JPS5910186B2 - ソシキカラタンリサイボウオチヨウセイスル ソウチ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的に生きた滅菌一次細胞を組織から得る装
置に関し、より詳しくは生きた滅菌組織細胞をニワトリ
又はアヒルの胚等から得るための半自動化法及び装置に
関する。

更に、本発明は酵素的に分離した細胞をそれらを含む液
体から分離するために有効な改良遠心分離機に関し、更
に酵素消化の前に組織を機械的に細断する改良細断装置
に関する。

本発明は又組織の細断方法に関する。細胞を紐織、例え
ばニワトリ又はアヒルの胚から得ることはそれ自体は知
られており、生化学又は免疫学の研究において有効な材
料を提供している。

典型的にはそのような組織細胞は胚を含む卵を壊しそこ
から成長しかけた胚を取り出すことによって得る。

胚は次に細片に切断し洗滌液で洗う。洗滌に続いて、細
断細胞をトリプシンのような酵素と制御温度で一定時間
混合し細胞間物質を壊し、個々の細胞又はその群を分離
する。

この酵素消化に続いて、細胞を適当な方法で酵素液から
分離する、例えば固形物を液体から分離するバケツ型、
定容遠心分離機中で混合物を回転する。

次に遠心機から回収した細胞物質は培養目的等に使用す
るまで保存する。

従来法は細胞をニワトリ又はアヒル胚のような組織から
回収するための手を使った技術を教えている。

方法は例えば胚のはさみ等を使った手による細断、洗滌
液による洗滌、続いて内容物を例えば磁石回転子を使用
して攪拌することによるフラスコ中での胚細片の酵素（
トリプシンのような）との混合を含む。

細断胚が制御温度下酵素によって消化される十分な時間
後、生じた混合物をガラスフラスコ中に注ぎ、遠心分離
して固体細胞物質を液体から分離し、その後液体をガラ
スフラスコからデカントする。

残った固体細胞物質を次に栄養液と混合し、細胞物質を
使用するまで適当な期間生きたままに保つ。

従来法はニワトリ胚からの手法による組織細胞の大量生
産は困難かつ高価であることを認織していた。

それ故、Ｆ．Ｃ．ベルト” （ Ｆ． Ｃ， Ｂｅｌｔ
ｏｎ）及びＢ，Ｐ．ガリオク（ Ｂ ， Ｐ， Ｇａｒ
ｒｉｏｃｋ ）は〔”一次細胞懸濁液の生産のための半
自動化法″（ Ａ Ｓｅｍｉ −Ａｕｔｏｍａｔｉｃ
Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏ
ｎｓ）Ｊｃｙｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＢ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
１２ ２巻、３３５−３４１ページ（１９７２）］にお
いてニワトリ胚懸濁液の生産に有効な組織生産装置を提
案している。

その論文に述べている装置は洗滌した胚を細断するため
のラム型（ ｒａｍ − ｔｙｐｅ ）切断機、酵素消
化を行う反応槽、及び細胞物質を溶液から分離するため
の多くのバケツ型遠心分離機からなる。

しかしながら、ベルトン（ Ｂｅｌｔｏｎ ）及びガリ
オク（ Ｇａｒｒｉｏｃｋ ）の述べた装置は本発明ほ
どの自動化程度を有しない。

更に、これから説明する理由のために、その従来の方法
は本発明が獲得した高い細胞収率を得ることができない
。

明らかに組織細胞を回収するためのどのような開放装置
も困難で、時間がかかり、細胞の汚染の可能性が多い。

生きた組織細胞を回収するために使用する種々の技術の
一般的な概観のために、ここではセル アンド ティッ
シュ イン カルチュア（Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｉｓ
ｓｕｅｓ ｉｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ ）、イー．エヌ．ウ
イルマ− （ Ｅ， Ｎ，Ｗｉｌｌｍｅｒ ）編集、ア
カデミック プレス社（ Ａ ｃａｄｅｍ ｉｃＰｒｅ
ｓｓ， Ｉｎｃ． ）、二”−−ヨーク（１９６５）を
参照した。

従来法の教えにもかかわらず、大量の胚を扱うことがで
き、工程中の操作を最小にして高収率を得、それ故操作
中の細胞の汚染の可能性を減少させることのできる、組
織細胞を得るための方法及び装置の必要性が存在する。

それ故生細胞を組織から得る方法及び装置を提供するこ
とが本発明の第１の目的である。

大量の胚を扱うことができ、工程中の操作を減少させ、
それ故生産する細胞スラリーの汚染の可能性を減少させ
る、胚から生きた組織細胞を得るための半自動化装置を
提供することが、本発明の更なる目的である。

処理する胚ダラム当り高収率の生細胞を与えることがで
きる胚から生きた滅菌組織細胞を得るための半自動化装
置を提供することが、本発明の更なる目的である。

高収率の細胞を得るために有効な改良遠心分離機を提供
することが本発明の更なる目的である。

胚を細断するだけでなく組織を撚って高収率の生細胞を
得ることができる胚を切断するための改良細断装置を提
供することが本発明のなお更なる目的である。

胚を細断するための方法及び胚を細胞から取り出すため
の完全な方法を提供することが本発明の更なる目的であ
る。

大量の胚を都合よく処理できる方法を提供することが本
発明の更なる目的である。

本発明の他の目的、特徴及び利点は続く記載によって明
らかとなるであろう。

要するに本発明は次の具体例を含む： 囚 胚を細片に壊すのに加えて組織を細断する細断装置
（ ｓｈｒｅｄｄｅｒ ｄｅｖｉｃｅ ） ，細断胚の
酵素消化のための反応槽及び固体細胞物質を酵素液から
分離するための方法（即ち、遠心分離機、口過器等）を
含む高収率の組織細胞を得るための半自動化装置。

