JPS5876090A - 固定化酵素用担体 - Google Patents

固定化酵素用担体

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JPS5876090A
JPS5876090A JP17336781A JP17336781A JPS5876090A JP S5876090 A JPS5876090 A JP S5876090A JP 17336781 A JP17336781 A JP 17336781A JP 17336781 A JP17336781 A JP 17336781A JP S5876090 A JPS5876090 A JP S5876090A
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JP
Japan
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enzyme
carrier
silica gel
poly
water
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Pending
Application number
JP17336781A
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English (en)
Inventor
Riyuunosuke Muneyuki
宗行 龍之祐
Tatsu Oka
岡 達
Kazuyuki Morihara
森原 和之
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shionogi and Co Ltd
Original Assignee
Shionogi and Co Ltd
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Polyamides (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明使用の担体は.縮合剤の存在下に酵素と結合し.
固定化酵素を形成する。
従来より,酵素の活性を低下させることなく酵素の安定
性を高める担体の研究が進められており。
また担体と酵素の結合方法に関しても種々の方法が開発
されている。現在汎用されている結合方法の1つに,担
体として多糖類を用い.これを臭化シアンで活性化した
後.酵素と結合させる方法があるが,この方法では,例
えば多糖類としてセファローズグB.酵素としてトリプ
シンを用いた場合・使用したトリプシンに占める固定化
された活性型トリプシンの割合(固定化率)はlθ%程
度に止まる。
本発明者等は,化学的lこ安定で毒性が極めて低く.か
つ効率良く酵素と結合する担体を見い出すべく種々の物
質を検討した結果.カルボキシル基を官能基として有す
るポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲルが優れ
た担体であることを見い出し,本発明を完成した。
本発明に先立ち.本発明者等は.カルボキシル基を官能
基として有するポリ−グルタミン酸が固定化率30%を
有する良好な担体であることを見い出したが.ポリ−グ
ルタミン酸で固定化した酵素は機械的強度に極めて乏し
く.また、アルカリ性の領域では完全に溶解するので,
固定化酵素本来の目的である再利用の面で不都合が生じ
る。そこで、固定化率が高いというポリ−グルタミン酸
の特質を備え持ち、且つ、長期に渡る繰り返し使用が可
能な担体を検索した結果1本発明担体、ポリーグルタミ
ル−アミノアルキルシリカゲルを見い出すに至った。
これまでに、ポリーγ−メチルグルタミン酸を出発物質
とし、その一部のγ−カルボキシルメチル基をr−カル
ボキシルアジドに変換したものを。
合成樹脂、ガラスピーズなどの固型物に被覆して担体と
した例は知られているが(米国特許3,9 、r jl
、/7) 、この担体も機械的強度が弱く、且つ、γ−
カルボキシルメチル基が徐々に加水分解を受けるので、
長期間の使用には適さない。また、この担体は、ポリー
r−メチルグルタミン酸を固形物に被覆したに過ぎない
ので、長期使用の際には脱落が避けられず、特に医薬品
等、有害物質の混入が問題となる化合物の製造には不適
当である。本発明担体は、ポリ−グルタミン酸のγ−カ
ルボキシル基とアミノアルキルシリカゲルとをアミド結
合を介して結合させたものであり、上記欠点を克服して
いる。
ここで、ポリ−グルタミン酸とは、ポリ−L −グルタ
ミン酸、ポリ−D−グルタミン酸およびポリーDL−グ
ルタミン酸を包含スる。
ポリ−グルタミン酸は市販品として入手可能であり、平
均分子量約so、oooの重合体であって。
アルカリ性では水に可溶で酸性では不溶となる。
ポリ−グルタミル−アミノアルキルシリカゲルは新規の
物質で、縮合剤の存在下に、上記のポリ−グルタミン酸
とアミノアルキルシリカゲルを結合させて得られる。こ
こでアルキルとは、メチル。
エチル、プロピル、オクチル、テトラデカチル。
ヘプタデカチル、オクタデカチル等の炭素数l〜/ざま
でのアルキルを包含するが、特にプロピルが好ましい。
縮合剤としては、ペプチド合成反応に使用できるものは
全て適用でき9例えば、ジシクロへキシルカルボジイミ
ド、/−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)
カルボジイミド等のカルボジイミド類や、カルボニルジ
イミダゾール・ウッドワード試薬′に′等が挙げられる
またはカルボン酸の活性型1例えばカルボン酸クロリド
