JPS5876090A - 固定化酵素用担体 - Google Patents
固定化酵素用担体Info
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- JPS5876090A JPS5876090A JP17336781A JP17336781A JPS5876090A JP S5876090 A JPS5876090 A JP S5876090A JP 17336781 A JP17336781 A JP 17336781A JP 17336781 A JP17336781 A JP 17336781A JP S5876090 A JPS5876090 A JP S5876090A
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- enzyme
- carrier
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明使用の担体は．縮合剤の存在下に酵素と結合し．
固定化酵素を形成する。
固定化酵素を形成する。
従来より，酵素の活性を低下させることなく酵素の安定
性を高める担体の研究が進められており。
性を高める担体の研究が進められており。
また担体と酵素の結合方法に関しても種々の方法が開発
されている。現在汎用されている結合方法の１つに，担
体として多糖類を用い．これを臭化シアンで活性化した
後．酵素と結合させる方法があるが，この方法では，例
えば多糖類としてセファローズグＢ．酵素としてトリプ
シンを用いた場合・使用したトリプシンに占める固定化
された活性型トリプシンの割合（固定化率）はｌθ％程
度に止まる。
されている。現在汎用されている結合方法の１つに，担
体として多糖類を用い．これを臭化シアンで活性化した
後．酵素と結合させる方法があるが，この方法では，例
えば多糖類としてセファローズグＢ．酵素としてトリプ
シンを用いた場合・使用したトリプシンに占める固定化
された活性型トリプシンの割合（固定化率）はｌθ％程
度に止まる。
本発明者等は，化学的ｌこ安定で毒性が極めて低く．か
つ効率良く酵素と結合する担体を見い出すべく種々の物
質を検討した結果．カルボキシル基を官能基として有す
るポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲルが優れ
た担体であることを見い出し，本発明を完成した。
つ効率良く酵素と結合する担体を見い出すべく種々の物
質を検討した結果．カルボキシル基を官能基として有す
るポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲルが優れ
た担体であることを見い出し，本発明を完成した。
本発明に先立ち．本発明者等は．カルボキシル基を官能
基として有するポリ−グルタミン酸が固定化率３０％を
有する良好な担体であることを見い出したが．ポリ−グ
ルタミン酸で固定化した酵素は機械的強度に極めて乏し
く．また、アルカリ性の領域では完全に溶解するので，
固定化酵素本来の目的である再利用の面で不都合が生じ
る。そこで、固定化率が高いというポリ−グルタミン酸
の特質を備え持ち、且つ、長期に渡る繰り返し使用が可
能な担体を検索した結果１本発明担体、ポリーグルタミ
ル−アミノアルキルシリカゲルを見い出すに至った。
基として有するポリ−グルタミン酸が固定化率３０％を
有する良好な担体であることを見い出したが．ポリ−グ
ルタミン酸で固定化した酵素は機械的強度に極めて乏し
く．また、アルカリ性の領域では完全に溶解するので，
固定化酵素本来の目的である再利用の面で不都合が生じ
る。そこで、固定化率が高いというポリ−グルタミン酸
の特質を備え持ち、且つ、長期に渡る繰り返し使用が可
能な担体を検索した結果１本発明担体、ポリーグルタミ
ル−アミノアルキルシリカゲルを見い出すに至った。
これまでに、ポリーγ−メチルグルタミン酸を出発物質
とし、その一部のγ−カルボキシルメチル基をｒ−カル
ボキシルアジドに変換したものを。
とし、その一部のγ−カルボキシルメチル基をｒ−カル
ボキシルアジドに変換したものを。
合成樹脂、ガラスピーズなどの固型物に被覆して担体と