好ましくは固体細胞物質を酵素液から分離する方法は分
離中細胞に作用する剪断力を十分に減少させるよう特に
設計したフロー遠心分離機（ ｆｌｏｗ ｃｅｎｔｒｉ
ｆｕｇｅ ）である。

（Ｂ） 胚を破壊するのに加えて胚組織を細断する細
断装置に胚を通しその結果酵素消化を受ける表面積を増
大させ、生細胞の収率を増大させることを特徴とする胚
の細断方法。

（Ｃ） 複数の可動刃素子及び少《とも対応する数の
分離した固定素子を有し、且つ可動刃素子は隣合った固
定部分によって限られた空間を通って動くようになって
おりそれ故可動及び固定素子の間に入れた胚を細断する
、酵素消化の前に胚を細断するための細断装置。

ここで可動及び固定素子の間隙は胚細胞を細断して酵素
消化に対してより大きな表面積をさらすようなものであ
る。

０ 分離中に細胞が受ける剪断力を減少させる装置を備
えた回転できるボールを含む細胞を酵素溶液から分離す
るための遠心分離機。

■ 胚を細断し、細断胚を制御温度で酵素液と接触させ
て細胞間物質を破壊し、次に分離中細胞に高い剪断力を
受けしめることなしに固体細胞物質を酵素液から分離す
る一連の工程を含む細胞の抽出法。

好ましくは分離はフロー遠心分離機によって行う。

本発明の装置は生きた滅菌細胞をニワトリ又はアヒル胚
のような組織から高収率で得るために特に有効である。

しかしながら、本発明の装置は生きた滅菌組織細胞及び
細胞懸濁液を多《の他の源から得るためにも有効である
。

説明の容易さだけのために本発明を好ましい具体例を参
照しながら記述するが、この分野の精通者は本発明のよ
り広い含蓄及び有用性を知るべきである。

生きた滅菌組織細胞をニワトリ胚から得る際、最初に卵
を光にすかしてニワトリ胚の有無を調べることが普通で
ある。

どのような通常の装置もこの目的のために使用でき、卵
を光にすかすための方法はそれ自体本発明の一部をなし
ていない。

更に卵を培養するために使用する方法及び技術はそれ自
体本発明の一部ではなく、胚を卵から取り出す特定の方
法も同様である。

この分野の精通者はこれらの目的を行うための都合良い
装置及び既知技術について知っているので、同じことを
記述することはここではしない。

さて１図に言及しながら、本発明の全装置の略図を説明
する。

特に給送じょうご１０は培養途中のニワトリ胚を細断機
１２（これは次に詳しく述べる）に給送するためにある
。

モーター１１は細断機１２の切断部分を運転するために
ある。

細断した胚は細断機の出口１４を通って下に行ぎ反応槽
１３に入る。

これはモーター１９で動かす攪拌機１６及び制御装置１
８で温度を制御する加熱器１７を備えている。

胚の給送じょうご１０への給送に加えて槽３４からの洗
滌液もニワトリ胚と同時にそこへ送られる。

槽３４からの洗滌液は次のようにじょうごに送られる。

管３１を口３３を通して槽３４に挿入し、槽を栓３２で
密封する。

槽に含まれる溶液をそこから引き出すことのできる他の
いずれの装置も又使用できる。

可逆的な変速管ポンプ（ ｔｕｂｉＩ１ｇｐｕｍｐ ）
２ ３は種々の液体及び溶液を装置全体に送るために
ある。

洗滌液を管２２を通してじょうご１０に給送するために
は、バルプＶ ＬＶ−３ｔＶ ４及びｖ−６を閉じ
バルブＶ−２及びＶ−５を開け、ポンプ２３を作動して
洗滌液を槽３４から給送じょうご１０ヘニワトリ胚とと
もに送る。

細断した胚は反応槽１３中で都合よ《滅菌食塩水である
洗滌液で洗う。

細断した胚を十分洗った後、バルブＶ−１及びＶ−５を
開け残りのバルブを閉じ、ポンプ２３を作動して洗滌液
を反応槽１３からその出口１５を通し次に管２１，３１
を通して洗滌液槽３４にもどす。

洗滌操作に続いてトリプシン溶液を槽２９から反応槽１
３に送る。

管２８を槽２９の口３０に挿入し栓９で密封する。

バルブＶ−４及びｖ−１を開き他の全てのバルブを閉じ
て、トリプシン溶液を槽２９からポンプ２３及び管２１
を通しで反応槽（ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔａｎｋ
） １ ３ヘその日１５から入れる。

細断した胚及びトリプシン溶液を混合し反応槽１３中で
約２時間約３７℃の制御温度に加熱し、その間細断した
胚をトリプシンで消化する。

細断した胚の細胞間物質を壊し個々の細胞又は細胞群を
分離するためのこの酵素消化段階に続いて、バルブｖ−
１及びｖ−６を開け全ての他のバルプを閉め、トリプシ
ン／胚／細胞混合物をポンプで遠心分離機３８に給送す
る。

沢過器３６は非消化組織のような望まし《ない物質を除
き、遠心分離機３８（これは後により詳しく述べる）は
固体細胞物質をトリプシン溶液から分離し、後者は管３
９を通って排水槽４０に送る。

