KR100397631B1

KR100397631B1 - 동물의 수정란 동결을 위한 플라스틱 스트로 및그를 이용한 수정란 동결보존방법

Info

Publication number: KR100397631B1
Application number: KR10-1999-0014689A
Authority: KR
Inventors: 공일근; 조성균
Original assignee: 공일근
Priority date: 1999-04-23
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2003-09-13
Also published as: KR20000067146A

Abstract

본 발명은 동물 수정란의 동결보호를 위한 플라스틱 스트로 및 그를 이용한 수정란 동결보존 방법에 관한 것으로, 배반포기배의 동결보존액을 결정하여 초기배에서 플라스틱 스트로를 이용한 동결보존 방법에 적용하고 난 후, 수정란의 VS1 노출시간에 따른 생존율을 조사하여 플라스틱 스트로를 이용한 동결보존방법을 제공하는 것으로, 플라스틱 스트로에 수정란을 동결하여 보존하면 융해 후 생존율 및 오염방지 효과를 높일 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

동물의 수정란 동결을 위한 플라스틱 스트로 및 그를 이용한 수정란 동결보존방법{Plastic straw for cryopreservation of embryo from animal and its cryopreservation method}

본 발명은 동물 수정란 동결보존을 위한 플라스틱 스트로(plastic mini straw)에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 외경이 0.3mm의 플라스틱 스트로를 이용하여 동물 수정란의 동결보존 방법에 관한 것이다.

현재 수정란의 동결은 외경이 0.8mm인 OPS(open pulled straw)를 이용하여 실시하고 있다. 수정란 동결은 고농도의 동결보호제를 이용하여 동결과 융해속도를 높이면 생존율을 거의 100%까지 높일 수 있다. 이와 같이 동결과 융해속도를 높이기 위해서는 플라스틱 스트로를 약 0.3mm의 외경을 갖는 굵기로 만들어 생쥐 및 소 수정란의 배반포기배(blastocyst stage)의 동결보존을 실시하면 융해 후 높은 생존율을 얻을 수 있다. 초자화(vitrification)방법은 약 3천에서 4천만원하는 고가의 동결보존기가 필요하지 않고 다만 액체질소통(LN₂tank)만 있으면 동결보존이 가능함으로서 비용절감효과도 매우 높다. 롤(Rall)과 파히(Fahy)가 최초로 유리를 이용한 동결보존방법이 생쥐수정란(8-세포단계)에 대해 효과적인 동결보존방법이라는 것을 증명하였고, 이 초자화 방법은 널리 사용되고 있으며 현재 과도적이지만 저속동결의 대안으로 간주되고 있다. 여러 종으로부터 획득한 수정란에 대해 다양한 동결보존액을 가지고 실시한 성공적 초자화 방법에 관한 보고서들이 많이 있다. 수정란을 초자화(vitrification)로 동결보존할 때, 고농도의 동결보존액을 사용하고 동결과 융해속도를 높여 줌으로써 얼음결정체 형성을 예방하였다. 이렇게 온도변화의 속도를 높이면 두 가지 장점이 생기는데 그 중 하나는, 동결보존액의 농도가 줄어들고 삼투압과 독성물질의 억제효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 위험한 초저온 영역을 빠르게 통과함으로서 냉기에 의한 심각한 손상을 줄일 수도 있다. 동결보존한 배의 효율은 냉각과 융해 속도를 높임으로서 두드러지게 향상된다. 동결보존시 동결과 융해속도, 동결보존액의 종류, 수정란의 질적인 차이 등이 동결보존 후 생존율에 영향을 미치는 조건들로 보고되고 있다. 동결속도를 높이기 위하여 LN₂직접침적법, 전자현미경 그리드(electron microscopy grid)방법, OPS 냉동보존방법과 OPP 동결보존방법이 보고되고 있다. 또한 각종 동결보존액은 VS3a 방법, EFS 방법, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)/PVP 방법, EDS 방법이 보고되고 있다.

그러나, 이러한 장점에도 불구하고 종래의 OPP 스트로(straw)는 양 끝 부분을 봉합(sealing)하여 액체질소로부터 다른 미생물의 오염을 방지할 수 있으나 융해 후 그 내용물을 다시 유출시켜 회수하기 위해서는 끝 부분을 절단해야 하는데이때 가는 유리관의 재질 때문에 정확하게 절단하기도 어려울 뿐만 아니라 파괴될 가능성이 높아 내용물인 수정란을 잃어버릴 수 있는 가능성이 매우 높다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 본 발명은 외경 0.3mm의 플라스틱 스트로(plastic straw)를 만들어 이용하여 높은 생존율뿐만 아니라 끝 부분의 완벽한 봉합으로 오염을 방지할 수 있고 또한 끝 부분의 완벽한 절단으로 수정란의 재회수가 용이하여 수정란의 동결보존에 매우 유리하다. 기존의 OPP 스트로 대신에 외경 0.3mm의 플라스틱 스트로(plastic straw)를 이용하여 생쥐, 소, 및 사람 등의 수정란을 동결하여 보존하면 융해 후 높은 생존율과 다른 미생물이나 물질의 오염방지 효과를 얻을 수 있다.

