KR100427850B1 - 소형견 채취 정액 및 수정란의 동결보존 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소형개 유래의 정액 또는 수정란을 동결보존하는 방법에 관한 것으로서, 소형개의 정액을 채취하여 완만동결 또는 초급속동결 방법으로 동결하고 액체질소통에 영구히 보존하면서 인공수정하는 방법과, 이를 공기중에서 30초간, 38℃ 항온수조에서 2분간 융해한 후, 이를 자연발정 암캐 또는 호르몬처리에 의해 과배란된 암캐에 인공수정시킨 수정란을 외과적으로 채취하여 동결에 의해 수정란을 액체질소에 영구보존함으로써 우수한 혈통의 종견을 보존할 수 있을 뿐만 아니라 고가의 외국산 개의 수입에 대체할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

소형견 채취 정액 및 수정란의 동결보존 방법 {FREEZING METHOD OF SEMEN OR EMBRYO DERIVED FROM SMALL-SPECIES DOGS}
본 발명은 소형견 채취 정액 또는 수정란을 동결보존하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 소형견의 정액을 채취하여 완만동결 또는 초급속동결 방법으로 동결하고 이를 액체질소에 영구보존하거나, 또는 자연발정 암캐 또는 호르몬처리에 의해 과배란된 암캐에 상기 동결정액을 융해한 정액을 인공수정시킨 수정란을 외과적으로 채취하여 완만동결 또는 초급속동결 방법으로 동결하는 것을 특징으로 하는 소형개 유래의 정액 또는 수정란을 동결보존하는 방법에 관한 것이다.
국내에서도 최근 경제성장과 더불어 국민경제가 윤택해짐에 따라 애완동물 사육수가 점차 빠른 속도로 증가하고 있는 실정이다. 특히, 개는 오랜 세월을 인간과 함께 해온 동물로써, 우리생활에 동반자로 인간에 꼭 필요한 동물이라 하겠다. 오늘날 전세계의 애견가 클럽에서 인정하고 있는 개의 품종은 200종을 훨씬 상회하고 있다. 세계 각지에 산재해 있는 개의 품종수는 수백종에 달하지만, 공인을 받지 못한 품종으로서 공인된 품종에는 각각의 개에 대한 공식기준이 정해져 있으며 각 품종은 공식기준에 규정되어 있는 타입과 교배되어야 한다. 이 기준은 애견가클럽이나 번식가 단체에 의해 매우 세밀하게 규정되어 있어 번식가들은 이 기준에 적합한 우수한 품종을 작출하기 위하여 노력하고 있다. 각 기준은 품종의 특징과 전체적인 외관을 기록한 뒤 머리부분, 몸통부분, 사지부분, 꼬리, 보행모습, 털색, 체격의 크기와 체중을 기록하도록 되어있고 아울러 실격조건도 열거되어 있는 실정이다.
가축에 있어서 소의 경우는 인공수정이 실용화되어 있어 목장에서는 숫소를 발견할 수 없고 다만 육우목장에서나 발견할 수 있는 정도까지 이르렀다. 근래에는 수정란이식의 유전형질 개량에 힘입어 종래의 유량이 4,500kg-6,000kg이던 것이 국내에서도 7,000-7,500kg으로 증가하였고 선진외국에서는 9,000-10,000kg까지 증가하기에 이르렀다.