全てのトリプシンを遠心分離機から除《ことを確実にす
るため、バルプＶ−３及びＶ−６を開き全ての他のバル
ブを閉じて栄養液を槽２５から遠心分離機３８に送る。

管２４を槽２５の口２７に挿入し栓２６で密封する。

ポンプ２３を栄養液槽２５から遠心分離機３８に送るた
め使用する。

栄養液が遠心分離機を洗い流し管３９を通って排水槽４
０に送られた後、固体細胞物質を遠心分離機のポールか
ら取り除《。

１図に示したような種々の槽、管、バルプ、ポンプ等は
滅菌に耐える材料でできていなければならない。

例えば槽はガラスでできていて、使用前に滅菌するため
に約１２１℃の温度で約１時間オートクレーヴできる。

種々の槽に送られる溶液はもちろん滅菌するし、１図に
示した装置は閉鎖系であり、胚及び種々の溶液を手で扱
わずに操作できるため、細胞スラリーの汚染の危険は大
巾に減少した。

更に細断機１２及び遠心分離機３８の設計のために、得
られる生細胞の収率は装置に送った胚重量に対して非常
に高い。

反応槽１３の加熱制御器１８は加熱器１７の温度を調節
できるどのような通常の制御器でもよい。

同様にどのような通常の可逆的変速ポンプも装置へ組込
む前に滅菌できる限りポンプ２３として使用できる。

同様に種々の物質がバルブを通らねばならない故、バル
ブも滅菌できなければならず、又柔らかい管を通る流れ
を調節するために使用する簡単なしめ金のような外部バ
ルブも使用できる。

口過器３６は管３５を通って管３７及び遠心分離機に送
られる溶液又は混合物から粗い物質を除去する。

例えば、口過器３６は口過体としてフィルター サポー
ト パッドを使用して細孔口過器（ ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ ｆｉｌｔｅｒ ）でよい。

本発明は洗滌液、トリプシン溶液又は栄養液中に使用す
る特定の材料それ自身中には存せず、一般的にはどのよ
うな通常の材料も適当な材料を選択できるこの分野の精
通者によってこの目的のために使用できる。

この目的のために使用する材料の開示のために前述のＥ
，Ｎ．ウイルマ−（ Ｅ， Ｎ，Ｗｉｌｌｍｅｒ ）の
論文及びＬ，Ｍ，リナルディ＝ （ Ｌ，Ｍ． Ｒ ｉ
ｍｌｄｉｎｉ ）著６生細胞の動物組織からの単離（Ｔ
ｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｖｉｎｇ Ｃｅ
ｌｌｓ ｆｒｏｍＡｎｉｍａｌ Ｔｉｓｓｕｅｓ ）
”Ｉ ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗｏｆ
Ｃｙｔｏｌｏｇｙ， ７巻、５８７ページ以下（１９
５８）を参照した。

前述の開示はこの中にはっきりと示されている。

使用できるトリプシン溶液の典型的な例はトリス（ＴＲ
ＩＳ）｝リプシンである。

洗滌液は例えばハ／クス緩衝培地（ Ｈａｎｋｓ Ｂａ
ｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ ｍｅｄｉａ ）であり栄養
液は培地１ ９ ９ （ Ｍｅｄｉｕｍ １ ９ ９
）にＦＣＳを１０％加えて調製できる。

さて２，３及び４図に言及しながら、細断機１２を非常
に詳しく示す。

下わく４１、上わ《４２及び側壁４３及び４４で限られ
た囲いは脚４５によって台のような支え４６上に支持さ
れている。

下わく４１に支え４７が付いておりこれは一方でプレー
ト４８を支えている。

モーター１１はボルト４９によってプレート４８に付い
ている。

細断機１２はプレート５１上に支持されており、これは
一方でボルト５２でプレート５０に付いている。

プレー｝５０は台木５３に付いているか又はその一部を
なしており、これは一方ボルト５４によって側壁４４に
付いている。

モーターは攪拌機１６を回転するために使用し特別な支
持装置は示していない。

本発明の細断機は胚を細片に切るだけでなく、その刃部
分の形及び設計の故に胚組織を細断する結果細胞を分離
し酵素消化に対して大きな表面積をさらす。

より詳しくは細断機の本質的な特徴は複数の可動刃素子
の少なくとも一組と少なくとも対応する数の固定刃素子
からなる。

胚を可動及び固定刃素子の間に入れ可動刃素子を隣合っ
た固定刃素子によって限られた空間を通って動かすこと
によって、胚は細片に細断され、可動及び固定刃素子の
異なる組の間で両者の間の小さな隙間のため働く引裂き
作用が胚の組織を細断する。

細断の結果、組織は分離され、より大きな表面積が酵素
液と接触できるようになり、多量の生細胞が得られるよ
うになる。

可動及び固定刃の隙間は普通約０．８から約１．２朋（
１／３２から３／６４インチ）であり、好ましくは０．
８ｉｇｍ（ １ ／ ３ ２インチ）位であるが、この
分野の精通者は隙間が種々の要因によって変わることを
認識している。

細断機１２は２，３及び４図に示したように特別な形の
一連の回転刃からなりこれはモーター１１によって軸５
８のまわりを回転できる。

より詳し《はモーター１１は軸５６を、更に連動機５７
によって軸５８を回転するようにできている。

特別な形の固定部分（４図によく見える）は刃５９が回
転する時に両者の間の隙間を限るように離れて配置され
ている。

細断機の内部の分解図である４図に示したように、固定
素子６０は側壁にはめてある部分６２及び６３によって
細断機の側壁に固定されている（３図参照）。

可動刃５９は３図に示した方向に回転して胚を細断する
。

それらは逆に動かすこともできる。

プレート５０は又細断機１２の出口の下に配置された円
錐じょうご６１を支えている。

加熱器１７は反応槽１３の下方にあり、略図で示してあ
る。

加熱器を加熱し、温度を制御する装置は示していない。

胚が給送じょうご１０を通って細断機に入ると、回転刃
５９が胚を細く切断し、胚は細断機を通ってじょうご６
１に達し更に反応槽１３に行き、ここで前述の操作が行
なわれる。