等を経由しても可能である。縮合反応は攪拌または振盪
下に7〜50時間行なえばよく1反応温度は、20〜1
0θIIC,特に3!;−10褌が好ましい。反応終了
後、目的とする担体を取り出すには1反応液中の固形物
を傾斜分離し、縮合剤および未反応の酵素を除去する操
作を加え、遠心分離等により精製すればよい。
本発明担体による酵素の固定化は、縮合剤の存在下に酵
素と担体を結合させることにより行なう。
縮合剤としては、ペプチド合成反応に使用できるもの全
てを固定化反応にも適用できる。酵素と担体との量比は
、使用目的に応じ、必要とする活性の大小によって、そ
の割合を調整する。本反応で用いる溶媒は、水が一般的
であるが、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、テトラ
ヒドロフラン。
ジメチルスルホキシド、アルコール類、メチルセロソル
ブ、モノグライム、ジグライム等の水溶性有機溶媒およ
び場合によっては、酢酸エチル等の水に難溶性の溶媒も
水と混合して用いることができる。反応温度は上記の溶
媒系において酵素の活性が低下しない範囲で任意に選び
うるが通常lj〜23′Cで行なう。反応時間は、酵素
の種類2反応温度等により異なるが通常2を時間以内で
ある。
本発明担体は、酵素と共有結合するため、目的とする固
定化酵素の純度が高く、結合が切れにくく、固定化酵素
使用中に不純物の溶出する恐れがない。また、高活性の
固定化酵素が収率良く得られる。更には、水に不溶であ
るため1反応終了後担体の分取が容易である等の利点を
有する。
本担体と結合して固定化酵素を形成する酵素としては、
一般に固定化に供される酵素9例えば。
トリプシン、ペプシン、パパイン、アミノアシラーゼ、
グルコースオキシダーゼ、グルコアミラーゼ、カタラー
ゼ、リパーゼ、カルボキシペプチダーゼ等が挙げられる
固定化酵素は酵素本来の目的に使用することができるが
1例えば1本発明の担体であるポリ−グルタミル−アミ
ノアルキルシリカゲルで固定化したアクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼ1 (Achromobac
ter 1yticus protease I)は。
以下の様にしてヒトインスリンの合成に応用できる。上
記の固定化酵素存在下に、B鎖30位のアラニンを欠い
たブタ型インスリンと第三級ブトキシスレオニンを反応
させると、B鎖の30位が第三級ブトキシスレオニンで
ある\ブタ型インスリ Iン(即ち、B鎖の30位に第
三級ブトキシル基の付加したヒト型インスリン)が得ら
れる。
以下に実施例および参考例を示して本発明の態様を明ら
かにするが、下記の例はいずれも本発明をなんら限定す
るものではない。
実施例1 ポリ−グルタミン酸・ナトリウム塩(2θOη)に水(
2sl)を加え、更に/N塩酸(3g! )を加え、得
られる沈澱物を遠心分離し0次いで10 ’N塩酸を加
えて2回、エタノールを加えて1回。
この順に遠心分離をして得ら、れる沈澱物を真空乾燥す
ると白色の固型物(/2011’)を得る。これにジメ
チルホルムアミド(DMF )(乙ml )を加え、リ
フa ツー’jw■(Lichrosorb NH、J
ル+2+2 )及びシンクロへキシルカルボジイミド(DCC)のD
MF溶液(/Ill/)を加えた後、容器全体を室温で
2’1時間1次いで37°Cで22時間回転する。内容
物を傾斜分離し、07M炭酸水素す) IJウム水溶液
を加えて遠心分離を3回行なった後に得られる沈澱物を
、上澄液に残渣が認められなくなるまで繰り返しイソプ
ロピルアルコールによる遠心分離に付す。沈澱物を7O
−jN塩酸で2回。
更に水で2回洗浄するとポリ−グルタミル−アミノプロ
ビルシリカゲルを得る。窒素の元素分析結果から、ポリ
−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルは、lf中に
グルタミル基2mmo l eを含む。
参考例/ 実施例1で得たポリ−グルタミル−アミノプロビルシリ
カゲルを水(2sl’)に懸濁し、アクロモバクタ−・
リティカス・プロテアーゼI(7#)を水(3sl)に
溶かした溶液および水溶性DCC(52■)を水(/+
++/)に溶かした溶液を順に加え、室温+tj分間回
転させた後、g’cで一晩回転させる。内容物を遠心分
離し、沈澱物を0/M酢酸緩衝液(pHIAθ)、O/
Mホウ酸緩衝液(pH10)、続いて7M塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄するとポリ−グルタミル−アミノプロピ
ノレジリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リテ
ィカス・プロテアーゼIの含水物(910111/)を
得る。
この含水固定化酵素/f当りの活性は、TLMEを基質
とした場合、pH’Zθにおいて/ 4jUである。こ
こで7Uとは、基質のトシルリジンメチルエステル(T
 LME ) / μmolefje/分間に加水分解
する酵素量をいう。
」111七 実施例1記載の方法により得られる含水ポIJ−グルタ
ミルーアミノプロビルンリカゲJしC230ダ)の懸濁
液(2ttl)に、トリプシン(2■)及び水溶性DC
C(2010)を水(約θ41/)12:溶かした溶液
を加え、室温で30分間回転させた後t°Cで一晩回転
させる。内容物を遠心分離し、沈澱物を0/M酢酸緩衝
液(pHIl、0 ) 、 O/Mホウ酸緩衝液<−5
lr、o)、続いて7M塩化す) IJウムで洗浄する
と、ポリ−グルタミル−アミノプロビルシリカゲルで固
