JPS5817203B2 - パ−ルジヨウシンスイセイポリマ−ノ セイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素用担体、蛋白質の分離、精製用担体
などと１〜て使用されるパール状親水性ポリマーの製造
方法に関する。

固定化酵素用担体、蛋白質の分離、精製用担体としてこ
れ丑でに使用さ゛れているものを大きく分類すると次の
よう（でなる。

（１） でん粉、セルロース、デキストラン及びその
誘導体などから得られる天然ポリマー。

（２） ポリアクリルアミド、ポリアミノポリスチレ
ン、アミノ酸共重合物、無水マレイン酸−エチレン共重
合物、ポリメタアクリル酸などから得らｆする合成ポリ
マー。

（３）多孔性カラス、活性炭、アルミナ、酸性白土など
の無機物。

これらの中で酵素の固定化の簡便さ、蛋白質の分離、精
製などの容易さから（１）の天然物及びその誘導体、例
えばテキストランの架橋体であるセファテックス（スウ
ェーデン、ファルマシア社商品名）やアカロースの架橋
体であるセファローズ（スウェーデン、ファルマシア社
商品名）などがアフイニテイクロマトグラフイーとして
好んで使用されることが多い。

しかし７これ゛ら天然物から得られる担体は一般に機械
的強度の点で（２）の合成ポリマーの担体に劣るため大
規模な装置で使用する際破壊ない［〜圧縮によりその性
能を十分に発揮しにくい。

（３）の無機物については機械的強度は十分であるが水
溶液中での取扱いに親水性の点で難がある。

本発明は（１）の天然ポリマーの利点を生きし、機械的
強度を（２）の合成ポリマーで補いさらに合成ポリマー
をパール状化することによりカラス、に充填した場合の
流出液の抵抗を改良することを主たる目的としたもので
あり基幹ポリマーと（〜で分子内−ＣＯＮＨ２を有し、
かつ該アミド結合重たはカルバモイル基の窒素原子の全
部゛または一部がメチロール化されているパール状ポリ
マーを使用し、これに分子内に水酸基を２個以−Ｌ有す
る化合物を酸性下グラフト化して新規なパール状親水性
ポリマーを得ることを要旨とする。

本発明の詳細な説明すると基幹となるパール状合成ポリ
マーとし、ではたとえ、ば次のものが挙げられる。

（ａ） ポリアクリルアミド寸たはポリメタクリルア
ミドをホルマリン処理して得られる部分Ｎ−メチロール
化ポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミド。

（ｂ） メチレンビスアクリルアミドのような架橋剤
存在下で得られるポリアクリルアミドまたはポリメタク
リルアミドをホルマリン処理して得られる部分Ｎ−メチ
ロール化ポリアクリルアミドまたはポリメタクリルアミ
ド。

（ｃ） Ｎ−メチロールアクリルアミドまたはＮ−メ
チロールメタクリルアミドの重合体。

（ｄ） メチレンビスアクリルアミドのような架橋剤
存在下でＮ−メチロールアクリルアミドまたはＮ−メチ
ロールメタクリルアミドを重合して得られる重合体。

（ｅ） ８−ナイロン、６−ナイロンなどをホルマリ
ン処理して得られる部分Ｎ−メチロール化８−ナイロン
、６−ナイロンなど。

これら基幹となるパール状合成ポリマーのうち６−ナイ
ロン等については重合後ポリマーを溶融してパール状に
成形することもできるが、一般には重合溶媒、分散剤、
反応条件等を適当に選択してモノマーを重合することに
よりパール状のポリマーを得ることができる。