可動刃５９及び固定部分６００間の細断作用及び両者の
間の隙間のために胚は細《切断される。

この切断は遠心分離機の設計と併せて本発明の装置によ
って得られ木生細胞の収率を非常に高めている。

固体細胞物質を酵素液から分離するための遠心分離機の
使用は知られていた。

高いＧ力は分離過程において生細胞を傷つけると信じら
れてきた。

この従来の考えとは反対に高いＧ力（約１００００Ｇ）
は細胞の分離において耐えうるものであり、別の力即ち
剪断力がフロー遠心分離機において主要な細胞傷害の原
因であることが今や判明した。

それ故本発明に従って、細胞収率は細胞物質を高い剪断
力にさらすことを防ぐ新規遠心分離装置によって高い遠
心速度においてさえ改善される。

５図について述べながら、従来の通常のフロー遠心分離
機のボール配置、特に１つの液体が他よりも重い液体一
固体混合物の分離に使用する型を説明する。

本質的に通常のフロー遠心分離機は、５図に示したよう
に高速で回転するボールからなり中央に給送口をもつ。

特に５図について述べるなら、ボールユニットは７２で
表わし、これは上に突き出した中央部分８８をもつボー
ルシエル８４からなる。

中央部分８８はボール全体７２を回転するための回転軸
７３を備えている。

管状軸８７はボールシエル８４に挿入されており、その
底部は５図に示したように曲っていて先端部に放射状に
回転羽根（ Ｓ ｐｉｎｎｅｒ ｖａｎｅｓ ） （示
していない）を備えている。

管状軸はそれとボールシエル８４との間の空間７１を限
っている。

複数の中間円盤７５（形はじょうご状である）が管状軸
８７を囲んでいて、各々の円盤を離れさせるためにあば
ら骨（示していない）のような適当な間隔装置を備えて
いる。

円盤７５は穴７６を備えこれは５図に示したように垂直
に並んでいる。

上端円盤８６は上端の中間円盤を被い更に管状軸を囲ん
でいる。

上端円盤８６には穴はあいていす、ポールトップ８５は
ボール７２の上側を被い、上端円盤８６との間に空間７
８を限っている。

上述のボール組立は給送口７０を備えていて、そこから
分離すべき混合物が軸に沿って重力によつてボールに送
られる。

特に、混合物はボール全体が軸７３によって回転してい
る間に管状軸８７、空間７１を通って下に送られる。

混合物がボール組立内部に入ると、それは遠心力のため
に外側に流れ、又中間盤７５にあいた穴７６を通って上
に流れる。

殆んどの重い液体及び重い固体は直ちに回転しているボ
ール組立内壁に向って押しやられる。

軽い液体は管状軸８７に向って内側へと置き換えられ、
そこで更に液体一液体分離が起る。

特に、重い液体は円盤７５の下側を下方に移動し、一方
軽い液体は円盤７５の上側に沿って上方へ移動する。

軽い液体は円盤７５を通って又上端円盤８６の下側に沿
って上方に行き、空間７４及び７Ｔを通って空間８３に
入り集められる。

同時に、重い液体はボール組立の外側に押しやられ、ポ
ールトップ８５の内壁に沿って流れ、上端円盤８６の上
の空間７８に入り、出口８１から集積空間８２に入って
集められる。

全ての固体物質はボールシエル８４の内壁に集まり、も
し混合物の固体含有量が高ければ、固体はボール８５の
内壁に沿って下方に流れ出口７９がら空間８０に入りも
し望むならそこに集めることができる。

５図の矢印はボール組立７２内における流れの模様を一
般的に示している。

従来のフロー遠心分離機においては、上に簡単に示した
ように管状軸の先端部に多くの放射状の先細回転羽根が
付いていて、それは管状軸の先端からボールシエルの方
へ伸びており、又先細になっている。

本発明の新規フロー遠心分離機を得るために上述の従来
のフロー遠心分離機に必要な修正は次の通りである。

本質的に修正は全ての中間円盤７５の除去、出口７９の
封鎖、出口７８のその最低部での封鎖、及び回転羽根の
緑のボールシエルの内周までへの拡大を含む。

後者の改良又は修正は従来の先細回転羽根の先端のまわ
りで引起された剪断作用を減少させることが判明した。

更に一般的な考えに反して、回転羽根の拡大の結果ボー
ル組立の回転速度は含まれる細胞物質を傷つけることな
しに増大できることが判明した。

なぜなら回転羽根の拡大は回転ボール中の細胞物質にか
かる剪断力を減少する役割をするからである。

これは得られる細胞の非常な収率の増大を可能にする。

換言すれば、本発明の遠心分離機は遠心分解中の細胞の
速度の受ける剪断力を減少するように設計されている。

さて６，７及び８図に言及しながら、本発明の装置にお
いて使用する遠心分離機について述べよう。

６図は本発明の遠心分離機の部分断面を含む側面図であ
る。

５図との混同を避けるため、異なる番号を同じ部分を記
述するために使用する。

６図について言及しながら、ポールケーシング１２４及
びモーター１１３を支える基盤９０を含む遠心分離装置
を示す。

９１を総称するボール盤はボールスピンドル９３によっ
て回転するように支持されており、これは下部及び上部
ベアリング１１１及び１１７Ａによって回転することが
できる。