した例は知られているが（米国特許３，９ 、ｒ ｊｌ
、／７） 、この担体も機械的強度が弱く、且つ、γ−
カルボキシルメチル基が徐々に加水分解を受けるので、
長期間の使用には適さない。また、この担体は、ポリー
ｒ−メチルグルタミン酸を固形物に被覆したに過ぎない
ので、長期使用の際には脱落が避けられず、特に医薬品
等、有害物質の混入が問題となる化合物の製造には不適
当である。本発明担体は、ポリ−グルタミン酸のγ−カ
ルボキシル基とアミノアルキルシリカゲルとをアミド結
合を介して結合させたものであり、上記欠点を克服して
いる。
した例は知られているが（米国特許３，９ 、ｒ ｊｌ
、／７） 、この担体も機械的強度が弱く、且つ、γ−
カルボキシルメチル基が徐々に加水分解を受けるので、
長期間の使用には適さない。また、この担体は、ポリー
ｒ−メチルグルタミン酸を固形物に被覆したに過ぎない
ので、長期使用の際には脱落が避けられず、特に医薬品
等、有害物質の混入が問題となる化合物の製造には不適
当である。本発明担体は、ポリ−グルタミン酸のγ−カ
ルボキシル基とアミノアルキルシリカゲルとをアミド結
合を介して結合させたものであり、上記欠点を克服して
いる。
ここで、ポリ−グルタミン酸とは、ポリ−Ｌ −グルタ
ミン酸、ポリ−Ｄ−グルタミン酸およびポリーＤＬ−グ
ルタミン酸を包含スる。
ミン酸、ポリ−Ｄ−グルタミン酸およびポリーＤＬ−グ
ルタミン酸を包含スる。
ポリ−グルタミン酸は市販品として入手可能であり、平
均分子量約ｓｏ、ｏｏｏの重合体であって。
均分子量約ｓｏ、ｏｏｏの重合体であって。
アルカリ性では水に可溶で酸性では不溶となる。
ポリ−グルタミル−アミノアルキルシリカゲルは新規の
物質で、縮合剤の存在下に、上記のポリ−グルタミン酸
とアミノアルキルシリカゲルを結合させて得られる。こ
こでアルキルとは、メチル。
物質で、縮合剤の存在下に、上記のポリ−グルタミン酸
とアミノアルキルシリカゲルを結合させて得られる。こ
こでアルキルとは、メチル。
エチル、プロピル、オクチル、テトラデカチル。
ヘプタデカチル、オクタデカチル等の炭素数ｌ〜／ざま
でのアルキルを包含するが、特にプロピルが好ましい。
でのアルキルを包含するが、特にプロピルが好ましい。
縮合剤としては、ペプチド合成反応に使用できるものは
全て適用でき９例えば、ジシクロへキシルカルボジイミ
ド、／−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド等のカルボジイミド類や、カルボニルジ
イミダゾール・ウッドワード試薬′に′等が挙げられる
。
全て適用でき９例えば、ジシクロへキシルカルボジイミ
ド、／−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）
カルボジイミド等のカルボジイミド類や、カルボニルジ
イミダゾール・ウッドワード試薬′に′等が挙げられる
。
またはカルボン酸の活性型１例えばカルボン酸クロリド
等を経由しても可能である。縮合反応は攪拌または振盪
下に７〜５０時間行なえばよく１反応温度は、２０〜１
０θＩＩＣ，特に３！；−１０褌が好ましい。反応終了
後、目的とする担体を取り出すには１反応液中の固形物
を傾斜分離し、縮合剤および未反応の酵素を除去する操
作を加え、遠心分離等により精製すればよい。
等を経由しても可能である。縮合反応は攪拌または振盪
下に７〜５０時間行なえばよく１反応温度は、２０〜１
０θＩＩＣ，特に３！；−１０褌が好ましい。反応終了
後、目的とする担体を取り出すには１反応液中の固形物
を傾斜分離し、縮合剤および未反応の酵素を除去する操
作を加え、遠心分離等により精製すればよい。
本発明担体による酵素の固定化は、縮合剤の存在下に酵
素と担体を結合させることにより行なう。
素と担体を結合させることにより行なう。
縮合剤としては、ペプチド合成反応に使用できるもの全
てを固定化反応にも適用できる。酵素と担体との量比は
、使用目的に応じ、必要とする活性の大小によって、そ
の割合を調整する。本反応で用いる溶媒は、水が一般的
であるが、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラ
ヒドロフラン。
てを固定化反応にも適用できる。酵素と担体との量比は
