JPS5824854A - 液体試料の電気化学的分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、液体中の微量成分の分析方法に関し１更に詳
しくは液体中の特定成分を電気化学的に分析する分析方
法に関する。

従来、液体、特に体液中の微量成分を分析する方法は多
数開発がなされ、できた。これらは主として溶液中で微
１成分の分光光学的変化を検知する事で、分析が行われ
ている。しかしながらこれらの溶液中での分光光度測定
は、複雑な分析操作の熟練を必要とし、かつ用いられる
分析試薬の安定性に問題があり、試料量ハ゛多く必要で
あるという欠点を有するばかりでなく、廃液は必然的に
環境汚染を引き起こすという問題を有していた。

一方、分光光度分析にかわり、該微量成分、あるいはそ
の分解生成物の生成又は失消を電気化学的に計測する試
みもなされてきた。これは水不溶性の担体に酵素等の相
互作用性組成物を化学的に結合あるいは高分子マトリッ
クス中に包括した、固定化酵素膜と電極を組合わせた酵
素２極法として広く知られている。

このような酵紫電極法番ま、酵素電極と試料液体とを接
触させることにより、酵素と基質の反応によって生成又
は消失する電極活性物質、例えば酵素、過酸化水素、ア
ンモニアガス、二酸化炭素ガス、水素イオン、炭酸イオ
ン、アンモニウムイオン、ＮＡＤＨ５ＮｈＤｐＨ等を電
極によりアンペロメトリック又はボテンシオメトリック
に検知し、試料液体中に含まれる微量成分の未知量を測
定する方法である。これらは例えば、秒置特許第２．６
３８゜１９８号、及び米国特許第３，５３９，４５５号
等に開示されている。上述の酵素電極法は、固定化酵素
膜との組合わせで液体成分の特定の物質と、特異的反応
を行なわしめるものであり、該固定化酵素膜に本来分析
に必要な特異的反応性が付与されているものである。

しかし７：Ｃがら、上記分析法にはいくつかの欠点を有
している。即ち、分析に用いられる固定化酵素膜は、酵
素を高分子材料に化学結合により結合する方法や、高分
子マトリックス中に酵素を包括する方法など等によって
調製されるため、酵素自体の失活がきわめて行いやすい
という欠点を有している。又、分析中に液体、特に体液
を用いた場合体液中の分析される成分以外の成分、特に
高分子量物質、例えば蛋白質等により、該固定化酵素膜
に吸着し固定化酵素膜の機能を低下させるという欠点を
有している。更に、固定化酵素膜を保存する場合には固
定化された酵素を有効ならしめるために緩衝液中での保
存が必要であり、取扱いは細心の注意を要するという欠
点を有している。

本発明の第１の目的は、液体中の特定成分を簡便にして
高い測定精度で分析することができる分析方法を提供す
ることにある。本発明の第２の目的は、保存性の改良さ
れた分析シートを用いた液体中の特定の成分を分析する
分析方法を提供することにある。本発明の第３の目的は
、微量の液体試料で液体試料中の特定の成分を定量的に
分析することが可能な分析方法を提供することである。

本発明の分析方法は、液体試料中の特定成分を電気化学
的に分析する分析方法であって、該特定成分と相互作用
をして電気化学的に検出可能な物質に変化するかまたは
電気化学的に検出可能な物質を生成する物質を担持する
シート上に、該液体試料の液膜を形成した後、該液膜に
電極を接触させることを特徴とする。

本発明において、液体試料中の特定成分と相互作用をし
て電気化学的に検出可能な物質に変するか、または電気
化学的に検出可能な物質を生成する物質を以下単に相互
作用性組成物という。この相互作用性組成物を担持した
シート上に滴下された１液体試料中の特定成分が、上記
相互作用性組成物によって、分解生成物又は反応生成物
を生起し、この分解生成物又は反応生成物もしくはそれ
らから導びかられる最終生成物を電気化学的計測により
測定するものである。この際電極と上記相互作用性組成
物担持シートは上記液体試料により形成された液膜によ
り連絡している。