モーター１１３は変速モーターであり、特にボール組立
９１の回転速度を望むように調節できるようなものであ
る。

ボール組立９１はベルト１１５がモーター滑車１１４及
び軸滑車１１６を結んでおり、後者がスピンドル９３に
付いていることから回転する。

ボール組立９１はスピンドル９３の上部に固定している
ボールシエル９２からなる。

管状軸の上端はボール９１の中心を通って上方に伸びて
いる。

管状軸９４の下端は多《の放射状の回転羽根を備えてい
て、これについては後述する。

管状軸９４を囲んで上端円盤９５があり、これは管状軸
９４の上に表面１１８で乗っていて、それ故ボール９１
の内部に空間１１９を与えている。

上端円盤の囲りにポールトップ９６があり、これは６図
に示したようにねじ輪１２２によってボールシエル９２
に固定されている。

上端円盤９５及びポールトップ９６によって限られた空
間９７は例えば溶接点９８のような方法で空間１１９か
ら封鎖する。

更なる修正は１０００所における出口９９（これは固体
除去のためのものであり、５図の出口７９に相当する）
を例えば溶接のような方法で封鎖することである。

更なる修正は回転羽根の拡大部１０５である。

従来の技術は先細回転羽根１０４を備えることを教えて
いるが、本発明は例えば羽根１０４に線１０６に沿って
付加物１０５を溶接することによって（回転羽根１０４
に）１０５と名づけだ部分を加える。

それ故、本発明の連続遠心分離機の回転羽根は先細でボ
ールシエルの内周に達していない従来の羽根に対して事
実上ボールシエル９２の内周に達していることが認識さ
庇るだろう。

更に従来の遠心分離機の中間円盤は１つも本発明のボー
ル組立９１内には存在しない。

（換言すれば、５図の中間円盤７５は６図に示した装置
からは除かれている。

）拡大部分１０５は剪断力の減少に寄与している。

ポールトップ９６の上に下部被い１０１、上部被い１０
８及び調節被い１０９がある。

空間９７は普通は空間１１９と下部被い１０７の内部と
を接続しているが、空間９７が９８で封鎖されているた
め液体は下部被い中に入ることはできない。

しかしながら空間１１９に送られた液体は上端円盤９５
の下側に沿って進み、空間１０１そして出口１０２を通
って最後に上部被い中の空間１０３に入る。

固体物質は出口９９が１００の所で封鎖されているので
ボールシエル９２中に単に集積する。

給送管１１０はその上端が遠心分離機の外部からはじま
り、調節被い１０９、上部及び下部被い１０８及び１０
７の各々を通ってボール９１まで下りている。

管１１２（これは１図の管３７に対応する）は遠心分離
すべき混合物を管１１０に送り、混合物はそこから空間
１１１を通ってボール組立９１の中央にはいり、更にボ
ールシエル９２と管状軸９４の間を流れて空間１１９に
入る。

上部ポールケーシング１２０は通常はボールシエル９２
から出口９９を通って排出される固体物質を集めるため
にあるが、出口は封鎖されている。

調節被い１０９、上部被い１０８及び下部被い１０７は
しめ金１２１によって上部ボールケーシング１２０には
ずせるように固定してある。

操作の際は、分離すべき混合物を管１１０の空間１１１
を通してボール組立９１の中央に送る。

次に混合物は管状軸９４とボールシエル９２０間を通っ
て空間１１９に入る。

ローターは軸９３によって回転しており、それは一方モ
ーター滑車１１４、ベルト１１５及び軸滑車１１６を通
してモーター１１３によって動かされる。

混合物が空間１１９に入ると、含まれる細胞は加速され
ポールシエル９２の内周に向って押しやられる。

混合物の軽い液体部分、トリプシン溶液はボールシエル
９２の内周に凸って次に上端円盤の下側に沿って上方へ
押しやられ空間１０１に入り、出口１０２から上部被い
の空間１０１に入り、出口１０２から上部被いの空間１
０３に入って集められるか又は排出される。

シール９８は液体が空間９Ｔに入るのを防ぎ、シール１
００は固体細胞物質がボールシエル９２から出口９９を
通って出るのを防ぎ、それ故ボール組立９１の回転が止
った時固体物質はボールシエル９２中に残りそこから回
収できる。

しかしながら上述したように細胞を回収する前に栄養液
を遠心分離機に通し全てのトリプシン溶液を遠心分離機
から除くのを確実にする。

本発明の遠心分離機のボール組立の分解図である７図に
ついて述べるがここでは６図におけるのと同じ参照番号
が同一部分を示している。

参照番号１２３は上に向ってゴム輪、座金、ナットの各
々を示しており、ポールトップ９６を上端円盤に確実に
結ぐために使用する。

８図について述べれば、これはポールシエル９２に挿入
したひれ拡大部（ ｆｉｎ ｅｘｔｅｎｔｉｏｎ ）
１ ０ ５を有する管状軸９４を図解している。

ひれ拡犬部１０５が回転羽根をボールシエル９２の内周
まで届かせていることに注目しなさい。

操作の際、分離操作が完了し、栄養液を遠心分離機のボ
ール内に送って全ての残ったトリプシンを除いた後、ボ
ールシエル９２内に含まれる固体細胞物質を回収するこ
とが望ましい。

