JPS58161862A - 免疫検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は免疫嘴定法ＫＩＪＩＬ、時に２橿の抗原解質の
相対＃度を決定するための検定に関する０本検定の使用
具体例として、試料中の３−ヒドロキン−エストラ−１
、３、５（１（１）−トリエン−１７−オン−３−β−
Ｄ−グルクピラノシジュロニ酸（３−ｈｙｄｒｏｘｙ　
−ｏｅｓｔｒａ　−１＋　３　＋　５　（１０）　−ｔ
ｒｌ＊ｎ＊　−１７−ｏｎｅ−３−β−Ｄ　−ｇｌｕｅ
ｕ　−ｐｙｒａｎｏｓｌｄｕｒｏｎｌｅ　ａｅｌｄ　）
（以下エストロン−３−グルクロニドまたはＥ１３Ｇと
いう）および５β−プレグナン−３ａ、′ｊｉ１ａ−ジ
オール３ａ−β−Ｄ−グルクピラノシジュロン酸（５β
−ｐｒ＊ｇｎａｎ＊　−３６、２Ｌｌａ　−ｄｌｏｌ　
３　ａ−β−Ｄ　−ｇｌｕｅｕｐｙｒａｎｏａｉｄｕｒ
ｏｎｌａ　ａｃｉｄ　）　（以下プレグナンジオール−
３−グルクロニドまたはＰ０３Ｇという）の相対ａｔを
検出するために本検定を使用することが挙げられる。 月ｓｍ期中の妊！可能期間（すなわち生育力のを示す簡
単でｇｉ積性のある技＊に対する必要性が長い間説かれ
て来た。多くの女性は医療上または帯宗教的の理由によ
り埃在入手可能な様々な避妊器具や婢妊薬を用いること
ができないでいる。月経周期中の妊娠０Ｔ能期関を＃ａ
値できる技術であれば、女性は自己の妊＆’　ｉ’Ｊｉ
＜Ｖ期間中性交渉を避けることによって避妊を行うこと
ができる。また妊娠可能期間を示す同一の技術は妊娠を
希望する場合にも役立つものである。 月経周期は下自体腺Ｗ６（下一体の前葉）と卵巣からの
リズオカルなホルモン放出によって支配される。各月経
周期中これらのホルモンおよび卵巣、下蟲体脈部および
脳のある部分中の物足の細胞との藺の儂鑵な相互作用の
結果、卵子が卵巣から鱗宮 放され、子音内膜は妊娠の準備な螢える。卵巣は卵子を
形成する多数の卵＠を有する＊維岨繊ストロマを有する
。下者体腺部からの卵胞調激ホルモン（ＦＢＩ　）の放
出により卵巣中の卵胞をとり囲んでいる卵巣ストロマの
細胞は増殖し空胴を形成する。卵胞の発達の間一群のス
テロイドホルモン群であるエストロゲンが量中される。 排卵はＦｆｆ１体腺部からの黄体形成ホルモン（ＬＨ）
の放出により卵胞の破裂が１ｉＩＩＩ家される時に生じ
る。 卵子がいったん腹腔内に放出され＄ｌＩＩ卵管を下り始
めると、卵胞の残余の細胞は黄体を形成する。黄体は第
２のステロイドホルモン群であるプロゲスチンを作り出
す。 月経周期は概念的に卵胞期（排卵まで）および黄体Ｊ＆
Ｑ（排卵凌）Ｋ分けることができる。卵胞期においては
成熟中の卵巣卵胞は前周期において子宮内膜が失った部
分を再生させるエストロゲンを排せつする。排卵がある
と黄体によるプロゲスチンの排せつＫより子宮内膜の粘
膜の形成が刺激され、予電は卵子の輸卵管下降中に受精
が行われれば卵子を着床させる準備をする。愛情があく
卵子が千′ぎに着床しない場合は黄体は変性しプロゲス
チンのし４ルが下る結果子宮内膜は変性し出血が起る。 全周期が完ＷＩする罠は約あ日を要する。 卵巣は３つのエストロゲン化合物すなわちエストラジオ
ール、エストリオールおよびエストロンを作り出す。エ
ストラジオールはもつとも傾力なエストロゲンであり人
体により容易に酸化されてエストロンを生成する。エス
トロンはヒトミキモル化されてエストリオールを生成す
る。これら３つのステロイドはすべてグルクロニド誘導
体として女性の尿中に存在する。 天然に生じるプロゲスチンはプロゲステロンである。血
液中のプロゲステロンのレベルは排卵後２８以＆に最大
値に達する。プロゲステロンはすみやかにプレグナンジ
オールに変性する。プレグナンジオールはグルクロニド
誘導体として尿中に排せつされる。 エストロゲン中間代藺物およびプロゲスチン中間代−物
の尿中のレベルを月ＩＩ！ｋＪＩ１１期の進展ｖｍ知す
るために利用することがａＴｗ＠である。％にエストロ