定化されたトリプシンの含水物を得る。この含水固定化
酵素/f当りの活性は。
ベンゾイルアルギニンエチルエステrb(BAEE)を
基質とした場合、pHr、oにおいて703Uである。
ここでlUとは、基質のBAEE/μmoleを7分間
に加水分解する酵素量をいう。
参考例3 実施例/記載の方法に従って得られる含水ポリークルタ
ミルーアミノプロピルシリカゲル(23;01#g)を
水(/+++l)に懸濁し、力Jレボキシペブチタ゛−
ゼA(シグマ社製、 !; !; uniis/#) 
(1!; W )を含む塩化亜鉛(7mM)・塩化力I
J(07M)溶液(/d)を加え、水溶性DCCで処理
すると。
ポリ−グルタミン酸で固定化されたカルボキシペプチダ
ーゼAの含水物を得る。かくして得られる含水固定化酵
素は、基質カルボベンゾキシグリシル−L−フェニルア
ラニンに作用してフェニルアラニンを遊離する。
参考例t 参考例1記載の方法に従って、バチルス・サーキュラン
スM −/ / 23−、j; ; (Bacillu
s circulansM−/ /23−!; ’lの
培養液から精製したエステラーゼを固定化し、モノ−2
−チェニル酢酸テトラエチレングリコールエステル(l
13N>及び7−アミノセファロスポラン酸(’?りを
00!;Mリン酸緩衝液<S6.S)に溶かした溶液中
で37”C,約3時間反応させるとセファロチンがIn
!t%で得られる。
参考例! 参考例1記載の方法に従って、β−D−グルコースオキ
シダーゼ(シグマ社製、タイプV)を固定化すると、こ
の含水固定化酵素の/f当りの活性はtloUである。
ここで/Uとは0−ジアニシヂン/ Itmolee 
2 !; ”C’、 7分間に酸化する酵素量をいう。
参考例6 参考例/記載の方法に従っ□て、リゾプス・ニベウス(
Riつ。pus n1veua)から精製したグルコア
ミラーゼ(2011)を固定化すると、含水固定化酵l
OUである。ここで/Uとはグ0°Cで1%デンプン溶
液から30分間に10ηのグルコースを生成する酵素活
性量であり、還元糖の測定はフエーリングーレーマンー
シュール法(Fehling−Lelunan−8ch
oorl Method)による。
参考例7 参考例/で得られるポリ−グルタミルアミノプロビルシ
リカゲルを水(2胃/)に懸濁し、トリコデルv−ヴイ
リデ(Trichoderma viride)の産生
するセルラーゼ(1011f/)を水(3I!Il)に
溶がした溶液を加え、更に水溶性DCC(J−、l)を
水(/ml )に溶かした溶液を加え、室温でグj分間
回転させた後、g’cで一晩回転させる。内容物を遠心
分離し、沈澱物を07M酢酸緩衝液(1)HIAl。
θ/Mホウ酸緩衝液(1)HIr、1.続イテ/ Mt
ll化ナトジナトリウムするとポリ−グルタミル−アミ
ノゾロビルシリカゲルで固定化された上記の酵素の含水
物(?θθIIIg)を得る。この含水固定化酵素IQ
当りの活性は3式θ00Uである。ここで。
/ X / clII’のP紙をグθ°C1tO分間に
完全に崩壊させる酵素量を!;00Uとする。
参考例! 参考例1で得られる。ポリ−グルタミル−アミノプロビ
ルシリカゲルで固定化されたアクロモバクタ−・リティ
カス・プロテアーゼIC13N>を、 B f1430
位のアラニンを欠いたブタ型インスリン(jmM)、第
三級ブトキシスレオニン(θ、5’M)、エタノールと
ジメチルホルムアミドの等景況合物(弘θ%)からなる
酢酸塩緩衝液(最終pH7)に懸濁し、緩やかに攪拌し
ながら37′Cで一晩保つと、B鎖の30位が第三級ブ
トキシスレオニンであるブタ型インスリン(即ちB鎖の
30位に第三級ブトキシ基の付加したヒト型インスリン
)が得られる。高速液体クロマトグラフィーで定量する
と収率は4j%である。
特許出願人  塩野義製薬株式会社

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)ポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル(
    但し、アルキルの炭素数は1〜/I’)からなる固定化
    酵素用担体。
  2. (2)ポリーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル(
    但し、アルキルの炭素数は/コ/♂)。
  3. (3)ポリーグリタミルーアミノプロピルシリカゲルで
    あることを特徴とする特許請求の範囲(2)記載のポリ
    ーグリタミルーアミノアルキルシリカゲル。
JP17336781A 1981-10-28 1981-10-28 固定化酵素用担体 Pending JPS5876090A (ja)

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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488533B2 (en) 2003-08-05 2009-02-10 Dsl Japan Co., Ltd. Highly oil absorbing amorphous silica particles

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7488533B2 (en) 2003-08-05 2009-02-10 Dsl Japan Co., Ltd. Highly oil absorbing amorphous silica particles

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