しめ金１２１を取ってボールをはずし、ボールの上端に
キャップをかぶせてから、それを細胞を再懸濁させるた
めに振盪機にのせる。

次にキャップをはずしボールをビーカーの上にさかさま
にし細胞を注ぎ出す。

生きた滅菌組織細胞は滅菌栄養液中に保存するか又は直
ちに使用することができる。

本発明は従来法に比べて次の利点を提供する。

１．装置は胚及び必要な反応溶液の手による操作を減少
させる故、組織細胞の汚染の可能性を減少させる。

２．本発明の細断装置は胚の組織を切断するのみならず
、トリプシン溶液にさらされる表面積を最大にするよう
に細断するため得られる組織細胞の高収率を可能にする
。

３．本発明の改良フロー遠心分離機の設計は、遠心分離
中に細胞が受ける剪断力を事実上減少させることによっ
て得られる組織細胞の高収率を可能にする。

それは又従来法に比べて多量の細胞を含む液体の処理を
町能にする。

４．上の利点は装置の最小の人間による監督で得られ、
それ故事実上の自動化操作の利点を獲得することができ
る。

本発明を次の例を参照することによって更に説明するが
、それらは説明のためであり限定のためのものではない
。

例１ ６４１個の１１．５日ニワトリ胚を細断機を通してトリ
プシン反応槽へ入れ、同時に培地１ １． ５ ＋Ｊッ
トルを細断機を通してトリプシン反応槽へポンプで給送
する。

培地１９９はウイルスの増殖のための細胞の保存に使用
するよく知られた培地である。

例えば”ウイルス及びリケツチャ病の診断法″（ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｏ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ
ｖｉｒａｌ ａｎｄＰｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ Ｄｉ
ｓｅａｓｅｓ ）第３版、Ｅ，Ｈ，レネツ｝ （ Ｅ，
Ｈ．Ｌｅｎｎｅｔｔｅ ）編集、アメリカ公衆衛生協
会（ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ
Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ， Ｉｎｃ ）、＝ユーヨー
ク（１９６４）、８９ページ参照。

培地１９９及び細断組織を次に１ ５ ０ ｒｐｍで１
分間攪拌する。

細断組織を５分間で槽の底に沈澱させる。

赤血球細胞及び破片を含む培地１９９を１３００ｍＡ！
／分で槽からポンプで排出する。

次に下に示した組成のトリスートリプシン１０ｌをトリ
プシン反応槽に給送する。

塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ベーカ ８．０クーリ
アゼント（ Ｂａｋｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ ）製、Ｍ
ＳＤ＃２ ７ １ ４ ０ 塩化カリウム（ＫＣＩ）、ベーカー ０．３８ｆ？リ
アゼント製、ＭＳＤ＃２６００５ 無水リン酸２ナトリウム ０．１Ｏｆ（Ｎ
ａ２ＨＰ０４）、ベーカーリアゼン ト製、ＭＳＤ＃２ ７ ３ ８ ８ デキストロース、ベーカーリアゼン １．Ｏ ｆ？
ト製、ＭＳＤ＃２ ２ ５ ４ １ トリスーヒドロキシメチル アミン ３．Ｏ ｒメ
タン、ニュトリショナル ビオケミ カ／Ｉ／ （ Ｎｕｔｒｉ ｔｉｏｎａｌ Ｂ ｉｏｃ
ｈｅ ｍ ｉｃａｌ ）〔Ｃ４Ｈ１、Ｎ０３〕 ネオマイシン、Ｃ，Ｍ，２７４ ０．５
ＩｒＬｌ蒸留水 ９９６
ｄトリプシン（ＧＩＢ），１：２５０ ２．５
？Ｃｏｎｅ ， ＭＳＤ＃ ２ ８ ４ ０ ６次
にトリプシン溶液を１ ５ Ｏ ｒｐｍで攪拌し３７℃
にし、トリプシン消化を２時間行う。

この時間後個々の細胞を含む液をトリプシン反応槽から
フロー遠心機へ５００ｍ／／分で送る。

遠心分離は８０００ｒｐｍで行う。

個々の細胞を含むトリプシン溶液が全て遠心分離機を通
った後、培地１９９及び１０％の牛胎児※血清を含む洗
滌液ＩＩ！をローターに通してトリプシンを除く。

ローターを減速し、遠心分離機からはずし、大きな振盪
機にのせる。

ローターを１分間振盪し細胞を壁からはがしさかさまに
して濃細胞スラリーを注ぎ出す。

例２ ２５個の胚を細断機を通してトリプシン反応槽に入れる
。

同時に培地（１９’９）１．５Ｊを細断機を通してトリ
プシン反応槽に送る。

次に培地（１９９）及び細断組織を１ ０ ０ ｒｐｍ
で１分間攪拌する。

細断組織を５分間で槽の底に沈澱させる。懸濁した赤血
球細胞及び細胞破片を含む培地（１９９）を槽から排出
する。

次に前と同じ組成のトリスートリプシン１．５１をトリ
プシン反応槽に送る。

次にトリプシン溶液を１０Ｏｒｐｍで攪拌し、トリプシ
ン消化を２時間行う。

２時間後、個々の細胞を含む液をトリプシン反応槽から
粗い口過器を通し培地１９９＋１０％牛胎児血清２，５
ｌを含むびんに入れる。

次にこれを５ミクロンのパッドを用いサルトリウス接線
流フィルタ（ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ｔａｎｇｅｎｔｉ
ａｌ ｆｌｏｗｆｉｌｔｅｒ）で培地１ ９ ９＋１
０％牛胎児血清８ｌに対して透析する（ ｄｉａｆｌｏ
ｗ ｍｅｔｈｏｄ ）。

