JPS5867630A - 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 - Google Patents
抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法Info
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- JPS5867630A JPS5867630A JP16608081A JP16608081A JPS5867630A JP S5867630 A JPS5867630 A JP S5867630A JP 16608081 A JP16608081 A JP 16608081A JP 16608081 A JP16608081 A JP 16608081A JP S5867630 A JPS5867630 A JP S5867630A
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- Japan
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- antibody
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- mouse
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は生細胞によるＨＧＨに特異的な抗体の産生、さ
らに詳しくは融合細胞（ハイブリドーマ）による抗ＨＧ
Ｈ抗体の産生に関する。
らに詳しくは融合細胞（ハイブリドーマ）による抗ＨＧ
Ｈ抗体の産生に関する。
一般に免疫処置された動物から得られる抗体（特異免疫
グロブリン）は他の免疫グロブリンとの混合物であり、
その中から必要な抗体のみを分離することは困難、場合
によっては不可能である。はとんどの場合抗体の純度が
増大するにつれて特異抗体としての価値も高まる０ζう
した理由から抗体産生細胞またはその前駆細胞と連続的
に分裂増殖が可能な癌細胞を融合させこれら両方の細胞
の特性を有している均質な細胞集団を得ようとする試み
が検討されてきた。
グロブリン）は他の免疫グロブリンとの混合物であり、
その中から必要な抗体のみを分離することは困難、場合
によっては不可能である。はとんどの場合抗体の純度が
増大するにつれて特異抗体としての価値も高まる０ζう
した理由から抗体産生細胞またはその前駆細胞と連続的
に分裂増殖が可能な癌細胞を融合させこれら両方の細胞
の特性を有している均質な細胞集団を得ようとする試み
が検討されてきた。
融合に＃ｉ分化経路が同一の細胞、九七えは感性骨髄腫
Ｂ細胞（ミエローマ細胞）と正常リンパ系Ｂ細胞（抗原
でプライムした動物より得たひ臓細胞々ど）が用いられ
る（ Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ・ｔ ｍｌ。
Ｂ細胞（ミエローマ細胞）と正常リンパ系Ｂ細胞（抗原
でプライムした動物より得たひ臓細胞々ど）が用いられ
る（ Ｇ、Ｋｏｈｌｅｒ・ｔ ｍｌ。
８ｏｍａｔｌｅ Ｃｅ１ｌ Ｇ＠ｎｅｔｉｃｍ、 ３
、３０３ （／り７７） ）、ｏ得られた雑種細胞の一
部はこれらを生じた両方の親の好ましい特質を有してい
る。すなわちハイブリドーマと呼ばれるこの雑種細胞は
抗体産生細胞と同様に特異抗体を合成し、かつミエロー
マ細胞と同様に連続的に分裂増殖する能力を有する。こ
れら、２種類の性質の組合わせによシハイブリドーマは
均一で特異性の高い単りｑ−ン性抗体を連続的に産生ず
ることができる。
、３０３ （／り７７） ）、ｏ得られた雑種細胞の一
部はこれらを生じた両方の親の好ましい特質を有してい
る。すなわちハイブリドーマと呼ばれるこの雑種細胞は
抗体産生細胞と同様に特異抗体を合成し、かつミエロー