、使用目的に応じ、必要とする活性の大小によって、そ
の割合を調整する。本反応で用いる溶媒は、水が一般的
であるが、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラ
ヒドロフラン。
ジメチルスルホキシド、アルコール類、メチルセロソル
ブ、モノグライム、ジグライム等の水溶性有機溶媒およ
び場合によっては、酢酸エチル等の水に難溶性の溶媒も
水と混合して用いることができる。反応温度は上記の溶
媒系において酵素の活性が低下しない範囲で任意に選び
うるが通常ｌｊ〜２３′Ｃで行なう。反応時間は、酵素
の種類２反応温度等により異なるが通常２を時間以内で
ある。
ブ、モノグライム、ジグライム等の水溶性有機溶媒およ
び場合によっては、酢酸エチル等の水に難溶性の溶媒も
水と混合して用いることができる。反応温度は上記の溶
媒系において酵素の活性が低下しない範囲で任意に選び
うるが通常ｌｊ〜２３′Ｃで行なう。反応時間は、酵素
の種類２反応温度等により異なるが通常２を時間以内で
ある。
本発明担体は、酵素と共有結合するため、目的とする固
定化酵素の純度が高く、結合が切れにくく、固定化酵素
使用中に不純物の溶出する恐れがない。また、高活性の
固定化酵素が収率良く得られる。更には、水に不溶であ
るため１反応終了後担体の分取が容易である等の利点を
有する。
定化酵素の純度が高く、結合が切れにくく、固定化酵素
使用中に不純物の溶出する恐れがない。また、高活性の
固定化酵素が収率良く得られる。更には、水に不溶であ
るため１反応終了後担体の分取が容易である等の利点を
有する。
本担体と結合して固定化酵素を形成する酵素としては、
一般に固定化に供される酵素９例えば。
一般に固定化に供される酵素９例えば。
トリプシン、ペプシン、パパイン、アミノアシラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カタラー
ゼ、リパーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる
。
グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カタラー
ゼ、リパーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる
。
固定化酵素は酵素本来の目的に使用することができるが
１例えば１本発明の担体であるポリ−グルタミル−アミ
ノアルキルシリカゲルで固定化したアクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼ１ （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ １ｙｔｉｃｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ）は。
１例えば１本発明の担体であるポリ−グルタミル−アミ
ノアルキルシリカゲルで固定化したアクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼ１ （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃ
ｔｅｒ １ｙｔｉｃｕｓ ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉ）は。
以下の様にしてヒトインスリンの合成に応用できる。上
記の固定化酵素存在下に、Ｂ鎖３０位のアラニンを欠い
たブタ型インスリンと第三級ブトキシスレオニンを反応
させると、Ｂ鎖の３０位が第三級ブトキシスレオニンで
ある＼ブタ型インスリ Ｉン（即ち、Ｂ鎖の３０位に第
三級ブトキシル基の付加したヒト型インスリン）が得ら
れる。
記の固定化酵素存在下に、Ｂ鎖３０位のアラニンを欠い
たブタ型インスリンと第三級ブトキシスレオニンを反応
させると、Ｂ鎖の３０位が第三級ブトキシスレオニンで
ある＼ブタ型インスリ Ｉン（即ち、Ｂ鎖の３０位に第
三級ブトキシル基の付加したヒト型インスリン）が得ら
れる。
以下に実施例および参考例を示して本発明の態様を明ら
かにするが、下記の例はいずれも本発明をなんら限定す