このようにして細胞懸濁液を濃縮しトリプシンを稀釈す
る。

本発明を好ましい具体例を参照しながら示してきたが、
種々の変更、修正及び／又は置き換えが本発明の精神を
離れることなく可能であることをはっきりと理解すべき
である。

それ故本発明は付属する特許請求の範囲によってのみ限
定されるべきである。

本発明の実施態様は次の通りである。

（１）特許請求の範囲第２項記載の装置。

（２）細断装置が細胞を含む組織を同時に破壊し、細断
する方法を含む第１項記載の装置。

（３）細胞を酵素溶液から分離するための装置が、遠心
分離中に細胞に高い剪断力を与えることなしに細胞を遠
心的に分離するための方法を備えたフロー遠心分離機を
含む第（１）項記載の装置。

（４）細断装置が細胞を含む組織を同時に破壊し細断す
るための方法を含む第（３）項記載の装置。

（５）洗滌液の第１槽、酵素液の第２槽、栄養液の第３
槽及び変速可逆ポンプを含む次のような給送装置、■洗
滌液を第１槽から細断装置へ組織と同時に送り、■酵素
液を第２槽から反応槽へ送り、■酵素液及び細胞混合物
を反応槽から遠心分離機へ送り、そして■酵素液を細胞
から分離した後栄養液を第３槽から遠心分離機へ送り実
質上全ての酵素液を遠心分離機から除去するための給送
装置を更に備えた第（３）項記載の装置。

（６）細断装置が、細断組織を直接反応槽へ送るために
反応槽の上に固定されている第（１）項記載の装置。

（力 反応槽が攪拌するための及び内容物の温度を制御
するための装置を各々含む第（１）項記載の装置。

（８）洗滌液、酵素液及び栄養液の給送を調節するため
の装置を更に含む第（５）項記載の装置。

（９）粗物質をフロー遠心分離機に送られる液体から除
去するための口過器を含む第（３）項記載の装置。

α０）細断装置が少な《とも１組の複数の可動刃素子及
び少な《とも対応する固定刃素子から成り、可動素子は
隣合った固定刃素子に限られた空間を動くようになって
いて、可動及び固定刃素子の間隙が組織を細断するよう
な第（２）項記載の装置。

ａυ 細断装置が入口及び出口をもつハウジング、複数
の回転刃の付いた少なくとも１個の回転軸、少な《とも
対応する数の固定刃素子を含み、これが隣の固定刃素子
との間の空間を限定し、回転刃素子がその空間を回転し
、更に軸を回転するモーターを含む第（１０）項記載の
装置。

ａ２ｌ 細断装置が反応槽上に固定されており、細断
装置の出口が直接反応槽に給送する第（１０）項記載の
装置。

（１３ フロー遠心分離機が軸のまわりを回転するボ
ールシエル、軸状配置の入口、前記ボールシエルの被い
及び１つの出口を含み、入口及び前記ボールシエル被い
によって限られる空間を特徴とする第（３）項記載の装
置。

α荀 入口が軸に沿って置かれた管からなり、管がその
最下端に実質的に前記管から前記ポールシエルの内周ま
で達している複数の放射状回転羽根を備えている第ａ顕
記載の装置。

ａ■ フロー遠心分離機が更に前記ボールシエルを回転
するための変速モーターを含む第０項記載の装置。

αｅ 特許請求の範囲第３項記載の装置。

（１７） 可動刃素子及び固定刃素子の隙間が０．８か
ら１．２朋であ名第（６）項記載の細断装置。

ａ８ ハウジング、その中に水平に置かれた回転軸、
軸に沿って一定間隔で固定された複数の回転刃、前記ハ
ウジングの中に置かれた少なくとも対応する数の固定刃
素子及び軸を回転するモーターを含み、回転刃が隣合っ
た固定刃素子の間の空間を回転するようになっている第
ａｅ項記載の細断装置。

０ 回転刃が前記軸が置かれている平面に対して湾曲し
ている第ａ８ｌ項記載の細断装置。

（イ）前記固定刃素子が、前記軸の置かれた水平面に対
してある角度で配置され、前記固定刃素子の少なくとも
一部分が前記回転刃素子の湾曲と反対向きに湾曲してい
る第０項記載の細断装置。

Ｃυ 特許請求の範囲第４項記載のフロー遠心分離機。

（２功 入口が管からなりその中心は軸に沿って配置
してあり、前記管の上部は前記被いを越えて伸び、その
最底部は複数の放射状の回転羽根を備え、前記管の外表
面から実質的に前記ボールシエルの内周まで達している
第Ｑυ項記載のフロー遠心分離機。

（２３）液体のための１つの出口を備え、前記入口を形
成している前記管と前記ボール被いとの間の環状の空間
を特徴とする第（２４項記載のフロー遠心分離機。

（２４）前記ボールシエルを回転するための変速モータ
ーを更に含む第（２１）項記載のフロー遠心分離機。

（２９ ボールシェルと前記被いにより限界された前
記ボールシエル内の空間が回転羽根及び前記入口を形成
している前記管を除いてほからである第（ハ）項記載の
フロー遠心分離機。

（２６）特許請求の範囲第１項記載の細断法。

０７）滅菌洗滌液を前記破壊及び細断操作中に前記組織
の上に供給する第（２６）項記載の細断法。

（ハ）前記固定刃素子と前記可動刃素子の間の前記空間
中の隙間が０．８から１．２ｍｍである第（イ）項記載
の細断法。

（２９）特許請求の範囲第５項記載の抽出法。

（至）特許請求の範囲第６項記載の抽出法。

（３υ 組織を複数の可動刃素子と少なくとも対応する
数の固定刃素子の間に挿入し、可動刃素子を隣合った固
定刃素子に限定された空間を動かすことによって工程（
１）を行う第（ト）項記載の抽出法。