マ細胞と同様に連続的に分裂増殖する能力を有する。こ
れら、２種類の性質の組合わせによシハイブリドーマは
均一で特異性の高い単りｑ−ン性抗体を連続的に産生ず
ることができる。
本発明はバイプリドーマによるＩｇＭクラス抗ＨＧ’Ｈ
抗体の製造法を提供する本のである＠すなわち本発明は
、動物をヒト成長ホルモン（以下ＲＧＨと称す）で免疫
し、該動物からの抗ヒト成長ホルモン抗体（以下抗ＨＧ
Ｈ抗体と称す）産生細胞とミエローマ細胞によυ融合細
胞（ハイブリドーマ）を形成させ、該ハイブリドーマを
クローン化し、ついで抗１ｇＭ抗体に対し反応性を有す
る抗ＨＧＨ抗体を産生ずるクローンを選択し培養するこ
とからなる、ＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体の製造法である
。
抗体の製造法を提供する本のである＠すなわち本発明は
、動物をヒト成長ホルモン（以下ＲＧＨと称す）で免疫
し、該動物からの抗ヒト成長ホルモン抗体（以下抗ＨＧ
Ｈ抗体と称す）産生細胞とミエローマ細胞によυ融合細
胞（ハイブリドーマ）を形成させ、該ハイブリドーマを
クローン化し、ついで抗１ｇＭ抗体に対し反応性を有す
る抗ＨＧＨ抗体を産生ずるクローンを選択し培養するこ
とからなる、ＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体の製造法である
。
以下に本発明方法を具体的に説明する。
マウス、ラット、ウサギ、モルモット等の動物を腹腔内
、皮下、静脈内投与等の方法によシＨＣＪで免疫する。
、皮下、静脈内投与等の方法によシＨＣＪで免疫する。
免疫の際、免疫増強のためＦｒｅｕｎｄ ｃｏｍｐｌｅ
ｔ＠ａｄｊｕｖａｎｔ （フロイント コンプリート
アジ具バント）を併用してもよい。該動物からひ臓、リ
ンパ節等をとシ出し抗ＨＧＨ抗体産生細胞の懸濁液を調
製する。一方マウス、ラット、ヒト等由来のＨＧＰＲＴ
（ヒポキサンチン。
ｔ＠ａｄｊｕｖａｎｔ （フロイント コンプリート
アジ具バント）を併用してもよい。該動物からひ臓、リ
ンパ節等をとシ出し抗ＨＧＨ抗体産生細胞の懸濁液を調
製する。一方マウス、ラット、ヒト等由来のＨＧＰＲＴ
（ヒポキサンチン。
グアニン、ホスフォリボシルトランスフェラーゼ）ある
いはＴＫ（チミジンキナーゼ）欠損鳳エローマ細胞を１
ｎマ１ｔｒｏ培養し懸濁液を調製する。該抗ＨＧＨ抗体
産生細胞と＃ミエローマ細胞はポリエチレングリコール
あるいはＨＶＪ （センダイウィルス）等によシ融合せ
しめる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の組合せに％ｋ
ｆ）Ｉｌｌ限けないが、同一動物種由来の細胞を用いる
のが好ましい。次いでＨＡＴ （ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）培地で培養する仁とにより抗Ｈ
ＧＨ抗体産生細胞とミエローマ細胞からなる融合細胞の
みを選択的に増殖させる。さらにｌｂｎＪＨｎｇ ｄｉ
ｌｕｔｉｏｎ （すａｙティング ダイ９゜−シ冒ン）
あるいはコロニー形成法等の方法によシフローン化を行
ない、抗ＩｇＭ抗体と反応性の有無を調べる。抗ＩｇＭ
抗体との反応性は０ｕｅｈｔｅｒｌａｎｙ法等の沈降反
応あるいはｒａｄｉ。
いはＴＫ（チミジンキナーゼ）欠損鳳エローマ細胞を１
ｎマ１ｔｒｏ培養し懸濁液を調製する。該抗ＨＧＨ抗体
産生細胞と＃ミエローマ細胞はポリエチレングリコール
あるいはＨＶＪ （センダイウィルス）等によシ融合せ
しめる。抗体産生細胞とミエローマ細胞の組合せに％ｋ
ｆ）Ｉｌｌ限けないが、同一動物種由来の細胞を用いる
のが好ましい。次いでＨＡＴ （ヒポキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）培地で培養する仁とにより抗Ｈ