本発明で用いられる液体試料の量は微量でよく、例えば
約５μｌ乃至約１００μノ、好ましくは約８μノ乃至（
資）μｌである。通常的１０　ｔｔｌが用いられる。

液体試料、により形成された液膜への電極の接触は軽く
密着させる事で可能でありいかなる方法でもよいが、例
えば上記相互作用性組成物担持シート上に、不活性な物
質で作られたアルミナープの微小片を設ける事、あるい
は織物、濾紙等の繊維構造物を積層する事により、所望
の膜厚の液膜を形成する事により適度な密着性を持維す
ることが可能である。

本発明に用いられる電極は、電気化学的に活性な物質に
より引き起こされる化学反応を測定する５− ものであり、この際の起電力（電位差）を測定するポテ
ンシオメトリー、電解電流を測定するアンペロメトリー
、電極波を分析するポーラログラフイー等が挙げられる
。

ポテンシオメトリーの一例として、イオン選択電極があ
げられる。これらは感応膜の状条、種類によってガラス
股電極、均質固体膜電極、不均質固体膜、液体膜電極、
ガス感応膜８ｆｉ＠が知られている。

上記の種々のボテンシオメトリーに係るｖｉ極は感応す
る電、気的活性な物質により、ｐＨｔ極、リチウムイオ
ン電極、ナトリウムイオン電極、カリウムイオン電極、
銀イオン電極、アンモニウムイオン電極、カルシウムイ
オン電極、炭酸ガス電極が挙げられる。

アンペロメトリーに用いられる電極には代表的なものに
白金電極が挙げられる。アンペロメトリーに用いられる
電極は特定の電気化学的活性物質例えば酸素や過酸化木
葉を直接電極反応により消費し、その際発生する電解電
流の変化を検知する−　八　− ものである。

上述の白金電極（１）うち、液体中の溶存酸素を測定す
る酸素電極はＥ　、Ｔ　Ｕｐｄｉｋｅｓら著「酵素電極
」（’Ｉ’ｈｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｅｌｅｏｔｒｏｄ、ｅ
　）　Ｎａｔｕｒｅ第２１４巻９８６頁１９６７年に詳
述されている。

一方、過酔化水紫を測定する過酸化水素電極は、米国特
許第３，５３９，４５５号に詳述されている。

これらの上述の電極は、測定物質及びその測定物質と、
相互作用を起こす相互作用性組成物及び相互作用性組成
物によって変化生成又は消失する電気化学的活性物質の
各々又はそれらの組合わせによって選択されるべきもの
である。

本発明に用いられる電極の形状は、平型、棒状等種々の
ものが用いられる任意である。但し、相互作用性組成物
担持シートと、液膜を介して接する電極部分は平面状の
ものが好ましく、更には鏡面仕上げのものが好ましい。

　・ 本発明に係る相互作用性組成物とは、液体試料中の特定
成分に特異的に作用し、変化を与えるものの総称である
。この相互作用とは、化学的活性、触媒活性（酵素−乱
質複合体形成）、免疫活性（抗原−抗体反応）並びに億
の形態のＷＬ電気的化学的又は物理的相互作用を意味す
る。

これら、電気的、化学的又は物理的相互作用により該担
シート上又は中で電気化学的に検知可能な変化が放出又
は生成もしくは消失されるものである。これにより液体
試料中の所望の成分又はその反応生成物の存在及び／又
は濃度が直接的か又は間接的に示され、る。

これらの該組成物には、例えば酵素、補酵素、免疫物質
、イオン能動物質等を挙げることができる。

酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ
等の酸化酵素類カタラーゼ等が挙げられるイオン能動輸
送物質としては、パリノマイシン、環式ポリエーテル、
テトラフェニルボレート、テトララクトンマクロリドア
クチン、環式ボン及びこれらの複合体が挙げられる。又
補酵素としては、例えばＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ等が挙げ
られる。

