JPS5827063A - 葉酸誘導体の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は葉酸誘導体のような敏感な生物学的活性中間代
謝産物の安定化方法に関するものである。

多（の異なる化学物質が人体内で代謝される。多くの化
学的および／または生化的反応が起り、元の化学物が複
数の構造的変化をすることがよくある。その際相互に関
係した生化学的経路以外の点で重要因子である中間化合
物が生成する。従って、患者の生物学的流動体試料中の
各種代謝中間体の存在を、定性的および／または定量的
に決定できることが切望されている。

代謝中間体存在の定性的検出および／または定量的測定
に共通して用いられる方法は、争奪たんばく質結合検定
である。通常、争奪結合検定を行うために、中間代謝産
物を天然由来源から入手したり、前駆化合物から合成し
たりし、ついでそれらのラベルしたものを用いて患者試
料中の未知量のラベルしてぃない中間代謝産物と競争さ
せて補結合剤または受容体に争奪結合させている。この
ための検定試薬として使用するために、安定度が十分な
中間代謝産物であることを要す。すなわち、適当な保存
期間、云わば少なくとも一週間から３〜４週間またはそ
れ以上の間、実質的に不変のまま、存在することを要す
。

上述した中間代謝産物の例としては、葉酸つ中間代謝産
物の一つである、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸があ
げられる。Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸は血液の一
成分であり、葉酸欠乏診断を行うために重要である。

人の巨大赤芽球性貧血の診断および治療には、本質的に
Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸およびビタミンＢ１２
の漿液レベルを決定できなければならない。ビタミンＢ
Ｉ２および葉酸エステル欠乏は血液学的および臨床学的
に区別できない。ビタミンＢＩ２およびＮ−５−メチル
テトラヒドロ葉酸の同時検定がよく行われる。

Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を安定化するのに好ま
れる保存剤であるアスコルビン酸が争奪結合ビグ４フ８
１２分析を妨げるので、ビタミンＢ１２／葉酸エステル
の同時検定においては、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉
酸の安定性の問題が生じている。

Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸のように敏感な中間代
謝産物を凍結乾燥したものを窒素雰囲気下封管する、先
行技術が開示されている。かかる技術は試薬用具一式の
調整には実際的ではなく、更に再構成後の安定性を延長
することもない。この場合のＮ−５−メチルテトラヒド
ロ葉酸の安定性は４℃で約３日間に過ぎない。

本発明の目的の一つは、中間代謝産物を安定化する方法
を提供することにある。

本発明の目的の他の一つは、争奪たんばく質結合検定手
段用の試薬としての中間代謝産物を安定化する方法を提
供することＫある。

更に、本発明の目的の他の一つは、通常の化学的安定剤
を用いることな（、安定化した中間代謝産物を提供する
ことにある。

本発明の他の目的の一つは、本発明により安定化された
中間代謝産物を含む放射線試薬用具一式のような争奪結
合検定試薬用具一式を提供することにある。

また、本発明の特別の目的は、Ｎ−５−メチルテトラヒ
ドロ葉酸の安定化方法およびそれにより安定化された物
を提供することにある。

本発明によれば、不安定で敏感な中間代謝産物を、補結
合剤゛または受容体、好ましくはたんぽ（質結合剤また
は受容体で複合化させて安定化させる。特に、本発明に
おいては、複合化を液状媒質中で行い、ついで、その混
合物を例えば凍結乾燥の如く、急速冷凍および脱水を行
う。その結果、生成物は乾燥粉末となる。

本発明の好ましい具体例として、不安定な中間代謝産物
は、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸である。

Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸を牛ミルク結合剤のよ
うな補たんばく質性または非たんばく質性の結合剤で複
合化できる。

本発明の他の好ましい具体例として、凍結乾燥した安定
化複合体は争奪たんばく質結合検定試薬である。

本発明では、中間代謝産物としてＮ−５−メチルテトラ
ヒドロ葉酸を例示している。しかしながら、本発明者は
、本発明の概念が広く、他の中間代謝産物およびその補
結合剤も含むと信じている。例えば、Ｎ−１０−ポルミ
ルテトラヒドロ葉酸、Ｎ−５−ボルムイミノテトラヒド
ロ葉酸、Ｎ−５−ポルミルテトラヒドロ葉酸ならびにＮ
−５、ｊ’Ｊ−１０−メチレンテトラヒドロ葉酸のよう
な他の葉酸代謝産物、酵素性基質、ビタミンＢ１２、ビ
タミンＤ等も当該分野で知られているその補結合性物質
と共に、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸に代って使用
することができる。