ＧＨ抗体産生細胞とミエローマ細胞からなる融合細胞の
みを選択的に増殖させる。さらにｌｂｎＪＨｎｇ ｄｉ
ｌｕｔｉｏｎ （すａｙティング ダイ９゜−シ冒ン）
あるいはコロニー形成法等の方法によシフローン化を行
ない、抗ＩｇＭ抗体と反応性の有無を調べる。抗ＩｇＭ
抗体との反応性は０ｕｅｈｔｅｒｌａｎｙ法等の沈降反
応あるいはｒａｄｉ。
ｉｍｎｕｎｏａａｍａｙ （ラジオ イムノアッセイ）
勢によシ、抗ＨＧＨ抗体産生性蝶ｒａｄｌｏ １ｒａｉ
ｕｎｏａａｓａｙ 。
勢によシ、抗ＨＧＨ抗体産生性蝶ｒａｄｌｏ １ｒａｉ
ｕｎｏａａｓａｙ 。
ｅｎｚｙｍｅ Ｉｒｒｎｕｎｏａｓｓ暑ｙ（エンザイム
イムノアッセイ）、あるいはＨＧＨ感作血球またはＨ
ＧＩ（愚作うｆ−クス等の凝集反応等によシーベること
ができる。
イムノアッセイ）、あるいはＨＧＨ感作血球またはＨ
ＧＩ（愚作うｆ−クス等の凝集反応等によシーベること
ができる。
ＩｇＭ抗体と反応性を有する抗ＨＧＨ抗体産生クローン
を増殖させる。該クローンはＩｎ ｖｌｌママ培養する
ことが可能であシ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養では培養上清
から、１ｎｖｉマ０培養では該クローンを注射した動物
の腹水、血清等からＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体を採取す
ることができる。
を増殖させる。該クローンはＩｎ ｖｌｌママ培養する
ことが可能であシ、Ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養では培養上清
から、１ｎｖｉマ０培養では該クローンを注射した動物
の腹水、血清等からＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体を採取す
ることができる。
従来法で得た抗ＨＧＨ抗体、すなわちＨＧＨで免疫処置
された動物より得た抗体に比べ、ハイブリドーマにより
産生される単クローン性抗体は特異抗体とによシ高い価
値をも′つ。ハイブリドーマによる単りローン性抗）Ｉ
ＧＨ抗体は血中ヒト成長ホルモンの測定、あるいは脳下
画体からのヒト成長ホルモンの抽出ｎ羨、遺伝子組換え
による培養物からの該ホルモンの抽出精製等に用いるこ
とができ、従来法で得た抗ＨＧＨ抗体よりも利用価値が
高いものである０ 今までにＪ、 １ｙａｎｙｉら（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｅ、 ／７九Ｊ７ （／９１０） ）、
Ｐ、Ｇｈ Ｂｕｎｄｅｍｅｎら（Ｊ、ＣＩｉｎｓＥｎｄ
ｏｅｒｌｎｏｌＭｎＣａｂｏｌ、、 Ｊ ／ 、 ／＆
７Ｊ（／？ｊ＃）による抗１１Ｇｉｉ抗体産生イ ハルブリドーマの報告があるが１本発明のように工ｇＭ
り、ラス抗体量生性のものは知られていない、 ＩｇＭ
クラス抗体は、他のクラスの抗体にくスの抗体にくらべ
極めて高い反応性を示しくτ。
された動物より得た抗体に比べ、ハイブリドーマにより
産生される単クローン性抗体は特異抗体とによシ高い価
値をも′つ。ハイブリドーマによる単りローン性抗）Ｉ
ＧＨ抗体は血中ヒト成長ホルモンの測定、あるいは脳下
画体からのヒト成長ホルモンの抽出ｎ羨、遺伝子組換え
による培養物からの該ホルモンの抽出精製等に用いるこ
とができ、従来法で得た抗ＨＧＨ抗体よりも利用価値が
高いものである０ 今までにＪ、 １ｙａｎｙｉら（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｅ、 ／７九Ｊ７ （／９１０） ）、
Ｐ、Ｇｈ Ｂｕｎｄｅｍｅｎら（Ｊ、ＣＩｉｎｓＥｎｄ
ｏｅｒｌｎｏｌＭｎＣａｂｏｌ、、 Ｊ ／ 、 ／＆
７Ｊ（／？ｊ＃）による抗１１Ｇｉｉ抗体産生イ ハルブリドーマの報告があるが１本発明のように工ｇＭ
