JPS5820593B2 - コウセイブツシツノセイホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＭＭ４５５０と命名された抗生物質及びその
塩類の製法に関する。

ストレプトマイセス オリバセウス（５ｔｒｅｐｔ。

ｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ ）のある菌及びその
関連微生物の醗酵により抗生物質を得ることができ、そ
の抗生物質が純品である際には多くのβ−ラクタマーゼ
に対し極めて強力な阻害剤であることを発見した。

我々がＭＭ４５５０と命名したこの抗生物質は、培養物
から得られた粗製の抗菌複合体をクロマトグラフィー精
製により実質的に純粋な形で得ることができる。

英国特許第１，３６３，０７５号明細書で、ストレプト
マイセス オリバセウスのある菌種の培養により有用な
β−ラクタマーゼ阻害剤が得られると開示した。

かくして、この発明に至るまで、上記英国特許で開示さ
れた物質は実質的に純品であると信じられていたが、こ
れは純品ではなく、この物質の受部分の成分が単離でき
、そのものは強いβ−ラクタマーゼ阻害活性を有するこ
とを発見した。

この新規物質をＭＭ４５５０と名付けられ且つこのもの
は現在のところ英国特許第１，３６３，０７５号明細書
の物質が有する抗菌活性のごく一部に寄与するが、該物
質の有するβ−ラクタマーゼ阻害活性の大部分を角って
いるものと信するものである。

もともとこの発明の明細書では該英国特許第１．３６３
，０７５号で開示された物質をクレームするものと解釈
されるべきではない。

他のβ−ラクタマーゼ阻害剤が、ストレプトマイセス
オリバセウスの菌種、例えばドイツ公告特許出願第２．
３４０，００５号で開示された菌で生産されることが公
知であるが、かような公知物質は実質的に純品であるＭ
Ｍ４５５０の有するがごとき強いβ−ラクタマーゼ阻害
活性を持っていない。

この発明のＭＭ４５５０は、固体のカルボン酸であり、
実質的に純粋なナトリウム塩の形で次の特性を有する。

１）水に易溶、メタノールに溶け、クロロホルム、ジエ
チルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。

１１）水溶液で、吸収極大を持った特有の紫外線吸収ス
ペクトルを有し、その吸収極大は約２３８ｎｍと約２３
７ ｎｍである。

［１１）新しく作ったＫＢｒディスク中０．４係（重量
／重量）含ませた際、殊に約３４５０．２９５０．１７
６５．１６９５．１５１０．１３９０と１２６０ｃｒｒ
Ｌ−１に吸収極大を有する特有の赤外線吸収スペクトル
を示す。

ＫＢｒディスクを調整約１週間後に再びスペクトルを測
定すると、かなり変化があり約１７６５ｃＩｒＬ−１の
大きなピークがかなり減少するか消失している。

ｔＶ） Ｄ２０中で測定した核磁気共鳴スペクトルは
殊に、（ａ）はぼ１５Ｈｚの結合定数を持ったほぼ２．
４５τと３．６５τに中心がある一対の低磁場二重線、
（ｂ）はぼ８．５５τに中心がある二重線、（ｃ）はぼ
７．９５τに鋭い一重線を有する。

Ｖ） スタフィロコッカス アウレウス、バチルスズ
ブチリス、ニジエリシア コリ、クレプシラエロゲネス
、プロテウス ミラビリス、アシネトバクタ−アニトラ
タス、セラチア マルセツセンス及びシゲラ ゾネイの
菌を含む各種の菌種に対し抗菌活性を有する。

■１）アンピシリンと混合して用いると、ニジエリシア
コリ、クレプシラ エロゲネス、プロテウス ミラピ
リス、プロテウス モルガニイ及びスタフィロコッカス
オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性を相
乗する。

ｖｌｌ）アミノ酸分析でこの物はポリペプチドや蛋白質
ではないことが示される。

酸性加水分解後α−アミノアジピン酸は見出されない。

ｖｉｉｉ）エールリッヒ試薬（３００ｍ９の４−ジメチ
ルアミノベンズアルデヒドを５４ｍ１のｎ−ブタノール
、９７７１１のエタノールと９ＴｒＬｌの濃塩酸の混合
液に溶解）に陽性で、ペーパークロマトグラムと薄層ク
ロマト板上で青色を示す。

ＩＸ）一般の酵素前ではなく、Ｅ、コリのβ−ラクタマ
ーゼを阻害するに必要な量より過剰濃度で、モノアミン
オキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ、ドーパデ
カルボキシラーゼ、トリプシン、キモトリプシン又はウ
レアーゼの各酵素を阻害しない。

セルロース上薄層クロマトグラフィーに付すと、ＭＭ４
５５０のジナトリウム塩は、次のようなおおよそのＲｆ
値を有する。

（ａ） ブタノール／イソプロパツール／水＝７ ニ
ア。

６ ： Ｒｆ＝０．６ （ｂ） イソプロパツール／水＝７ ： ３ ：Ｒｆ
＝０．７（Ｃ）ｎ−ブタノール／エタノール／水＝７：
７：６ ； Ｒｆ＝ ０．７ （ｄ） ｎ−プロパツール／水＝４ ： １ ；Ｒｆ
＝０．６シリカゲル（メルクＦ、２５４）上薄層クロマ
トグラフィーに付すと、ＭＭ４５５０のジナトリウム塩
は、次のようなおおよそのＲｆ値を有する。

（ｅ） ｎ−プロパツール／ Ｈ７の０．１モルリン
酸緩衝液＝７ ： ３ ； Ｒｆ＝０．６ （ｆ） ｎ−ブタノール／メタノール／水＝４：１：
２ ： Ｒｆ＝０．３４ ＭＭ４５５０のジナトリウム塩は、エシエリシ；アコリ
８１１のβ−ラクタマーゼに対し０．０００１以下の
■、。

（後述）を示す。ＭＭ４５５０（ｄストレプトマイセス
オリバセウスＡＴＣＣ３１１２６によって生産された
硫黄含有β−ラクタマーゼ阻害化合物として特徴付ける
ことができ、そのジナトリウム塩の水溶液では約２３８
ｎｍと約２８７ ｎｍに紫外部吸収極太を有する。

このスペクトルは図１に示される。あるいはＭＭ４５５
０は、その実質的に純粋なジナトリウム塩の形で新しく
作った０、 ４ ％ （重量／重量）ＫＢｒディスクで
の赤外線吸収スペクトルは、図２で示したごときであり
、且つ実質的に純粋なジナトリウム塩の形で新しく作っ
たＤ２０の溶液で測定した核磁気共鳴スペクトルは、図
３で示したごときである抗菌性剤として特徴付は得るも
のである。

かくしてＭＭ４５５０は式（Ｉ） で表わすことができる。

物質ＭＭ４５５０は、塩にしない酸の形では不安定であ
る傾向にある。

従ってこの発明でＭＭ４５５０の塩類を提供するのが好
ましい。

又ＭＭ４５５０の塩は２塩基塩であることが好ましい。

最も適切な塩類としては、ナトリウム、カリウム、カル
シウム、マグネシウム、アルミニウム、通常の置換アン
モニウムイオン類などの医薬的に受容なイオン類とで形
成された塩である。

特に適切な塩類としては、ナトリウム又はカリウム塩、
例えばジナトリウム又はジカリウム塩のようなアルカリ
金属塩である。

この発明によって提供されるＭＭ４５５０及びその塩類
としては、少なくとも５０係の純品であるのが適切であ
り、少なくとも７０係の純品であるのがより適切で、好
ましくは８０係純品例えば９０〜１ｏｏ４の純品である
ことである。

この発明によるＭＭ４５５０及びその塩は、医薬的に受
容な賦形剤と共に医薬組成物として用いることができる
。

最も適切な組成物としては、ＭＭ４５５０のナトリウム
塩又はカリウム塩例えばジナトリウム塩又はジカリウム
塩を含むものである。

かような組成物は、経口、局所又は非経口用に適する剤
型であってもよい。

例えば、錠剤、カプセル、クリーム、シロップ、調剤用
散剤や、注射もしくは注入に適する滅菌形態で使用しう
る。

このような製剤には希釈剤、結合剤、着色剤、矯味剤、
保存剤、崩壊剤のような通常の医薬的に受容なものをペ
ニシリン類及びセファロスポリン類のような抗生物質の
製剤化によく知られた通常の製剤プラクテイスに従って
含め得る。

ＭＭ４５５０又はその塩類は、それだけを含めた組成物
としてもよいが、β−ラクタム系抗生物質と一諸に製剤
化してもよい。

適切なβ−ラクタム系抗生物質にはβ−ラクタマーゼに
感受性があることが知られたものやβ−ラクタマーゼに
対しかなり強い固有の耐性を有するものを含む。

このようなβ−ラクタム系抗生物質としては、アンビシ
リン、アモキシシリン、ベンジルペニシリン、フェノキ
シメチルペニシリン、プロピシリン、セファロリジン、
セホキシチン、セファロチン、セファレキシン、カルベ
ニシリン、チカルシリン、及びカルベニシリン又はチカ
ルシリンのフェニル、トリルもしくはインダニルエステ
ル又はアンピシリン、ベンジルペニシリン、アモキシシ
リン、セファロリジン、セファログリシンなどのアセト
キシメチル、ピバロイルオキシメチルもしくはフタリジ
ルエステルのような生体内で加水分解しうるエステル類
を含む。