重合溶媒とし７ては重合性モノマーを溶解する溶媒及び
有機溶媒を併用するのが好ましい。

重合性モノマーを溶解する溶媒としては上記有機溶媒に
不溶性のものが好ましく特に水が適当である。

非プロトン性の極性溶媒は有機溶媒に可溶性であり好ま
しくない。

有機溶媒としては、上記重合性モノマーを溶解する溶媒
として水を使用した場合には、水と均一に混和しないも
のであれば何でもよい。

たとえばベンゼン、トルエンなどの芳香族炭化水素、ｎ
−ヘキサン、ｎ−ヘプタンなどの脂肪族炭化水素、四塩
化炭素、モノクロルベンゼンなどのハロゲン化炭化水素
、メチルイノブチルケトンなどのケトン類、イソアルミ
エーテルなどのエーテル類あるいはこれら２以上の有機
溶媒の混合溶媒等を挙けることができる。

つぎに分散剤は重合中特にポリマー粘度の上昇した重合
末期に於て重合性モノマーの溶解した水溶液を有機溶媒
中に安定に分散させるために必要である。

分散剤としては水溶液を有機層に乳化させることなく分
散させるものなら何でもよい。

たとえばソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノス
テアレート、ソルビタンジステアレート、ソルビタンモ
ノオレエート ソルビタンセスキオレート、ソルビタン
トリオレエート等のソルビタン脂肪酸エステル類などの
非イオン系界面活性剤を挙げることができる。

なおポリビニルアルコールやポリエチレングリコールな
どの親水性界面活性剤はソルビタン脂肪酸エステルなど
の親油性界面活性剤より劣る。

分散剤は重合性モノマーに対し重量比で通常１〜０，０
１好ましくは０５〜０．０５使用される。

重合は重合性モノマー、架橋剤、イソプロピルアルコー
ルなどの分子量調節剤、緩衝溶液などを水に溶解し、こ
の水溶液に分散剤を含む有機溶媒を加え、窒素まだはア
ルゴンなどの不活性ガスを導入して系内の酸素を置換し
ながら水溶液を有機溶媒中に十分に分散させることによ
って行われる。

重合開始剤は重合性モノマー等を含む水溶液に直接添加
しても、また分散処理を行った後に添加してもよい。

水溶液と有機溶媒の容量比（浴比）はパール状重合物の
粒径の大きさに影響を与える。

即ち必要とするパール状重合物の粒径にあわせて容量比
を任意に選ぶことができるが通常水溶液量：有磯溶媒喰
は１：９９から５０ ： ５０ （容積比：に変化し得
る。

パール重合体の粒径の大きさをコントロールする因子は
上述した浴比の他に有機溶剤の種類（殊に粘度、比重）
分散剤の種類及び量、攪拌速度、重合開始剤の種類及び
濃度反応器形式、反応温度等である。

これらを規定することにより任意の大きさのパール状重
合体を得ることができる。

パール状重合体を得るだめの反応温度、反応時間等は通
常の溶液重合系の場合のそれと全く同一である。

重合反応後、分散剤は使用した有機溶媒で数回繰返して
洗浄することにより容易にポリマーから除去することが
できる。

反応条件とパール状重合体の粒径との関係はイオン交換
樹脂として使用されているポリスチレン−ジビニルベン
ゼン系ポリマーに於て知られている相関関係と同一であ
るが要約すると次のとおりである。

このようにして得られるパール状の合成ポリマーをグラ
フト化すると目的とするパール状の親水性ポリマーが得
られる。

グラフト化に使用される分子内に水酸基を２個以上有す
る化合物としてはたとえば次のものが挙げられる。

（ａ）糖類 （ｉ） 単糖類 ぶどう糖類 （ｂ）糖アルコール ツルピント グラフト化の反応溶媒としては、基幹ポリマー及びグラ
フト化する糖類、糖アルコールなどが溶解又は膨潤しや
すい溶媒が適当であり、この点で水が最も好ましくその
他非プロトン性極性溶媒であるジメチルスルフォキサイ
ド、ジメチルホルムアミドなども使用できる。

