JPS58502088A - 哺乳動物の胎児を凍結保存するためのストロ− - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳動物の胎児を凍結保存するため のストロ−およびこのストロ−の胎 児移植への適用 本発明は哺乳動物の胎児の冷凍保存に関するものである。かかる胎児は胎児移植 に適用される。

従来技術では、ストロ−（ｓｔｒａｗ　）と呼ばれ、適当な液体中に遊動精子（ ｓｐｅｒｍａｔｏｚｏｉｄ　）が入っている小形プラスチック管が知られている 。

他方、胎児の凍結には凍結プロテクター（ｃｒｙｏ−ｐｒｏｔｅｃｔｏｒ　）が 必要であることが知られている。しかし、解凍後にこの凍結プロテクターを除去 するこる。、先に、本発明のストロ−とは異なる構造を有していて、解凍後に凍 結プロテクターを希釈する備えを有していないストロ−内で牛の胎児を凍結する ことが提案された。

本発明は胎児を処理することなく　（ｗｉｔｈｏｕｔ　ｍａｎｉ−ｐｕｌａｔｉ ｎｇ　）凍結プロテクターを除去できる新規な構造のストロ−を提供する。

本発明のストロ−においては、胎児は凍結前には包み込まれており、このストロ −をそのまま移植時に使用する。

本発明は従来技術で要求されるような胎児を複数回取扱う必要性をなくす封鎖さ れたストロ−を提供する。従って、より正確には、本発明では１個の単一包装、 すなわち受容体である女性の子宮内に設置するために必要な］個の単一包装が必 要である。

本発明のストロ−は、凍結した胎児を顕微鏡的規模で取扱うことなく、生育場所 で使用することを可能にする。この直ちに使用できる胎児は携帯用低温容器内に 貯蔵することができる。従来技術はすべていやおうなしに、解凍後に、双鏡レン ズ下に胎児を取扱うための従来手段を生物学者に要求する。

本発明は、哺乳動物の胎児の細胞内に入り込む凍結保護剤（すなわち凍結プロテ クター）を含有する凍結解凍可能な保存用媒体内に前記胎児を凍結保存するため のストロ−において、 前記ストロ−は哺乳動物に使用する時までその両端で封鎖されており、 前記凍結保存用媒体内の前記胎児はニ ー（Ａ）一方では、一端に向けて順次、（ａ）ガス状混合物、（ｂ）培地、およ び（Ｃ）第２封鎖川端部栓により、 ＝（Ｂ）他方では、他端に向は順次、（ＣＩ）気泡、（ｅ）周囲温度において前 記胎児に対して毒性を有しているとしても低毒性であって前記胎児の細胞内に入 り込まないが前記凍結プロテクターを前記細胞の外方に向は漸次拡蔽させるのに 充分な滲透圧を前記胎児の外側に与える少くとも１種の水混和性物質の溶液であ って、解凍した際に、その保存用媒体内の前記胎児が前記溶液と直接接触するよ うに配置されている溶液、（ｆ）もう一つの気泡および（ｇ）第２封鎖川端部栓 により それぞれ囲まれていることを特徴とする哺乳動物の胎児を凍結保存するためのス トロ−をその目的とする。

また本発明は哺乳動物の胎児を凍結保存するための識別棒を設けたストロ−に関 するものである。

現在本明細書に開示されているようなストロ−内の凍結されている胎児を識別す る手段は供給されている。

本発明のストロ−は使用前には液体窒素中で貯蔵する。本発明のストロ〜はその 本体上に識別に必要＼ な種々のデータ、例えば胎児が凍結されている組織（ＯｒｇａｎｉＺａｔｉＯｎ 　）の記号、冷凍データ、供与体である雌の品種および関連事項を担持している のが普通である。

かかるデータはストロ−の本体上に直接付けられているから、作業者は識別のた めには液体窒素からストロ−を短時間取出して付いている情報を読取ればよい。

普通ＪＯ〜４・０μｌの容積内に凍結されている胎児は液体窒素内から取出され ると直ちに全く急激に再加温される。よく知られているように一１９６°Ｃから 一６０°Ｃまでの再加温速度はほぼ３６０″Ｃ／分程度である。

