JPS5823076B2 - Ｄｅ−３９３６ ノセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は動物用抗原虫物質ＤＥ−３９３６の製法に関す
るものである。

本発明者は、東京都武蔵野市で採取した土壌試料より分
離したストレプトマイナス属に属する９７３５−１菌を
培養したとき、優れた抗原虫作用を示す物質が蓄積され
ることを見出し、本発明を完成した。

この菌の菌学的性質は次の通りである。

（１）形態的特徴 半画の空中菌糸は基生菌糸から直状乃至曲状に伸長し、
それより単純分枝として形成された分生胞子柄の先端に
コンパクト及びクローズドタイプの螺旋を形成する。

分生胞子は１０個以上連鎖し、電子顕微鏡的に観察する
とその形は卵形乃至短円柱形で大きさは０．８〜１．０
μ×１．０〜１．５μであり、その表面はいぼ状である
。

車軸分枝、鞭毛胞子、胞子溝及び菌核は認められない。

又、基生菌糸は曲状乃至波状に伸長し、断裂はみられな
い。

（１１）各種培地における生育状態 各種培地上で２８℃、２１日間培養観察した生育状態は
第１表の如くである。

（＋；＋） 生理的性質 常法に従い試験した結果を第２表に示した。

０Ｖ）炭素源の利用性 プリダムらの方法（ジャーナル・オブ・バクテリオロジ
ー、第５６巻、１０７〜１１４頁、１９４８年）に従っ
て試験した半画の各種炭素源の利用性は第３表の如くで
ある。

以上の諸性質をバーシース・マニュアル・オブ・デイタ
ーミナテイブ・バクテリオロジー、第７版および第８版
（１９５７および１９７４）、ニス・ニー・ワックスマ
ン著、ジ・アクチノミセーテス、第２巻（１９６２）お
よびその他国内外の文献に照合して既知菌種との比較、
同定を行ったところ、半画は（１）空中菌糸がコンパク
トおよびクローズドタイプの螺旋を形成する。

（２）空中菌糸の色は培地の種類および培養時期によっ
て多少異なるが、いずれも褐色を帯びた灰色を基調とし
ている。

（３＄成および有機および天然の各種培地に於いて可溶
性色素を殆んど産生しない。

（４）メラニン色素形成培地で黒褐色の可溶性色素を産
生ぜず、チロシナーゼ反応が陰性であることからノンク
ロモヂエニツク・タイプである。

（５）ある種の培地上に於いて成熟時に空中菌糸がとこ
ろどころ湿潤し、黒褐色の斑点を生じ、それが次第に全
体に拡がる等の特徴を有しているので、半画はこれらの
特徴を備えるストレプトマイセス・パイグロスコピカス
群数線菌に属せしめるのが最も妥当と考えられる。

さらに、トレスナーら（アプライド・マイクロバイオロ
ジー、第１５巻、６３７〜６３９頁１９６７年）および
ディエツトら（同上、第１６巻、９３５〜９４１頁、１
９６３年）はこの群の放線菌を胞子の形態およびその他
の点により更にストレプトマイセス・バイグロスコピカ
スタイブとストレプトマイセス・プランテンシス・タイ
プに細別しているが、これらの分類基準に従えば半画は
ストレプトマイセス・バイグロスコピカス・タイプに属
すると考えられる。

このストレプトマイセス・バイグロスコピカス・タイプ
に属する菌種としてはストレプトマイセス・バイグロス
コピカスおよびストレプトマイセス・エンダス等が挙げ
られており、半画は培地の種類によっては空中菌糸の生
育および色、基生菌糸の色、可溶性色素の産生、その他
硝酸塩還元性等に於いて、ストレプトマイセス・バイグ
ロスコピカスとは若干の相異がみもれる。

しかし、トレスナーおよびバッカス（アプライド・マイ
クロバイオロジー、第４巻、２４３〜２５０頁、１９５
６年）は、ストレプトマイセス・バイグロスコピカスの
基本的特徴として（１）胞子柄がクローズド・タイプの
螺旋を形成すること。

