマの生活力ある抗体産
生培養を提供する。腫瘍細胞と抗体産生細胞は同じ種属
に由来するものであることが望ましく、このような場合
には親細胞の発生学的及び生化学的性質が良好に調和す
る確率が大きいので、生活力あるハイブリドーマを製造
することができる。
本発明によって使用できる、充分に特徴づけられる骨髄
腫細胞ラインは多く存在する。この例はP3−X63−
At8、P3−X63−At8.653.8194、Y
3,5P210.MPO−11及びこれらの誘導体であ
る。特に、P3−X63−A48.653(ONOMI
−251)ライン(Kearney等−J。
Immunol 123号1548頁(1979年)〕
の使用が望ましい。また、生成するハイブリドーマが親
−膵臓またはリンノ々節−細胞の抗体鎖のみを産生ずる
ように、抗体を産生しない骨髄腫ラインを選択するのが
望ましい。
骨髄腫細胞は10%FO8i添加したR、 P M 1
1640に合目的に保持される。骨髄腫細胞とヒトに陽
性赤血球で免疫化したマウスから採取した細胞とは、K
ohler、G、とMilstein、 0.  の方
法[Bur、J、Immunol、 6巻、292(1
976年)〕によって融合する。ハイボキサンテiアミ
ノゾテリンーテミジン(RAT)媒質の使用によってハ
イプリドーマ全選捩するならば、HAT 媒質中での成
長はマウス−膵臓細胞とマウス−骨髄腫細胞の効果的な
ハイブリッドを示す。マウスの免疫化に用いたに陽性赤
血球に対する抗体が製造されたことは、血液凝集テスト
によって確認した。ハイブリッド細胞は「限定希釈方法
」によって、ミクロ選定プレートでクローン化する。
ハイプリP−マのクローンは、例えばコツトン等がBu
r、J、Immunol 、 3巻136頁(1973
年)に4述べているように、公知の組織培養法によって
、試験管内で培養することができる。しかし、代替的に
ハイブリドーマは生体内でも、組織親和性動物または無
気力な無毛マウスにおける腫瘍として培養することがで
きる。抗体は試験管内培地からあるいは血清または腹水
液から、公知の方法によって得られる。
各クローンの抗体がヒト赤血球の血液型特徴Kに対して
特異性であることを、血液凝集テストによって確認し、
ヒト赤血球の血液型特徴Kに対して特異性を示す抗体産
生クローンを選別する。
実施例 ハイプリドーマ細組ラインの製造BALB10
マウスに5X108 ヒトに陽性赤血球全週2回、全体
で10回注入した。最後の注入をした4日後に、マウス
を殺害し、膵臓細胞を融合実験用に採取した。
次に、肺臓細胞懸濁液全製造し、肺臓細胞懸濁液をバン
ク媒質中での遠心分離(800Xf)2回によって洗浄
した。
前述の方法によって得た膵臓細胞108個と、10%F
O8を添加したR、PM11640中に保持されたマウ
ス骨髄腫細胞P’3−X63−AP8.653(ONO
MI−251)10’個の融合に゛よって、ハイブリド
ーマ細胞ラインが得られた。
混会細胞全5ooxrにおいて2回遠心分離し、融合さ
せるために、40 (V/Y)%のポリエチレンクリコ
ール(PEG)4000バンク媒質溶液に再懸濁させ、
ハイブリドーマ1HAT媒質の使用によって、次のよう
に選別し、血液型特徴Kに対して特異性を有する抗体に
関して試験した。
ミクロ選定プレートの570凹みに細胞懸濁液200μ
t(細胞濃度1.3 X 105細胞/ゴ)全加えた。
37℃、5%002において12日間インキュベーショ
ンさせた後に、224凹みにおいてクローンが検出され
た。
224凹みの中の174凹みの上澄みを血液型抗原に対
する抗体に関して試験した。
上澄みを公知の小筒遠心分離テストと抗ヒトグロブリン
テストによる直接の凝集テストによって試験した。
この上澄みの1つは抗ヒトグロブリンテス)を適用した
際に、血液型抗原KVC対する特異性を示した。
この凹みを「限定希釈法」によってクローン化した。全
体で384個のミクロ選定プレート凹みに加えた。この
中の316個(はクローン成長含水し、その中の70個
でけ1クローンのみが成長した。この70凹みを特異性
に関して試験した。70凹みの中の66個は血液型特徴
Kに対して陽性であった。
次の表は種々の細胞によって得られたハイブリドーマ上
澄みの典型的な反応?示す。
表に記載した反応型を有する抗体含水したノ・イブリド
ーマを、「限定希釈法」によってクローン化した。
このようにして得られたノ・イブリドーマラインを確定
し、上澄みにおいても、BALB10マウノにハイプリ
ドーマライン全接種した後に得た腹水液においても、テ
スト赤血球を用いて特異性と親和性に関して、試験した
得られたハイブリトーマライン全NO,BS 45 (
ONOMI−268)として確定して、寄託した。
ハイブリドーマラインはIf’G1クラスの抗体全製造
する。ラインB S 45 (CNOM I −268
)は、望壕しくはFl、PM11640媒質中の細胞懸
濁培養において、この抗体を永久に製造する。
ハイプリドーマラインB 845 (ONOM I−2
68) l’i BALB、10マウスにおける腹腔内
腫瘍としても成長し、この条件下で前述の特異性を有す
るIrG1抗体を産生し、この抗体は腫瘍含有動物の腹
水から採取される。
本発明による抗体は輸血療法及び法医学検査用の貴重な
手段である。
特許出願人 ビオテストーセルムーインステチュートゲゼルシャフト
 ミツト ペシュレンクターハフツング 外2名 号 3” フルドア0ボーネマン・ストラー 上20イー フルトーニーデルラット・オー デンバルトストラーセ32 フルドア0オツフエンバツフエル ・ラントストラーセ237 手続補正書 昭和59Fト2 、j!15  日 特許庁長官殿 1、事件の表示 昭和58年特許願第252562号 2、発明の名称 ヒト血液型抗原Kに対して特異的なモノクローナル抗体
並びにこ扛?産生するハイブリドーマ細胞ライン3、補
正をする者 事件との関係   特許出願人 ビオテストーセルムーインスチチュート ゲゼルシャフ
ト ミットベシュレンクター ハフラング 4、代 理 人 5、補正命令 の日付(自発) 昭和 −年  月  日 !’ ””””−、、−15,,1 6、 補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 7、 補正の内容 明M書第3頁第16行乃至第18行の「抗体7ラクシヨ
ン・・・・・・抗体を含んでいる。」を下記の通り訂正
する。
記 「抗体フラクションは注入した抗原に対する特異性を有
する仇体並ひに動物が産生ずる他の多くの抗体金含んで
いる。」