本発明の相互作用性組成物は、シートに担持される。こ
の際シートはその分析の目的に従って、液体不浸透性の
ものも、液体浸透性のものも、任意に選択する事が可能
である。例えば酵素の如き、相互作用性組成物を担持す
る場合、液体不浸透性シートを用いる事ができる。用い
Ｃ）れるシートは、ポリエチレンテレフタレート、ポリ
スチレン、ポリカーボネートの如き合成高分子重合体、
酢酸セルロースの如きセルロース誘導体、ガラス板等が
用いられる◇ 相互作用性組成物である酵素はシート表面に親水性コロ
イド物質、例えばゼラチン、ポリビニルアルコール、ア
ガロース等の中に溶解し積層、担持する事が可能である
。又前記酵素担持層にはｐＨの緩衝剤、界面活性剤、硬
膜剤等を添加する事は可能である。

上記水不浸透性シートの場合好ましい液体試料の膜厚は
、約父μ乃至約５００μであり必要に応じ９− て選択する事が可能である。

相互作用性物質が、イオン能動輸送物質の場合、好まし
い相持シートとして以下のもσ）が挙げられる。即ち、
ミリボアの商品名で知られる多孔性メンブレン等の液体
不浸性シートーヒにイオン能動輸送物質を含んだポリマ
ー膜をハリ合わせ相互作用性組成物相持シートとする事
が可能である。多孔性メンブレンの膜厚は、該メンブレ
ンの空隙率との関係で決定されるものであり、−砂的に
決める事はできないが、例□えば約薗μ乃至約６００μ
の範囲で用いられる。又空隙率は約２５％乃至約８５％
の範囲で選択され、る。この際空隙率が大きい程、膜厚
は小さくする事が可能である。イオン能動輸送物質を含
むポリマー膜は、疎水性のポリマーバインダーが用いら
れるが、例えばポリ塩化ビニル、ポリウレタン、カルボ
キシル化、塩化ビニル、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合
体、シリコーンエラストマー、ポリカーボネート、セル
ロースエーテル、塩化ビニル−塩化ビニリデン共重合体
、ポリビニルブチラール、及びポリビニルホルマール等
１０− が好ましい。液体試料は、液体浸透性シート側から供給
され、該試料中の特定イオン種がイオン能動輸送物質に
より電極界面に輸送され、それを電極により測定する事
ができる。

更に免疫物質である抗原または抗体の測定の場合、酵素
免疫測定法と呼ばれるものが一例として本発明に適用す
る事が可能である。

酵素免疫測定法の詳細については、放置例えば石川栄治
、河合　忠、宮井　潔　編集１酵累免疫測定法”　１９
７８年　医学書院刊等に参照する事ができる。

本発明を免疫分析に適用した好ましい一態様としては、
支持体上に多孔質層を設けたものを用いる。免疫物質で
ある抗原または抗体は多孔性層に担持されている。本発
明の多孔性層は、米国特許第３，９９２，１５８号等も
用いる事が可能であるが、特に好ましくは１ミリボア“
の商品名で知られる多孔性メンブレン、欧州特許第１３
，１５６号記載の如き粒状構造体、特願昭５５−１７９
６１３号、同５５−１７９６１４号記戦の粒子結合体構
造層が用いられる。

抗原又は抗体は、多孔性構造の孔の部分に物理的吸着又
、化学的結合をもって担持される。この際、分析的に抗
原−抗体反応以外の不望の非特異的反応を防ぐ意味から
、非特異的反応防止剤、例えば正常血清タンパク、ｐＨ
緩衝剤等を含む事ができる。