（２）褐色を帯びた灰色の空中菌糸を着生すること。

（３）ある種の培地上で空中菌糸が湿潤すること。

を指摘しており、半画にもこれらの基本的特徴に合致す
る点が多い。

したがって半画はワックスマンの分類基準によって、ス
トレプトマイセス・バイグロスコピカスに属せしめるの
が妥当と考え、ストレプトマイセス・バイグロスコピカ
スＡ ９７３５−１ （Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓＡｉ：９７３５ １）と呼
称することとし、このものは工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第３１５９号として保管されている
。

本発明によりＤＥ−３９３６物質を得るには例えばスト
レプトマイセス・バイグロスコピカスに属する９７３５
−１菌を適当な栄養培地を用い、振盪培養又は通気攪拌
培養等の通常放線菌の培養に用いられる方法で好気的培
養条件下に培養すればよい。

栄養培地としては半画の利用し得る栄養源を単独或は適
当に組合せたものが用いられ、炭素源としては半画の利
用し得るものであればいづれでもよいが、たとえばグル
コース、フラクトース、蔗糖、デキストリン、澱粉、廃
糖蜜、グリセリン等が用いられ、就中グルコースが望ま
しい。

窒素源も半画の利用し得るものならばいづれでも用いら
れ、たとえば大豆粉、綿実粉、デイステイラーズソリブ
ル、コーンステイープリカー、酵母、酵母エキス、ポリ
ペプトン等が用いられ、望ましいものは大豆粉、綿実粉
、デイステイラーズソリブル等である。

更にこの培地に添加することの出来るものとしてはある
種の脂肪酸やその塩又はエステルその他一般に放線菌の
培養に用いられるたとえば無機塩類、有機および無機の
微量成分、消泡剤等がある。

培養開始時の培地のｐＨは放線菌の発育しうる範囲内に
あればよいが、６．５と７．５の間にあることが望まし
く、培養温度は半画の生育しうる範囲であればよいが、
ＤＥ−３９３６を効率よく蓄積せしめる為には２７〜３
１℃が望ましい。

ＤＥ−３９３６の培地中への蓄積は通常６５〜１１０時
間で最高に達する。

ＤＥ−３９３６を比較的少量得る場合には、振盪培養に
よって行なうことが出来るが、工業的に大量に得るため
には、例えば醗酵タンクを用いて通気攪拌培養を行なう
のが有利である。

醗酵タンクを用いた培養方法を示せば大要次の通りであ
る。

醗酵タンク中の培地には、ＤＥ−３９３６の生産菌であ
るストレプトマイセス・バイグロスコピカス／Ｉ６．９
７３５ １の胞子懸濁液を直接接種することも出来るが
、これでは接種菌の生育が遅延することがあるので生産
菌はあらかじめ他の培養装置で前培養を行なっておくの
が良い。

即ち醗酵タンク中の培地量の０．２〜２％に相当する量
の同種又は異種の培地に胞子懸濁液を接種して予備的に
培養することにより、栄養細胞の十分に生育した活性の
ある種培養液を作る。

ついでこの種培養液を醗酵タンク内の培地に接種し通気
攪拌培養を行なう。

通気攪拌培養において、タンク内の培地に通じる無菌空
気の量は醗酵タンクの型式により異なるが、ＤＥ−３９
３６の十分な生成蓄積を得るための通気量は通常０．２
〜１．ＯＶＶＭ（醗酵培地１容当り１分間に０．２〜１
．０容の空気）である。

培養物からのＤＥ−３９３６の採取は、その物理化学的
性質を利用し、普通に用いられる方法で遊離酸の形又は
その塩の形で得ることが出来る。

即ちＤＥ−３９３６遊離酸或はその塩は種々の有機溶媒
に可溶であるので先ず培養物から適当な溶媒で抽出を行
ない、ついで各種クロマトグラフィー、結晶化等により
精製を行なう。

醗酵を終了したＤＥ−３９３６を含有する培養物は例え
ば苛性ソーダ溶液を用いてｐＨを７．０〜８．０に調整
してから抽出を行なうのが好ましい。

しかし醗酵終了時の培養物のｐＨは大抵の場合その範囲
に達しているのでこの操作は省くことが出来る。

ＤＥ−３９３６は培養菌体および培養濾液の両方に含ま
れているので、まず培養物は通常の方法によって菌体と
濾液とに分け、それぞれに適した溶媒で抽出を行なう。

例えば菌体からは適当量のメタノール、アセトン等の溶
媒で、又濾液からは適当量のベンゼン、クロロホルム、
チクロルエタン、酢酸エチル等の溶媒でそれぞれＤ Ｅ
−３９３６の抽出を行なう。