るものではない。
かにするが、下記の例はいずれも本発明をなんら限定す
るものではない。
実施例１
ポリ−グルタミン酸・ナトリウム塩（２θＯη）に水（
２ｓｌ）を加え、更に／Ｎ塩酸（３ｇ！ ）を加え、得
られる沈澱物を遠心分離し０次いで１０ ’Ｎ塩酸を加
えて２回、エタノールを加えて１回。
２ｓｌ）を加え、更に／Ｎ塩酸（３ｇ！ ）を加え、得
られる沈澱物を遠心分離し０次いで１０ ’Ｎ塩酸を加
えて２回、エタノールを加えて１回。
この順に遠心分離をして得ら、れる沈澱物を真空乾燥す
ると白色の固型物（／２０１１’）を得る。これにジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ ）（乙ｍｌ ）を加え、リ
フａ ツー’ｊｗ■（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ、Ｊ
ル＋２＋２ ）及びシンクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のＤ
ＭＦ溶液（／Ｉｌｌ／）を加えた後、容器全体を室温で
２’１時間１次いで３７°Ｃで２２時間回転する。内容
物を傾斜分離し、０７Ｍ炭酸水素す） ＩＪウム水溶液
を加えて遠心分離を３回行なった後に得られる沈澱物を
、上澄液に残渣が認められなくなるまで繰り返しイソプ
ロピルアルコールによる遠心分離に付す。沈澱物を７Ｏ
−ｊＮ塩酸で２回。
ると白色の固型物（／２０１１’）を得る。これにジメ
チルホルムアミド（ＤＭＦ ）（乙ｍｌ ）を加え、リ
フａ ツー’ｊｗ■（Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＮＨ、Ｊ
ル＋２＋２ ）及びシンクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）のＤ
ＭＦ溶液（／Ｉｌｌ／）を加えた後、容器全体を室温で
２’１時間１次いで３７°Ｃで２２時間回転する。内容
物を傾斜分離し、０７Ｍ炭酸水素す） ＩＪウム水溶液
を加えて遠心分離を３回行なった後に得られる沈澱物を
、上澄液に残渣が認められなくなるまで繰り返しイソプ
ロピルアルコールによる遠心分離に付す。沈澱物を７Ｏ
−ｊＮ塩酸で２回。
更に水で２回洗浄するとポリ−グルタミル−アミノプロ
ビルシリカゲルを得る。窒素の元素分析結果から、ポリ
−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルは、ｌｆ中に
グルタミル基２ｍｍｏ ｌ ｅを含む。
ビルシリカゲルを得る。窒素の元素分析結果から、ポリ
−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルは、ｌｆ中に
グルタミル基２ｍｍｏ ｌ ｅを含む。
参考例／
実施例１で得たポリ−グルタミル−アミノプロビルシリ
カゲルを水（２ｓｌ’）に懸濁し、アクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼＩ（７＃）を水（３ｓｌ）に
溶かした溶液および水溶性ＤＣＣ（５２■）を水（／＋
＋＋／）に溶かした溶液を順に加え、室温＋ｔｊ分間回
転させた後、ｇ’ｃで一晩回転させる。内容物を遠心分
離し、沈澱物を０／Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨＩＡθ）、Ｏ／
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）、続いて７Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄するとポリ−グルタミル−アミノプロピ
ノレジリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リテ
ィカス・プロテアーゼＩの含水物（９１０１１１／）を
得る。
カゲルを水（２ｓｌ’）に懸濁し、アクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼＩ（７＃）を水（３ｓｌ）に
溶かした溶液および水溶性ＤＣＣ（５２■）を水（／＋
＋＋／）に溶かした溶液を順に加え、室温＋ｔｊ分間回