본 발명의 목적은 동물 수정란의 동결보존과 오염방지를 위한 플라스틱 스트로를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 전 이식단계의 동물의 수정란과 동결보존액을 가지고 플라스틱 스트로를 이용하여 동결보존방법을 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 배반포기배를 hCG 처리 후 18시간에 난관에서 채취하고 배반포기배의 적당한 동결보존액을 결정하기 위하여 EFS 또는 EDS에 대한 플라스틱 스트로 동결보존방법을 실시하고, 수정란을 hCG 처리 후 18시간에 난관에서 채취하여 mHTF배양액에 5% CO2, 37℃조건에서 배양하면서, 수정란, 2-, 4-, 8-세포기, 상실배, 배반포기 등의 초기배에서도 플라스틱 스트로 동결방법이 적당한지를 판단하고 난 다음, 수정란의 VS1에 노출시간에 따른 생존율을 조사하여 플라스틱스트로 동결보존방법으로 생쥐수정란의 동결보존에 유용하게 이용할 수 있음을 증명함으로서 달성하였다.

이하 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.

본 발명은 수정란 획득단계; 플라스틱 스트로의 제작단계; 배반포기배의 동결보존액 결정단계; 초기배에서 플라스틱 스트로를 이용한 동결방법 적용단계; 수정란의 VS1 노출시간에 따른 생존율조사 단계로 이루어진다.

이하, 본 발명은 하기 실시예를 통하여 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 수정란 획득방법

3주에서 5주령된 미성숙 수컷과 암컷 C57BL/6 마우스는 화학연구소(Chemical Research Institute; 대덕, 한국)에서 구입하였다. 수컷들은 각각의 사육장에서, 암컷은 빛을 조절할 수 있는 방(6시부터 14시간 조명)에서 6마리에서 8마리의 그룹으로 사육하였다. 수정란(zygote)은 5IU hGC(유한, 한국)를 접종 처리한 48시간 후, 5IU PMSG(Sankyozoki, 일본)로 슈퍼배란(superovulate)을 유도한 미성숙 암컷으로부터 수집하였다. 암컷은 hCG 주입 후 즉시 번식력 있는 C57BL/6 수컷과 짝지어준 다음, 20시간 후 목을 탈구시켜 안락사 시켰다. 수정란(zygote)은 절제한 난관(oviduct)으로부터 흘러 나왔고, 이것을 2분 동안 히알우론산 분해효소(hyaluronidase)에 노출시켜 퇴적물(cumulus)을 제거하고 0.3% BSA를 첨가한 멸균된 D-PBS로 세 번 세척하였다. 수집된 모든 수정란들은 2-, 4-, 8-세포기, 상실배(morula), 그리고 21, 34, 45, 69 그리고 76시간의 배반포기단계(blastocyst stage)까지 10% FCS가 첨가된 mHTF에서 배양하였다.

실시예 2: 플라스틱 스트로의 제작

플라스틱 스트로는 내경이 0.3mm가 되게 만들었다. 플라스틱 스트로는 흐르는 70% 에탄올로 멸균하여 크린벤치(clean bench)에서 건조시켜 사용하였다.

실시예 3: 배반포기배의 동결보존액 결정단계

수정란들은 EFS 동결보존액(이하 EFS)과 EDS 동결보존액(이하 EDS)을 사용해 플라스틱 스트로를 이용하여 동결보존하였다. 사용된 동결보존액은 홀딩 배지(holding medium; 5% FCS가 첨가된 D-PBS)내에 40%(v/v)의 에틸렌 글리콜 (ethylene glycol), 18%(w/v)의 피콜(ficoll), 0.3M 자당(sucrose)용액으로 구성되어 있는 EFS 및 16.5%의 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 16.5%의 디메틸 설포시드(dimethyl sulfoxide), 0.5M 자당(sucrose)용액으로 구성되어 있는 EDS를 이용하였다. VS1과 VS2는 기본액(TCM-199 + 20% FCS)에 7.5%의 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 7.5%의 DMSO를 첨가한 VS1과 16.5%의 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 16.5%의 DMSO, 0.5M 자당(sucrose)을 첨가한 VS2를 제조하였다. EFS를 이용한 동결보존의 경우, 수정란들을 접시(dish)내의 EFS에 현탁시킨 다음 EFS로 두 번 더세척하고 EFS에 1분 동안 노출시킨 후, 플라스틱 스트로에 넣었다. EDS의 플라스틱 스트로 동결보존방법의 경우, 수정란들을 먼저 1분 동안 VS1액에 배양한 다음, 대략 1에서 2㎕의 용액을 20㎕ VS2액으로 옮겼다. 농축된 동결보존제로 처리된 수정란의 냉각접촉 시간은 25초를 넘지기 않았다. 만약 1에서 2㎕의 VS2액을 함유하는 수정란들을 넓은 컬럼(wide column)속에 넣는다면, 동결속도가 감소하기 때문에 수정란의 생존율이 감소할지도 모른다. 배반포기배의 적당한 동결보존액을 결정하기 위하여 EFS 또는 EDS로 플라스틱 동결보존방법을 실시하였다. 재확장배반포기에 의한 생존율은 대조군과 EDS 처리군(100, 100%)이 EFS 처리군(95.0%)보다 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났고, 부화배반포기에서는 EFS 처리군(90.0%)이 대조군(100%) 및 EDS 처리군(95.0%)보다 유의적으로 낮은 발달율을 보였다.