ＭＭ４５５０又はその塩とβ−ラクタム系抗生物質との
割合は通常１０：１〜１：１０、例えば３：１〜１：３
である。

単一の服用型に存在させる抗菌剤の全量は通常５０〜１
５０ダで、１００〜１０００１ｖが普通であろう。

好ましい単一服用組成物としては、泌尿管系、呼吸器系
、軟組織系などの疾患の治療に１日当り１回以上、例え
ば１日当り２〜４回投与しうるものである。

かくしで、組成物は気管支炎、淋炎、中耳炎、乳腺炎な
どの治療に用いうる。

この発明の一つの観点によれば、後述するごときＭＭ４
５５０（複合物、Ｃｏｍｐｌｅｘ）の溶液を実質的にＭ
Ｍ４５５０又はその塩の溶液よりなるフラクションと他
のフラクションにクロマトグラフィー的に分け、その溶
液からＭＭ４５５０又はその塩を分離することよりなる
ＭＭ４５５０又はその塩の製法が提供される。

ここで”実質的にＭＭ４５５０又はその塩の溶液よりな
る”フラクションとは、その溶液中に存在する抗生物質
がＭＭ４５５０又はその塩のみか又は他の抗生物質が存
在した際はＭＭ４５５０又はその塩より少なく存在する
ことを意味する。

ＭＭ４５５０又はその塩は、フラクション中の抗生物質
の７０係であるのが適切で、より適切には８０係、好ま
しくは９０〜ｌｏｏ％存在することである。

どのフラクションが本質的にＭＭ４５５０又はその塩の
みからなるかを決める適当な方法としては、各サンプル
の紫外部吸収スペクトルを測定することであることを見
出した。

図Ｉと類似の紫外部吸収スペクトルを示すフラクション
には、後述のＭＭ１３９０２のような他の抗生物質を実
質的に含まず、通常ＭＭ４５５０又はその塩を含む。

一般的に約２８５ ｎｍに明白な紫外部吸収極大を示す
フラクションは所望純度のものである。

上の方法は、通常ＭＭ４５５０をジ塩基性塩として単離
するのに使用される。

ＭＭ４５５０のモノ塩基性塩又は遊離酸のＭＭ４５５０
自体を必要とする場合には、一般にＭＭ４５５０のモノ
塩基性塩及び遊離酸のＭＭ４５５０はＭＭ４５５０（複
合物）のような混合物から分離するに充分な安定性を持
たないので、ＭＭ４５５０のジ塩基性塩を酸性化して作
ることができる。

モノ塩基性塩及び遊離酸は安定性が悪いため容易に得る
ことはできない。

前述したようにＭＭ４５５０のクロマトグラフ的分離は
ジナトリウム塩のようなＭＭ４５５０の塩を用いて行う
のが最良であると考える。

ＭＭ４５５０の塩類は高親油性溶媒より水性溶媒により
溶解するので、この発明に用いるクロマトグラフによる
精製には水性溶媒系を使用するのが好ましい。

はぼ中性に緩衝された電解質の水性溶液を塩基性イオン
交換樹脂のような極性支持体と共に使用するのが適当で
あることを見出した。

かくしてリン酸緩衝液のような通常の緩衝液で約ｐＨ７
にした塩化ナトリウムの水性溶液を第３級アミノ基又は
第４級アンモニウム基を含み得る支持体と共に使用する
ことができる。

塩基性イオン交換セルロース類及び塩基性イオン交換架
橋されたテキストラン類が適当な支持体であり、ＱＡＥ
セファデックス（登録商標名）Ａ２５が、０．７モルの
塩化ナトリウムのｐＨ７リン酸緩衝液よりなる溶媒系の
際に特に好適な支持体であることが見出された。

あるいは、水及び低級アルカノールのような水と混和し
つる有機溶剤からなる溶媒系をシリカゲル又はセルロー
スのような不活性支持体と共に使用するのに適すること
が判明した。

セルロースと共に使用するのに特に適当な溶媒系とは水
とインプロパツールの混合物、特にイソプＯ／々ノール
７：水３の混合物である。

しかしながら、イオン交換樹脂を用いる上記の操作によ
る製品は、食塩を多く含むことが多いので、集めた溶液
を脱塩するのがよい。

脱塩は、溶液を親油性物質を含むカラムに通すことによ
って行うことができ、そこでＭ４５５０は吸着され食塩
は吸着されない。

カラム用の適当な資材とじては、アンバーライトＸＡＤ
４のようなポリスチレン類が含まれる。

あるいはセファデックスＧ２５のような架橋デキストラ
ン類やバイオゲル（登録商標名）Ｐ２のようなポリアク
リルアミドゲル類のごとき濾過剤を使用してのゲル濾過
法も利用できる。

抗生物質は、水、水性メタノールなどを用いてカラムよ
り溶離させることができる。

上記の工程で所望の溶液が得られた際、緩和な条件下で
溶媒を除去することによりＭＭ４５５０のジ塩基性塩を
固体で得ることができる。

かような固体物を得るのに用い得る方法とじハ■４５５
０含有の集めたフラクションを減圧濃縮し、凍結乾燥す
ることがあることを見出した。

所望により上記の工程は２以上の段階に分けて行うこと
ができる。

例えば、ＭＭ４５５０（複合物）の溶液を他の抗菌剤の
それ自体の重量までまざったＭＭ４５５０又はその塩よ
りなるフラクションに分けることができ、フラクション
は例えばＭＭ４５５０又はその塩を約５０〜６０係含む
物を得るべく凍結乾燥でき、次いでこの物は例えばＭＭ
４５５０又はそ。

の塩を９０〜１００係含む物を得るべく再びクロマトグ
ラフィーに付すことができる。

この明細書で用語”ＭＭ４５５０ （複合物、Ｃｏｍ−
ｐｌｅｘ）”とはもともと英国特許第１，３６３，０７
５号でＭＭ ４５５０として表示した物を表すために用
４いられる。

同特許の実施例を繰り返して行い生産されたＭＭ４５５
０（複合物）は、ＭＭ１３０９２（後述）の塩類、ＭＭ
４５５０の塩類及びかなりの量の他の物質を各種割合で
含む不純物である。

ＭＭ４５５０（複合物）は、ＭＭ ４５５０の紫外線の
。

特異吸収を持たない。

英国特許第１，３６３．０７号の実施例の追試で得たＭ
Ｍ４５５０（複合物）のＩ、ｏ（後述）は通常０．００
０４ ｐｇ／ｍｌ以下ではない。

ＭＭ４５５０（複合物）中に存在するＭＭ４５５０の塩
類とＭＭ１３９０２の塩類の割合は、。

非常に変動していると思われ、使用した微生物の菌及び
／又は使用した正確な分離技術のような因子によるもの
と考えられるが、この複合物はＭＭ１３９０２よりＭＭ
４５５０をより多く含むことが一般的に見出された。

ＭＭ４５５０（複合物）の製。法は後の”解説”の項で
述べる。

この明細書で、用語“ＭＭ１３９０２”は強力な抗菌剤
であり、ある程度のβ−ラクタマーゼ阻害活性を有する
実質的に純粋な化合物を述べるのに用いられる。

ＭＭ１３９０２の性状は６解説”の項で後述する。

他の観点によれば、この発明はＭＭ４５５０及びその塩
類の製法を提供するもので、その製法はストレプトマイ
セス属のＭＭ ４５５０生産菌を培養し、その培養物か
らＭＭ４５５０又はその塩を採取することよりなる。

この方法においてＭＭ４５５０生産菌とは後述するごと
きストレプトマイセス オリバセウス及びその関連微生
物の菌である。

ストレプトマイセス オリバセウスのＡＴＣＣ２１３７
９：微工研寄託番号２９６０、ＡＴＣＣ２１３８０：微
工研寄託番号２９５６、ＡＴＣＣ２１３８１：微工研寄
託番号２９５７、ＡＴＣＣ２１３８２：微工研寄託番号
２９５８、ＡＴＣＣ３１１２６（＝ＡＴＣＣ２１３７９
／Ｍ３）：微工研寄託番号２９５５又はそれらの変異菌
が最も適当な微生物として使用される。

更にこの方法で使用するのに特に好ましい微生物は、ス
トレプトマイセス オリバセウスＡＴＣＣ３１１２６で
ある。

ここで使用した用語゛培養”とは、炭素、窒素、硫黄及
び鉱物塩類の同化性源の存在下に故意の好気性発育をさ
せることを意味する。

このような好気性発育は、固体又は半固体の栄養培地中
又は栄養源が溶解又は懸濁している液体培地中で行うこ
とができる。

好気的表面培養又は液内培養によって行うことができる
。

栄養培地を複合栄養物で作ってもよく又化学的に限定す
ることもできる。

酵母抽出物、大豆粉末などのような複合栄養源を含む培
地が特に好ましいことを見出した。

又コバルトイオン、硫酸イオン及び炭酸カルシウムの添
加がよいことも見出した。

２８±２℃の温度での培養が抗生物質の許容できる収率
を与え且つ醗酵開始後２〜３日でブロスを採取するのが
良い時期であることを見出した。

ここで使用した用語”変異株”とは、自然に生じるか又
は外部剤を故意に用いるか否かにかかわりなくその外部
剤によって生ずる変異菌を含む。

変異菌を作る適当な方法としては、Ｈ，１，アドラー氏
、国際原子カエネルギー局、ウィンでのシンポジウムの
議事録、１９７３年、１２４１頁の”工業用微生物に対
する照射と放射性同位元素”の中での「微生物の発展技
術」に述べられた方法を含むものである。