グラフト化反応は酸性（ｐＨ０，１〜６５）で進行する
ので、触媒としては酸性試薬であれば種類を問わず、種
々の有機、無機の酸性試薬が使用できる。

なお、酸性下ではＮ−メチロール基同志の縮合脱水反応
が進行するので、グラフト化反応時にこの反応による架
橋も進行する。

一般に反応は次のようにして行われる。

基幹ポリマーとグラフト化する糖類、多価アルコール、
糖アルコールなど（これらはあらかじめ水などの溶媒に
均一に溶解しておく）を溶媒中で混合し均一にする。

この場合、架橋した基幹ポリマーのように溶媒に溶解し
にくいポリマーを使用する場合は、膨潤状態で糖類、多
価アルコール、糖アルコールなどと均一になじませる。

使用する原料の量比は、基幹ポリマーのＮ−メチロール
基１個当りアルコール性水酸基が０．１〜１００個、好
ましくは０．２〜５０個含捷れるように置部して、グラ
フト化反応は行われる。

この比が小さすぎるとグラフト化反応が十分に行なわれ
ず、まだこの比が太きすぎると未反応の糖類、糖アルコ
ール、多価アルコールなどが多量に残存して経済的に不
利である。

次に触媒として使用する酸性化試薬としては有ａｔ性化
試薬、例ぐ−ばパラトルエンスルフォン酸、トリフルオ
ロメタンスルホン酸などのスルフォン酸誘導体、酢酸な
どのカルボン酸誘導体が挙げられ、無機酸性試薬として
は、例えば硫酸、塩酸、硝酸、リン酸、ホウ酸、ホウフ
ッ化水素酸、ケイフッ化水素酸、過塩素酸などの強酸、
弱酸試薬を挙げることができる。

これらの有機、無機酸性試薬は２以上混合して使用する
こともできる。

使用量は特に規定されないが反応液のｐ、 Ｈが酸性側
、好ましくは１〜６．５になるように酸性試薬を使用す
る。

その他塩化アンモニウム、塩化叱鉛、硝酸亜鉛、硫安等
の酸性の塩類を使用してもよい。

ｐＨがこの値より小さくなると基幹ポリマー及びグラフ
ト化する糖類、糖アルコールなどの分解が起り、一方こ
の値より大きくなるとＮ−メチロール基の反応性が減少
してグラフト化反応が進行しなくなる。

次いで、以上のようにして調製した基幹ポリマー及びグ
ラフト化する糖類、多価アルコール、糖アルコール等な
らびに酸性試薬の存在する水溶液から水分を除去する。

一般に水存在下ではグラフト化反応は進行しないからで
ある。

水分除去法としては通常行なわれるどの方法を使用して
もよい。

例えば加熱蒸発、減圧脱水及びベンゼン、トルエンなど
の水と共沸する第３成分の添加による共沸脱水方法が採
用できる。

十分に水分を除去した後、加熱してクラフト化する。

加熱温度は加熱時間と相関するが、一般に５０〜１５０
°Ｃ１好ましくは８０〜１２０℃であり、加熱時間は１
分〜５時間、好ましくは２分〜２時間である。

加熱が不十分であると（加熱温度が低く、加熱時間が短
い場合）グラフト化反応は十分に進行しない。

一方加熱しすぎるとグラフト化ポリマーは分解する恐れ
がある。

グラフト化によってグラフト化試剤は苓幹ポリマーにエ
ーテル結合し７、グラフト化ポリマーは水に不溶性とな
る。

以−Ｌのように加熱処理して得られた反応物を溶媒とし
て使用した水などで十分に洗浄すると未反応のグラフト
化試剤（糖類、多価アルコール、糖アルコール等）およ
び触媒に使用した酸性試薬は溶解（〜で除去できる。

残渣を乾燥すると目的とするパール状のグラフト化ポリ
マーを得ることができる。

得られたグラフト化ポリマー＆ｉ 一般ニパール状を保
持しているが乾燥中にパール状粒子が相等に付着し形状
の変化することがある。

この場合これを粉砕すれば、パール状を破壊することな
く独立法を得ることができる。

この、にうにしてポリアクリルアミドやナイロンルバモ
イル基−ＣＯＮＨ２を有する親水性の合成ポリマーをＮ
−メチロール化したパール状の変性ポリマーにアルコー
ル性水酸基を有する糖類、糖アルコール、多価アルコー
ル等をグラフト的に化学結合させることにより新規のパ
ール状親水性ポリマーを製造できる。