従って、ストロ−上を直接読取ることは制御されていない再加温を惹起し、これ は凍結されている媒体の゛再結晶を促進する。

かかる再結晶は細胞内にある分量の細胞量水が存在している場合にますます著し くなる（ファラント、フェザ−およびウオルター、１９７フーイフエクトオプ・ インターアクション・ビトウィーン・クーリング・アンド・リウオーミング・コ ンディションス・オン・サバイバル・オン・セルス。「ザ・フリージング・オン ・ママリアン・エンプリオス、チバ・ファウンデーション・シンポジウムＪ５２ 、エルセビール（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　）、エキスセルブタ・メチイカ（Ｅｘｃｅ ｒｐｔａ　ＭｅｄｉＣａ　）　、北オ７ンダにおいて）。さて、現在胎児に用い られている凍結のクイズは正にこのようなものである。

従って、識別に関する問題がある。

しかも、凍結プロテクター含有部分（ｆｒａｃｔｉ○ｎ）、従って゛胎児と、解 凍後凍結プロテクターを希釈する作用をする部分との間に存在する気泡の較正（ ｃａｌｉ−ｂｒａｔｉｏｎ　）に関する問題がある。

本発明はストロ−にこのストロ−内の胎児の正確な識別手段および上述の気泡を 較正する手段の両方を与えると共にストロ−の容易な組立てを可能にする栓を設 けることによりこれらの問題を除くものである。

本発明においては、哺乳動物の胎児の細胞内に入り込む凍結保護剤（すなわち凍 結プロテクター）を含有する凍結解凍可能な保存用媒体内に前記胎児を凍結保存 するためのストロ−において、前記ストロ−は哺乳動物に使用する時までその両 端で封鎖されており、前記凍結保存用媒体内の前記胎児は＝（Ａ）一方では、一 端に向けて順次、（ａ）カス状混合物、（ｂ）培地、および（Ｃ）第１封鎖用端 部栓により、（Ｂ）他方では、他端に向は順次、（（ｉ）気泡、（ｅ）周囲温度 において前記胎児に対して毒性を有しているとしても低毒性てあｐで前記胎児の 細胞内に入り込まず前記凍結プロテクターを前記細胞の外方に向は漸次拡散させ るのに充分な滲透圧を前記胎児の外側に与える少くとも１種の水混和性物質の溶 液であって、解凍した際に、その保存用媒体内の前記胎児が前記溶液と直接接触 するように配置されている溶液、（ｆ）もう一つの気泡および（ｇ）第２封鎖用 端部栓によりそれぞれ囲まれており、前記第２封鎖用端部栓は合成物質の棒であ ってその本体は前記ストロ−より幅が広く、解凍した際に媒体部分を横切って上 昇する気泡を破裂させて凍結プロテクターを希釈する作用をする前記棒の端部は 、前記ストロ−の充填後に、前記気泡を正確に較正できるよう自由に選定°され る深さまで前記ストロ−の一端内に少くとも１個の平坦部を介して押込嵌合され ている哺乳動物の胎児を凍結保存するためのストロ−を提供する。