これには次のことが含まれる。１）イオン化照射（例え
ばＸ線やγ線照射）、紫外線光、紫外線光と感光剤（例
えば８−メトキシフソラレン）、亜硝酸、ヒドロキシル
アミンピリミジン塩基同族体（例えば５−ブロムウラシ
ル）、アクリジン類、アルキル化剤（例えばマスタード
ガス、エチルメタンスルホン酸塩）過酸化水素、フェノ
ール類、ホルムアルデヒド熱など。

１１）くみかえ、形質変換、形質導入、溶原化、溶原的
変換や突然変異用の選択的手法のような遺伝学的手法。

変異促進剤を用いると所望抗生物質の生産量を増す能力
のある微生物が作り得ることを見出した例えば、ストレ
プトマイセス オリバセウスＡＴＣＣ２１３７９（微工
研寄託番号２９６０ ）の培養物に照射し、次いで得ら
れる菌種を分離すると後述するようなＫＡＧ検定で最大
の活性ゾーンを生産するとみられるもので、ストレプト
マイセスオリバセウスＡＴＣＣ３１１２６の分離につな
がった。

この菌はこの発明に使用するのに好ましい菌である。

なおＡＴＣＣ３１１２６はオランダでＣＢ５１５５．７
５として寄託されている。

ストレプトマイセス オリバセウスとその関連微生物は
次の第１の特性を有する。

（ａ） 灰色又は黄色の胞子形成気生菌糸を有する。

（ｂ） 波形又は螺旋形の担胞子形態を有する。

（ｃ） 平滑な表面の胞子を有する。

（ｄ） メラミンを生産しない。

上記の特性を有する菌種には、表５〜９に記載したもの
を含む。

一般に所望の抗生物質を得るのに用いる全ての分離及び
精製法は例えば２０℃以下より好ましくは１２℃以下の
高めた温度ではなくて行う必要がある。

所望の製品は、通常培養濾液より多く得られるので、分
離工程の最初に、醗酵物より例えば濾過により固形物の
除去を行う。

ＭＭ ４５５０又はその塩の不純製品は、透明化した培
養濾液からＭＭ４５５０又はその塩を活性炭のような活
性物質に吸着させ次いでそれから水性アセトンのような
溶媒を用いて溶離させることにより得ることができる。

この工程は通常ＭＭ４５５０のジ塩基性塩について行わ
れる。

又は、ＭＭ４５５０又はその塩の不純製品を培養濾液よ
り、親油性アンモニウム塩と水非混和性溶媒とを用い抽
出することにより得ることができる。

これは上記の方法より有利であることが多い。

（ＭＭ４５５０は減圧下で有機溶媒を留去すると置換ア
ンモニウム塩として得ることができる。

）ＭＭ４５５０の置換アンモニウム塩の当初溶液を沃化
ナトリウムのような沃化アルカリ金属の溶液を用いて水
層に逆抽出するのが好ましい。

この最後の工程を変え一般に不純なＭＭ４５５０のジ塩
基性塩の水性溶液を作るのに用いられる。

上記したようなＭＭ４５５０又はその塩類の不純なもの
から、許容しうる純度の物を得るため前述のクロマトグ
ラフィーに付される。

次の解説は抗菌化合物の分離に有用な一般的情報を明ら
かにするものである。

又次の実施例はこの発明を例証するためのものである。

−解説１：Ｉ、ｏの決定 Ｉ５０値は、ニジエリシア コリ Ｂｌｌのβ−ラクタ
マーゼ酵素（この微生物はＲ因子で制御されたβ−ラク
タマーゼを含む）によりアンピシリンの加水分解を５０
係阻止するに必要な物質の量である。

β−ラクタマーゼは、リッチモンドとスキーズＣＡｄｖ
、 ｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、 Ｐｈｙｓｉｏｌ、 ９
．３１（１９７３））の分類によれば、タイプＩＩＩａ
の酵素に入る。

アンピシリンからそのベニシロ酸へのβ−ラクタマーゼ
加水分解の割合は、澱粉・ヨード滴定検定により分かり
、その一つの方法でベニシロ酸の生成割合が澱粉・ヨー
ド複合物の脱色で分かる。

この方法及びβ−ラクタマーゼの製法は、Ｍ、コール、
Ｓ、エルソンとＰ、Ｄ、フルフ宅ツクの報告（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ １９７２．１２７
、２９５〜３０８）に記載されている。

上記の方法の少し改良として、阻害剤のサンプルは基質
のアンピシリンを添加する前３７℃で１５分間酵素と予
め培養した。

その操作は次の通りであった。試薬 緩衝液：０．０５モル、 ｐＨ７’）ン酸カリウム緩衝
液澱粉／ヨード液二ノビツクＣＢｉｏｃｈｅｍ、 Ｊ−
（１９６２）８３，２３６）記載の方法で調整基質：緩
衝液中アンピシリン４０μ９／ｒｕｌβ−ラクタマーゼ
酵素：コールら（Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｊ、（１９７２）１２７．２９５〕記載の方法に従いＥ
、コＩＪ Ｂ １１より調整。

緩衝液中の酵素製品の希釈は、未阻止反応で１００秒当
り約０．３の光学濃度単位の低下を来たすようにした。

他のＥ。コリのβ−ラクタマーゼ生産菌を用いることが
でき、特にこれらの菌はＲ因子例えばＲ−ＴＥＭを伝達
する。

条件 反応は３７℃で１σのキュベツト中で５ｐｓｏ。

パイ ユニカム分光光度計を用い行った。

これは。４つのサンプルのキュベツトと対応するブラン
クで行うことができる。

最初のキュベツトを対照の反応に使用し、阻害剤を含め
なかった。

第２〜４のキュベツトは各種希釈の阻害剤に用いた。

反応は、５９０ ｎｍにおける光学濃度を記録しながら
、３〜６分間隔で１００秒当りの光学濃度の変化をみて
反応速度を測定しつつ行われた。

阻害剤サンプルは、阻害剤を加えない対照での反応割合
の５０係に達する迄希釈した。

解説２ ：ＫＡＧ検定 ＫＡＧ検定は、醗酵ブロス中又は分離工程中でのβ−ラ
クタマーゼ阻害剤の存在を決める方法である。

４５℃のモルトン栄養培地にクレブシラエロゲネスの適
当なβ−ラクタマーゼ生産菌を接種し、次いで寒天中ペ
ニシリンＧが６μｇ／ｒｎｌの濃度になるのに充分な量
のペニシリンＧ滅菌液を混合する。

次いで寒天をペトリ皿に注ぎ、固化後滅菌金属カッター
を用い寒天層に等しい空間をもった円筒ウェルを入れる
。

テスト溶液をウェルに導入する。

次いでこの皿を２７°Ｃ〜３７℃の一定温度で培養する
。

培養期間中、テスト溶液中の阻害剤をウェルから寒天中
へ拡散させ、そこでクレブシラのセルから生産されたβ
−ラクタマーゼの作用が阻止される。

かくして、ペニシリンＧはβ−ラクタマーゼによる分解
から保護され、クレブシラの発育を防ぐに充分な濃度で
存在する。

寒天のこの部分に阻害剤が充分な濃度に拡散しないとク
レブシラの高密度の発育を許し、β−ラクタマーゼによ
りペニシリンＧが分解される。

クレブシラ発育の明白な円形の阻止帯が阻害剤を含むウ
ェルの周囲に形成される。

各阻止帯の大きさは、テスト溶液中の阻害剤の濃度に従
属する。

テスト溶液の力価（任意単位／Ｔｎｌ）は帯の直径に対
する阻害剤の対数濃度の標準線を参照して得られる。

この検定系はパイオートグラフィーに用いることもでき
る。

解説３ ：英国特許第１，３６３，０７５号に開示され
た物と比較できるＭＭ４５５０（複合 物）の製法 ストレプトマイセス オリバセウスＡＴＣＣ２１３７９
をロークス瓶中の固形寒天斜面上で２８℃で７日間生育
させた。

寒天培地の組成は次の通り。

酵母抽出物は、英国・バートンオントレンド・ウニリン
グトンロードのボブリル・フッド・イングレジエンツ社
より供給の１イーテツクス”を用い、寒天は英国・Ｓ、
Ｅ、１０ンドン・サウスワークブリッジロードのオキソ
イド社より供給のものを用いた。

）培地は滅菌前にｐＨ６，８に調製した。

ｏ、ｏ２４のツウイン８０（ポリオキシエチレン・ソル
ビタン・モノオレエート）含有の５０ｒｒＬｌ滅菌脱イ
オン水をロークスびん培養物に加え、胞子を振盪して懸
濁液とした。