得られたパール状の親水性ポリマーは既述のとおり各種
担体とし２て使用されるがこれをカラムに充填した場合
、カラムに空隙を生じるため無定形ポリマーに比し流出
抵抗が減少ｌ、極めてスムーズに流出液を流出させるこ
とができる。

本発明のパール状親水性ポリマーはグラフト末端のＯＨ
基を利用してさらにブロムシアン（ＢｒＣＮ）で処理す
ることにより種々の酵素の固定化が可能であり、その他
蛋白質の分離、精製などに使用できる。

さらに本発明で得られたポリマーは、その末端ＯＨ基を
処理し７てイオン交換基を導入することにより、親水性
イオン交換樹脂としても使用できる現在この種の担体と
して広く弔いらねているセファデックス、セファロース
の原料は、デキストラン、アガロースなどであり、前者
は微生物によってのみ生産され、寸だ後者は寒天より得
られるがいずれも高価である。

一方、本発明によるパール状親水性ポリマーはパール状
合成ポリマーおよび容易に人手可能な天然物等を原料と
するが、いすねも低圃格で製）告１可能である。

次に本発明を参考例、実施例及び試験上１１によって具
体的に説明するが、その要旨を超えない限り、本発明は
これら実施例に限定されない。

参考例 １ 架橋したポリアクリルアミドの合咬 内容債３１のセパラブルフラスコにアクリルアミド４０
，９を採って脱イオン水２００ｍ１に溶解させこれに１
％酸性リン酸２ナトリウム （Ｎａ２ＨＰＯ４）水溶液２０ａ９及び゛メチレンヒス
アクリルアミド０．４９を１７＋］、ｔ、た。

一方トルエン１０００ｍ、ｌ：にソルビタンジステアレ
ー）１０１ｒ溶解した溶液を上記フラスコ中にゆっくり
攪拌しながら加えた。

窒素ガスを液中に泡出して反応液及び反応器内を十分に
窒素置換した後１％過硫酸カリウム水溶液１−０ｍ１を
ｊ）Ｄ、＋−て容器を閉じ電磁攪拌しなから昇温を開始
した。

反応器内か４０〜，１５℃になると重合が始呼つだ。

３時間５０°Ｃに保持した後生成ポリマーをトルエンで
十分洗浄し分散剤を除去した後アセトン及び水で洗浄を
くり返した。

このポリマーを５０°Ｃで真空乾燥すると白色パール状
ポリマーが定量的に得られた。

参考例 ２ Ｎ−メチロール化ポリアクリルアミドの合成（ホルマリ
ン処理による方法） 上記の方法に従って得られた架橋し７たパール状ポリア
クリルアミド５０．ＣＮ９を脱イオン水２０００ｍ７！
中に分散した後０．５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液を添加
して分数液のｐＨを１０．９に調節した。

これにパラホルムアルデヒド４６．１を加えて攪拌して
後室温に静置し７た。

時々攪拌しながら室温で４８時間放置後反応液をアセト
ン中に移しポリマーを析出させた。

析出しだポリマーを再び水中で膨潤させた後にこれをア
セトン中に移しだ。

この操作を２回繰返して精製した後５０°Ｃでこのポリ
マーを真空乾燥すると白色パール状ポリマーが５９２ｇ
得られた。

参考例１及び２で得られたポリマーの元素分析値は次の
通りであった。

この結果から窒素を基準にして考えると反応によって炭
素、水素、及び酸素はそれぞれ０．８４゜１．６７及び
０．８３個だけ増加した。

即ちＣＨ２Ｏの付加が確認され、反１芯率は炭素数の増
加から算出すると８４係であった。

参考例 ３ Ｎ−メチロール化ポリアクリルアミドの合成（Ｎ−メチ
ロールアクリルアミドを重合子ろ方法） Ｎ−メチロールアクリルアミド責綜合化学■）製品）Ｃ
Ｈ２−ＣＨＣＯＮＨＣＨ２０Ｈ（メチロール化率９８．
２８係）５０．０ｇを内容積３１のセパラブルフラスコ
に採って脱イオン水２００ＴＬｌに溶解させこれに１係
酸性リン酸２ナトリウム水溶液（Ｎａ２ ＨＰＯ４）
２５ ＆及びメチレンビスアクリルアミド０．！ｌを加
えた。