り、ラス抗体量生性のものは知られていない、 ＩｇＭ
クラス抗体は、他のクラスの抗体にくスの抗体にくらべ
極めて高い反応性を示しくτ。
ＫＬｓｈｉｍｏｔｏ ａｔ ａｌ、 Ｓ、工ｍｍｕｎｏ
１．ｓ １５４ 、 ｊｊ＆（／９７／ｌ Ｊ、０ｎｏ
ｕａａｔ ａｌ−Ｐｒ０Ｑ、８００．１）ＣｐｓＢＩＱ
ｌａＭ＠ｄ＋＃ Ｊ／ ＊ ３００（／９４４１ な
ど）。
１．ｓ １５４ 、 ｊｊ＆（／９７／ｌ Ｊ、０ｎｏ
ｕａａｔ ａｌ−Ｐｒ０Ｑ、８００．１）ＣｐｓＢＩＱ
ｌａＭ＠ｄ＋＃ Ｊ／ ＊ ３００（／９４４１ な
ど）。
血中ヒト成長ホルモンの測定法畔への応用に広く有用で
ある。また、同様に抗原との結合部位を多くもつことか
ら抗原精製用のりガントとしても有用である。
ある。また、同様に抗原との結合部位を多くもつことか
ら抗原精製用のりガントとしても有用である。
以下に、Ｈ（）１１であらかじめ免疫されたｍｘａＡｙ
マウスのひ臓細胞とｍ々マウスのｌエローマ細胞との融
合によりＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体書生産生へリドーマ
のセルラインを調製する方法を本発明方法の一例として
示す。
マウスのひ臓細胞とｍ々マウスのｌエローマ細胞との融
合によりＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体書生産生へリドーマ
のセルラインを調製する方法を本発明方法の一例として
示す。
（荀 融合のためのび繊細胞の調製
融合のためのひＩＩＩＪＩＩＭＩＩを調製するためＫＨ
Ｇ！Ｉを数回マウスに注射し、最後のブースターより３
〜４Ｉ日後にひ臓を採取する。採取したひ臓はＭＩＣＭ
（ｊＬニマムエッセンシャル培地）中で懸濁液とする
。
Ｇ！Ｉを数回マウスに注射し、最後のブースターより３
〜４Ｉ日後にひ臓を採取する。採取したひ臓はＭＩＣＭ
（ｊＬニマムエッセンシャル培地）中で懸濁液とする
。
（Ｉｓ） 融合のためのミエローマ細胞の調製ＭＯＰ
Ｏ−λ／ラインに由来しＨＧＰＲτを欠如するＢＡＩＡ
／ｌｌ １工ローマ細胞ＰＪｌＣ＆Ａｇｆｆσ／ （Ｍ
ａｒｇｕＬｌｉｓｓ＊％ ｍｌ、Ｏｏｌ＋１ 日ｐ
ｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ８％ｐ、（４ｕｔｎｔ、Ｂ
ｉｏｌ 、、、１／ 。
Ｏ−λ／ラインに由来しＨＧＰＲτを欠如するＢＡＩＡ
／ｌｌ １工ローマ細胞ＰＪｌＣ＆Ａｇｆｆσ／ （Ｍ
ａｒｇｕＬｌｉｓｓ＊％ ｍｌ、Ｏｏｌ＋１ 日ｐ
ｒｌｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ８％ｐ、（４ｕｔｎｔ、Ｂ
ｉｏｌ 、、、１／ 。
７ｆ／（／９７４＋１ をＲＥ’ＭＩ １４４ｔＯ培
地（１０−牛脂児血清含）で継代しておく。
地（１０−牛脂児血清含）で継代しておく。
（０） バイプリドーマの生成
に凶ミエローマ細胞とＨＧＩｉ感作ＢＡＬａ１０マウス
より得られたひ臓細胞との混合物をポリエチレングリコ
ール中に懸濁して融合させる。融合細胞はＲＰＭＩ／４
Ｑθ培地（／θ慢牛脂児血清含ＩＫ移し、培養用プレー
トに分注、融合の翌日よりＨムτ選択培地を加える。
より得られたひ臓細胞との混合物をポリエチレングリコ
ール中に懸濁して融合させる。融合細胞はＲＰＭＩ／４
Ｑθ培地（／θ慢牛脂児血清含ＩＫ移し、培養用プレー
トに分注、融合の翌日よりＨムτ選択培地を加える。
（１１） 特異抗体のアッセイ９およびクローニング
増殖のみられたｗａｌｌ （ウェル）の培養上清にりい
て抗ＨＧＨ抗体産生の有無を調べる。
増殖のみられたｗａｌｌ （ウェル）の培養上清にりい
て抗ＨＧＨ抗体産生の有無を調べる。
抗体を産生ずるＷ・ｉｌが見つかれば、そのｗａｌｌ中
のバイプリドーマを１１ｍｉｌｌｎｇ ｄｉｌｕｔｌｏ
ｎ 等の方法によりクローン化する。増−殖のみられ