この胞子懸濁液を接種材料として１００１のステンレス
鋼製の醗酵釜に入れた７５１の滅菌種段階用培地に加え
た。

種段階用培地の組成は次の通りである。

９０ ｄ千 旦０１
／）（大豆粉末は英国・マンチェスター・オールドトラ
フオードのプリティシュ・アルカデー社製のアルカソイ
５０を用いた。

）発泡をおさえるために滅菌前の醗酵培地に大豆油中ｔ
ｏ４（容量）のプルロニックＬ８１（登録商標名）の５
０−を加えた。

〔プルロニックＬ８１ハ英国・Ｗ、 ３ ロンドン・
ザバーレ２３１のヤコブセン・ファン・デン・ベルク・
ニー・ケー社より供給されたもので、エチレンオキシド
とプロピレンオキシドのブロック重合体である。

〕培地を醗酵槽中で１２０℃で２０分間蒸気滅菌した。

種段階培養液を８．５インチ直径の翼付皿攪拌機を用い
３４０ ｒ、 ｐ、ｍ、で攪拌し、開放式スパージャ−
を通して１５０ ｌ／ｍｉｎの滅菌空気を導入した。

培養器にはバッフルプレートを装備した。２８℃に調整
しこの条件下で４５時間培養後に、この種培養液の７．
５１を、３００１のステンレス鋼製の醗酵釜に入れた１
５０１の滅菌醗酵培地に接種液として入れた。

醗酵培地の組成は次の通り。発泡防止用に大豆油中１０
係のプルロニックＬ８１を３００ｍ１加えた。

４８時間後に醗酵物を取り遠心分離で澄明にした。

この澄明にしたものは、１００．０００の１の希釈度で
の酵素検定で５０係の阻止をした。

これの１００１１を１２ｋｇ（湿重量）ワットマンＤＥ
３２イオン交換セルローズのアセテート型（英国・Ｅ、
Ｃ，４０ンドン・ニューブリッジストリート、Ｈ，リー
ブ・アンセル社製。

ジエチルアミノエチル基で置換された微細結晶性セルロ
ーズ）と攪拌した。

スラリーを濾過し、０．５モル硫酸カリウム１２ｎでＭ
Ｍ４５５０（複合物）を溶離させた。

溶出液を減圧下３０℃以下でクライミング・フィルム蒸
発器中で６１に濃縮、１２１のアセトン添加で多量の硫
酸カリウムを沈澱させ、沢液を３０℃以下減圧下で２０
０１１Ｌｌに濃縮した。

濃縮液をアンバーライトＸＡＤ−４［脂（ロームアンド
ハース社製、非イオン系ポリスチレン樹脂）の７６龍Ｘ
２ｍ塔に通し、脱イオン水で溶離させ、溶出液を１４０
７ｄのフラクションに集めた。

ＫＡＧ検定により検出された活性フラクションを集め（
２，２１）、アミコンＵＭ＝０．５膜（直径１５０ｍ＋
ｍ英国・ハイワイコブ・クイーンロード５７、アミコン
社製）を用いるウルトラ濾過で６０Ｐ、Ｓ、１．窒素気
流中２７５ｍ１に濃縮した。

濃縮物を凍結乾燥し、褐色粉末（ｌ５ｏＯ，００４μμ
ｇ／ｍｌ ） ２．２ ｇを得た。

この粉末１ｇを０．２モル硫酸す） ＩＪウム１１に溶
解し、ジクロルメタン中２係（重量／容量）のテトラ−
ｎ−ブチルアンモニウム・ハイドロゲン・サルフェート
（スウーデンのＡＢ、アストラ社製）の１１と混合した
。

ジクロルメタン層を分け、７０℃に冷却し、濾過して氷
を除去し蒸発で２０Ｍに濃縮した。

４０〜６０℃の石油エーテル４００威を加え、遠心分離
で沈澱物を集めた。

沈澱物を１０−のジクロルメタンに再溶解し、沃化バリ
ウム８０〜と炭酸バリウム７０〜含有の１０麻の水で抽
出した。

層を分離し、水層を濾過しｐＨ６，５に調製した。

溶液を凍結乾燥し黄色粉末を得た。固体をアセトンで洗
浄し、過剰沃化バリウムを溶出させ淡黄色の固形物を遠
心分離で採取し減圧乾燥した。

収率１３ｍ＆（ｌ５ｏＯ，０００４μｇ／１ｒＬｌ）解
説４ ：英国特許第１，３６１，０７５号記載の物を得
るに有用な培養濾液の炭素吸着の例 示 解説３で得られた培養濾液は、穴あき板状寒天拡散抗菌
検定でクレブシラ エロゲネスに対しゾーンの直径１７
ｉｔｍを与えた。

ＫＡＧ検定でゾーンの直径３８ｉｎで’５０は１００，
０００のＩ希釈。

５℃の清澄培養濾液１７０１を９インチ直径のカラムで
活性炭（英国のプアーボーン・ケミカル社製のファーネ
ルＢＯ１６０〜８０メツシュで１規定塩酸で予め洗浄、
リン酸塩でｐＨ６に緩衝）を１６インチの高さにつめた
ものに通し毎分８００〜１０００ｍの上昇流動で浸出さ
せた。

プリューを脱イオン水１０１で洗浄し、カラムは２０℃
で２０係アセトンで溶離させた。

１０１に至る活性フラクションを３０℃以下で減圧濃縮
し６１にし、凍結乾燥してｌ５ｏＯ，０５ｐ、ｇ／ｍｌ
を示す粗製ＭＭ４５５０（複合体）２８：１１を得た。

酵素阻害活性の回収率は２２係であった。

ダルコグラニュラー炭素（英国のハネ−ウィル・アタラ
ス社製）を用いて活性炭処理を行っても同様な結果が得
られた。

解説５ ：英国特許第１，３６３，０７５号記載の物を
得るに有用な培養濾液のイオン交換樹脂 クロマトグラフィーの例示 内径１ｃＩｒＬのカラムに６ ｃｍ （床容量４．７
ｗｔｌ ）の高さにダウエックス２１にイオン交換樹脂
（英国・ドルセット・ボールのＢ、Ｄ、Ｈケミカル社製
、塩基性基含有ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂、
２０〜５０米国メツシュでクロリド型）をつめた。

次いでこれを５係水性メタノールでほぼ４．７ｍｌで４
回及び蒸留水４．７ＴＬｌで１回洗浄した。

解説３で記載したごとき方法で得られた２１の培養濾液
をカラムに通した。

次いで５０係水性メタノールで洗浄し不純物を除去した
。

５０係水性メタノール中５係の食塩でＭＭ４５５０（複
合物）を溶離させた。

下記の表１は活性単位の用語で得られた結果を示すもの
である。

培養濾液中のＭＭ４５５０（複合物）の含量は、任意に
８単位／１ｒＬｌにされた。

カラムからの溶出フラグジョンは、クレブシラ エロゲ
ネスに対する抗菌拡散法を用い検定し、その活性単位は
、培養Ｐ液の各種希釈液の単位／ｒｒｌｌに対してゾー
ン直径をプロットして作った標準線（培養濾液を標準と
して用いた）を参照して算出した。

カラム法がＭｌｌ／Ｉ４５５０（複合物）の濃縮に効果
的な方法であったことが判るであろう。

フラクション２〜５が全量わずか３７ｒｒＬｌで活性の
６０係を含んでいた。

このフラクションの全乾燥重量は約２１０■であり、従
って３５ｇの固形物がカラムに添加されたことになる。

表１ グラエクス２１Ｋを用いてのクロマトグラフィーの結果 解説６ ：英国特許第１，３６３，０７５号記載の物を
得るに有用な培養濾液のイオン対抽出 の例示 硫酸ナトリウム２４８ｇを解説３で記載された方法で作
った清澄培養濾液１０Ａに加え、その溶液をジクロルメ
タン中２係テトラｎ−ブチルアンモニウム ハイドロゲ
ン スルフアート１０１で３０分攪拌しつつ抽出した。

層を分離し、ジクロルメタン層を２°Ｃに冷却した。

ワットマンＡ１２８紙を通し少量の懸濁水を除去した。

ジクロルメタン溶液を３０℃以下で減圧濃縮し２０１ｒ
Ｌｌとした。

４００ｍ１の石油エーテル（４０〜６０℃）を加えると
ＭＭ４５５０（複合物）含有のゴム状物が沈澱した。

これを遠心分離で集め、５０ｗＬｌのジクロルメタンに
再溶解し、１ｇの沃化バリウムとＩＩの炭酸バリウム含
有の水５０ｍ１で２分間振とうし抽出した。

固形分を濾別し、二つの層を分離し、バリウム塩として
ＭＭ４５５０（複合物）を含有する水性層をｐＨ６，５
に調整、凍結乾燥した。

それにより、Ｉ５０が０．００１ ｐｇ／ｍｌの粗製Ｍ
Ｍ４５５０（複合物）を３１７即得た。

解説７ ：テトラｎ−ブチルアンモニウム ハイドロゲ
ン スルフアートを使用して ＭＭ４５５０とＭＭ１３９０２含有の部分精製された抗
生物質複合物の製法 解説４に従って作られたＭＭ４５５０（複合物）の粗製
品１２．５ｇを水１２５ｍＪに再溶解し、１０係（重量
／容量）テトラｎ−プチルアンモニウムハイドロゲン
スルフアートのジクロルメタン溶液１２５ｒｒＬｌで抽
出した。

