JPS59109176A - 固定化生体触媒の製法 - Google Patents

固定化生体触媒の製法

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JPS59109176A
JPS59109176A JP22080282A JP22080282A JPS59109176A JP S59109176 A JPS59109176 A JP S59109176A JP 22080282 A JP22080282 A JP 22080282A JP 22080282 A JP22080282 A JP 22080282A JP S59109176 A JPS59109176 A JP S59109176A
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JP
Japan
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immobilized
enzyme
biocatalyst
porous membrane
solution
Prior art date
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Pending
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JP22080282A
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English (en)
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Toshiyuki Yamauchi
俊幸 山内
Haruyuki Date
伊達 晴行
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Panasonic Electric Works Co Ltd
Original Assignee
Matsushita Electric Works Ltd
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は反応の触媒等として用いられる固定化生体触
媒の製法に関する。
従来、化学2食品、医薬品工業等では、一般に、高温、
高圧といった過酷な条件の反応により製品が生産されて
きたが、近年、生体外で生体反応を行うことにより、製
品を生産することが試みられるようになった。生体反応
は常温常圧といった緩やかな条件で行うことができ、こ
の反応を利用すると、従来多段の反応を必要とした製造
工程をかなり短縮することができるようにもなる。生体
反応のうし、特に生体触媒である酵素を利用する反応は
、製造工程の短縮化とともに反応装置を縮小することも
でき、この二つの点からみるとコスト的に有利である。
そのうえ、この酵素反応は、無公害で反応速度が非常に
速いので、近年益々注目されるようになった。
しかし、酵素は水溶性であって、これまでは、普通、酵
素を水に溶解させた状態で酵素反応を行うようにしてい
たので、反応終了後に反応溶液中から酵素のみを分離2
回収し、再利用することは技術的に極めて困難であった
。そのため、酵素反応の反応形態としてはバッチ式が主
流であって、反応毎に酵素を分離1回収することなく消
費していた。酵素は高価であるので、酵素を再利用でき
ないということは、コスト的にみて非常に不利である。
そこで、反応ごとに酵素を分離3回収して再利用するこ
とができるよう何らかの形で酵素に修飾を行って酵素を
水不溶性にすること等、酵素を固定化することが提案さ
れた。
これまでに提案された酵素の固定化法は、一般に三つの
方法、すなわち担体結合法、架橋法および包括法に大別
することができる。もつとも普通の場合について述べれ
ば、担体結合法は酵素を担体に結合させて水不溶性とす
る方法であって、その結合様式によって、さらに共有結
合法、物理的吸着法およびイオン結合法の三つに細分さ
れる。