また、本発明は下記の特徴に関するもので、これらの特徴を単独であるいはその 技術的に可能なあらゆる組み合わせとして有しているニ ー　前記ガス状混合物（ａ）を空気、窒素、および二成分もしくは三成分ガス状 混合物からなる群から選定するニ ー　前記ガス状混合物（ａ）が窒素と酸素と二酸化炭素とから、特に窒素９０％ と酸素５％と二酸化炭素５％とからなる； −前記培地（ｂ）が炭酸塩またはリン酸塩緩衝剤、例えば本質的にグルコースと 無機塩とアミノ酸とからなる炭酸塩緩衝剤またはＰＢＳ型リン酸塩緩衝剤を含有 する生体外培養用培地であるニー前記凍結プロテクターがグリコール、ジメチル スルホキシドまたはプロパンジオールである；−前記胎児と前記溶液（ｅ）との 間の気泡（（ｉ）が空気、窒素または二成分もしくは三成分ガス混合物からなる ニ ー　前記溶液（ｅ）がスクロースおよび塩（リン酸塩または炭酸塩）緩衝剤を含 有している；−前記溶液（ｅ）がポリヒニルピロリドンおよび塩（リン酸塩また は炭酸塩）緩衝剤を含有している；−前記溶液（ｅ）中の塩緩衝剤の規定度がこ の溶液中に存在する物質のモル濃度の関数であり、前記物質のモル濃度が高い程 前記緩衝剤の塩基度が低いという法則が存在する； −前記溶液（ｅ）と前記第２栓（ｇ）との間の気ａ（ｆ）が空気、窒素または二 成分もしくは三成分ガス混合物からなる； −前記ストロ−が水平位置で凍結されている；−全ストロ−容１５００マイクロ リットルの場合ノ成分要素の相対容積が次の値： 胎児　４０マイクロリットル ガス状混合物（ａ＞　５０　マイクロリットル培地　（ｂ）　１．５０　マイク ロリットル胎児と溶液（ｅ）との間の気泡（ｄ）　２０マイクロリツトル溶液　 （ｅ）　２００　マイクロリットル溶液（ｅ）と第２栓（ｇ）との間の気泡（ｆ ）４０マイクロリツトルである； −前記気泡を破裂させる前記枠の端部が球の一部分の形である； −前記気泡を破裂びせる前記枠の端部が截頭円錐の形である； −前記気泡を破裂ぎせる前記枠の端部が円錐の形である； −前記枠の截頭円錐または球の一部分の形には頂部に短い針先が設けられている ； −前記枠の本体がストロ−識別用記号を有している； −前記枠が射出成型されたプラスチックから作られている； −前記枠がポリ塩化ビニルから作られているニー　接合区域に溶接工程を適用す ることにより前記枠の押込嵌合された取付は部を強化する。

本発明を添付図面を参照して例について説明するが、本発明はかかる例に限定さ れるものではない。

添付図面において： 第１図は凍結前の本発明のストロ−の構造を示し；第２図は本発明のストロ−を 胎児の移植に適用するに先立って解凍して凍結プロテクターの希釈が行われた際 の第１図と同一のストロ−を示し：第３図は識別俸を設けた凍結前の本発明のス トロ−の構造の１例を示し： 第４図は球の一部分の形をしている前記枠の一端の断面図であり； 第５図は截頭円錐の形をしている前記枠の一端の断面図であり： 第１図において、本発明のストロ−を全般的に１で示す。その両端１３　、１４ ・を栓で止め、これらの２個の栓をそれぞれ２および３で示す。第１栓２はポリ ビニルアルコールを含浸させた脱脂綿からなる従来の栓である。このような栓は フランス国特許第１４７２１３９号に披瀝されている。第２栓３は栓２と同じ栓 とすることができるが、そのようにする必要はなく、単にポリビニルアルコール の栓とすることができる。容ｉ　ｓ　Ｏｏマイクロリットルのストロ−】は直径 ２．７センチメードルの場合に大きさ１３ｃｍである。胎児４′は凍結保存用媒 体中にある。この媒体はかかる目的に知られている任意の媒体とすることができ る。この含まれている媒体は緩衝剤で処理されており、例えば、グリセリン、ジ メチルスルホキシドまたはプロパンジオールからなる凍結プロテクター４が添加 されている。かかる凍結保存用媒体に関するこれ以上の情報に関しては、かかる 技術分野における通常の知識を有する者は刊公物：ザ・フリージング・オン・マ マリアン・エンプリオス。