一方トルエン１０１００Ｏにソルビタンジスデアレート
１０ｇを溶解した溶液を上記フラスコ中に添加した。

ゆっくり攪拌しながら（攪拌速度２５Ｏｒ、ｐｏｍ）ア
ルゴンを液中に流出して反応液及び反応器内を十分に脱
酸素しだ後１係過硫酸カリウム水溶液５０ｍ１を添加し
５０°Ｃで３時間反応させた。

反応後析出物をトルエンで十分に洗浄し分散剤を除去し
た後アセトン洗浄及び水洗浄を繰返した。

上記析出物を再度アセトン中に移して脱水して後、これ
をジメチルホルムアミド中に移し、膨潤させてからアセ
トンを加えて脱水及び脱ジメチルホルムアミド処理を行
ない５０°Ｃで真空乾燥するとパール状の白色ポリマー
が４０９得られた。

得られたポリマーの粒径を篩別法で測定すると１４９μ
以下のパール状重合物２５．３ｇ、１４９〜２５０μの
重合物７．２ｇ、２５０μ以上の重合物６°Ｏｇｌその
他１．５ｇであった。

参考例 ４ Ｎ−メチロール化６−ナイロンの合成 内容積１ｉのセパラブルフラスコに３７％ホルマリン水
溶液１９５．！ｌ及び塩化カルシウム３４ｇを採り、こ
れに硫酸を加えてｐＨを０．１に調節した後、パール状
６−ナイロン（Ｍｎ、 ＝ １．３８ Ｘｌ ０”
） １０．０ｇを添加し、この反応液を攪拌しつつ９０
℃に２時間保持した。

粉末は時間とともに相互に付着し反応液上に浮」ニジた
。

反応後沢過、水洗し酸性炭酸すｌ−ＩＪウムで中和した
。

さらに水洗して弾性のあるパール状白色ポリマーを得た
。

乾燥によるＮ−メチロール基同志の縮合反応をさけるた
めに湿潤状態で冷蔵庫に保存した。

得られた白色ポリマー及び原料の６−ナイロンの元素分
析値は次の通りであった。

この結果から窒素を基準にして考え−ると反応によって
炭素、水素及び酸素の増加が確認されＣＨ２Ｏの付加が
起っていた。

炭素数の増加から反応率を算出すると５６係であった。

実施例 １ 参考例２で得られたパール状のＮ−メチロール化ポリア
クリルアミド４．Ｏｇをぶどう糖２］、、４．？及び塩
化アンモニウム２．０ｇを含む脱イオン水１００ｍｇ中
に分散し、減圧下５０℃で水を除去しさらに５０℃で２
４時間真空乾燥して十分に脱水した。

さらに得られた混合物を８０℃で１時間加熱してぶどう
糖と反応させた後十分に水洗して未反応のぶどう糖及び
触媒である塩化アンモニウムを除去し残りを５０℃で真
空乾燥すると白色ポリマーが７．８ｇ得られた。

これを攪拌式小型粉砕器で粉砕するとパール状ポリマー
が得られた。

ポリマーの粒径を測定すると８８〜１４９μのポリマー
５．４ｇ、８８μ以下のポリマー１．１ｇ、１４９μ以
上のポリマー０．５ｇであった。

ポリマーの元素分析値は次の通りであった。

炭素数の増加から反応率を算出すると３２２係であった
。

実施例 ２ ソルビタンセスキオレエート３０ｇを使用シた他は参考
例３と全く同一条件で反応させて白色パール状のＮ−メ
チロール化ポリアクリルアミドを得た。

このパール状ポリマー２５ｇをぶどう糖１５０ｇ及び塩
化アンモニウム１５ｇを含む脱イオン水３００ｍ１中に
分散し実施例１と同様にして脱水、加熱及び水洗処理を
行うと、５３．３ｇの白色ポリマーが得られた。