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、 抗体産生動物細胞と新形成細胞との融合によって
    得られる、ヒトの赤血球血液型特徴に対して特異性を有
    する抗体を製造するハイブリドーマ細胞ラインにおいて
    、ヒト赤血球の血液型特徴Kに対する特異性を有する抗
    体ヲ製造することを特徴とする細胞ライン。 2、 抗体産生細胞がネズミ起源のものであることを特
    徴とする特許請求の範囲第1項記載の細胞ライン。 3、抗体産生細胞がB A L poマウス牌臓細胞で
    あること全特徴とする、特許請求の範囲第1項または第
    2項記載の細胞ライン。 4、 新形成細胞が骨髄腫細胞であること全特徴とする
    、特許請求の範囲第1項から第3項までのいずれか1項
    記載の細胞ライン。 5、 新族攻葦1が、抗体を産生しない骨髄腫細胞ライ
    ンp3−x63−Ajs、ss3(oNaM■−251
    )であることを特徴とする特許請求の範囲第1項から第
    4項までのいずれか1項記載の細胞ライン。 6、 ハイブリドーマ細胞ラインBS45(ONOMI
    −268)。 7 ヒト赤血球の血液型特徴KK対して特異性を有する
    ことを特徴とするモノクローナル抗体。 8、 特許請求の範囲第1項から第6項までのいずれか
    1項記載のハイブリドーマ細胞ラインによって製造する
    ことを特徴とする特許請求の範囲第7項記載のモノクロ
    ーナル抗体。 9、 ヒト赤血球の血液型特徴に決定に用いる特許請求
    の範囲第7項または第8項記載のモノクローナル抗体。
JP58252362A 1982-12-30 1983-12-29 ヒト血液型抗原kに対して特異的なモノクロ−ナル抗体並びにこれを産生するハイブリド−マ細胞ライン Pending JPS59132887A (ja)

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DE32486189 1982-12-30
DE3248618 1982-12-30

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EP (1) EP0115063B1 (ja)
JP (1) JPS59132887A (ja)
AT (1) ATE32267T1 (ja)
DE (1) DE3375516D1 (ja)

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Also Published As

Publication number Publication date
EP0115063A3 (en) 1986-08-27
ATE32267T1 (de) 1988-02-15
EP0115063A2 (de) 1984-08-08
EP0115063B1 (de) 1988-01-27
DE3375516D1 (en) 1988-03-03

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