たｗ＠ｌ ｌについて再度抗体書生の有無を調ベクロー
ンを分離する。
のバイプリドーマを１１ｍｉｌｌｎｇ ｄｉｌｕｔｌｏ
ｎ 等の方法によりクローン化する。増−殖のみられ
たｗ＠ｌ ｌについて再度抗体書生の有無を調ベクロー
ンを分離する。
（ｅ） バイプリドーマのｌ！ｌ ｖｌマＯの増殖分
離したクローンを培養用フラスコで増殖させ、 ７０′
ｙ個の細胞を肱−々マウスの腹腔内に注射する。腹部に
肥大が見られた時点で腹水を採取する。
離したクローンを培養用フラスコで増殖させ、 ７０′
ｙ個の細胞を肱−々マウスの腹腔内に注射する。腹部に
肥大が見られた時点で腹水を採取する。
（ｆ） 腹水の精製
ｘｇＭクラス抗体はゲルろ適法により精製す為のが一般
的である（Ｆ１６６１１！ｌ ＠ｔ ａｌ、、Ｂｉｏａ
ｈｌａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｇ。
的である（Ｆ１６６１１！ｌ ＠ｔ ａｌ、、Ｂｉｏａ
ｈｌａ＋、Ｂｉｏｐｈｙｇ。
ムａｔ龜、 ４３． ダθＪ（／？ＡＪｌｌ。
以下に実施例により本発明の詳細な説明するが１本発明
がこれにより限定されるものではないことはいう！でも
ない。
がこれにより限定されるものではないことはいう！でも
ない。
実施例１
Ｕ〕ｋｘｘされたＨ Ｇ Ｈ１０ρ＃Ｖと：ＩＦｒ＠ｕ
ｎｄ ａｏｍｐ１ｍｓ＊注射してプライムを行ない、さ
らに同量のＨＧＨを数回静脈内に注射してブースターを
行なった。最後のブースターより４日後にマウスよりひ
臓を採取し単細胞懸濁液を調製した。赤血球細胞はθ、
ｔ３優ＭＨ，ＯＬ中で３７℃７分間イン本、ベートすｂ
ことによシ破壊させ、生ずる細胞懸濁液は血清不含ＭＩ
ＩＭで洗浄した。この懸濁液よりｌθ８個の細胞をと抄
、すでに培養を行なっていたマウス邂エローマ細胞／θ
１個と混合しｓ：ｏｏｘｔで遠心し、融合のために血清
不含のＭＩＩＭ中で希釈した４（ｊ憾ｎ／ｖ＋ポリエチ
レングリフ−を−≦０θθ中に再懸濁すせた。ｊ分間室
温で放電後ＭＩＩＩＭで希釈し再トに分注した。融合の
翌日より１〜３日おきに培地の半量をＬ１選択培地で交
換したところ約−週間後にいくつかのＷ・１１で増殖が
艶られ、マウスひ臓細胞とマウスミエローマ細ヨ穀舊Ｈ
肚嘘 μン増殖の見られたＷθ１１の培養上清について、ラテ
ックス凝集法により抗ＨＧＨ抗体活性を検定した。コン
トロールにはウサギ抗ヒト成長ホルモン抗血清を用い九
〇検定の結果、特に抗体活性の強いｖｏｌａ中のへイブ
リドーマについてｌｌｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
によるクローニングを行った。この際、ＲＡＩＪＢ１０
マウスより採取し九胞腺細胞をｆｏ＠Ｋｌｅｒ １ａｙ
ｅｒ （フィーダー レイヤー）として用いた。
ｎｄ ａｏｍｐ１ｍｓ＊注射してプライムを行ない、さ
らに同量のＨＧＨを数回静脈内に注射してブースターを
行なった。最後のブースターより４日後にマウスよりひ
臓を採取し単細胞懸濁液を調製した。赤血球細胞はθ、
ｔ３優ＭＨ，ＯＬ中で３７℃７分間イン本、ベートすｂ
ことによシ破壊させ、生ずる細胞懸濁液は血清不含ＭＩ
ＩＭで洗浄した。この懸濁液よりｌθ８個の細胞をと抄
、すでに培養を行なっていたマウス邂エローマ細胞／θ
１個と混合しｓ：ｏｏｘｔで遠心し、融合のために血清
不含のＭＩＩＭ中で希釈した４（ｊ憾ｎ／ｖ＋ポリエチ
レングリフ−を−≦０θθ中に再懸濁すせた。ｊ分間室
温で放電後ＭＩＩＩＭで希釈し再トに分注した。融合の
翌日より１〜３日おきに培地の半量をＬ１選択培地で交
換したところ約−週間後にいくつかのＷ・１１で増殖が
艶られ、マウスひ臓細胞とマウスミエローマ細ヨ穀舊Ｈ
肚嘘 μン増殖の見られたＷθ１１の培養上清について、ラテ
ックス凝集法により抗ＨＧＨ抗体活性を検定した。コン
トロールにはウサギ抗ヒト成長ホルモン抗血清を用い九