Ｎ−５−メチルテトラ上１口葉酸用の多種葉酸エステル
結合用たんばく質が知られており、例えば、多種の動物
器官（特に、腎臓、肝臓、および膵臓）からの抽出物、
β−ラクトグロブリン調製、いるか漿液、牛ミルク、山
羊ミルク等があげられる。複合化により、中間代謝産物
の安定性は当然向上するが、その複合体を凍結および脱
水し乾燥粉末としなければ、本発明の利益を充分受ける
ことはできない。

更に詳しくは、中間代謝産物がその受容体に結合できる
条件下、中間代謝産物とその結合剤を、液状媒質中、通
常は水基質媒中、で混合する。かかる反応は、生化学分
野では周知である。混合物の凍結温度より高いが、たん
ぽ（質のように熱に敏感な結合剤が分解される温度より
低い温度で、短時間（例えば、約１５分から１時間）、
混合物を保温するが、一般的には室温程度の温和な保温
条件を用いる。一般的には、低温かつ長時間で行う。後
日、複合体を再構成する溶媒と類似またはほぼ同一組成
の液状媒質中で、複合化すると好都合である。即ち、再
構成後存在する緩衝塩、人漿液アルブミン、他のたんぽ
（質等の各種添加剤は、その添加剤が複合体形成または
その後の凍結乾燥を邪魔しないかぎり、複合体を含む液
体中に存在させることができる。

適切な保温期間の後、当分野で知られている方法を用い
て、組成物を凍結乾燥する。得られた乾燥粉末を適切な
容器、好ましくは、空気および光を遮へいするものに保
存することができる。以下に例示したように、保存は室
温またはそれより低い温度で行うことができる。複合体
を長期間使用しない場合には、低温、保存が好ましく（
。

再構成には、凍結乾燥粉末に、複合体形成時に使用され
たものと同じか異なる液体を加えて、混合するだけであ
る。例えば、うす巻き混合術を使用する。

中間代謝産物を化学的遊離状態で使用することを、切望
されることが多いので、中間代謝産物をその結合剤から
遊離させ、複合体形成を防ぐことが必要となる。これは
、いろいろな異なる方法で行うことができる。たんばく
質結合剤を用いたときの最も簡単な遊離方法は、結合用
たんばく質を分解するのに充分な温度と時間、多くの場
合約９０℃で１０から３０分間、加熱することである。

本発明の各種態様は当業者にとって明らかである。例え
ば、包括的見解からして、イオン交換樹脂、疎水性物質
のカラム等のようなもので、小分子が結合できる非たん
ば（質性のものを受容体として使用することができる。

ガラス器具内実験では、ガラス粒子がたんばく質受容体
表面と類似した能力があることが分っている。受容体は
たんばく質であるが、含有炭水化物、脂質およびペプチ
ド部分のようなたんばく質の非たんばく質部分を通じて
結合が起ることも時々みられる。

以下、代表的な中間代謝産物としてＮ−５−メチルテト
ラヒドロ葉酸を用いて、本発明の実施例を示す。

実施例１ 本実施例において、表１に示した濃度のＮ−５−メチル
テトラヒドロ葉酸を含む６対の標準価試料を用いた。各
標準価試料はｉｏ。

１イクロリツトルで、かつＮ−５−メチルテトラヒドロ
葉酸以外の成分は、緩衝塩、塩化ナトリウム、アジ化ナ
トリウム、メルシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ　
）および人漿液アルブミンである。

各対の試料の一つに、表１に示した量の牛葉酸エステル
結合たんばく質を加える。混合した後、試料を４℃で３
峙間保温する。その直後、各試料を凍結乾燥して乾燥粉
末とする。