チバ・ファウンデーション・シンポジウム、５２゜エルセビ′−ル、北オランダ 、１９７７、およびレナト（Ｒｅｎａｒｄ　）等による刊公物：テリオジエ７０ ジー　（Ｔｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ　）　１５　、１１３を参照することがで きる。例えば、凍結プロテクター（グリセリン）４の濃度は約１〜ｌ。５Ｍであ る。５００マイクロリツトルのストロ−■の場合には、凍結保存用媒体中の胎児 ４′の容積は４０マイクロリツトルで、凍結ロリットルのガス状混合物５により 囲まれている。

ガス状混合物５は空気、窒素とすることができ、あるいは二成分または三成分混 合物とすることができる。例えば、ガス状混合物５は窒素と酸素と二酸化炭素と から、特に窒素９０％と酸素５％と二酸化炭素５％とから構成することができる 。上述のようにほぼ５０マイクロリツトルの容積を有するガス状混合物５と、栓 ２との間にあるのは培地６である。培地６は生体外培養に適当な任意の培地であ る。かかる培地の特定例は［ミＵ　ニー　（Ｍｉｌｉｅｕ　）　Ｂ２ＩＮＲＡＭ ＥＮＥＺＯＪなる商品名でフランス国ＡＰＩ社から市販されていて、本質的にグ ルコースと無機塩とアミノ酸とからなる炭酸塩緩衝剤含有培地である。使用でき るもう一つの培地６はＰＢＳなる一般的名称で入手できるものでこれはリン酸塩 緩衝剤含有培地であり；ＰＢＳ培地は特にウィッティングハムによつファーティ リテイ・サブリメント（Ｊｏｕｒｎａｌ○ｆＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ 　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　）　Ｊ　１４ニア−２１−１９ ７１に記載されている。生体外培養用培地６は解凍した際の胎児４′の生育性お よびその代謝活性の正常な回復の両方を可能にする。栓３に面する側では、凍結 プロテクター４を含有する凍結保存用媒体中の胎児４′は容積２０マイクロリツ トルの気泡７、次いで周囲温度において胎児に対して毒性を有しているとしても 低毒性であって胎児４１の細胞内に入りこまないが凍結プロテクター４を前記細 胞の外方に向は漸次拡散させるのに充分な滲透圧を胎児の外側に与える少くとも ］種の水混和性物質の溶液８によって囲まれている；前記溶液は８で示されてお り、この例では、２００マイクロリツトルの容積を占めている。最後に、容積４ ０マイクロリツトルのもう１つの気泡９が溶液８と栓３との間にある。

２個の気泡７および９は空気または窒素から構成することができ、あるいは二成 分または三成分混合物とすることができる。溶液８にとって好ましい物質はスク ロースである。溶液８は、例えば、スフロー　スオヨヒスクロースのモル濃度の 関数として選定される規定度を有する（リン酸塩または炭酸塩）緩衝剤を含有す る。緩衝剤の規定度はスクロースのモル濃度が高い程低くする。良好な結果を与 える組み合わせはＩＮの緩衝剤の場合には０．２５　Ｍのスクロースからなる。

上述の条件を変えないで、スクロースの代すにポリビニルピロリドンを使用する ことができる。

溶液８は胎児４′の細胞からの凍結プロテクター４の部分的除去を可能にする部 分である。勿論、少量の凍結プロテクター４はどのようにしても存在する。本発 明のストロ−］における配置は解凍した際に、胎児保存用媒体中の胎児４′が溶 液８と直接接触するようにする。

気泡７は再加温プロセス中に消失して溶液８と凍結プロテクター４とを合流させ る部分であるが、ガス状混合物５は子宮内に移植するまでの間凍結プロテクター と溶液との混合物］１と培地６との分離を維持する作用をする。

溶液８は胎児の細胞内に入り込まないが、凍結保存用媒体の滲透圧を増大するこ とにより、凍結プロテクターが胎児４′の細胞の外方に向は受動的な拡散を行う 間における細胞膜に対する滲透圧ショ゛ンクを限定する作用をする。