ついでＤＥ−３９３６含有の溶媒層を水層或は固形物か
ら分離し、これらを合して減圧下に蒸発濃縮したのち濃
縮液を吸着剤、例えばアルミナを用いたカラムクロマト
グラフィーにより精製する。

この場合展開溶媒としてはベンゼン、酢酸エチル、メタ
ノール又はこれらの混合溶媒が用いられる。

溶出液を分画して抗菌力又は呈色反応（バニリン−硫酸
による）によりＤＥ−３９３６含有の区分を集め、減圧
濃縮し、更にセファデックスＬＨ−２００カラムクロマ
トグラフィー（展開溶媒としてはメタノールが適してい
る）、シリカゲルのカラムクロマトグラフィー（展開溶
媒としては主としてベンゼン、アセトン又はこれらの混
合溶媒等が適している）、活性炭処理等を適当に組合せ
て精製を行なう。

溶出液を分画して得られたＤＥ−３９３６の含有区分を
集め減圧濃縮すると精製されたＤＥ−３９３６の白色粉
末が得られる。

この粉末を例えば少量のベンゼンに溶解し、石油エーテ
ルを加えて室温又は冷所に放置すればＤＥ−３９３６は
無色のプリズム状又は柱状の結晶として得られる。

ここに得られた結晶ナトリウム塩を主体としたＤＥ−３
９３６の塩である。

この様にして得られたＤＥ−３９３６は、次の方法によ
り遊離酸として得ることが出来、更にまたナトリウム塩
、カリウム塩、アンモニウム塩、銀塩等の塩の形として
も得ることができる。

培養物から得られたＤＥ−３９３６をベンゼン、クロロ
ホルム等の水と混合しない溶媒に溶解して希塩酸と振盪
する。

この操作を数回くり返し溶媒層を分離した後濃縮するこ
とによりＤＥ−３９３６を遊離酸の形で白色粉末として
得ることが出来る。

この様にして得られた粉末をベンゼン、石油エーテル系
の溶媒より再結晶することにより無色の柱状晶又はプリ
ズム晶として純粋のＤＥ−３９３６遊離酸を得ることが
出来る。

また別の方法によっても遊離酸を得ることが出来る。

すなわち培養物から得られたＤＥ−３９３６をアセトン
に溶解した後、適当量の水を添加し、次いで希塩酸でｐ
ｎ２〜４とした後、ベンゼン等の水と混ざらない溶媒で
抽出することによりＤＥ−３９３６の遊離酸を得ること
が出来る。

ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩については
次の如くして得ることが出来る。

まずＤＥ−３９３６の遊離酸をアセトンに溶解しこれに
水を加えた後、それぞれ水酸化ナトリウム液、水酸化カ
リウム液又はアンモニア水を加えてｐＨをアルカリ側（
９〜１２）とした後、濃縮してアセトンを除き、ベンゼ
ン、酢酸エチル、クロロホルム等の溶媒を使用して抽出
し、これを濃縮することによりそれぞれの塩を無色の粉
末として得ることが出来る。

こうして得られた粉末は、ペンゼンー石油エーテル系、
ベンゼン−ｎ−ヘキサン系や水−メタノール系の溶媒よ
り再結晶することにより針状晶、柱状晶或はプリズム晶
として得ることが出来る。

銀塩についてはまずＤＥ−３９３６ナトリウム塩やカリ
ウム塩をメタノールに溶解し、これに硝酸銀の水溶液を
加えることにより得られ、これをベンゼン−石油エーテ
ル系や水−メタノール系の溶媒により柱状晶又はプリズ
ム晶として得ることができる。