分離したジクロルメタン層を１９０■の沃化ナトリウム
含有の２℃の水１００ｍ１を用いゆっくり攪拌しつつ且
つ水層を２係炭酸水素ナトリウムでｐＨ６，４に調整し
つつ逆抽出した。

溶液を凍結乾燥し、乾燥固体をアセトン洗浄して、Ｅ、
コリβ−ラクタマーゼに対し１５６０１０００２８ｇを
持つＭＭ４５５０とＭＭ１３９０２のナトリウム塩が混
った製品８８〜を得た。

抗生物質の回収率は７０係。アンピシリンと解説７で得
た物との混合物の抗菌力を栄養寒天中希釈法で測定した
。

得られた最低発育阻止濃度は表２の通りである。

アモキシシリンとＭＭ４５５０（複合物）の混合物でも
上記と同様な相乗効果が認められた。

解説８ ：セチルジメチルベンジルアンモニウムクロリ
ドを使用してのＭＭ４５５０と ＭＭ１３９０２含有部分精製抗生物質複 合物の製法。

解説４で記載されたごときファーネル炭素カラムからア
セトン・水で溶離させたもの、凍結乾燥品（Ｉ、ｏ＝０
．０２μ９／ｍｌ）を蒸留水に溶解し、１３■／ｍｌの
濃度とし、ｐＨ６，５に調製した。

この溶液１００ ｒｕｌを０．１４セチルジメチルベン
ジル アンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液の等
量で抽出した。

遠心分離で層を分け、有機層を再びｏ、ｏ５％沃化ナト
ＩＪウム溶液１００７ｒＬｌで逆抽出した。

層を分離し、水層に残存するジクロルメタンを減圧下１
０分間で除去した。

水層を凍結乾燥し、乾燥品を５０ｍＡ’のアセトンで３
回洗浄した。

アセトン洗浄の製品を真空乾燥器中で乾燥し、淡褐色粉
末（４，３ｒｒｕ；１ 、 Ｉ、ｏ＝ｏ、ｏ ｏ ２ｄ
／ｍＪ）を得た。

解説９ ニゲル濾過を使用してＭＭ４５５０とＭＭ１３
９０２含有部分精製抗生物質複 合物の製法 解説４の方法で作った粗製ＭＭ４５５０（複合物）ｌ５
ｏ＝０．２μｇ／ｒｎｌの１ｇを溶離剤としてアセトン
／水工４二６を用いセファデックスＧ２５（上級品）で
クロマトグラフィーに付した。

カラムの大きさは２．５ｃｒｒＬ×３２ｃＩｒＬで溶離
は毎分１．５ｍｌで行った。

活性フラクションを集め、３０℃以下で減圧濃縮し、凍
結乾燥して無晶形の淡黄色固体（■５゜＝ｏ、ｏ Ｏ５
ｐｇ／ｍ１）２２ｍｇを得た。

回収率８８係で４０倍に精製された。

解説１０ ：セルロース・クロマトグラフィーを使用し
てＭＭ４５５０とＭＭ１３９０２含有精製抗生物質複合
物の製法 解説７で作られたＭＭ４５５０（複合物）６１０■を溶
離剤としてイソプラパノール／水＝７：３（容量）を用
い、セルロース（ワットマンＣＣ３１）をつめた２、５
ｃｒｒＬ×３２ｃＩｒＬのカラムでクロマトグラフィー
に付した。

溶離速度は毎分１．５ｍ１０抗菌活性を示すフラクショ
ンを合せ、３０℃以下で減圧濃縮、凍結乾燥して抗生物
質複合物（■５゜＝ｏ、ｏ ｏ ｏ ０７ ｐＨ／ｍｌ
）の褐色無晶形固体４０〜を得た。

Ｉｎ２が非常に小さい値であることは活性物質の純度が
改善されたことを示す。

別の機会に、上記の操作を行いｌ５ｏ＝０．００１μｇ
／ｍｌの物を得た。

これらの抗菌活性を表３に示す。

抗菌活性は光接種を用いるオキソイド感性ブロス（１係
の一夜ブロス）で標準微量適定法で測定した。

解説１１ ：ＭＭ１３９０２は次のような性質を認め
ることができる。

ＭＭ１３９０２は酸性の固体でそのナトリウム塩の形で
は次の特性を有する。

ｉ）水に易溶、メタノールに溶解、クロロホルム、ジエ
チルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である。

１１）水溶液で、吸収極大を持った特有の紫外線吸収ス
ペクトルを有し、その吸収極大の一つは約３０５ ｎｍ
である。

１ｉｉ）新しく作ったＫＢｒディスク中０．４％（重量
／重量）含ませた際、殊に約３４５０．２９５０゜１７
５０．１６２０，１５１０，１４００と１２６０Ｃｒｒ
Ｌ−’に吸収極大を有する特有の赤外線吸収スペクトル
を示す。

！Ｖ） Ｄ２０中で測定した核磁気共鳴スペクトルは
、殊に（ａ）はぼ１４Ｈｚの結合定数を持ったほぼ２．
８５ｒと４．０Ｏｒに中心がある一対の低磁場二重線、
（ｂ）はぼ８．５５ｒに中心がある二重線、及びほぼ８
．０Ｏｒに鋭い一重線を有する。

Ｖ） スタフィロコッカス アウレウス、バチルスズ
ブチリス、ニジエリシア コリ、クレブシラエロゲネス
、プロテウス ミラビリス、サルモネラ テイフイ及び
シュードモナス エルギノーザの菌を含む各種の菌種に
対し抗菌活性を有する。

ｖｌ）アンピシリンと混合して用いると、ニジエリシア
コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラビ
リス、プロテウス モルガニイ及びスタフィロコッカス
オウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性を相
乗する。

ＭＭ１３９０２の純ジナトリウム塩はβ−ラクタマーゼ
阻害剤で、ニジエリシア コリＢｌｌのβ−ラクタマー
ゼに対し０．００１μ９／ｙｎｌと０．０００１μｆｉ
／ｍｌの間の１．。

（後述）を示す。セルロース上薄層クロマトグラフィー
に付すと、ＭＭ１３９０２の純ジナトリウム塩は、次の
ようなおおよそのＲｆ値を有する。

ａ、。

ｎ−ブタノール／イソプロパツール／水＝７＝７＝６（
容量） ： Ｒ４＝０．７２ ｂ、イソプロパツール／水＝７：３；Ｒｆ＝０．８５ ｅ、 ｎ−ブタノール／エタノール／水＝７：７：６
： Ｒ４＝０．８１ ｄ、 ｎ−プロパツール／水＝４ ： １ ；Ｒｆ＝
０．７５゜ かくしてＭＭ１３９０２は式（■）： で表すことができる。

解説１２ ：微生物 最初ＡＴＣＣ２１３７９、ＡＴＣＣ２１３８０゜ＡＴＣ
Ｃ２１３８１とＡＴＣＣ２１３８２（これらはスペイン
、ニューシーラント、南画及びイスラエルでそれぞれ得
られた土壌サンプルから分離）の培養物にＭＭ４５５０
（複合物）が生産されていることを見出した。

我々の研究所では、これらの培養物は同じであると思わ
れ、かつボウスフイルド博士、スコツトランド・アベル
デーン・ドーリ−リサーチステーションのザ・ナショナ
ル・コレクション・オブ・インダストリアル・バクテリ
ヤ（ＮＣＩＢ）の放線菌の専問家により、ツユ−ター氏
の広く知られた１９６７年の分類〔Ｓ１カルジヤー、バ
ーセルのシステマチック・デル・ストレプトマイセチン
、３８２頁〕を用い全てストレプトマイセスオリバセウ
スと同定された。

以後にＭＭ４５５０生産が表５にみられるような他のス
トレプトマイセス属の菌種にも見出された。

Ｓ１オリバセウスはワックスマン氏により１９１９年に
記載された〔カルチュアル・スタデーズ・オブ・スピー
シズ・オブ・アクチノマイセス、フィル、サイエンス、
８．７１〜２１５〕。

続いて１９６０年にソ聯の研究グループが非常によく似
た特長を持った菌種を報告し、それをアクチノマイセス
（ストレプトマイセス）フルボビリデスと命名した〔ク
ユーシエバら、Ｔｒｕｄ、 Ｉｎ５ｔ。

Ｍｉｋｒｏｂｉｌ、 Ａｋａｄ Ｎａｕｋ、 ５ＳＳＲ
０ｔ ８ ｔ ２２６〜２５３（１９６０））。

ストレプトマイセス属の微生物は、その生育条件により
形態学的及び生理学的特性が非常に異にするものである
。

多くの菌種についての記述は、その大きな相異があるこ
とを認識する以前になされており、結果的に重複や同義
語があるとツユター氏（１９６７年）は２５種をＳ、フ
ルボビリデスを含むＳ１オリバセウスと同義語であると
している。

命名と分類の混同を解消すべく、１９６２年にシャーリ
ングらによるザ・インターナショナル・ストレプトマイ
セス・プロジェクト（ＪＳＰ）が始った（Ｉｎｔ、 Ｊ
、 ５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １８゜６
９〜１８９（１９６８））。