上述の構造における種々の部分は１ｍｌ注射鋼を使用して本発明のストロ−１中 に単に吸引することによって配置される。ストロ−１をその両端１３゜１４にお いて２個の栓２および３によって封鎖し、しかる後に第１図に示す組立体を水平 位置で凍結させる。

第２図は解凍および凍結プロテクター４の希釈を示し、この例においてこれは１ ．５Ｍのグリセリンである。解凍した際に、ストロ−］はほぼ３７°Ｃの温度の 水浴中に第２図の１０で示す立て位置に配置する。

溶液８は凍結プロテクター４の溶液より濃度が低く、溶液８はストロ−１の壁１ ５から融解し始める最初のものである。従って、解凍温度において、凍結保存用 媒体より低い濃度を有する溶液８は、融解し始める最初のものであり、このため 解凍を伴う温度変化の全く始めから気泡７はストロ−１内を上昇することができ る；前記気泡７の寸法はこの気泡の上昇が漸次起るように選定する。ガス状混合 物５の容積は気泡７より大きく、これは実際上変化せず、保存用媒体と培地６と の分離を維持する。これよりきる。グリセリン／スクロースの容積比を］：５に するとグリセリンは漸次拡散することができる。ストロ−１を５〜７分間交互に 上下にひつくり返すことにより、胎児４′は液柱全体を横切って流れることがで き、これにより凍結プロテクター４の均一な拡散が促進される。

立て位置に保持されているストロ−】をその上端で切断し、次いで移植ガン１２ に取付ける。この例ではグリセリンとスクロースとからなる希釈媒体Ｊ１の一部 分を放出し、次いで胎児４′を所定の場所に設置する。このようにして受容体で ある女性の子宮内に胎児４′を付着させる間に培地６との混合が確実に行われる 。第２図では、同一記号を用いて第１図のものと同一の部分を示す。

第３〜６図ではストロ−を全般的に］で示し、その壁を１５で示す。このストロ −はその一端１３において柱２により止められており、この栓は例えばポリビニ ルアルコール栓である。胎児４′は凍結プロテクター４中にあり、ガス状混合物 ５および気泡７のそれぞれによって囲まれている。ガス状混合物５と栓２との間 にあるのは培地６である。周囲温度において前記胎児に対して毒性を有している としても低毒性であって胎児４′の細胞内に入り込まないが凍結プロテクター４ を前記細胞の外方に向は漸次拡散させるのに充分な滲透圧を前記胎児の外歯に与 える少くとも１種の水混和性物質の溶液８を気泡７と前記溶液８を栓３から分離 するもうひとつの気泡９との間に配置する。

ストロ−１の端１４に設けられている栓３はプラスチック棒３１で、この棒はス トロ−］より幅の広い本体３２を有している。この棒３］は少くとも１個の平坦 部が設けられているその端部３４の一方においてストロ−１の端１４内に圧入す なわち押込嵌合されている。球の一部分３４ａ、截頭円錐３４・ｂまたは円錐３ ４Ｃの形をしていて細い針先３＋ｄが設けられているか設けられていない棒３１ の端部３４は解凍した際に気泡７が棒３１と接触した時の気泡７の破裂を容易に し、これによってストロ−１をひつくり返した時に気泡７のストロ−１内におけ る復帰運動が回避される。かかる運動は部分４・と８との混合物とからなるカラ ムを横切る胎児４′の運動を妨げることがある。ストロ−１を充填した後に、棒 ３】を気泡７が正確に較正されるよう自由に選定できる深さまで嵌合する。棒３ １の調節自在な挿入から生ずるピストン作用によって、気泡７を極めて高い精度 で較正することができる。棒３］はストロ−】を識別するのＧコ必要な記号を有 している：従って、本発明においては、ストロ−］に識別マークを直接つける容 易さが保持されているが、プラスチック棒３］に記号をつけることもでき、プラ スチック棒３１は４る程度の熱慣性（ｔｌ−１ｅｒｍａｌ　１ｎｅｒｔｉａ　） を有し、この棒３１をストロ−】の端１４内に嵌合する。