その日のうちに、各試料に脱イオン水を加えて再構成し
、ついで放射線検定で存在する葉酸エステルの量を０日
、４日、８日および１４日毎に評価した。試験期間中、
全ての再構成試料を４℃で保存した。０日というのは、
凍結乾燥日のことである。データ約分技法を用いて、各
試料のＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸量を裏足した。

その結果を表１に示す。

実施例２ 実施例１で再構成した各試料の一部を室温で８日間保存
し、ついで実施例１のように評価した。その結果を表２
に示す。勿論、０日における価は実施例１と同じもので
ある。

表　　２ 標準価　葉酸エステル　葉酸エステル結合　葉酸エステ
ル結合結合たんばく質　たんばく質無　　たんば（質有
添加量 （ｒ１ｇ／ｍｅ）　（ｍｃ、９／ｒｒＪ）日　　　数　
　　　　　　　　日　　　数４８４８ ０　　　　　０　　　　　−０．１０　０．２８　　−
０．０１　　０．２４１　　３．３　、０．３００．３
０　０．６６０．８７２．５　８．３　０．８３０，４
１　２．４２゜０５．０　１６．６　１．９０．８７　
４．７３．６１０．０　３３．２　３．４１．３　１０
．１　８゜４２０．０　６６．４　６．６２．６　１８
．５１８．６実施例３ 実施例１に従って、Ｎ−５−メチルテトラヒドロ葉酸と
葉酸エステル結合用たんばく質との複合化した試料を調
製して、再構成後４℃で保存した。０．２．３．４．５
．６．７および８週後におけるＮ−５−メチルテトラヒ
ドロ葉酸濃度を実施例１に準じて決定した。

その結果を表３に示す。

表　　　３ １．０１，７１．５１，３１，３１．２１．０　＋、１
０．８２．５３．１３．０２．８２．５２．２１゜９２
．３２．０５、Ｑ　６，６５．９５．７５．７４．７５
．０５．５５．７１０．０１１．８１０，９９．９９．
８８．９９．１１０，１１１，１２０．０２０，６２０
．１２０゜４２０．３−２０．９１８，４１９．７１８
似Ａ 実施例３で用いた一連の凍結乾燥試料を約４℃で保存し
、ついで分析を行う日に再構成した。５．６．７および
８週毎に測定し、その結果を表４に示す。

表　　　４ １．０　１．２１．３１．５　１．１ ２．５２．７２，７２．７　２，９ ５．０４．２６，１５．６　５．８

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 Ｉ）液状媒質中で中間代謝産物をその補結合剤または受
   容体で複合化することおよび当該複合体を凍結乾燥して
   安定な仮台体を含む乾燥粉末とすること、からなる中間
   代謝産物の安定化方法。 ２）結合剤または受容体がたんばく質である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ３）水基質液体中で、当該中間代謝産物とたんばく質結
   合剤または受容体を混合し、ついで当該凍結乾燥前の複
   合体とするために、当該混合物をその凍結温度より高い
   が、たんばく質結合剤または受容体を分解しない温度で
   充分保温するものである特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 ４）中間代謝産物が葉酸誘導体またはその類似体である
   特許請求の範囲第１または３項記載の方法。 ５）中間代謝産物がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸で
   ある特許請求の範囲第１または３項記載の方法。 ６）当該液体が凍結乾燥物を使用″１−るための再構成
   時に存在する少なくとも一つの所望付加成分を含むとこ
   ろの特許請求の範囲第１または３項記載の方法。 ７）中間代謝産物が葉酸誘導体またはその類似体である
   特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８）中間代謝産物がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸で
   ある特許請求の範囲第６項記載の方法。 ９）中間代謝産物とその結合剤または受容体との複合体
   を凍結乾燥粉末として安定化された複合体。 １０）結合体または受容体かたんば（質である特許請求
   の範囲第９項記載の複合体。 １１）中間代謝産物が葉酸誘導体または類僚体である特
   許請求の範囲第９または１０項記載の複合体。 １２）中間代謝産物がＮ−５−メチルテトラヒドロ葉酸
   である特許請求の範囲第９または１０項記載の複合体。 １３）争奪結合検定に使用することを特徴とする特許請
   求の範囲第９から１２項のいずれか１項に記載の安定化
   された中間代謝産物複合体。