本発明の好ましい態様の一例に従えば、液体不浸透性支
持体上に抗原又は抗体などの免疫学的特異的反応物質を
包含した多孔性層を設は上記多孔性層に上記抗原又は抗
体と特異的に結合する物質を含んだ液体試料及び上記抗
原又は抗体と特異的に結合する物質に標識化合物を化学
的に結合された物質を一定比率で混合し、この一定量を
多孔性層上に滴下し、一定時間、一定温度でインキュベ
ージ■ンを行なった後未反応の抗体又は抗原及び、未反
応の標識抗体又は標識抗原を洗浄により除去乾燥後一定
量、一定濃度の標識化合物と反応する基質を滴下、一定
温度、一定時間インキユベーシヨンを行ない電極により
分解生成物を電気化学的に計測する事が可能である。

以下に本発明を実施例をもって具体的に説明するが、こ
れによって本発明が何ら限定されるものではない。

実施例−１ ｆｆａＩ８０μの下引き済ポリエチレンテレフタレート
支持体上に下記組成の酵素担持層を有する酵素担持シー
トを作成した。

脱イオン化ゼラチン１９ｆ１９／１００ｃｒｌコレステ
ロールオキシダーゼ　　　４３Ｕ／１００ｃｒｌＩＪ　
ン酸二ナトリウム　　　　　　　７．３Ｍｇ／１００ｃ
ｉｌリン酸カリウム　　　　　　　　　　４．５１９／
１００ｃＩＩＩコポリ　（メチルアクリレ−）−ｎ−ブ
チルアクリレート−２−アクリルア ミド−２−メチルプロパンスルホン 酸ナトリウム）１９６■／１００ｉ 重量比８８　：　７５　：４５ 上記酵素担持シートを３７℃で保温し、種々のレベルの
コレステロール標準液を用意ｔ、１０μノのｆｆ１ｚス
テロール標準液を酵素担持層上に滴下、白金７ノード、
銀カソードからなるクラーク型過酸化水１３− 素電極を滴下点に軽く接触し、電極−シート間に液膜を
形成せしめた。上記電極に接続されたポーラログラフに
より、酵素反応によって生皮した過酸化水素の酸化電流
を測定した。電流は、１分間以内に一定値を示した。結
果は表−１に示す。

表　　−１ 以上の結果から、コレステロール濃度と電流値の間に良
好な直線関係が認められた。

実施例−２ 実施例−１で用いた酵素担持シートを用いて、１４− 以下の検討を行なった。即ち高レベル、低レベルのコレ
ステロール濃度を有する人血清を用い、上記血清にコレ
ステロールエステラーゼ４Ｕ／１０μノヲ加え１０分間
３７°Ｃで処理した後、実施例−１と同様に測定を行な
い、コレステロール濃度を決定した。

Ｊｔ較として総コレステロール測定用のキット、コレス
テロールＯ−テストワコー（和光ＭＭ株製）を用いて測
定した。結果は表−２に示す。

表　　−２ 実施例−３ 膜厚１８０μの下引き済みポリエチレンテレフタレート
支持体上に下記の組成の酵素担持層を積層し１グルコー
ス測定用酵累担持シートを作成した。

脱イオン化セラチン１９６１ｎ９／１００ｃＩＩグＡ／
　コ−Ｘ　＃キシターゼ　　　　２４０　Ｕ／１００ｃ
Ｉｌリン酸二ナトリウム　　　　　　　７．３ｆｆｌｐ
／１００Ｃｒ７１！Ｊ　ンａ　力り　ラム４．５Ｔｎ９
／　１００ｆｆｌコポリ　（メチルアクリレート 一□−ブチルアクリレート −２−アクリルアミド−２ 一メチルプロパンスルホン 酸−１−）　ＩＪ　ラム）　　　　　　　　　１９６ｍ
９／１００ｃｒ１重量比８８　：　７５　：　４５ 上記グルコース用酵素担持シート及び白金アノード、銀
−塩化銀カソード、塩化カリウム電解液から成る酵素検
出方式のポーラ「Ｊグラフ電極に組合せ、実施例−１と
同様に各種濃度のグルコース水溶液１０μｌを滴下し、
検量線を作成した。この時電流値は９秒以内に安定化し
た。