読み取りにはストロ−１そのものを液体窒素中に残しておいてプラスチック棒３ ］を液体窒素から取出すことが必要であるだけである。端】４の棒３■の組立体 本体３２に対してカラーインデックスを使用すると液体窒素容器内に保持されて いる一群のストロ−に対する第１識別が可能である。ストロ−１に棒３１を加え た長さを現在市販されている種々の容器内の貯蔵空間と一致するように保持する には、ストロ−１の全長を後述のように縮める。

上述のように、棒と栓との組立体８，３１もストロ−の組立てを容易にする。事 実、解凍した際にストロ−］内を上昇できるようにするには、気泡７を小さな容 積、すなわち５００μｌストロ−の場合には２０μｌ、２５０μノストローの場 合には６〜８μｌにする必要がある。ストロ−１を組立てる際に気泡７の較正を 正確に行う必要がある。吸込まれた空気の容積が僅かに小さすぎる場合には、上 述の２種の部分は混ざり易く、この工程を繰返す必要がある。

プラスチック棒３１は、ストロ−］の端端部内に挿入する間に、組立体内のガス 状部分を圧縮するので、その容積は小さくなる。かかる容積の減少は棒３１がス トロ−１内に侵入した深さによって左右されるが、かかる容積の減少は、作業者 が過大な容積をとることができまた最終工程として棒３１がストロ−１内に挿入 される深さを変えることにより空気またはガス状混合物部分の容積を調節するこ とができる点で、組立てを容易にする。

ストロ−］内のプラスチック棒３１の押込嵌合ずなわち圧入は所要に応じて接合 区域に溶接作用を適用することにより強化することができる。かかる方法により 、例えば、短い溶接パルスにより、２個のプラスチック部材の接合を強化してス トロ−１を全く漏洩しないようにすることができる。

本発明によって、内径２．８能のストロ−（５００μｌのストロ−に相当する） および内径１，７ｚｍのストロ−（２５０μｌのストロ−に相当する）を製造し た。

以下に小直径、すなわち２５０μｌストロ−の場合の成分要素の相対容積および 長さを示す。

胎児（４−・ル／）　５　１２ ガス状混合物［５）　ｌｏ　ｚ＋ 胎児（４，・４′）と溶液（８）との間の気泡（７）　２．５　６スクロース溶 液（８）　２５　５５ 培地（６）　２５　５５ 端部気泡（ｇ）　２．５　６ 栓（２）を除く全ストロ−（］）　７０　１．６０棒（３１）を除く全ストロ− （１）の長さ　８７棒（３］）の長さ　５５ 全長　１４２ 本発明は哺乳動物に適用できる。最良の結果は牛、羊および山羊の胎児について 得られた。しかし、本発明は牛、羊および山羊の胎児への適用に限定されるもの ではない。

本発明のストロ−１を胎児の移植に用いた。得られた結果は次の通りである： 凍結し、次いで解凍後２４〜４８時間の間生体外で培養した３０個の胎児のうち 、２５個が正常な生育を示した。この数値は８３．３％の収率を示す。

凍結し、次いで解凍後に直接移植した］４個の胎児のうち、７個の５５日までの 姓娠が達成され、生存率は５０％であった。従来技術を使用した場合には生存率 は３５％にすぎなかった。

本発明はストロ−１の特殊な上述のような構罎にある。壁】５を形成するプラス チックは、従来技術において、ストロ−に従来使用されていたプラスチックであ って、これは本発明の範囲内にない。

最後に、５００マイクロリツトルのストロ−】の容量は変えることができ、また 例えば２５０マイクロリツトルのストロ−のような異なる容積を有することがで きるストロ−を容易に製造できることが重要である。