粉砕するとパール状のポリマーが得られ粒径が１４９μ
以下のものがほとんど（５１，，２ｇ）であった。

得られたポリマーの元素分析値は次の通りであった。

炭素数の増加から反応率を算出すると６４２係であった
。

参考例 ５ 実施例２で得た白色パール状のＮ−メチロール化ポリア
クリルアミド３０． Ｏｇ、をグリセリン９０．０ｇ及
び塩化アンモニウム１５ｇを含む脱イオン水２００ｍ１
中に分散し実施例１と同様にして脱水、加熱及び水洗処
理を行うと、４０．４ｇの白色ポリマーが得られた。

ポリマーの粒径を測定すると８８μ以下のものが１８．
１．？、８８〜１４９μのものが９．５，９．。

１４９μ以りのものが１１．０ｇであった。

このポリマーの元素分析値は次の通りであった。

炭素数の増加から反応率を算出すると７４７係であった
。

実施例 ３ 参考例４で得られた白色のＮ−メチロール化６−ナイロ
ン５ｇをソルビット２５ｇ及び塩化アンモニウム２．０
ｇを含む脱イオン水１．００ｍ１中に分散し、減圧下５
０°Ｃで水を除去しさらに５０℃で２４時間真空乾燥し
て十分に脱水した。

さらに８０℃で１時間加熱処理してから十分に水洗し未
反応のソルビット及び触媒の塩化アンモニウムを除去し
、５０℃で真空乾燥すると白色ポリマーが８．５ｇ得ら
れた。

これを小型粉砕器で粉砕するとパール状ポリマーが得ら
れた。

試験例 実施例２で得られたパール状の親水性ポリマー及び分散
剤を使用せずに溶液重合して生成したポリマーを粉砕し
て得られた無定形の親水性ポリマーの濾過性テストを実
施した。

濾過性テストの実施方法 直径２ｃｍのガラス製塔（長さ２０ｃｒｒＬ、底部にコ
ック及びガラスフィルターＧ１を付ける）に試験用ポリ
マーを膨潤時に高さ２ｃｖｔになるように充填する。

流出液としては３０係のグリコース水溶液を使用し液面
がポリマー上端より１０αあるように保持しつつ種々の
圧力下でグルコース液の流出速度（ｍｌｌ馴）を測定し
た。

試１験用ポリマーとしては膨潤度 及び水分保持率””
がはソ等しいパール状及び無定形ポリマーを使用してポ
リマーの形状による影響を調べた。

膨潤度及び水分保持率は次式によって測定した。

使用しだポリマーの物性は次のとおりであった。

膨潤度水分保持率粒堕ｄｒｙ） パール状ポリマー ２．２３ ２．８９ ８８〜１４９
μ無定形ポリマー ３．７７ ３．３２８８〜１４９
μ沖過性テストの結果を第１図に示す。

第１図から明らかなようにパール状ポリマーの濾過性は
著しく改良されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例２で得られたパール状の親水性ポリマー
及び分散剤を使用せずに溶液重合で得られた無定形の親
水性ポリマーの濾過性テストの結果を表わす。 Ｗ：軸は親水性ポリマーをカラムに充填して流出液を流
した時の流出液の流速（ｍｌ／ｍ＝ ）を表わし、横軸
はカラ人中の圧力（大気圧との差ｍｍＨｇ）を表わす。 図中で実線はパール状ポリマーの場合を表わし、破線は
不定形ポリマーの場合を表わす。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. モイル基−ＣＯＮＨ２を有し、かつ該アミド結合重たは
   カルバモイル基の窒素原子の全部捷たは一部がメチロー
   ル化されているパール状ポリマーと、ぶどう糖又はソル
   ビットとを、酸性下で反応させることを特徴とするパー
   ル状親水性ポリマーの製造法。