架橋法は酵素を2個もしく母それ以上の官能基を有する
試薬(架橋剤)と反応させ、酵素同士を架橋剤で結合さ
せて水不溶性とする方法、包括法は酵素をゲルの微細な
格子の中に包み込んだり(格子型)、半透膜性のポリマ
ーの皮膜によって被覆する(マイクロカプセル型)方法
である。
ごれらの方法で得られた固定化酵素を用いるようにずれ
ば、従来では酵素反応を回分式(バッチ式)でしか行う
ことができなかったのに対し、連続法で行うことが可能
となる。また、酵素が失活あるいは変性するまで何度も
反応に利用できるので、コス1へ的にも非常に有利とな
る。さらに、酵      ′素の基質特異性を利用し
て特定の物質を検出するセンサーをつくることができる
ようにもなる。
先に述べた固定化方法には、それぞれ、長所。
短所がある。すなわち、担体結合法のうちのイオン結合
法および物理的吸着法は、得られる固定化、酵素の酵素
活性保持率が優れているという長所を持つが、固定化に
長時間を要し、得られる固定化酵素の使用可能なpl+
範囲およびイオン強度範囲が限定さるという短所を持つ
。他方、担体結合法のうちの共有結合法と、架橋法およ
び包括法は、いずれも、得られる固定化酵素の使用条件
はさほど限定されないという長所を持つが、固定化に比
較的部しい反応を必要とするため、固定化酵素の酵素活
性保持率が低くなるという短所を持つ。
発明者らは酵素活性保持率が高く、使用条件の限定され
ない固定化酵素を短時間で得ることのできる製法を得よ
うとして研究を重ねた。その結果、酵素を多孔性膜に強
制的に固定化する方法によればよいことを見出した。ま
た、酵素を生産するため、生体触媒として用いられる微
生物菌体も同様の方法によれば、その性質を損なうこと
なく短時間で固定できるということを見出し、ここにこ
の発明を完成した。
すなわち、この発明は、生体触媒溶液の溶媒は通すが生
体触媒は通さない多孔性膜の一方に生体触媒溶液が配置
された系を準備し、この系に対し、前記生体触媒溶液側
が高くその反対側が低い圧力差を住じさせることによっ
て、生体触媒を前記多孔性膜に固定させることを特徴と
する固定化生体触媒の製法をその要旨とする。以下、こ
の発明の詳細な説明する。
ここで、生体触媒としては、酸化還元酵素、転移酵素、
加水分解酵素、脱離酵素、異性化酵素。
合成酵素等の酵素、たとえばインへルターゼ、トリプシ
ン、グルコース、オキシダーゼ等の酵素のうちの少なく
とも1種、あるいはEscberichia co−1
i、Pseudomonas  putida等の微生
物菌体のうちの少なくとも1種が用いられ、酵素と微生
物菌体の両者が同時に用いられることもありうる。溶媒
としては、水等の酵素や微生物菌体を均一に分散させう
るものが用いられる。多孔性膜としては、生体触媒溶液
の溶媒は通ずが生体触媒は通さないものが用いられ、た
とえばセロファン膜、コラーゲン膜等が好ましく用いら
れるが、酵素や微生物菌体の種類に応じて適するものを
選ぶ必要がある。
この発明にかかる固定化生体触媒の製法は、たとえば第
1図に示されているような装置を用いて実施される。図
にみるように、この装置は、パイプがU字形に曲げられ
てなる容器1を備えている。
容器1の中間部には多孔性11ii2が通路を塞ぐよう
に張られて固定されており、この多孔性膜2により容器
1は二つのへやA、Bに区切られている。
へやAの立ち上がり部分にはピストン3が上下移動可能
に配置されている。
まず、この装置のへやAに生体触媒溶液を入れ、へやB
には生体触媒溶液の溶媒のみを入れる。つぎにピストン
3を押すと、多孔性膜2のへやA側、すなわち生体触媒
溶液が配置された系の側の圧力が、その反対のへやB側
、すなわち溶媒側に比べ高くなる。そうすると、この圧
力差にもとづき、生体触媒溶液の溶媒はへや入側からへ
やB側に移動する。他方、生体触媒は溶媒とともに移動
しようとするが、多孔性膜2をii1過することができ
ず、多孔性膜2の表面に吸着されたり、多孔性膜2内部
の微少な空洞中に閉し込められたりする等して、強制的
に多孔性膜2に固定される。
このように、この発明にかかる製法では固定化のために