한편, 개의 인공수정이나 수정란이식은 선진국 특히 미국에서는 상당히 많이 이루어지고 있지만 국내에서는 극소수에서 시도되고는 있지만 아직 많은 문제점을 가지고 있어 실용화 단계는 요원한 실정이다. 특히, 소형개는 대형개에 비하여 정액량 및 정자수가 적고, 특히 개정액은 다른 가축정액과는 달리 정장성분이 동결에 유해하게 작용하여 정액을 동결하기가 매우 어려우며, 또한 소형개의 수정란을 동결시켜 보존하였다가 이 동결수정란을 암캐에 이식하는 동결수정란 이식방법은 국내외를 막론하고 전무한 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 정액량과 정자수가 적은 소형개를 대상으로 정액을 채취하여 스트로정액으로 동결하는 방법, 그리고 영구보존이 가능하고 암수 양성의 유전형질을 개량가능케하는 수정란을 동결하는 방법을 규명함으로써 본 발명을 달성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 소형개의 정액 또는 수정란을 동결보존하는 방법을 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 소형개 정액을 동결보존하는데 있어서 희석액으로 사용되는 Equex STM 페이스트 함유 동결희석액을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 마사지법을 이용하여 소형 수캐로부터 제1차, 2차, 3차의 분류 정액을 채취하고, 정자수가 많고 활력이 우수한 제2분획 정액만을 이용하여 정자의 생존율을 높이기 위하여 Equex STM 페이스트(Equex STM paste) 성분을 첨가한 동결희석액(내동액)과 상기에서 채취한 정액을 혼합한 후 원심분리하여 동결에 장해요소로 작용하는 정장성분을 제거하고, 완만동결방법 또는 초급속동결방법으로 개정액을 동결보존하고, 높은 생존율을 유지한 채 상기 동결 정액을 융해하고, 초음파기를 이용하여 배란기를 예측하여 수태율이 높은 시기에 상기에서 융해된 정액을 암캐에 인공수정을 실시하고, 상기 인공수정기술을 통해 수정된 수정란을 채취하여 동결보존함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 개정액의 동결건조
가. 동결전처리
공시견(供試犬)은 구충과 예방접종을 실시한 후 3주간 예비사육한 건강하고 번식력이 강한 성숙한 수컷 소형종(예를 들면, 요크샤테리어, 말티스종)을 대상으로 하였다.
정액은 수지 마사지법(Boucher 등, 1958)에 따라 정액을 분획별로 채취하거나 정자농도가 가장 높은 제 2 분획부분을 채취하여 시험에 사용하였다. 채취한 원정액 중 일부는 정액의 일반적 검사, 즉 정액량, 정자수, 활력 및 기형정자수 검사에 사용하였고, 나머지는 전처리후 동결하였다.
나. 정액의 희석
80∼150×106/㎖ 정자농도를 갖는 정액을 1:3 트리스 버퍼(Tris buffer)로 희석한 후, 상기 희석액 700g을 6분간 원심분리하였다. 그후, 상층액을 버리고 정자 펠렛(pellet)을 동결희석액 Extender-1, 2로 2단계 희석하였다. 제 1단계로 Extender-1액 1.5㎖를 실온에서 상기 정자 펠렛에 희석한 후, 4℃에서 45분 동안 냉각하였다. 그후, Extender-2액 1.5㎖ 및 Extender-2-E액 1.5㎖를 차례로 4℃에서 상기 제 1단계에서 희석된 용액에 첨가하고 수회 부드럽게 거꾸로 흔들어 혼합한 다음 4℃에서 25분간 냉각하였다.
최종 정자농도는 50×106/㎖ 이상이 되도록 하였고, 내동제 평형후 정자수, 활력, 기형정자수 등의 정자지수를 측정하였다. 상기에서 희석한 희석액의 조성을하기 표 1에 나타내었다.
희석액(내동제포함) 조성
Extender-1 Extender-2 Extender-2E 트리스-버퍼
트리스-버퍼(g) 2.4 2.4 2.4 2.4
시트르산 모노히드레이트(g) 1.4 1.4 1.4 1.4
글루코스(g) 0.8 0.8 0.8 0.8
나트륨-벤질페니실린(g) 0.06 0.06 0.06 0.06
스트렙토마이신 설포네이트(g) 0.1 0.1 0.1 0.1
난황(㎖) 20 20 20
글리세롤(㎖) 3 7 7
Equex STM 페이스트(㎖) 0 0 1
증류수(㎖) 전체부피가 100이 되도록 전체부피가 100이 되도록 전체부피가 100이 되도록 전체부피가 100이 되도록
pH 6.53 6.56 6.48 6.6
삼투압(m·Osm/ℓ) 740 1390 1370 253
다. 정자의 스트로(straw)내 충진
상기와 같이 희석정액을 내동제로 평형시킨 후 실험실에서 제작한 1cc용 주사통과 마이크로피펫 팁을 연결시킨 주입기를 사용하여 0.25㎖ 스트로내로 충진히였다.
라. 정액의 동결
내동제로 평형시킨 희석정액을 자동기록기(autorecorder)로 확인하면서 동결온도는 실온∼-4℃까지는 1℃/min., -4℃∼-30℃까지는 0.2℃/min., -30℃∼-38℃까지는 0.2℃/min.으로 동결시킨 후 곧바로 LN2(액체질소) 용기에 침지하는 자동 세포동결기(Cell Freezer Forma Co., USA)로 동결하는 완만 동결을 실시하거나, 또는 예비동결 시작 75분 후 스트로 정액을 LN2(액체질소)가 들어있는 용기에 액체질소부표 5cm 위에 스트로 랙(straw rack)을 놓고 스트로를 예냉한 다음 스트로 정액을 LN2에 침지하는 초급속 동결을 실시하였다.