このプロジェクトで協力者らが標準条件下でのストレプ
トマイセスの菌種の正確な記述をする一連の研究を行っ
た。

このテーマにより、Ｓ、オリバセウスやＳ、フルボビリ
デスを含む約４００の命名された菌種の代表釣菌に標準
的な記載が作られた。

Ｓ。

オリバセウスとＳ、フルボビリデスについてのこのプロ
ジェクトによる記載は、二つの特性のみが異なっている
。

即ち１）担胞子体の形態と１１）唯一の炭素源としてイ
ノシトールの利用能。

Ｓ、オリバセウスは次のように記載されている。

胞子鎖形態二液形（Ｒｅｃｔｉｆ １ｅｘｉｂｉｌｅ）
部分を暗示する屈曲性の胞子鎖から漸次う つり変る開放螺旋形を持つ螺旋形 部分。

成熟胞子鎖は一般に長く、１つの鎖当り５０以上の胞子
を持 つことが多い。

炭素利用性＝Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、ｉ−イノシ トール、Ｄ−マニトール、Ｄ−フ ルクトースとラムノースを生育に 利用する。

シュクロースとラフィノースには全くの生育を認めない かこん跡の生育しか認めない。

Ｓ、フルボビリデスについて次のように記載されている
。

胞子鎖形態二液形部分、成熟胞子鎖はやや短かく１つの
鎖当り１０〜５０の胞子 をもつ。

炭素利用性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−マニト ール、Ｄ−フルクストースとラム ノースを利用。

シュークロースの利用は疑問。

ｉ−イノシトール又はラフィノースは全く生育を認め ないかこん跡の生育しか認めない。

Ｓ、オリバセウス又はＳ、フルボビリデス及び他の関聯
菌種と同義語と命名された一連のカルチャーを標準的方
法及び培地を用いて測定した〔前掲ＩＰＳで推奨された
シャーリングらＩｎｔ、 Ｊ。

５ｙｓｔ、 Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、 、 １６ 、３１
３〜３４０（１９６６）参照〕。

カルチャーが異なるソースより得られた。

ＡＴＣＣ２１３７９，２１３８０，２１３８１，２１３
８２をＭＭ４５５０（複合物）の生産をもとにして土壌
より分離した。

比較目的に他の菌種を各種のカルチャーから得た。

ＭＭ４５５０（複合物）の生産、気生菌糸の色、担胞子
体の形、基質菌糸の色、溶解色素産生、メラミン産生及
び炭素利用の試験結果を表５〜９に示す。

全ての菌種について電子顕微鏡下で胞子表面はなめらか
である。

ＩＳＰ記述よりＳ、オリバセウスの担胞子体の螺旋状生
育は変りやすい特性であることが明らかである。

真正の螺旋をＳ。オリバセウス即ちＡＴＣＣ３３３５の
タイプに観察された。

担胞子体の大部分は長い。

ＡＴＣＣ２１３７９。２１３８０．２１３８１又は２１
３８２の培養物に担胞子体は長く波形の背景の中で螺旋
状の傾向を示したが、真正の螺旋が観察されなかった。

しかし、二つのＳ、オリバセウス菌即ちＮＣＩ Ｂ８２
３８とＮＣＩＢ８５０９では大部分の担胞子体は波形で
あった。

ＮＣＩ ８８２３８では中間の長さで、ＭＣＩＢ８５０
９は長かった。

Ｓ、フルボビリデスの典型釣菌のＡＴＣＣ１５８６３か
ら観察された担胞子体はＡＴＣＣ２１３７９，２１３８
０，２１３８１，２１３８２゜３１１２６のものより短
かく唯一の波形であった。

これらの特性からみてＡＴＣＣ２１３７９゜２１３８０
．２１３８１，２１３８２，３１１２６はよく一致する
が正確にはＳ、オリバセウスの記述に一致しない。

ＡＴＣＣ２１３７９，２１３８０，２１３８１，。

２１３８２．３１１２６はイノシトール利用性でいくら
か変化を示しこれはＳ、オリバセウスとＳ。

フルボビリデスとのＩＳＰの典形的菌種の記述によると
異にする特性である（表８参照）。

ＡＴＣＣ３１１２６とＡＴＣＣ２１３８０はイノシトー
ル４を利用し、これは、Ｓ、オリバセウスの特性であり
、一方他の菌種は利用性が疑しいか陰性である。

しかし、一つの炭化水素の利用能をみて種を分けること
は一般に満足し得るものではない。

このような差異は、一つの遺伝子の突然変異で生ずるか
。

も知れないし、菌株の意味であると考えられることがよ
くある。

Ｓ、オリバセウスのＮＣｌ８８１３８゜ＮＣＩＢ８５０
９．ＡＴＣＣ２１５４９，ＡＴＣＣ１２０１９及びＡＴ
ＣＣ３３３５の糖料用性の差異を多くの権威者は、それ
らは種を異にすると考えないと示唆している。

かくして、ＡＴＣＣ２１３７９゜２１３８０．２１３８
１，２１３８２，３１１２６はＳ、オリバセウスとして
表わすのが適当とみえる。

現在Ｓ、オリバセウスとＳ。

フルボビリデスと命名されたものにより重要な差異が見
出されない限り、これらは国際的に一つの種と認められ
る可能性があろう。

この場合、正しい名前は先行規定によってＳ。

オリバセウスであろう。これは又ツユター氏がＳ、オリ
バセウスと同義語として挙げたものもこれに含まれるで
あろう。

ＭＭ４５５０（複合物）生産用のＳ、オリバセウス及び
その関聯菌の培養濾液の試験は次のように行うことがで
きる。

即ち、リストした菌の培養濾液をワットマン屑１紙の原
点に２０μｌスポツトし、冷時−夜をかけてｎ−ブタノ
ール：イソプロパノール：水＝７＝７＝６でクロマトグ
ラフィーをした。

別の組でｎ−ブタノール：氷酢酸：水層１２：３：５を
用い同じく冷時−夜をかけて行った。

部分精製したＭＭ４５５０（複合物）のサンプルを同時
に二つの系で展開した。

又は２５ｍ１の清澄培養プリューをジクロルメタン中ｏ
、２％のセチルジメチルベンジルアンモニウム クロリ
ド液１２．５ｍＡで抽出し、層を分け、有機層を残し、
０．５係の沃化ナトリウム溶液２．５１ｒＬｌを加え、
振盪、分離、水層を残し、これをクロマトグラフィーに
付す。

例えば薄層クロマト片に５μスポツトし、ｎ−ブタノー
ル：イソプロパノール：水＝７：７：６で展開する。

Ｓ、オリバセウスＡＴＣＣ２１５４９゜ ＡＴＣＣ１２０１９及びＡＴＣＣ３３３５はＭＭ４５５
０ （複合物）を生産しなかった。

なお上記の各画と微生物工業研究所での寄託番号（受理
番号）との関係は次の通りである。

表９ Ｓ、オリバセウス、Ｓ、フルボビリデス及びその関連菌
の炭素利用性 ＋＝化合物が利用されたことを示す。

−一化合物が利用されなかったことを示す。

±＝利用性が疑わしいか非常に少ないことを示す。

実施例 Ｉ ＭＭ４５５０ （複合物）の製法とＭＭ４５５０とＭＭ
１３９０２への分離 解説の項で説明した分離操作を各種の順序で利用できる
。

特に必切な順序とは下記のような活性炭吸着、イオン対
抽出とセルロースクロマトグラフィーである。

解説３で得たような培養濾液３４０１をファーネルＢＯ
炭素をつめた塔（直径９インチ×高さ２１インチ）に毎
分８００〜１２００ｒＩＬｌの上昇流で通した。

炭素はＭＭ４５５０（複合物）の吸着前に使用されたも
ので、次の試薬で洗浄し再生した。

０．５規定水酸化ナトリウム、０．２規定水酸化ナトリ
ウム：アセトン−３：２、水、１規定塩酸、水、ｐＨ６
のリン酸緩衝液、水。

カラムを水２０！！で洗浄し、培養濾液を除き、アセト
ン：水＝２：８（容量）を毎分２００〜２５０ＴｒＬｌ
流下させて溶離させた。

１１のフラクションを集めた。

ＭＭ４５５０（複合物）含有のフラクションをクレブシ
ラエロゲネスを用いての抗菌拡散検定で検出し、これを
集め（１１１）、８０℃以、で減圧濃縮して５．５１と
した。

この段階のＭＭ４５５０（複合物）の回収率は２０係で
あった。

濃縮物を２°Ｃに冷却し、−５℃のジクロルメタン中２
係（重量／容量）のテトラｎ−ブチルアンモニウム ハ
イドロゲン スルフアート５．５１を加え、２つの層を
２分間混合した。