激しい反応を必要としないので、酵素を固定する場合は
得られる固定化酵素の酵素活性保持率が高くなり、微生
物菌物を固定する場合はその性質が損なわれない。また
、この発明にかかる製法によれば、得られる固定化酵素
の使用条件が限定されないし、短時間で生体触媒を固定
することができる。
なお、前記の製造例では、へやAに生体触媒溶液を入れ
、へやBに溶媒を入れるようにしたが、両者を逆にして
入れるようにし、ピストンを引くようにしても、多孔性
膜の生体触媒溶液側の圧力を溶媒側よりも高くすること
ができる。生体触媒溶液の反対側に溶媒を入れるように
する必要がない場合もありうる。また、製造装置は第1
図に示されているようなものに限られるものではない。
要するに、多孔性膜の生体触媒溶液側が高く、その反対
側が低い圧力差を生じさせることができる糸を作ること
ができれば、どのような装置でもよいのである。
この発明にかかる固定化生体触媒の製法はこのように構
成されるものであって、前記のように圧力差にもとづき
生体触媒を強制的に多孔性膜に固定するので、固定化に
要する時間が短くてすむ。
また、酵素を固定する場合では、活性保持率の高い固定
化酵素が得られるようになった。そして、この製法によ
れば、酵素を多量に固定することができ、得られる固定
化酵素の使用条件が限定されず、そのうえ活性の安定性
が良好となることが確められた。微生物菌体を固定する
場合では、その性質が損なわれない。
つぎに、実施例および比較例について説明する。
〔実施例1〕 第1図に示されている装置において多孔性膜としてセロ
ファン膜(厚み80.um)を用い、この装置によりイ
ンへルターゼを固定した。
マス、へやAに5■/mβのインベルターゼ水溶液を入
れるとともに、へやBに水を入れた。つぎにピストンを
押して、セロファン膜のインベルターゼ水溶液側の圧力
を水側よりも2kg / ctAだけ高くした。そうす
ると、セロファン膜にインベルターゼが固定され、固定
化酵素が得られた。
比較例1として、実施例1と同様にしてセロファン膜の
片方にインベルターゼ水溶液、他方に水を配置したが圧
力差は生じさせなかった。
実施例1および比較例1におけるセロファン膜に固定さ
れた酵素タンパクの量(固定化収率)の(9) 経時変化を測定した。ただし、固定化収率はっぎのよう
にして算出した。すなわち、インベルターゼ水溶液の酵
素タンパクの初濃度および時間経過後濃度(残余酵素濃
度)を+−o w r y法により測定し、この測定値
をもとにし、つぎの式を用いて算出した。
×100 測定結果を第1表に示す。
第1表 第1表より、実施例1では時間の経過とともに固定化収
率が太き(上昇しているのに対し、比較例ではほとんど
固定化収率が変化していないこと(10) がわかる。
〔実施例2〕 第1図に示されている装置において多孔性膜としてセロ
ファン膜を用い、この装置によりトリプシンを固定した
まず、へやAに6.3 mg/ m 7!のトリプシン
水溶液を入れるとともに、へやBに水を入れた。つぎに
ピストンを押して、へやA側に圧力を負荷し、セロファ
ン膜のトリプシン水溶液側の圧力を水側よりも2.0k
g/adだけ高くした。そうすると、セロファン膜にト
リプシンが固定され、固定化酵素が得られた。この固定
化酵素を5%(W/V)のグルタルアルデヒド溶液で処
理したあと、30分間洗浄して固定化標品とした。この
固定化標品を用い、基質としてのNa−ヘンシイルーD
L−アルギニン−p−ニトロアニリド塩酸(以下BAP
Aと略す)の加水分解反応を行った。反応中のBAPA
の減少を波長410nmの光線を用いて比色分析により
測定し、固定化標品の活性(比活性)を測定した。
(11) 比較例2として、包括法を用い、トリプシンをポリアク
リルアミドで包括固定した。得られた固定化酵素の活性
(比活性)を、実施例1に示したのと同様の方法により
測定した。
実施例2おまひ比較例2で得られた固定化酵素の比活性
および活性保持率を第2表に示す。ただし、Nativ
e l−リプシン(固定されでいないトリプシン)の比
活性は64.9 u/■である。
第2表 第2表より、実施例2で得られた固定化酵素は、比較例