また本発明は哺乳動物の凍結保存用の識別棒を設けたストロ〜を提供し、このプ ラスチック棒３１はストロ−］内に配置されている胎児の正確な識別および気泡 ７の自由な較正を可能とし、かつ前記ストロ−１の組立てを容易にする。棒３１ はストロ−１内の種々の部分と融和性である任意のプラスチックから形成するこ とができる。例えば、前記棒３１はポリ塩化ビニルから作られるが、任意の類似 の材料も適当である。棒３１上の識別記号は任意の適当な方法で設けることがで き；例えばゴムダイ（ｒｕｂｂｅｒｄｉｅ　）を使用して前記記号を印刷するこ とができる。

棒３１の本体３２とストロ−１の本体との間の幅の差異は自由に変えることがで きるが；棒３１の本体３２をストロ−１の本体より僅かに幅広にするのが好まし い。

本発明は上述の例に限定されず、この技術の分野における通常の知識を有する者 の視界内にある種々の同等物および変形を包含するものである。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、６ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ■、＠乳動物の胎児（４′）の細胞内に入り込む凍結保護剤（すなわち凍結プロ テクター）（４）を含有する凍結解凍可能な保存用媒体内に前記胎児を凍結保存 するためのストロ−において、 前記ストロ−は哺乳動物に使用する時までその両端（１３，１４）で封鎖されて おり、前記凍結保存用媒体内の前記胎児（４′）は：（Ａ）　一方では、一端（ １３）に向けて順次、（ａ）ガス状混合物（５）、（ｂ）培地（６）、および（ Ｃ）第１封鎖用端部栓（２）により、ＣＢ）　他方では、他端（１４）に向は順 次、（（１）気泡（７）、（ｅ）周囲温度において前記胎児（４′）に対して毒 性を有しているとしても低毒性であって前記胎児の細胞内に入り込まないが前記 凍結プロテクター（４）を前記細胞の外方に向は漸次拡散させるのに充分な滲透 圧を前記胎児（４′）の外側に与える少くとも１種の水混和性物質の溶液（８） であって、解凍した際に、その保存用媒体内の前記胎児（４′）が前記溶液（８ ）と直接接触するように配置されている溶液、（ｆ）もう一つの気泡（９）およ び（ｇ）第２封鎖用端部栓（３）により それぞれ囲まれていることを特徴とする哺乳動物の胎児を凍結保存するためのス トロ−８２前記ガス状混合物（ａ）（５）を空気、窒素、および二成分もしくは 三成分ガス状混合物からなる群凡 から選定する請求の範囲第１項記載のストロ−０３前記ガス状混合物（ａ）　（ ５）が窒素と酸素と二酸化炭素とから、特に窒素９０％と酸素５％と二酸化炭素 ５％とからなる請求の範囲第１項または第２項記載のストロ−６ ４前記培地（ｂ）　（６）が炭酸塩またはリン酸塩緩衝剤、例えば、本質的にグ ルコースと無機塩とアミノ酸とからなる炭酸塩緩衝剤またはＰＢＳ型リン酸塩緩 衝剤を含有する生体外培養用培地である請求の範囲第１〜３項のいずれか一つの 項に記載のストロ−０ ５前記凍結プロテクター（４）がグリコール、ジメチルスルホキシドまたはプロ パンジオールである請求の範囲第１〜４項のいずれか一つの項に記載のストロ− ０ ６前記胎児（４′）と前記溶液（ｅ）　（８）との間の気泡（（ｉ）げ）が空気 、窒素または二成分もしくは三成分ガス混合物からなる請求の範囲第１〜５項の いずれか一つの項に記載のストロ−８ ７前記溶液（ｅ）　（８）がスクロースおよび塩（リン酸塩または炭酸塩）緩衝 剤を含有している請求の範囲第１〜６項のいずれか一つの項に記載のスト８　前 記溶液（ｅ）　（８）がポリビニルピロリドンおよび塩（リン酸塩または炭酸塩 ）緩衝剤を含有している請求の範囲第１〜７項のいずれか一つの項に記載のスト ロ−０ ９前記溶液（ｅ）　（８）中の塩緩衝剤の規定度がこの溶液中に存在する物質の モル濃度の関数である請求の範囲第１〜８項のいずれか一つの項に記載のストロ −０ ］０　前記物質のモル濃度が高い程前記緩衝剤の塩基度が低いという法則が存在 する請求の範囲第１〜９項のいずれか一つの項に記載のストロ−８１１前記溶液 （ｅ）　（８）と前記第２栓Ｃｇ）（３）との間の気泡（ｂ、）　（９）が空気 、窒素または二成分もしくは三成分ガス混合物からなる請求の範囲第１〜１０項 のいずれか一つの項に記載のストロ−０］２　前記ストロ−が水平位置で凍結さ れている請求の範囲第１〜１１項のいずれか一つの項に記載のストロー。 ］３　全ｇ積５０ｏマイクロリットルを有するストロ−（１）の場合の成分要素 の相対容積が次の値：胎児（４’　）　４０　マイク８ノットルガス状況合物（ ５）　５０　マイクロリットル培地（１））　（６）　１．５０　マイクロリッ トル胎児（４’）と溶液（ｅ）（８）との間の気泡（ｄ）（７）２０　マイクロ リットル 溶液（ｅ）　（８）　２００　マイクロリットル溶液（ｅ）（８）と第２栓（ｇ ）（３）との間の気泡（ｆ）（９）４・０　マイクロリットル である請求の範囲第１〜１２項のいずれか一つの項に記載のストロ−０ ］４・　第２封鎖用端部栓（３）は合成物質の棒（３］）であってその本体（３ ２）はストロ−（］）より幅が広く、解凍した際に媒体部分に沿って上昇する気 泡（７）を破裂させて凍結プロテクターを希釈する作用をする前記棒（３］）の 端部（３４）は、前記ストロ−（］）の充填後に、前記気泡（７）を正確に較正 できるよう自由に選定される深さまで前記ストロ−（１）の一端（１，４）内に 少くとも１個の平坦部を介して押込嵌合されている請求の範囲第１〜１３項のい ずれか一つの項に記載のストロ−０】５　前記気泡（７）を破裂させる前記棒（ ３］）の端部（３４）が球の一部分（３４ａ）の形を有する請求の範囲第１４項 記載のストロ−０ １６前記気泡（７）を破裂させる前記棒（３］）の端部（３４）が截頭円錐（ａ ＋ｂ）の形を有する請求の範囲第１４項記載のストロ−０ １７前記気泡（７）を破裂させる前記栓（３］）の端部（３４）が円錐（３４Ｉ Ｃ）の形を有する請求の範囲第］４・項記載のストロ−０ １８前記棒（３］）の截頭円錐（３４ｂ）または球の一部分（３４ａ）の形には 頂部に短い針先が設けられている請求の範囲第１５項または第１６項記載のスト １９　前記棒（３１）の本体（３２）が前記ストロ−（１）を識別するのに必要 な記号を有している請求の範囲第１４〜１８項のいずれか一つの項に記載のスト ２０　前記棒（３■）が射出成型されたプラスチックから２１　前記俸（３１） がポリ塩化ビニルから作られている請求の範囲第］４・〜２０項のいずれか一つ の項に記載のストロ−０ ２２接合区域に溶接工程を適用することにより前記棒（３］）の押込嵌合された 取付は部を強化する精求の範囲第１４〜２１項のいずれが一つの項に記載のスト ロ−０ ２３全ストロ−容積および長さが次の値；ガス状混合物（５）　］０　２４ 胎児（４・Φつと溶液（８）との間の気泡（７）　２．５　６スクロース溶液（ ８）　２５　５５ 培地（６）　２５　５５ 端部気泡（９）　２．５　６ 栓（２）を除く全ストロ−（１）　７０　１．６０棒（３１）を除く全ストロ− （１）の長さ　８７棒（３１）の長さ　５５ 全長　１Φ２ 、特許請求の範囲第１４〜２２項のいずれが一つの項に記載のストロ−６ ２４請求の範囲第１〜２３項のいずれか一つの項に記載のストロ−を胎児の移植 に適用すること。