転させた後、ｇ’ｃで一晩回転させる。内容物を遠心分
離し、沈澱物を０／Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨＩＡθ）、Ｏ／
Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）、続いて７Ｍ塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄するとポリ−グルタミル−アミノプロピ
ノレジリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リテ
ィカス・プロテアーゼＩの含水物（９１０１１１／）を
得る。
この含水固定化酵素／ｆ当りの活性は、ＴＬＭＥを基質
とした場合、ｐＨ’Ｚθにおいて／ ４ｊＵである。こ
こで７Ｕとは、基質のトシルリジンメチルエステル（Ｔ
ＬＭＥ ） ／ μｍｏｌｅｆｊｅ／分間に加水分解
する酵素量をいう。
とした場合、ｐＨ’Ｚθにおいて／ ４ｊＵである。こ
こで７Ｕとは、基質のトシルリジンメチルエステル（Ｔ
ＬＭＥ ） ／ μｍｏｌｅｆｊｅ／分間に加水分解
する酵素量をいう。
」１１１七
実施例１記載の方法により得られる含水ポＩＪ−グルタ
ミルーアミノプロビルンリカゲＪしＣ２３０ダ）の懸濁
液（２ｔｔｌ）に、トリプシン（２■）及び水溶性ＤＣ
Ｃ（２０１０）を水（約θ４１／）１２：溶かした溶液
を加え、室温で３０分間回転させた後ｔ°Ｃで一晩回転
させる。内容物を遠心分離し、沈澱物を０／Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨＩｌ、０ ） 、 Ｏ／Ｍホウ酸緩衝液＜−５
ｌｒ、ｏ）、続いて７Ｍ塩化す） ＩＪウムで洗浄する
と、ポリ−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルで固
定化されたトリプシンの含水物を得る。この含水固定化
酵素／ｆ当りの活性は。
ミルーアミノプロビルンリカゲＪしＣ２３０ダ）の懸濁
液（２ｔｔｌ）に、トリプシン（２■）及び水溶性ＤＣ
Ｃ（２０１０）を水（約θ４１／）１２：溶かした溶液
を加え、室温で３０分間回転させた後ｔ°Ｃで一晩回転
させる。内容物を遠心分離し、沈澱物を０／Ｍ酢酸緩衝
液（ｐＨＩｌ、０ ） 、 Ｏ／Ｍホウ酸緩衝液＜−５
ｌｒ、ｏ）、続いて７Ｍ塩化す） ＩＪウムで洗浄する
と、ポリ−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルで固
定化されたトリプシンの含水物を得る。この含水固定化
酵素／ｆ当りの活性は。
ベンゾイルアルギニンエチルエステｒｂ（ＢＡＥＥ）を
基質とした場合、ｐＨｒ、ｏにおいて７０３Ｕである。
基質とした場合、ｐＨｒ、ｏにおいて７０３Ｕである。
ここでｌＵとは、基質のＢＡＥＥ／μｍｏｌｅを７分間
に加水分解する酵素量をいう。
に加水分解する酵素量をいう。
参考例３
実施例／記載の方法に従って得られる含水ポリークルタ
ミルーアミノプロピルシリカゲル（２３；０１＃ｇ）を
水（／＋＋＋ｌ）に懸濁し、力Ｊレボキシペブチタ゛−
ゼＡ（シグマ社製、 ！； ！； ｕｎｉｉｓ／＃）
（１！； Ｗ ）を含む塩化亜鉛（７ｍＭ）・塩化力Ｉ
Ｊ（０７Ｍ）溶液（／ｄ）を加え、水溶性ＤＣＣで処理
すると。
ミルーアミノプロピルシリカゲル（２３；０１＃ｇ）を
水（／＋＋＋ｌ）に懸濁し、力Ｊレボキシペブチタ゛−
ゼＡ（シグマ社製、 ！； ！； ｕｎｉｉｓ／＃）
（１！； Ｗ ）を含む塩化亜鉛（７ｍＭ）・塩化力Ｉ
Ｊ（０７Ｍ）溶液（／ｄ）を加え、水溶性ＤＣＣで処理
すると。
ポリ−グルタミン酸で固定化されたカルボキシペプチダ
ーゼＡの含水物を得る。かくして得られる含水固定化酵
素は、基質カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−フェニルア
ラニンに作用してフェニルアラニンを遊離する。
ーゼＡの含水物を得る。かくして得られる含水固定化酵
素は、基質カルボベンゾキシグリシル−Ｌ−フェニルア
ラニンに作用してフェニルアラニンを遊離する。
参考例ｔ
参考例１記載の方法に従って、バチルス・サーキュラン