本発明の方法により得られたＤＥ−３９３６のベンゼン
−石油エーテルより結晶化したナトリウム塩は次のよう
な物理化学的性質を有する。

■、物質の外観：無色針状結晶、無色柱状結晶または無
色プリズム状結晶 ２、酸性、塩基性、中性の区別：モノカルボン酸のす）
ＩＪウム塩でほぼ中性である。

３、融点：１７３．０〜１７６．０℃（キャピラリー法
）（僅かに褐色になりながら溶けるので分解を伴なった
融点と考えられる） ４、比旋光度ニー〕賃−＋６７．０°（Ｃ−１、クロロ
ホルム） ５、溶解性：低級アルコール類、エステル類、クロロホ
ルム、四塩化炭素、エーテル、ベンゼン等に易溶、シク
ロヘキサン、ｎ−ヘキサン、石油エーテル等の溶媒に可
溶、水にほとんど不溶。

６、元素分析値（％）：Ｃ６２，５２、Ｈ８，９０、Ｎ
ａ ２．５１ ７、呈色反応：硫酸、リン酸、ｐ−アニスアルデヒド、
三塩化アンチモン、ヨウ素、ワニリン−硫酸反応・・・
・・・陽性 モーリッシュ反応、アンスロン反応、ニンヒドリン反応
・・・・・・陰性 ８、紫外部吸収スペクトル：メタノール中で測定した場
合２１０〜３７０ｎｍの間に特徴ある吸収ピークは認め
られない。

９、光外部吸収スペクトル（クロロホルム中）：第１図
に示した通りである。

１０、ＮＭＲスペクトル（ＣＤＣ１３中）：第２図に示
した通りでメトキシ基を４個有すると推定される。

なお分子式及び分子量はＤＥ−３９３６のメチルエステ
ルの質量分析及び遊離酸の高分解能質量分析轍より、分
子式Ｃ４，４Ｈ７５ｃｉ４ Ｎａ、分子量８５０（万国
原子索表による値を用いた計算値は８５１．０７）であ
り、これらとＸ線回折分析の結果から化学構造は次式の
如く決定された。

ＤＥ−３９３６ナトリウム塩の生物学的性質は次の通り
である。

１、抗菌スペクトル：グラム陽性菌に対して抗菌活性を
有するが、ダラム陰性菌、カビ、酵母に対しては抗菌活
性は認められなかった。

また、植物病原菌のエルウィニア・カロトボーラ（野菜
類の軟腐病菌）に対し強い抗菌活性を示した。

２、急性毒性 ■ マウス（ｄｄｙｓ系雄）に対するＬＤ５ｏは次の通
りである。

４５．８ｍ９／ｍ９（経口投与） １３．０〜／ｋｇ（腹腔投与） ■ ニワトす（ヒナ、雄２〜３週令）に対するＬＤ、ｏ
は次の通りである。

１９０．９〜／ｋｙ（経口投与） ９．１３〜／ｋｙ（腹腔投与） 次にＤＥ−３９３６の遊離酸の化学的性質は下に示した
通りである。

１、物質の外観：無色プリズム状結晶 ２、酸性、塩基性、中性の区別：酸性（ＢＰＢ発色で黄
色） ３、融点：１０９〜１１４℃（キャピラリー法）４、比
旋光度：（ロ）賀−±６６．６°（Ｃ−１、クロロホル
ム） ５、元素分析値（％）：Ｃ６４，６５、Ｈ９，０５溶解
度、呈色反応、紫外部吸収スペクトルについてはほぼナ
トリウム塩と同様である。

マススペクトル法及び元素分析値の結果から分子式はＣ
４４Ｈ７６Ｃ１４であり、ベンゼン−石油エーテルで結
晶化したものは、１分子の水と１分子のベンゼンを含有
していると推定される。

なお、以上の物性は現在得られる最も精製された試料に
ついて測定されたものであるが、なお若干の不純物を含
んだものの値となっていることも考えられる。

ＤＥ−３９３６は各種原生動物による原虫症に対して有
効である。

即ち、マンリヤ症、トキソプラズマ症及びコクシジウム
症に予防並びに治療効果を示し、現在これらの原虫症に
使用されているサルファ剤、葉酸拮抗剤、キノリン系剤
、抗サイアミン剤等の抗原虫薬との併用効果も期待出来
、合剤としての使用が可能である。

マラリャ原虫プラスモジウム・ベルゲイ （Ｐ ｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ ） ＮＫ
６５及びトキンプラズマ症原虫トキンプラズマ・ボン
ブイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ ） ＲＨ
を感染せしめたマウスにＤＥ−３９３６又はその各種金
属塩の１５ｍＩ？／ｋｇ以上を１〜数回投与する事によ
り、無投薬群に比較して明らかに延命効果が認められる
。