ジクロルメタン層を分離し、０℃の０．６係沃化ナトリ
ウム溶液の１１を加えた。

２層をゆっくり攪拌した。水層を２係炭酸水素ナトリウ
ム水溶液で除々にｐＨ６，５〜７．０に調整した。

水層を分離、凍結乾燥した。

乾燥固体を乾燥アセトンで抽出して、過剰の沃化ナトＩ
Ｊウムを除去し、次いで不溶性残渣から減圧下でアセト
ンを除去し淡黄色粉末１．１ｇを得た。

この段階でのＭＭ４５５０（複合物）の一貫回収率は１
０係であった。

培養濾液中に溶解していた全固形物にもとづいての精製
度合は、１２５倍であった。

２、５ ｃｍ直径のカラムに、イソプロパツール：水＝
７：３容量比中セルロース粉末（ワットマンＣＣ３１）
を３２ｃｒｒＬの高さに詰めた。

５００ｒｒ１９の淡黄色粉末をイソプロパツール：水＝
７：３容量比の２ｍｌに溶解し、同じ溶媒を用い１分間
１．５１ｒＬｌの流速でクロマトグラフィーをした。

３ｍｌのフラクションを集め、約２８５ ｎｍに紫外部
吸収極大を示すものを合し、濃縮・凍結乾燥してＭＭ４
５５０（複合物）を得た。

上の実験で、約２８５ ｎｍに吸収を示すフラクション
には酵素阻害・抗菌活性を示す物質が含まれていること
を認めた。

凍結乾燥したＭＭ４５５０（複合物）の収率は３５■で
あった。

水晶は、褐色無晶形で■５ｏ＝０．０００１μ９７ｍｌ
を有した。

この段階での活性物質の一貫回収率は３係で、通算６０
０倍に精製された。

この製品の抗菌活性を光接種物を用いるオキソイド感光
テストの標準微量滴定法で決めた。

得られた最小発育阻止濃度は前述の表３に示したものと
類似であった。

この製品を展開剤としてｎ−ブタノール：イソプロパノ
ール：水（７：７：６）を用いセルロース（イーストマ
ンコダック社“クロマトグラム”シート）上での薄層ク
ロマトグラフ分析で２つの活性物質に分離され、その１
つはほぼＲｆ＝ ０．５８でＭＭ４５５０と同定し、は
ぼＲｆ＝ ０．７２のものはＭＭ１３９０２と同定した
。

この両物質は、Ｂ。。ズブチリス、Ｓ、アウレウス（オ
クスホード）、Ｓ、アウレウス（ペニシリン耐性菌）、
Ｅ、コリ・（ペニシリン感受性及び耐性菌）、サルモネ
ラティフィムリウム、プロテウス ミラビリス、プロチ
ウム モルガニとクレブシラ エロゲネスを含む各種微
生物でパイオートグラフィーで検出できる。

得た結果を表４に示す。更に実験を行ない、２つの物質
をセルロース薄層クロマト上でインプロパツール：水（
８：２）で展開し分離、リン酸緩衝液で溶出した。

各抽出液のβ−ラクタマーゼ阻害を検定し、両物質共Ｅ
。

コリのβ−ラクタマーゼ阻害剤であることが判明１した
。

又両物質共に、エロゲネスに対しベンジルペニシリンと
相乗作用することが判明した。

実施例 ２ ＭＭ４５５０（複合物）の製法とＭＭ４５５０とＭＭ１
３９０２の分離 Ｓ、オリバセウスＡＴＣＣ３１１２６を５℃、ｐＨ６，
５での醗酵から得られた培養濾液１，１００１を６ダル
コ”顆粒炭素を詰めたカラム（０，３ｍＸ１ｍ）に毎分
３，２１で通した。

〔炭素はＭＭ４５５０（複合物）の吸着に前に使用され
たもので、０．５規定水酸化ナトリウム０．２規定水酸
化ナトリウム：アセトン（３：２）、水、１規定塩酸、
水、リン酸緩衝液（ｐＨ６）、水の順序で洗浄再生して
から用いた。

〕カラムを６０Ａの水で洗浄し、培養濾液を除去、次い
でアセトン：水（２：８容量比）を用い３０℃で毎分１
．１１で溶離させた。

６０７を集め続いて５Ｘ１０ ｌのフラクションを得た
。

Ｋ、エロゲネスを用いる抗菌拡散検定で検出したＭＭ４
５５０（複合物）含有フラクションを集め（４０１）、
３０℃以下減圧下で３２１に濃縮した。

この段階でのＭＭ４５５０（複合物）の回収率は１５係
。

濃縮物を５℃に冷却し、１６１のｏ、２％セチルジメチ
ルベンジルアンモニウムクロリドのジクロルメタン溶液
（５℃）を加え、２つの層を５分間混合した。

ジクロルメタン層を分離し、０．４係沃化ナトリウム溶
液（５℃）３．７５１を加えた。

２つの層を５分間混合、水層を分離、凍結乾燥した。

乾燥固体を乾燥アセトンで抽出し、過剰の沃化ナトリウ
ムを除去し、残存固体を減圧乾燥し淡黄色粉末２．８７
ｇを得た。

この時点でのＭＭ４５５０（複合物）の一貫回収率は６
係であった。

培養濾液中の全溶解固体より算出した精製度合は１６０
倍であった。

６３５ｍ直径のカラムにインプロパツール：水（７：３
容量比）中のセルロース粉末（ワットマンｃｃ３１）を
３００ｗｇの高さに詰めた。

２．ｏｇの淡黄色粉末をイソプロパツール：水（７：３
）５罰に溶解し、同じ溶媒で１分間３ｍｌでクロマトグ
ラフィーを行った。

Ｋ、エロゲネスに対する検定で、ＭＭ４５５０ （複合
物）含有フラクションを取り、３０℃以下で減圧濃縮し
、凍結乾燥して２０７■の褐色固形物を得た。

この際のＭＭ４５５０（複合物）の回収率は５１係であ
り、精製は５倍であった。

１６ｉｃｉＥ直径のカラムにｎ−プロパツール：水（４
： １容量比）中のセルロース粉末（ワットマンｃｃ３
ｔ）を３００ｉｎの高さに詰めた。

１９８Ｔｎ９の褐色固形物を水：ｎ−プロパツール（１
：１）に溶解し、ｎ−プロパツール：水（４：１）で１
分間０．５ ｍｌの流速でクロマトグラフィーを行った
。

６ｍｌのフラクションを集め、Ｋ、エロゲネスに対し微
生物検定した。

各フラクションの紫外部スペクトルを測定した。

フラクション２３〜２８は約３０５ ｎｍの紫外部吸収
極太を有し、ＭＭ１３９０２のジナトリウム塩を含有し
た。

このフラクションを集め、減圧濃縮、凍結乾燥し３０■
の固形物を得た。

水晶バイーストマン・コダック社セルロース板を用い、
ｎ−プロパツール：水（４：１容量比）での薄層クロマ
トでＲｆＯ，７７に唯一の抗生物質活性を有するゾーン
を示した。

このゾーンはバシルス ズブチリスでパイオートグラフ
ィーにより検出した。

フラクション２９〜４０は、約２８５ｎｍに紫外部吸収
極大を示しＭＭ４５５０を含有した。

これらを集め、減圧濃縮、凍結乾燥し５３■の固形物を
得た。

このものは少量のＭＭ１３９０２の塩が混入したＭＭ４
５５０の塩を含有した。

実施例 ３ ＭＭ４５５０製造の好ましい分離法 Ｓ、オリバセウスＡＴＣＣ３１１２６の胞子を乾燥剤付
密封容器内の乾燥土壌チューブ中に２０℃において保存
した。

少量の土壌貯蔵物（はぼ２０〜）を次の培地１００１ｒ
Ｌｌ含有の５００ｍＪエルレンマイヤーフラスコに無菌
的に移した。

組 成 量９／ｌ グルコース１水和物 ２０．０ 大豆粉末 ｉｏ、。

脱イオン水を加えて １１ 滅菌前にｐＨを６．５に調製した。

大豆粉末は、英国・マンチェスター・オールドストラド
フォードのプリティシュ・アルカデー社の６アルカソイ
５０”を用いた。

フラスコは回転式振盪機上（２４０ｒ、ｐ、ｍ）２８℃
で約３０時間培養した。

２ｍｌの得られる発育生成物を”ロークス″ビンの傾面
固形寒天に接種した。

寒天培地の組成は次の通り。組 成
量 Ｖ−８野菜ジュース２０．０ｍｌ 寒天 ２０．１ 脱イオン水を加え １１ 滅菌前にｐＨを６．０に調整した。

Ｖ−８ジユースは英国・ノルフォーク・キンゲスレイン
のキアンベルス・スープ社より得たものである。

接種物はビンを振動さすことにより寒天表面に拡げられ
、次いでまっすぐの状態で３０℃で培養した。

２日間培養後、過剰の液体をピペットで除去し更に４日
間培養を行った。

“ロークス”ビン培養物のこの製法を採用すれば、傾向
培養物にアクチノファージが起るのが抑制されることは
すでに見出されている。

ｏ、ｏ２％ツウイーン８０含有の滅菌脱イオン水５０ｍ
Ａ！を゛ロークス”ビン培養物に入れ、振とうして胞子
を懸濁させた。

この胞子懸濁液を１００４ステンレス鋼製醗酵釜に入れ
た７５１の滅菌種つけ培地に接種した。

種つけ培地組成は次の通り。組 成
量＆７１ 大豆粉末（アルカソイ５０） １０．０グルコ
ース１水和物 ２０．０飲料水を加え
１１発泡抑制のため、１０係（
容量）゛プルロニックＬ８１”大豆油溶液５０ｍ１を滅
菌前の醗酵培地に添加した。