〇検定の結果、特に抗体活性の強いｖｏｌａ中のへイブ
リドーマについてｌｌｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ
によるクローニングを行った。この際、ＲＡＩＪＢ１０
マウスより採取し九胞腺細胞をｆｏ＠Ｋｌｅｒ １ａｙ
ｅｒ （フィーダー レイヤー）として用いた。
培地を２〜３日おきに半量交換しつつ培養を続けたとこ
ろ、約λ週間後に増殖が見られ、培養上清中の抗ＨＧＨ
抗体活性を検定した結果、−０個の抗ＨＧＨ抗体産生性
クローンを分離し九〇曇慕鼻止 Ｇノ分離したクローンを組織培養用フラスコで増殖さ、
せた後、／θ７側の細胞をＢＡＬＯ／ Ｏマウスの腹腔
内に注射した０注射後約−週間で腹部の著しい肥大がみ
られ、腹水を採堆し九。
ろ、約λ週間後に増殖が見られ、培養上清中の抗ＨＧＨ
抗体活性を検定した結果、−０個の抗ＨＧＨ抗体産生性
クローンを分離し九〇曇慕鼻止 Ｇノ分離したクローンを組織培養用フラスコで増殖さ、
せた後、／θ７側の細胞をＢＡＬＯ／ Ｏマウスの腹腔
内に注射した０注射後約−週間で腹部の著しい肥大がみ
られ、腹水を採堆し九。
ｃノ採取した腹水に同量の飽和硫安を加え、生じた沈殿
を遠心して集めθ、／！； Ｍ Ｎａ０ｊ！を含む０．
０２Ｍ ’ｒｒｉｓ ＨＣ！ｆｌバッフｙ−（ｐＨに。
を遠心して集めθ、／！； Ｍ Ｎａ０ｊ！を含む０．
０２Ｍ ’ｒｒｉｓ ＨＣ！ｆｌバッフｙ−（ｐＨに。
θ）に溶解し、−夜回バッファーに対し透析した後、生
じた沈殿を除いて同バッファーで平衝化したカラムに添
加した（カラムは内径λ−４６ｎ ％高さ３６ｍ）。
じた沈殿を除いて同バッファーで平衝化したカラムに添
加した（カラムは内径λ−４６ｎ ％高さ３６ｍ）。
添加後、同バッファーで溶出し、採取した溶出液の各両
分について蛋白量と抗体活性を測定したところ、抗ＨＧ
Ｈ抗体活性はｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅに溶出された蛋白
画分に集中した。このｖｏηｖＯ１（至）に溶出された
蛋白を還元条件下８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析したところ、分子量約７万と約２万３千に相
当する一つのバンドが検出された。前者がＩｇＭクラス
抗体の■鎖の分子量、後者が１４１４の分子量に相当す
ることから、ｖｏｌａ ｖＱｌ−に抗ＨＧ’Ｈ抗体活性
を有するＩｇＭクラス抗体が存在することが確認された
。
分について蛋白量と抗体活性を測定したところ、抗ＨＧ
Ｈ抗体活性はｖｏｉｄ ｖｏｌｕｍｅに溶出された蛋白
画分に集中した。このｖｏηｖＯ１（至）に溶出された
蛋白を還元条件下８Ｄ８−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動で分析したところ、分子量約７万と約２万３千に相
当する一つのバンドが検出された。前者がＩｇＭクラス
抗体の■鎖の分子量、後者が１４１４の分子量に相当す
ることから、ｖｏｌａ ｖＱｌ−に抗ＨＧ’Ｈ抗体活性
を有するＩｇＭクラス抗体が存在することが確認された
。
４齢１１負日ぺ
（に）寒天中に穴をあけ抗原と抗体を対しさせる方法（
０ｕａｂｔｅｒｌｏｎｙ法）Ｋよシフローン培養土楕中
の抗ＨＧＨ抗体のクラス讐調べた。中央の穴に培養上清
を硫安で濃縮した液、周囲のＳつの穴に抗マウスエｇＭ
ｓ抗マウスＩｇＧｔｓ抗マウス”ｇ”ｈｅ抗マウスＩｇ
Ｇ２ｂ、抗マウスニー３を入れ３７℃で一夜放置したと
ころ、抗マウスＩｇＭと培養上清との間にだけ沈降帯が
形成され、へイブリドーマから産生されている抗ＨＧＨ
抗体は１ｇＭクラスであることがわかった。
０ｕａｂｔｅｒｌｏｎｙ法）Ｋよシフローン培養土楕中
の抗ＨＧＨ抗体のクラス讐調べた。中央の穴に培養上清
を硫安で濃縮した液、周囲のＳつの穴に抗マウスエｇＭ