마. 동결정액의 융해 및 배양
동결한 스트로 정액을 공기중에서 1분 동안, 38℃의 항온수조에서 1분 동안 융해한 후, 상기 융해정액 200㎕을 동일온도의 디쉬(dishi)내에서 400㎕의 트리스 버퍼로 희석하였다. 상기 정액 희석액을 38℃의 배양기내에서 배양하면서 정자분석기를 사용하여 시간당 정자수, 활력 및 기형정자수를 측정하였다.
본 발명 소형개 정액의 완만동결 또는 급속동결 후의 생존정자수는 원정액 정자수 기준 각각 95%와 82%이었으며, 활력치는 각각 95%와 88%이었다. 바람직하게, 동결 후의 정자 생존율과 활력이 70∼80% 이상인 정액만이 인공수정에 사용될 수 있는 바, 본 실시예에 따라 동결보존된 정액은 상업적으로 소형개의 인공수정에 적합함을 알 수 있었다. 동결방법에 따른 정자의 생존율, 활력 및 기형·사멸 정자수를 하기 표 2에 나타내었다.
동결방법에 따른 정자의 생존율, 활력 및 기형·사멸 정자수
동결보존방법 생존율(%) 활력(%) 기형·사멸 정자수
완만 동결 95.07±2.32 95.42±2.65 4.58±0.15
초급속 동결 82.09±2.27 88.17±3.42 11.83±2.43
바. 주입
자연발정개 또는 호르몬을 처리하여 발정을 유기한 소형개에 제작된 정액주입기로 발정후 2회 주입하고 수태 및 임신여부를 초음파 진단기로 진단한 결과 높은 임신율을 얻을 수 있었다.
실시예 2 : 개수정란의 동결
가. 호르몬 주사에 의한 과배란 처리
자연발정의 암캐를 이용하거나, 초음파진단기에 의해 황체가 인정되는 경우에는 PGF2α500IU를 주사하거나, 황체가 없는 경우에는 FSH 2mg을 3일간 주사하여 발정을 유기하였다.
나. 인공수정
상기 발정을 유기한 암캐에 상기 실시예 1에서 동결융해한 정액을 주입기를 사용하여 주입함으로써 다수정란을 유기하였다.
다. 수정란 채취
인공수정 4∼6일째날 국소마취한 개로부터 외과적인 수술법으로 난관을 들어올려 PBS액으로 관류하여 수정란을 디쉬에 회수하였다.
라. 수정란의 동결
35℃에서 0.2M, 0.4M. 0.8M, 1M, 1.5M의 글리세롤 용액에서 10분 간격으로 단계적으로 평형시키고, 1시간 후 예비냉각시킨 다음 동결하였다. 글리세롤 내동제로 평형시킨 수정란을 1cc 주사기와 팁을 연결하여 제작한 스트로 주입기를 사용하여 공기-매질-수정란-매질-공기의 순으로 스트로내에 장진하다.
내동제로 평형시킨 수정란을 자동기록기로 확인하면서 동결온도는 실온∼-4℃까지는 1℃/min., -4℃∼-30℃까지는 0.2℃/min., -30℃∼-38℃까지는 0.2℃/min.으로 동결시킨 후 곧바로 LN2(액체질소) 용기에 침지하는 자동 세포동결기(Cell Freezer Forma Co., USA)로 동결하는 완만 동결을 실시하거나, 또는 평형 냉각시킨 수정란을 장진한 스트로를 액체질소가 들어있는 용기에 액체질소 부표 5cm 위에 스트로 랙(straw rack)을 놓고 스트로를 5분 동안 방치하여 액체질소 증기로 예냉한 다음 곧 바로 스트로 수정란을 액체질소에 침지하는 초급속 동결을 실시하였다.