培地を１２０°Ｃで２０分間醗酵釜中で蒸気滅菌した。

種つけ培養物を、７．５インチ直径の羽根型攪拌機を用
い１４０ ｒ、 ｐ、ｍ、で攪拌し、開放末端スパージ
ャ−を通して滅菌空気を毎分７５１供給した。

温度は２８℃に調節し、この条件下で４８時間培養させ
た後、２０００１ステンレス鋼製じゃま板付醗酵釜に入
れた１ ５００１の滅菌醗酵培地に容器の内容物を接種
した。

醗酵培地の組成は次の通り。

組 成 量（９／ｌ ）大豆粉末（ア
ルカソイ５０） １０．０グルコース１水和物
２０．０白あ（沈降炭酸カルシウム）０．
２ 塩化コバルト（ＣｏＣ１２・６Ｈ２０） ００ＯＯ
１硫酸ナトリウム（無水）１．０ 飲料水を加えて １５００７滅菌前に水酸
化ナトリウムでｐＨを６．０に調整した。

１ｏ４“プルロニックＬ８１”大豆油液３１を滅菌前に
発泡防止に加えた。

滅菌後、滅菌水酸化ナトリウム溶液で再びｐＨ７，０に
調整した。

二つの１９インチ直径の羽根器付攪拌機を１０６ｒ、ｐ
、ｍ、に攪拌した。

温度を３０°Ｃに調節し、空気流量毎分１２００１で醗
酵を行った。

６０時間後に醗酵物を取り出し、遠心分離で澄明化した
。

上記の生産物は、任意に３４０単位／ｍｌに定められた
。

検定は解説２記載の方法を用いた。１０℃、ｐＨ８の培
養濾液１０５０Ａｌ’（３４０単位／ｌ）をセチルジメ
チルベンジルアンモニウム クロリド１２０（Ｂｉ’含
有のジクロルメタン３１０１を用い１０℃で、予め決め
た流速でインラインミキサーを通し二つの液体をポンプ
で送り抽出した。

層をシャープレス連続遠心分離で約２分間混合して分離
した。

ジクロルメタン層３００１を水性沃化ナトリウムで抽出
した。

この逆抽出は、２１０ｇの沃化す） ＩＪウム含有の全
量７１の水を用い４つのバッチで行った。

層は比重で分けた。

水層を希塩酸でｐＨ７，７〜７．０に調整し、濾過した
。

沃化ナトリウム抽出液７１には２１，９００単位／１ｒ
Ｌｌを含有した。

１０ｃｒＩＬ直径のガラス製カラムに食塩（０，３モル
）含有のｐＨ７ＩＪン酸緩衝液（０，０５モル）中のＱ
ＡＥセファデックスＡ２５（ファーマシア社製）を４０
ｃＩｒＬの高さに詰めイオン交換樹脂塔を作った。

５℃の沃化す） ＩＪウム抽出液（７１）を毎分５０ｍ
１の速さでこの塔に入れた。

ｐＨ７の０．０５モルリン酸緩衝液中０．７モル塩化ナ
トＩＪウム溶液で毎分２５１１の流速で５℃において溶
離させた。

２ノの溶出液を捨て、９０のフラクション（１００ｒＬ
ｌ）を集めた。

このフラクションを紫外分光々変針で検出し、約２８５
ｎｍに吸収極太を示すこれらのフラクションを取り、
ｐＨ７に調整した。

（フラクション２５〜３５は１，２３０ｍ１で、７１，
０００単位／ＴＬｌであった。

）この領域に吸収極太を有するフラクションはＭＭ１３
９０２を含有したことを前に示した。

この集めたフラクションに塩化ナトリウム（５ｆｉ／１
００ｍ１）を加え、５°Ｃにおいて、６．３ｃｒＩＬ直
径のカラムにアンバーライトＸＡＤ４ｍ 脂（ローム・
アンド・バース社製）を３０ｃｍの高さに詰めたものに
毎分２０ｒｒｔｌの流速で通した。

抗生物質は無機の不純物がなくこれらの条件下で樹脂に
吸着される。

抗生物質を室温で蒸留水２００ｍ１次いで５０係水性メ
タノールを用い溶離させた。

溶出液１１を３０℃以下で減圧濃縮し、７０ｒＩＬｌと
し、ｐＨ７に調整、凍結乾燥すると２．１１の褐色固形
物が得られた。

このものは３．１００単位／■活性を有する部分精製さ
れたＭＭ４５５０の塩であった。

部分精製のＭＭ４５５０ジナトリウム塩０．５５ｇをセ
ルロースカラム（４，５ｃｒｒＬＸ ２９ｃＩｒＬ、ワ
ットマンＣＣＢＩセルロース）でｎ−プロパツール／水
（４：１容量比）を用い毎分２．５ ｍｌの流速でクロ
マトグラフィーを行った。

溶出液の最初の１３５＊ｍｌを捨て、１５１ｒＬｌのフ
ラクションを集めた。

ＭＭ４５５０ジナトリウム塩含有フラクション（紫外線
吸収で測定）は９０ｒｆＬｌになった。

これを３０°Ｃ以下で減圧濃縮してｎ−プロパツールを
除去し、次いで凍結乾燥して８７ダの黄色粉末（活性６
．６００単位／■）を得た。

１係 このものはＥ −＝約２４０を持ち、約２８５ｃｒｆＬ ｎｍに紫外部吸収極大を示した。

又このものは図２及び図３のような赤外線及び核磁気共
鳴スペクトルを有した。

抗菌活性は表１０に示す通りである。

元素分析により、ことに窒素、硫黄、ナトリウムを含み
、その割合即ちＮ：Ｓ：Ｎａはおおよそ２：２：２であ
った。

ＭＭ４５５０のジナトリウム塩についての円偏光２色性
曲線の正及び負極大を通路長さ１ｃｒｒＬＸ濃度０．３
７〜／ｄで記録計付きカリ−・６１分光偏光光度計で測
定した。

その結果は次の通りであった。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図及び第３図は、ＭＭ４５５０のジナトリ
ウム塩についての紫外線吸収スペクトル、赤外線吸収ス
ペクトル及び核磁気共鳴スペクトルをそれぞれ示すもの
である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 抗生物質ＭＭ４５５０を産生しうるストレプトマイ
   セス属に属する微生物を培養し、培養物からＭＭ４５５
   ０（複合物）を採取し、その溶液をクロマトグラフィー
   的にＭＭ４５５０又はその塩の溶液から実質的になるフ
   ラクションと他のフラクションに分別し、溶液から実質
   的に純粋なＭＭ４５５０又はその塩即ち １）水に易溶、メタノールに溶け、クロロホルム、ジエ
   チルエーテルと炭化水素類に実質的に不溶である、 １１）水溶液で、吸収極太を持った特有の紫外線吸収ス
   ペクトルを有し、その吸収極大は約２３８ｎｍと約２８
   ７ ｎｍである、 １ｉｉ）新しく作ったＫＢｒディスク中ｏ、４％（重量
   ／重量）存在する際、殊に約３４５０．２９５０．１７
   ６５．１６９５．１５１０．１３９０と１２６０ｃＩＩ
   Ｌ−１に吸収極太を有する特有の赤外線吸収スペクトル
   を示す、ＫＢｒディスクを調整約１週間後に再びスペク
   トルを測定すると、かなり変化がみられ約１７６５ｃｒ
   ｒＬ’の大きなピークがかなり減少するか消失している
   。 ＩＶ）Ｄ２０中で測定した核磁気共鳴スペクトルは殊に
   、（ａ）はぼ１５Ｈｚの結合定数を持ったほぼ２．４５
   ｒと３．６５ｒに中心がある一対の低磁場二重線、（ｂ
   ）はぼ８．５５ｒに中心がある二重線、（ｃ）はぼ７．
   ９５ｒに鋭敏な一重線を有する、Ｖ） スタフィロコ
   ッカス アウレウス、バチルスズブチリス、ニジエリシ
   ア コリ、クレブシラエロゲネス、プロテウス ミラビ
   リス、アシネトバクタ−アニトラタス、セラチア マル
   セツセンス及びシゲラ ゾネイの菌を含む各種の菌種に
   対し抗菌活性を有する、 ■１）アンピシリンと混合使用すると、ニジエリシア
   コリ、クレブシラ エロゲネス、プロテウス ミラビリ
   ス、プロテウス モルガニイ及びスタフィロコッカス
   アウレウス ラッセルを含む微生物に対する活性を相乗
   する、 ｖＩＤ アミノ酸分析でこの物はポリペプチドや蛋白
   質ではないことが示される、酸性加水分解後α−アミノ
   アジビン酸は見出されない、 Ｖｊｉｉ）エールリッヒ試薬（３００１ｎｆｌの４−ジ
   メチルアミノベンズアルデヒドを５４ｍ１のｎ−ブタノ
   ール、９１ｒＬｌのエタノールと９−の濃塩酸の混合液
   に溶解）に陽性で、ペーパークロマトグラムと薄層クロ
   マト板上で青色を示す、 ｉＸ）一般の酸素前ではなく、Ｅ、コリのβ−ラクタマ
   ーゼを阻害するに必要な量より過剰濃度で。 モノアミンオキシダーゼ、カルボニックアンヒドラーゼ
   、ドーパデカルボキシラーゼ、トリプシン、キモトリプ
   シン又はウレアーゼの各酵素を阻害しない、を分離する
   ことを特徴とする抗生物質の製法。