2で得られたものに比べ比活性が高く、活性保持率が高
くなっていることがわかる。
〔実施例3〕 第1図に示されている装置において多孔性膜としてコラ
ーゲン膜を用い、この装置によりグルコースオキシダー
ゼを固定した。
(12) まず、へやAに水をいれるとともにへやBに8゜0■/
m7!のグルコースオキシダーゼ水溶液を入れた。つぎ
に、ピストンを引いてへやA側を減圧し、コラーゲン膜
のグルコースオキシダーゼ水溶液側の圧力を水側よりも
2.5 kg / ctAだけ高くした。
そうすると、コラーゲン膜にグルコースオキシダーゼが
固定され、固定化酵素が得られた。この固定化酵素を5
.2%(W/V)のグルタルアルデヒド溶液で処理して
固定化標品とした。この固定化標品の保存安定性すなわ
ち、比活性の減少率を測定した。
比較例3として、包括法を用いグルコースオキシダーゼ
をポリアクリルアミドゲルで包括固定した。得られた固
定化酵素の比活性の減少率を測定した。
実施例3および比較例3で得られた固定化酵素の比活性
の減少率の測定結果を第3表に示す。ただし、固定化酵
素の作製後の保存は常温かつ緩衝液中で行うようにした
。また、基質として1Mグルコース水溶液を用いて測定
を行った。
(13) 第3表 第3表より、実施例3で得られた固定化酵素は、比較例
3で得られたものより活性の減少率が小さく、活性が安
定していることがわかる。
【図面の簡単な説明】
第1図はこの発明にかかる固定化生体触媒の製法におい
て使用される製造装置の構造説明図である。 1・・・容器 2・・・多孔性膜 A、B・・・へや 
3・・・ピストン 代理人 弁理士  松 本 武 彦 (14) 第1図 手続補正書(自発) 131058年 4月20日 ■計ロ57年特許願第220802号 2、発明の名称 固定化生体触媒の製法 3、補正をする者 事件との関係     特許出願人 柱   所    大阪府門真市大字門真1048番地
名 称(583)松下電工株式会社 代 表 者    代表取締役 小 林  郁4、代理
人 な   し 6、補正の対象 明細書の特許請求の範囲欄および発明の詳細な説明欄〜
7、補正の内容 (1)明細書の特許請求の範囲欄の全文を別紙のとおり
に訂正する。 (2)  明細書第6頁第10行ないし同頁11行の1
コラーゲン膜」と「等が好ましく」の間に、「に−カラ
ギーナン膜、アルギン酸膜、セルローストリアセテート
膜」を挿入する。 〔別紙〕 2、特許請求の範囲 (1,1生体触媒溶液の溶媒は通すが生体触媒は通さな
い多孔性膜の一方に生体触媒溶液が配置された系を準備
し、この系に対し、前記生体触媒溶液側が高くその反対
側が低い圧力差を生じさせることによって、生体触媒を
前記多孔性膜に固定させることを特徴とする固定化生体
触媒の製法。 (2)生体触媒が酵素である特許請求の範囲第1項記載
の固定化生体触媒の製法。 (3)溶媒が水である特許請求の範囲第1項または第2
項記載の固定化生体触媒の製法。 (4)多孔性膜がセロファン膜、ユ立二ゲノ狽ユ友五回
である特許請求の範囲第1項から第3項までのいずれか
に記載の固定化生体触媒の製法。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)生体触媒溶液の溶媒は通すが生体触媒は通さない
    多孔性膜の一方に生体触媒溶液が配置された系を準備し
    、この系に対し、前記生体触媒溶液側が高くその反対側
    が低い圧力差を生じさせることによって、生体触媒を前
    記多孔性膜に固定させることを特徴とする固定化生体触
    媒の製法。
  2. (2)生体触媒が酵素である特許請求の範囲第1項記載
    の固定化生体触媒の製法。
  3. (3)溶媒が水である特許請求の範囲第1項または第2
    項記載の固定化生体触媒の製法。
  4. (4)多孔性膜がセロファン膜およびコラーゲン膜のど
    ちらか一方である特許請求の範囲第1項から第3項まで
    のいずれかに記載の固定化生体触媒の製法。
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