特に感染の１〜２日以前に投薬を開始すれば効果を更に
著しく向上させる事が出来る。

従ってＤＥ−３９３６及びその金属塩は動物のマラリャ
、トキソプラズマ等の症状の予防並びに治療に有効な物
質である。

また、ＤＥ−３９３６及びその塩は動物のコクシジウム
感染に対しすぐれた効果を有する。

ＤＥ−３９３６又はその塩を２５〜１５０ｐｐｍの割合
で添加した飼料はアイメリャテネラ（Ｅ ｉｍｅｒｉａ
ｔｅｎｅｌｌａ ）、Ｅ、ネカトリツクス、Ｅ、アセル
ブリナー及びＥ、マキシマ等の単独感染症並びにそれら
の混合感染症にすぐれた予防効果があり、更に１００〜
５００ｐｐｍの割合で飼料に添加すれば上記アイメリャ
類の原虫症に対してすぐれた治療効果を有している。

特に現在抗原虫薬として使用されているサルファ剤、キ
ノリン系剤及び抗サイアミン剤等の普通使用量に対する
耐性株によるコクシジウム感染症の予防、治療に有効で
ある。

コクシジウム感染に対する効果は次の試験によって確認
された。

即ちＤＥ−３９３６及びその塩を次の組成の初生ビナ用
飼料に添加した。

トーモロコシ ４７ ％ 大麦粉 １０ ％ 脱脂糖 １０ ％ 大豆粕 １０ ％ 魚粉 ７％ ふすま ７ ％ 砂糖 ２％ ルーザンミール ３ ％ 炭カル ３ ％ 食塩 ０．５％ ビタミンＦ Ｏ，５％１００ ％ これで１群１０羽の８日令のヒナを飼育し、飼育開始後
４８時間目に試験用のアイメリャの胞子分裂したオーシ
ストを感染させた。

飼育期間は感染アイメリャ種によって異るが、評価期日
の２４時間前までＤＥ−３９３６又はその塩を添加した
飼料を与えた。

別にＤＥ−３９３６及びその塩を添加しない飼料により
飼育した１群１０羽のヒナにも同様に胞子分裂オーシス
トを感染させこれを感染対照群とした。

また他の１群にはＤＥ−３９３６を含まない飼料を与え
かつコクシジウムにも感染させず、これを正常対照群と
した。

結果は感染４乃至７日後に各種の測定を行ない評価した
。

第４表、第５表、第６表、第７表及び第８表にその成績
を示した。

表中のＯＰＧは糞便１７中に含まれるオーチスト数を示
している。

なお、ポリエーテルモノカルボン酸系物質のうち、モネ
ンシンは抗コクシジウム剤として米国で使用されている
が、これに関する文献（ＡｄｖａｎｃｅｄＰｈａｒｍａ
ｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ２４１頁
１９７３年）並びに本発明者による比較試験の結果から
ＤＥ−３９３６の抗コクシジウム活性が優れており、極
めて有用な薬剤である。

即ち、前記文献の２４１頁記載のＴａｂｌｅＩＶによれ
ばモネンシンは２×１０５オーシストの接種例ではある
が、２５０ｐｐｍ添加でも死亡例が認められており、増
体量は正常対照群が５９ｆ！に対して３６．９ｆと低く
、オーシストの排泄は４．３７Ｘ１０６／ ｃｈｉｃｋ
残っている。

又、生後８日令のヒナにＥ、ネカトリックスの多剤耐性
オーシス）３．４Ｘ１０’ケを感染せしめモネンシン及
びＤＥ−３９３６の夫々の純末換算値で７５ｐｐｍ、
１００ｐｐｍ１１２５ｐｐｍを添加した飼料により飼
育した結果［）Ｅ−３９３６では何れの割合の添加飼料
によっても死亡例が無かったのに対して、モネンシンで
は７５ｐｐｍ群では５羽中２羽、１１００ｐｐ群では５
羽中１羽が死亡した。