ｓ抗マウスＩｇＧｔｓ抗マウス”ｇ”ｈｅ抗マウスＩｇ
Ｇ２ｂ、抗マウスニー３を入れ３７℃で一夜放置したと
ころ、抗マウスＩｇＭと培養上清との間にだけ沈降帯が
形成され、へイブリドーマから産生されている抗ＨＧＨ
抗体は１ｇＭクラスであることがわかった。
身羞遥ｉ
Ｃ，ｔ）クローン培養上清中の抗体価を経時的に検定し
九０表１に示すようＫ ＩＩＱ’ｆ！に対する反応性に
何ら変化は見られなかった。
九０表１に示すようＫ ＩＩＱ’ｆ！に対する反応性に
何ら変化は見られなかった。
表／、クローン培讐上清中Ｏ抗体価
りローニング後経過日数 抗ＨＧ用売体釧７６週
、１２６ １１讃１１分 （γ）ＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体産生クローンの一つ（
クローン７１９と称す）Ｋついてカリオロジー分析を行
なった。表２に示すようＫＰ３ＸｕムｇざＵ／親細胞は
約１１０個の染色体を含有し、ＢＡＬＢｌｏひ臓細胞は
９０個の染色体を含有するが、クローン７Ｂデ中の染色
体数は約／４ｔＯであυ、クローン７Ｂ？がミエローマ
細胞とひ臓細施の／：／に融合し九九イブリドーマであ
ることが確認された。
、１２６ １１讃１１分 （γ）ＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体産生クローンの一つ（
クローン７１９と称す）Ｋついてカリオロジー分析を行
なった。表２に示すようＫＰ３ＸｕムｇざＵ／親細胞は
約１１０個の染色体を含有し、ＢＡＬＢｌｏひ臓細胞は
９０個の染色体を含有するが、クローン７Ｂデ中の染色
体数は約／４ｔＯであυ、クローン７Ｂ？がミエローマ
細胞とひ臓細施の／：／に融合し九九イブリドーマであ
ることが確認された。
表コ、親シよびハイブリドーマ中の染色体数細胞
細胞あたシの染色体数 ＰＪＸＪＡｇＪ’Ｕ／ 〜／１０※ＢＡＩ４／
Ｃひ臓細胞 ダθ クローン７Ｍ９ 〜１ｌｌｏ※※コ個のメタセ
ンター性のマーカー染色体を含む手続補正書（自発） 特許庁長官 島 １）春 樹 殿 ■、事件の表示 昭和５６年 特許願第 １６６０８０ 号２、発明の
名称 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許比１１人 住 所 大阪市東区北浜５丁目ＩＦａ地名称 （２０
９）住友化学工業株式会社代表者 土 方
武 ４、代理人 住 所 大阪市東区北浜５丁目１゛囁地住友化学工業
株式会社内 氏名 弁理士（６１４＠）木村勝装 置＋０６１２２０−３４０４ ６、補正の内容 （１）明細書第４頁第２〜８行に「（以下ＨＧＨと称す
）」とあるを削除する。
細胞あたシの染色体数 ＰＪＸＪＡｇＪ’Ｕ／ 〜／１０※ＢＡＩ４／
Ｃひ臓細胞 ダθ クローン７Ｍ９ 〜１ｌｌｏ※※コ個のメタセ
ンター性のマーカー染色体を含む手続補正書（自発） 特許庁長官 島 １）春 樹 殿 ■、事件の表示 昭和５６年 特許願第 １６６０８０ 号２、発明の
名称 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 ３ 補正をする者 事件との関係 特許比１１人 住 所 大阪市東区北浜５丁目ＩＦａ地名称 （２０
９）住友化学工業株式会社代表者 土 方
武 ４、代理人 住 所 大阪市東区北浜５丁目１゛囁地住友化学工業
株式会社内 氏名 弁理士（６１４＠）木村勝装 置＋０６１２２０−３４０４ ６、補正の内容 （１）明細書第４頁第２〜８行に「（以下ＨＧＨと称す
）」とあるを削除する。
（２）同第４頁第４行に「（以下ＥＩＧＨ抗体と称す）
」とあるを削除する。
」とあるを削除する。
（３） 同第５頁１！１４〜１５行に「抗ＩｇＭ抗体
と反応性の有無を調べる。」とあるを 「抗ＩｇＭ抗体と反応性を有する抗ＨＧＨ抗体の産生の
有無を調べる。」と訂正する。