마. 수정란의 보존
상기 동결과정을 완료한 스트로 수정란을 액체질소통내 캐니스터(canister)에 10개씩 넣어 보관하였다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 방법에 따라서 소형개 유래 정액 또는 수정란을 동결보존함으로써 암수 양성의 유전형질을 개량가능할 뿐만 아니라 우수한 혈통의 종견을 보존할 수 있으며 고가의 외국산 개의 수입에 대체할 수 있으므로, 본 발명의 소형견 채취 정액 또는 수정란을 동결보존방법은 소형견 육종 산업상 매우 유용한 것입니다.

Claims (5)

  1. 마사지법을 이용하여 소형 숫캐로부터 정액을 제1, 2, 3 분획별로 채취하는 단계;
    상기 단계에서 채취한 정액을 원심분리한 후 상층액을 제거하여 정자 펠렛을 얻는 단계;
    상기 단계에서 얻어진 정자 펠렛을 동결희석액 Extender-1과 혼합하여 희석시키고 냉각하는 제1희석단계;
    상기 단계에서 얻어진 희석액을 Extender-2 및 Extender-2E와 혼합하여 최종 정자농도가 50×106/㎖ 이상이 되도록 희석하고 냉각하는 제2희석단계;
    상기 단계에서 얻어진 희석정액을 스트로에 충진하는 단계; 및
    상기 단계에서 충진된 희석정액을 -4℃까지는 1℃/min, -4℃에서 -30℃까지는 0.2℃/min, -30℃에서 -38℃가지는 0.3℃/min으로 동결한 후 액체질소에 침지하여 완만동결하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 소형 숫캐로부터 채취된 정액의 동결보존방법.
  2. 마사지법을 이용하여 소형 숫캐로부터 정액을 제1, 2, 3 분획별로 채취하는 단계;
    상기 단계에서 채취한 정액을 원심분리한 후 상층액을 제거하여 정자 펠렛을 얻는 단계;
    상기 단계에서 얻어진 정자 펠렛을 동결희석액 Extender-1과 혼합하여 희석시키고 냉각하는 제1희석단계;
    상기 단계에서 얻어진 희석액을 Extender-2 및 Extender-2E와 혼합하여 최종 정자농도가 50×106/㎖ 이상이 되도록 희석하고 냉각하는 제2희석단계;
    상기 단계에서 얻어진 희석정액을 스트로에 충진하는 단계; 및
    상기 단계에서 충진된 정액을 액체질소통의 액체질소 부표 5cm 위 스트로 랙(straw rack)에 놓고 스트로를 예냉한 다음 스트로정액을 액체질소에 침지하는 초급속동결하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 소형 숫캐로부터 채취된 정액의 동결보존방법.
  3. 삭제
  4. 제1항 또는 제2항에 의한 동결 정액을 융해한 융해정액을 자연발정의 암캐 또는 호르몬제를 주사하여 발정을 유기한 암캐에 주입하여 수정란을 유기하는 인공수정 단계;
    상기 인공수정 4~6일째에 마취한 암캐의 난관을 들어올려 PSB액으로 관류하여 수정란을 채취하는 단계;
    상기 채취된 수정란을 35℃에서 0.2M, 0.4M, 0.8M, 1M, 1.5M의 글리세롤 용액에 단계적으로 평형시킨후 냉각하는 단계;
    상기 평형시킨 수정란을 스트로에 충진하는 단계; 및
    상기 충진된 스트로 수정란을 -4℃까지는 1℃/min, -4℃에서 -30℃까지는 0.2℃/min, -30℃에서 -38℃가지는 0.3℃/min으로 동결한 후 액체질소에 침지하여 완만동결하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 소형견의 수정란 동결보존방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 의한 동결 정액을 융해한 융해정액을 자연발정의 암캐 또는 호르몬제를 주사하여 발정을 유기한 암캐에 주입하여 수정란을 유기하는 인공수정 단계;
    상기 인공수정 4~6일째에 마취한 암캐의 난관을 들어올려 PSB액으로 관류하여 수정란을 채취하는 단계;
    상기 채취된 수정란을 35℃에서 0.2M, 0.4M, 0.8M, 1M, 1.5M의 글리세롤 용액에 단계적으로 평형시킨후 냉각하는 단계;
    상기 평형시킨 수정란을 스트로에 충진하는 단계; 및
    상기 스트로 수정란을 액체질소통의 액체질소 부표 5cm 위 스트로 랙(straw rack)에 놓고 스트로를 예냉한 다음 스트로정액을 액체질소에 침지하는 초급속동결하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 소형견의 수정란 동결보존방법.
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