실시예 4: 초기배에서 플라스틱 스트로를 이용한 동결방법 적용단계

4개의 웰 디쉬(well dish)의 바닥부분에 준비된 0.25M 자당(sucrose)을 함유한 1.2mL의 HM에 수정란이 든 플라스틱 스트로의 말단 부분을 액체에 담가 융해하고 1분이 지난 후, 모든 수정란들을 5분 동안 1.0mL 부피의 0.15M 자당으로 옮기고 나서 5분 동안 두 번 HM으로 세척하였다. 융해에 사용된 배지 온도는 대략 35℃로 조절하였다. 수정란(zygote), 2-, 4-, 8-세포기, 상실배 및 배반포기 등의 초기배에서도 플라스틱 스트로 동결방법이 적당한지를 판단하기 위하여 실시하였다. 70%의 수정란(zygote)은 동결융해 후 배발달율이 2-, 4-, 8-세포기, 상실배 및 배반포기배에 비하여 유의적으로 낮은 발달율을 보였다(89.7, 90.0, 92.8, 97.6, 및97.5%)(P<0.05). 또한 동결 융해란의 할구수에서는 대조군 및 배반포기배 (35.7±2.98 및 39.6±2.81)에서 수정란(zygote), 2-, 4-, 8-세포, 상실배(29.8±3.21, 31.3±3.83, 29.3±3.58, 28.9±3.21, 및 30.8±2.93)보다 유의적으로 높게 나타났다(P<0.05). 통계분석의 데이터는 SAS 프로그램으로 chi-square 테스트에 의해 분석하였다.

실시예 5: 수정란의 VS1 노출시간에 따른 생존율조사 단계

플라스틱 스트로에 동결보존된 수정란의 생존율은 수정난, 2, 4, 8, 상실기(morula), 및 배포아기(blastocyst)까지, 그리고 시험관 내에서 융해(post-thaw)후 12, 19, 47, 71 그리고 92시간의 배반포기(blastocyst)확장발달단계까지 결정하였다. 수정란들은 10% FCS가 첨가된 mHTF에서 5%의 CO₂를 지닌 습한 공기 중에서 37℃의 온도로 배양되었다. 수정란(zygote)의 VS1의 노출시간에 따른 생존율을 조사한 결과 융해 후 2-세포기(91.6, 88.5, 및 88.9%) 그리고 배반포기(83.3, 74.3, 및 69.4%)까지 배발달율은 1, 2, 3분간의 노출시간에 따른 유의적인 차이를 보이지 않았다. 또한 융해 후 노출시간에 따른 할구수에서도 유의적인 차이를 보이지 않았다(36.4±4.76, 32.4±4.67, 및 27.6±4.52). 이상의 결과에서 플라스틱 스트로 동결보존방법은 EFS 또는 EDS 동결보존액에 따른 유의적인 차이 없이 이용될 수 있는 것으로 판단된다. 배발달 단계에 따른 생존율은 수정란(zygote)의 초기배가 2-, 4-, 8-세포기, 상실배 및 배반포기보다 유의적으로 저조한 생존율을 보였다. 수정난(zygote)의 VS1에 노출시간에 따른 생존율도 1분간의 노출시간에서 높은 배달율을 보였다. 플라스틱 스트로 동결보존방법은 생쥐 및 동물의 수정란 동결보존과 오염방지에 유용하게 이용 가능한 것으로 판단된다.

이상, 실시예에서 설명한 바와 같이 본 발명은 플라스틱 스트로를 이용하여 생쥐, 소, 및 사람 등의 동물 수정란을 동결하면 보존 후 높은 융해 생존율과 동결보존시 미생물의 오염방지의 효과를 높일 수 있는 뛰어난 효과가 있으므로, 수정란의 동결보존 후 융해시 높은 생존율과 오염방지를 필요로 하는 수정란 동결보존 산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

외경이 0.3mm이고 재질이 플라스틱인 것을 특징으로 하는 동물 수정란 동결용 플라스틱 스트로.
배 반포기의 동물 수정란을 동결보존액에 희석하고 스트로에 분주한 후 동결시키는 동물 수정란의 동결방법에 있어서, 상기 스트로는 제 1항 기재의 동물 수정란 동결용 플라스틱 스트로를 사용하고, 상기 배 반포기의 동물 수정란 동결보존액은 EFS 동결보존액 또는 EDS 동결보존액을 이용하는 것을 특징으로 하는 동물 수정란의 동결방법.
제 2항에 있어서, 상기 동물 수정란은 생쥐 수정란인 것을 특징으로 하는 생쥐 수정란의 동결방법.