と反応性の有無を調べる。」とあるを 「抗ＩｇＭ抗体と反応性を有する抗ＨＧＨ抗体の産生の
有無を調べる。」と訂正する。
（４） 同第６頁第１２行に「特異抗体とにより高い
」とあるを、「特異抗体としてより高い」と訂正す芯。
」とあるを、「特異抗体としてより高い」と訂正す芯。
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１）動物をヒト成長ホルモン（以下ＨＧＨと称す）で
免疫し、該動物からの抗ヒト成長ホルモン抗体（以下抗
ＨＧＨ抗体と称す）産生細胞とミエローマ細胞により融
合細胞（ハイブリドーマ）を形成させ、骸へイブリドー
マをクローン化し、次いで抗ＩｇＭ抗体に対し反応性を
有する抗ＨＧＨ抗体を産生ずるクローンを選択し培養す
ることからなゐＩｇＭクラス抗ＨＧＨ抗体の製造法。 Ｑ ＃抗ＨＧＨ抗体産生細胞がひ臓細胞及びリンパ節細
胞よシ成り立つ群よシ選択し九細胞である特許請求の範
囲第（１）項記載の方法。 （匈 骸ひ臓がマウスのひ臓で該ミエローマがマウスミ
エローマである特許請求の範Ｈ第−礒記載の方法。 （９）骸マウスがＢＡＬＢ／ｃ マウスである特許請
求の範囲第０項記載の方法。 （支）該ミエローマ細胞がＭＯＰＣ−，２／ラインに由
来するＰＪＸＡＪＡｇｌｒＵＩである特許請求の範囲第
（ジまたは（ト）項記載の方法。 （６） 抗１ｇＭ抗体が抗マウスＩｇＭ抗体である特
許請求の範囲第（ジ、（ロ）または（イ）記載の方法。 （７）＃ハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する
特許請求の範囲第（１）、ｕ、 （Ｊｌ、（９）、Ｇ！
：）または（６）項記載の方法。 （イ）該ハイブリドーマを組織適合性のおる動物に注射
しｉｎ ｖｌｖｏで培養する特許請求の範囲第（１）、
−１（５′）、（鉤、（、ｆ）または（４項記載の方法
０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16608081A JPS5867630A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16608081A JPS5867630A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5867630A true JPS5867630A (ja) | 1983-04-22 |
Family
ID=15824603
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16608081A Pending JPS5867630A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | 抗ヒト成長ホルモン抗体の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5867630A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60172934A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-06 | Kachiku Eisei Shikenjo | 免疫グロブリンの製造法 |
-
1981
- 1981-10-16 JP JP16608081A patent/JPS5867630A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60172934A (ja) * | 1984-02-17 | 1985-09-06 | Kachiku Eisei Shikenjo | 免疫グロブリンの製造法 |
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