対照の感染無投薬群が５羽中３羽死亡している点から若
干の効果は認められたものの、ＤＥ−３９３６群に比べ
ると効果は弱い。

小腸病変ではＤＥ−３９３６群が病変を認められないの
に対してモネンシン群では明らかな病変が認められ、又
糞便の異常程度もモネンシンの１２５ｐｐｍ群で丑、１
１００ｐｐ群で枡、７５ｐｐｍで冊を示し、感染無投薬
群が冊を示したのに比べて効果は僅に認められるものの
、ＤＥ−３９３６が全く異常が無い点とでは著しい差が
ある事を認めざるを得ない。

病変の指数−１＋、廿、■、冊は病変無し←）、微（イ
）、ト、中（へ）、重（ハ）で示した。

本発明により得られるＤＥ−３９３６は動植物体に対し
て病原性を有する微生物及び寄生原生動物による疾患及
び植物病の治療剤及び予防剤として使用し得る。

動物用として用いるにはＤＥ−３９３６又はその塩は飼
料に混合して投与するのが最も簡単であるが、獣医薬製
造業において普通知られている製剤、例えば乳化剤、水
薬、カプセル及び錠剤等に仕上げてもよい。

植物病原菌の防除用としては溶解液又は微粉末で散布出
来る剤型が望ましい。

実施例 １ 回転振盪培養機によるＤＥ−３９３６の製造法光ツ種培
養液を得るためにストレプトマイセス・バイグロスコピ
カス／１６．９７３５ １を次の組成を有する前培養培
地で２８℃、３日間振盪培養した。

前培養培地ニブドウ糖 ２０ ？／ｌ：ペ
プトン ５７／ｌ 肉エキス ３２／ｌ 乾燥酵母 ３７／１ 食塩 ５ ｆｌ／７３炭酸カルシウ
ム ３７／ｌ ｐＨ７，０ 本培養は次の組成を有する生産培地を用いて行った。

生産培地ニブドウ糖 ３０ グ／ｌ犬豆粉
８．３Ｐ／ｌ 綿実粉（ファルマメデ ５．５？／ｌ イア） 食塩 ５１／ｌ 炭酸カルシウム ３ グ／ｌ ｐＨ７，０ 上記の生産培地４０ｒＩｌｌを３００ｍ１容三角フラス
コに仕込み種培養液０．８ ｒｎｌを接種して２８℃２
２０回転／分で６日間培養した。

培養終了後培養液を濾過し培養濾液についてバイオアッ
セイにより抗菌力価の測定を行ったところ、ＤＥ−３９
３６は５１０ ｍｃｇ ７ｍｌ生産されており、また菌
体中にも存在することが分った。

このような方法によって得られた培養液１１を濾過して
菌体と培養濾液とに分は菌体（湿菌体重量約５０１）は
２００ｍ１のメタノールで２回抽出した後約５０ｍ１ま
で濃縮し、これに２００ｍ１の水を加えて１００ｍ１の
ベンゼンで２回抽出した。

培養濾液の方は２５０；４０ベンゼンで２回抽出し菌体
より得られたベンゼン抽出物と併せて濃縮し赤褐色オイ
ル状物質を得た。

この物質をメタノールに溶解して不溶物を除いた後、セ
ファデックスＬＨ−２０のカラムクロマトグラフィーを
行いメタノールで展開した。

この操作を２回繰り返した後接生物質ＤＥ−３９３６区
分を濃縮乾固して褐色粉末７５０ｍ９を得た。

次に脱色するためにこの粉末をベンゼン３０ｍ１に溶解
して活性炭のカラム（活性炭１グとセライト１７を混合
したもので調製）を通し、続いてベンゼンで洗滌して十
分に溶出し、得られたベンゼン溶液を濃縮乾固して白色
粉末６８０ｍ９を得た。

実施例 ２ ２００１容醗酵タンクによるＤＥ−３９３６の製造方法 生産培地として次の組成のものを用いた。

生産培地ニブドウ糖 ２５ ′？／１綿実
粉（ファルマ ５？／ｌ メディア） コーンステイープ ５ ′？／１ リカー 食塩 ５７／ｌ 炭酸カルシウム ３７／ｌ 消泡剤 ３０ｍ１／１３０１ ｐＨ６，８ 生産培地１３０１を２００１容醗酵タンクに仕込み実施
例１と同様の方法に上って得られた種培養液１１を接種
し、温度：３０℃、通気量ニア０１／分、内圧： １ｋ
ｇ／ｃ４、攪拌回数：２００回／分の条件で９６時間培
養した。