（３つ 前記遠心分離中に高い剪断力をうけしめるこ
となしに、前記細胞を酵素液から遠心分離する第（７）
項記載の抽出法。

（至）工程（２）の接触を制御温度条件下、酵素液及び
細断組織混合物を攪拌しながら行う第（３）項記載の抽
出法。

０４）細胞が遠心分離機のボール内に残っている前記遠
心分離機、滅菌栄養液を遠心分離機中に送ってそこに残
っている全ての酵素を除去する第（３）項記載の抽出法
。

０９ 栄養液を通した後、遠心分離機のボールをはず
し、ボールにふたをかぶせ、振盪機にのせ、振盪してボ
ール中の細胞を再懸濁し、生じた細胞スラリーを容器に
注ぐことによって遠心分離機内に残った細胞を回収する
ことを更に特徴とする第（３４）項記載の抽出法。

【図面の簡単な説明】

１図は本発明を具体化している組織細胞回収装置の略図
である。 ２図は１図の装置の一要素をなす細断装置の一部断面を
含む側面図である。 ３図は２図の細断装置の一部断面を含むもう一方の側面
図である。 ４図は２及び３図の細断装置の切断部分を示した分解図
である。 ５図は１図の装置中の遠心分離機の一部断面を含む部分
正面図である。 ６図は１図の装置中の遠心分離機の一部断面を含む側面
図であり、本発明の一つの態様をなしている。 ７図は６図の遠心分離機のボール組立（ ｂｏｗｌ ａ
ｓｓｅｍｂｌｙ ）の要素の内部構造を示した分解図で
ある。 ８図は本発明の遠心分離機の改良の一つである回転羽根
付加物を説明した図である。 〔主要部分の符号の説明〕、９・・・・・・栓、１０・
・・・・・給送じょうご、１１，１１３・・・・・・モ
ーター、１２・・・・・・細断機、１３・・・・・・反
応槽、１４，１５，７９，８１，９９，１０２・・・・
・・出口、１６・・・・・・攪拌機、１７・・・・・・
加熱器、１８・・・・・・加熱制御器、１９・・・・・
・攪拌機モーター、２Ｌ２２，２４，２８，３１，３５
，３７，３９，１１２・・・・・・管、２３・・・・・
・可逆変速ポンプ、２５・・・・・・栄養液槽、２６・
・・・・・栓，２７，３０，３３・・・・・・口、３９
・・・・・・槽、３２・・・・・・栓、３４・・・・・
・洗滌液槽、３６・・・・・・沢過器、３８・・・・・
・遠心分離機、４０・・・・・・排水槽、４１・・・・
・・下枠、４２・・・・・・上枠、４３ｔ４４・・・・
・・側壁、４５・・・・・・脚、４６，４７・・・・・
・支え、４８，５０，５１・・・・・・プレート、４９
，５２，５４・・・・・・ボルト、５３・・・・・・台
木、５６ ， ５８・・・・・・軸、５７・・・・・・
連動機、５９・・・・・・可動刃、６０・・・・・・固
定刃、６１・・・・・・円錐じょうご、７０・・・・・
・給送口、７１・・・・・・空間、７２，９１・・・・
・・ボール全体、７３・・・・・・回転軸、７５・・・
・・・中間円盤、７６・・・・・・穴、７７，７８，８
０，８２，８３，９７，１０１，１０３，ｉｉｉ，ｉ１
ｓ・・・・・・空間， ８４ ， ９２・・・・・・ボ
ールシェル、８５，９６・・・・・・ボールトツ７’，
８ ６ ｔ９５・・・・・・上端円盤、８７，９４・
・・・・・管状軸、８８・・・・・・中央部分、９０・
・・・・・基盤、９３・・・・・・ボールスピンドル，
９８，１００・・・・・・シール、１０４・・・・・・
先細回転羽根、１０５・・・・・・回転羽根拡大部分、
１０６・・・・・・線、１０７・・・・・・下部被い、
１０８・・・・・・上部被い、１０９・・・・・・調節
、１１０・・・・・・給送管、１１４・・・・・・モー
ター滑車、１１５・・・・・・ベルト、１１６・・・・
・・軸滑車、１１７・・・・・・下部ベアリング、１１
１Ａ・・・・・・上部ベアリング、１１８・・・・・・
表面、１２０・・・・・・上部ボールケーシング、１２
１・・・・・・しめ金、１２２・・・・・・ねじ輪、１
２３・・・・・・ゴム輪、座金、ナツ｝、１２４・・・
・・・ポールケーシング。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 複数の可動刃素子と少な《とも対応する数の固定刃
   素子とを有し、且つ隣合った固定刃素子によって限界さ
   れた空間を通って可動刃素子を押しつける手段を有して
   いることを特徴とする組織を細断するための細断装置； 細断組織を酵素液と接触させ、細胞間物質を破壊して組
   織細胞を分離するために使用する反応槽；軸のまわりを
   回転するボールシエル、細胞及び酵素液を前記ボールシ
   エルに送る入口、前記ボールシエルの被い、前記酵素液
   が出ることのできる出口及び生細胞が前記ボールシエル
   の回転中に受ける剪断力を減少させるための前記ボール
   シエル中の回転羽根装置を含む生細胞を酵素液から分離
   するためのフロー遠心分離機； 及び 材料を前記細断機から前記反応槽へ、又前記反応槽から
   前記分離装置へと送るための装置を含む組織から一次細
   胞懸濁液を調整するための閉鎖半自動化装置。