結果は表−３に示したが、グルコース濃度と電流値との
間には良好な直線性が得られた。

次いで正常人血清（グルコーステストＯ−ワコー　和光
純薬■を用いてグルコース濃度９ｅｌ”９７ｄｌＤを同
様に３６℃で加面測定し検量線から濃度の平均値及び変
動係数を求めた。結果は表−４に示す。

表　　−３ 表　　−４ 実施例−４ 膜厚１８０μの下引き済みポリエチレンテレフタレート
支持体上に下記組成の免疫物質担持層を塗布し、免疫物
質担持シートとした。

１７− 試験試料溶液として、インシュリン濃度４Ｘ１０゜Ｉ　
Ｘ　１０−？ｍｏｌ／Ｊ　０．０３　Ｍ−リン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）を用意し、酵素標識抗原としてインシュ
リンにカタラーゼをゲルタールアルデヒドを介して標識
したものを用いた。

（但し１力タラーゼ１分子にインシエリン約１．４分子
結合したものを用いた。）このカタラーゼ標識インシュ
リンの一定量を上記インシュリン溶液に混合し１約加μ
ｌを滴下、４℃Ｕ時間インキエペーシ冒ンした後、蒸留
水及び０．０３　Ｍ−リン嬢緩衝液で洗浄し、１０ｍｍ
ｏｌ／ｌの過酸化木葉溶液−（リン酸緩衝液ｐＨ７，０
）を加μノ滴下し、３０’Ｃで１０分間イ１８− ンキュベーシ目ンを行ない、白金アノード１銀−塩化銀
カソード、塩化カリウム電解質から成る、ｒｇ素検出方
式のポーラログラフ電極に組合せ、実施例−３と同様に
測定を行なった。（但し一定時間当りの電流の上昇率で
初期速度を調べた。）結果は表−５に示す。

表　　−５ 上記結果の如く、本発明の分析方法は、酵素免疫分析法
に適用した場合も良好な結果を与える事がわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の分析法を示した説明図である。第２
図、第３図、＃！４図、第５図は、相互作用組成物担持
層−トの一実施例である。 １・・・・・・相互作用組成物担持シート２・・・・・
・電極　　３・・・・・・測定機器４・・・・・・液体
試料液膜 １１・・・・・・相互作用組成物担持層１２．１５・・
・・・・液体不浸透性支持体１３・・・・・・多孔性相
互作用組成物担持層１４・・・・・・多孔性相互作用組
成物担持シートＡ・・・・・・液体試料滴下方向 Ｂ・・・・・・電極設置方向 代理人　　桑　原　義　美 手続補正書 １１１′イ和５７年９月９１１ 特許１’ｌ長官若杉和夫殿 昭和５６年特許願第　９８７２８　　リ２　発明の名称 液体試料の電気化学的分析方法 ３　補正にする者 事件との関係　特許出願人 住　所　　東京都新宿区西新宿１丁目２６番２−７名　
称　（＋２７）小西六写真玉業株式会社代表取締役　川
　　本　　信　　彦 ４、代理人 〒１９１ 居　所　　東５；〔都＋１！ｌ’ｆ中さくら町１冴地小
西六写真［業株式会７１内 自発 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ７、　補正の内容 （１）発明の詳細な説明を次の如く補正する。 　２−

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 液体試料中の特定成分を電気化学的に分析する分析方法
   であって、該特定成分と相互作用をして電気化学的に検
   出可能な物質に変化するかまたは電気化学的に検出可能
   な物質を生成する物質を担持するシート上に、該液体試
   料の液膜を形成した後、該液膜に電極を接触させふこと
   を特徴とする液体試料の電気化学的分析方法。