醗酵終了後全培養液を濾過して湿菌体約２．６ ｋｇと
培養濾液（ｐＨ７，０、ＤＥ−３９３６力価３１０ ｍ
ｃｇ／ｍｌ）約１２０ｍ１を得た。

湿菌体は１．５１のメタノールで１回抽出し更に５１の
メタノールで抽出した。

このメタノール抽出液を約２１まで濃縮してメタノール
を留去した後、水１１を加え３１のベンゼンで４回抽出
した。

培養濾液の方はベンゼン３５１で１回抽出し、更に２０
１のベンゼンで１回抽出した。

この様にして得られた菌体及び培養濾液からのベンゼン
抽出液を合併して濃縮し、暗赤色オイル状物質約２００
７を得た。

このオイル状物質はまず活性アルミナカラムクロマトグ
ラフィーにより精製した。

即ち、オイル状物質はベンゼンに溶解してカラムに通し
ベンゼンで出来るだけ不純物を除いた後、酢酸エチル次
いで酢酸エチル：メタノール混液（１：１）で溶出し、
活性区分を濃縮乾固して赤褐色のオイル状物質を得た。

次にこの物質をメタノールに溶解してセファデツクスＬ
Ｈ−２０カラムに通し、メタノールで展開して活性区分
を濃縮して５５７の赤褐色オイル状物質を得た。

さらにこれを精製するためにシリカゲルカラムクロマト
グラフィーを行なった。

まず５５グの赤褐色オイル状物質をベンゼンに溶解して
カラムに吸着させた後ベンゼン及びアセトン：ベンゼン
（１：５０）で不純物を溶出し、ついでアセトン：ベン
ゼン（１： ２０〜１：５）で活性物質を溶出した。

このシリカゲルクロマトグラフィーを２回行なった後溶
出液を濃縮乾固してＤＥ−３９３６を微黄色の粉末とし
て３］、、５Ｓ’を得た。

実施例 ３ ＤＥ−３９３６の結晶化 実施例１〜２の方法によって得られたＤＥ−３９３６の
粉末を６．８７使用して結晶化を行なった。

まず、本粉末を１０ｍ、ｌのベンゼンに溶解すると直ち
にプリズム状結晶が析出しはじめるが、さらに石油エー
テル１０ｒｕｌを加えて３時間冷蔵庫（５℃）に放置す
る。

次いで析出した結晶は母液と分離し、結晶は石油エーテ
ルで数回洗滌した。

この洗液を母液に加えて冷蔵庫に放置し第２晶を析出さ
せた。

この結晶を分離した後、その母液及び洗液からもう一度
結晶化を行ない第３晶を得た。

こうして得られた結晶の収量は第１晶４．６り、第２晶
０．３７、第３晶０．２７の合計５．１７で無色のプリ
ズム状である。

実施例 ４ ＤＥ−３９３６の結晶化及び再結晶 実施例１〜２の方法によって得られたＤＥ−３９３６の
粉末２，８７を１．０ｒｆＬｌのベンゼンに溶解して室
温に放置しておくと無色の柱状もしくはプリズム状の結
晶が析出する。

この結晶を分離して数回石油エーテルで洗滌した後、こ
の洗液と母液は一旦濃縮乾固し、これを５ｒＩＬｌのベ
ンゼンに溶解して室温に放置すると結晶が析出したので
、これを分離して母液は濃縮乾固した。

ここまでに得られたＤＥ−３９３６の無色プリズム状（
または柱状）結晶は１７であった。

濃縮乾固した母液の部分は更にベンゼン１０ｗＬｌに溶
解して石油エーテル３０ｒｒＬｌを加えることによって
無色のプリズム状または柱状の結晶１７を得た。

以上の如くして得られた結晶の中１７をメタノール６Ｔ
ＩＬｌに溶解し水１．５１７１１を加えて室温に放置す
ると徐々に無色針状結晶が析出するのでこれを分離して
３６０ｍ９の結晶を得た。