スＭ −／ ／ ２３−、ｊ； ； （Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＭ−／ ／２３−！； ’ｌの
培養液から精製したエステラーゼを固定化し、モノ−２
−チェニル酢酸テトラエチレングリコールエステル（ｌ
１３Ｎ＞及び７−アミノセファロスポラン酸（’？りを
００！；Ｍリン酸緩衝液＜Ｓ６．Ｓ）に溶かした溶液中
で３７”Ｃ，約３時間反応させるとセファロチンがＩｎ
！ｔ％で得られる。
スＭ −／ ／ ２３−、ｊ； ； （Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓＭ−／ ／２３−！； ’ｌの
培養液から精製したエステラーゼを固定化し、モノ−２
−チェニル酢酸テトラエチレングリコールエステル（ｌ
１３Ｎ＞及び７−アミノセファロスポラン酸（’？りを
００！；Ｍリン酸緩衝液＜Ｓ６．Ｓ）に溶かした溶液中
で３７”Ｃ，約３時間反応させるとセファロチンがＩｎ
！ｔ％で得られる。
参考例！
参考例１記載の方法に従って、β−Ｄ−グルコースオキ
シダーゼ（シグマ社製、タイプＶ）を固定化すると、こ
の含水固定化酵素の／ｆ当りの活性はｔｌｏＵである。
シダーゼ（シグマ社製、タイプＶ）を固定化すると、こ
の含水固定化酵素の／ｆ当りの活性はｔｌｏＵである。
ここで／Ｕとは０−ジアニシヂン／ Ｉｔｍｏｌｅｅ
２ ！； ”Ｃ’、 ７分間に酸化する酵素量をいう。
２ ！； ”Ｃ’、 ７分間に酸化する酵素量をいう。
参考例６
参考例／記載の方法に従っ□て、リゾプス・ニベウス（
Ｒｉつ。ｐｕｓ ｎ１ｖｅｕａ）から精製したグルコア
ミラーゼ（２０１１）を固定化すると、含水固定化酵ｌ
ＯＵである。ここで／Ｕとはグ０°Ｃで１％デンプン溶
液から３０分間に１０ηのグルコースを生成する酵素活
性量であり、還元糖の測定はフエーリングーレーマンー
シュール法（Ｆｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｌｕｎａｎ−８ｃｈ
ｏｏｒｌ Ｍｅｔｈｏｄ）による。
Ｒｉつ。ｐｕｓ ｎ１ｖｅｕａ）から精製したグルコア
ミラーゼ（２０１１）を固定化すると、含水固定化酵ｌ
ＯＵである。ここで／Ｕとはグ０°Ｃで１％デンプン溶
液から３０分間に１０ηのグルコースを生成する酵素活
性量であり、還元糖の測定はフエーリングーレーマンー
シュール法（Ｆｅｈｌｉｎｇ−Ｌｅｌｕｎａｎ−８ｃｈ
ｏｏｒｌ Ｍｅｔｈｏｄ）による。
参考例７
参考例／で得られるポリ−グルタミルアミノプロビルシ
リカゲルを水（２胃／）に懸濁し、トリコデルｖ−ヴイ
リデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の産生
するセルラーゼ（１０１１ｆ／）を水（３Ｉ！Ｉｌ）に
溶がした溶液を加え、更に水溶性ＤＣＣ（Ｊ−、ｌ）を
水（／ｍｌ ）に溶かした溶液を加え、室温でグｊ分間
回転させた後、ｇ’ｃで一晩回転させる。内容物を遠心
分離し、沈澱物を０７Ｍ酢酸緩衝液（１）ＨＩＡｌ。
リカゲルを水（２胃／）に懸濁し、トリコデルｖ−ヴイ
リデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）の産生
するセルラーゼ（１０１１ｆ／）を水（３Ｉ！Ｉｌ）に
溶がした溶液を加え、更に水溶性ＤＣＣ（Ｊ−、ｌ）を
水（／ｍｌ ）に溶かした溶液を加え、室温でグｊ分間
回転させた後、ｇ’ｃで一晩回転させる。内容物を遠心
分離し、沈澱物を０７Ｍ酢酸緩衝液（１）ＨＩＡｌ。
θ／Ｍホウ酸緩衝液（１）ＨＩｒ、１．続イテ／ Ｍｔ
ｌｌ化ナトジナトリウムするとポリ−グルタミル−アミ
ノゾロビルシリカゲルで固定化された上記の酵素の含水
物（？θθＩＩＩｇ）を得る。この含水固定化酵素ＩＱ
当りの活性は３式θ００Ｕである。ここで。
ｌｌ化ナトジナトリウムするとポリ−グルタミル−アミ
ノゾロビルシリカゲルで固定化された上記の酵素の含水
物（？θθＩＩＩｇ）を得る。この含水固定化酵素ＩＱ
当りの活性は３式θ００Ｕである。ここで。
／ Ｘ ／ ｃｌＩＩ’のＰ紙をグθ°Ｃ１ｔＯ分間に
完全に崩壊させる酵素量を！；００Ｕとする。
完全に崩壊させる酵素量を！；００Ｕとする。
参考例！
参考例１で得られる。ポリ−グルタミル−アミノプロビ
ルシリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リティ
カス・プロテアーゼＩＣ１３Ｎ＞を、 Ｂ ｆ１４３０
位のアラニンを欠いたブタ型インスリン（ｊｍＭ）、第
三級ブトキシスレオニン（θ、５’Ｍ）、エタノールと
ジメチルホルムアミドの等景況合物（弘θ％）からなる
酢酸塩緩衝液（最終ｐＨ７）に懸濁し、緩やかに攪拌し
ながら３７′Ｃで一晩保つと、Ｂ鎖の３０位が第三級ブ
トキシスレオニンであるブタ型インスリン（即ちＢ鎖の
３０位に第三級ブトキシ基の付加したヒト型インスリン
）が得られる。高速液体クロマトグラフィーで定量する
と収率は４ｊ％である。
ルシリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リティ
カス・プロテアーゼＩＣ１３Ｎ＞を、 Ｂ ｆ１４３０
位のアラニンを欠いたブタ型インスリン（ｊｍＭ）、第
三級ブトキシスレオニン（θ、５’Ｍ）、エタノールと
ジメチルホルムアミドの等景況合物（弘θ％）からなる
酢酸塩緩衝液（最終ｐＨ７）に懸濁し、緩やかに攪拌し
ながら３７′Ｃで一晩保つと、Ｂ鎖の３０位が第三級ブ
トキシスレオニンであるブタ型インスリン（即ちＢ鎖の
３０位に第三級ブトキシ基の付加したヒト型インスリン
）が得られる。高速液体クロマトグラフィーで定量する
と収率は４ｊ％である。
特許出願人 塩野義製薬株式会社
Claims (3)
- （１）ポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル（
但し、アルキルの炭素数は１〜／Ｉ’）からなる固定化
酵素用担体。 - （２）ポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル（
但し、アルキルの炭素数は／コ／♂）。 - （３）ポリーグリタミルーアミノプロピルシリカゲルで
あることを特徴とする特許請求の範囲（２）記載のポリ
ーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17336781A JPS5876090A (ja) | 1981-10-28 | 1981-10-28 | 固定化酵素用担体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17336781A JPS5876090A (ja) | 1981-10-28 | 1981-10-28 | 固定化酵素用担体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5876090A true JPS5876090A (ja) | 1983-05-09 |
Family
ID=15959079
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17336781A Pending JPS5876090A (ja) | 1981-10-28 | 1981-10-28 | 固定化酵素用担体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5876090A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7488533B2 (en) | 2003-08-05 | 2009-02-10 | Dsl Japan Co., Ltd. | Highly oil absorbing amorphous silica particles |
-
1981
- 1981-10-28 JP JP17336781A patent/JPS5876090A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7488533B2 (en) | 2003-08-05 | 2009-02-10 | Dsl Japan Co., Ltd. | Highly oil absorbing amorphous silica particles |
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