母液の方は更に室温放置することにより柱状結晶１６０
〜を得た。

結晶を得る場合短時間に析出させると針状結晶または柱
状結晶及び小さなプリズム状結晶が得られ、ゆっくり析
出させると大きなプリズム状結晶が得られる傾向がある
。

実施例 ５ ＤＥ−３９３６遊離酸の調製 実施例３で得られたＤＥ−３９３６の１１をアセトン１
００Ｉ７１１に溶解して５０ｒＩｌｌの水を添加する。

この状態でｐＨは約７．２である。

これに０．５Ｎ塩酸を加えてｐＨを２．９とした後、５
００ｍ１のベンゼンで３回抽出を行ないベンゼン層を水
洗し硫酸ソーダで脱水した。

このベンゼン溶液を濃縮乾固すると約１７の白色粉末が
得られた。

これをベンゼン８ｍｌに溶解し約２ｍｌまで濃縮して石
油エーテル６ｍｌ加え室温に２日間放置すると無色プリ
ズム状結晶が析出した。

この結晶を濾過して石油エーテルで洗滌し、ＤＥ７３９
３６の無色プリズム状結晶８００Ｔｎ９を得た。

実施例 ６ ＤＥ−３９３６カリウム塩の調製 実施例５のような方法により得られた［）Ｅ−３９３６
遊離酸の粉末１グをアセトン５０ｍ１に溶解し２５ｒＩ
Ｌｌの水を加えた。

この溶液に０．５Ｎ水酸化カリウムを加えてｐＨ１２，
２とした後、濃縮してアセトンを留去し、残った水溶液
に酢酸エチルを加えて抽出した。

酢酸エチル層を水洗し、硫酸ソーダで脱水後濃縮乾固し
て白色粉末約９００〜を得た。

こうして得られた粉末５００ｍ１を１０ｍ１のベンゼン
に溶解し約１ｍｌまで濃縮して石油エーテル５ｍｌを加
え、室温に放置すると無色プリズム状結晶が析出した。

この結晶を集めてＤＥ−３９３６カリウム塩３９０〜を
得た。

実施例 ７ ＤＥ−３９３６アンモニウム塩の調製 実施例５のような方法により得られたＤＥ−３９３６遊
離酸の粉末１７をアセトン５０ｍ１に溶解し２５ｗ１ｌ
の水を加えた。

この溶液に０．５Ｎアンモニア水を加えてｐＨ９，０と
した後、濃縮してアセトンを留去し残った水溶液に約５
００１１′ｔ９の塩化アンモニウムを加えてベンゼンで
抽出した。

ベンゼン層を水洗して硫酸ソーダで脱水濃縮乾固して白
色粉末約９００〜を得た。

こうして得られた粉末５００〜を１０ｒＩＬｌのベンゼ
ンに溶解して約１ｍＡまで濃縮して石油エーテル４ｍｌ
！を加え室温に放置すると無色柱状結晶が析出した。

この結晶を集めてＤＥ−３９３６アンモニウム塩３７０
〜を得た。

実施例 ８ ＤＥ−３９３６銀塩の調製 実施例３或は４のような方法によって得られたＤＥ−３
９３６の結晶５００〜を４ｏｒｎｌのメタノールに溶解
した。

一方、２１４ηの硝酸銀を３Ｔｌｌの水に溶解して両者
を混合し、暗黒下に室温で４時間放置した。

その後この溶液を濃縮乾固して水洗し、残った不溶物を
ベンゼン５０ｍ１に溶解し、更に微量の硝酸銀がな（な
るまで水洗した。

こうして得られたベンゼン溶液を濃縮乾固して白色粉末
約５００ダを得た。

これを１ｍｌのベンゼンに溶解して石油エーテル５ｒｕ
ｌを加え暗黒下で室温に放置すると無色プリズム状結晶
が析出した。

この結晶を集めてＤＥ−３９３６銀塩を２５０ｍ９得た
。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図はそれぞれ、［）Ｅ−３９３６ナトリ
ウム塩の赤外部吸収スペクトル及びＮＭＲスペクトルで
ある。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ ストレプトマイナス属に属するＤＥ−３９３６生産
   菌を培養し、培養物からＤＥ−３９３６物質を遊離酸の
   形または塩の形で単離することを特徴とするＤＥ−３９
   ３６物質の製法。