ン−３−グルクロニドのプレクナン、ジオールー３−グ
ルクロニドに対する比率は月経周期の歳初の週には低い
が、排卵−数日前（たとえば２日ないし５日＃１）に増
加し始め、排卵ｗＩｌ頃（排卵周辺期）ピーク櫃に達す
る。この比率は次いで急激に減小し排卵時の２日後まで
に低い１ｉＫ下る。この比率が上昇する月経周期中のＪ
９１１ｉ４は月経周期中の妊１ｈ用吐期間に対応するか
ら、この比率が上昇した憾を示す検定は明らかに極めて
高い価値を有するものである。 もしこの検定が安価で簡単なものであれば、それは受精
′ｃｉ］能か否かを検知するための極めて有益なテスト
の２＆礎となることができる。 本出願人の実画特許ＧＢ第２０２９０１１Ｂ号明細１４
Ｆにおいて、本出願人は試薬系と前記比率を決定する方
法を記載している。同明細書には、２つの方柱周期中の
妊娠ａＪ北期間を検知する免疫化学的方法が目己載され
ている。この方法は、上記２つの中間代ｄ物の存在によ
り兜＆複合体が解離する度付いを決定することに依存す
る。 本出願人の前記ＣＩ４＃書に記載した免役豪合体は。 プレグナンジオール−３−グルクロニドに対する抗体な
固相に不可逆的に付着させた固相と、ウシ血清アルブミ
ンに不可逆的に何層したエストロン−３−グルクロニド
部分（ｍ・ｌＩｔｌ・Ｉ）およびプレグナンジオール−
３−グルクロニド部分とを含む２１ｄｆｉ配位子と、エ
ストロン−３−グルクロニｒ＜対する抗体とを有する。 この配位子は、免疫化学的結合により、前記同相支持体
に何着したプレグナンジオール−３−ダルクロニド抗体
に対しり逆円に結合し、エストロン−３−グルクロニド
抗体は免役化学的結合により該配位子に対し可逆的に結
合する。 前記方法においては、免疫複合体を尿でインキュベート
する。尿中の谷中間代−物は抗体を＠指して競う結果兜
＆複合体は部分的Ｋｐｓ離する０次いで固相を洗浄する
。同相に何着して残っている、照射されたエストロン−
３−グルクロニド部分の数は、尿中のエストロン−３−
ダルタロニドのプレグナンジオール−３−グルクロニド
に対する比率に＠！存する。照射されたエストロン−３
−グルクロニド部分の数はエストロン−３−グルクロニ
ドに対する酵１ｃ憚繊抗体により決定することができる
。 上記英１特許第２０２９０１１８号明細書記載の試薬系
および方法は有効ではあるが、ある檎の限界がある。 すなわち、エストロン−３−グルクロニドおよびグレダ
ナンジオールー３−グルクロニドは概念的に２１１１１
の配位子を形成するため支持たん白（実施例ではウシ血
清アルブミン）に結合させられる。 この配位子と同相に結合した抗プレグナンジオールー３
−グルクロニドとの闇に形成された結合およびこの配位
子と抗エストロンー３−グルクロニドとの蘭に１Ｖ３成
された結合はり逆円であることが必漠東往である。しか
し現在これらの結合は部分的にのみ可逆的であり、その
結来兜投複合体は、エストロン−３−グルクロニドおよ
びプレグナンジオール−３−グルクロニドを含む浴液で
インキュベートした時、光分な解囁を示さないことが判
った。これはｑ！ｒ部分の２つ以上が支持たん白に何層
するため配位子が多愉反応を起すことに帰因するとも考
えられる。 また、ウシ血清アルプンン自身の上の非ステロイド決定
基と固相に付着した抗体との閣の免役反応が起ることに
帰因することも考えられる。 さらに、女性の尿中に存在するエストロン−３−グルク
ロニドとプレグナンジオール−３−グルクロニドのａｌ
ｌ！度がはなはだしく異るために生じる間呟がある０適
音プレグナンジオールー３−グルクロニドの濃度はエス
トロン−３−グルクロニドの濃度の１（）〜５ｏ偕であ
る。前記時許ＱＢ第２０２９０１１Ｂ号明細書紀載の試
薬系および方法は、エストロン−３−グルクロニドおよ
びプレグナンジオール−３−グルクロニドの双方に対し
て四槽の感度を示す。これは誤った試験結果に導くおそ
れがある。 前記物許ＧＢ第２０２−９０１１Ｂ号配幀の方法は、２
つの微分４Ｆｌ物を同時に検定する方法であるから。 本明細書では以下二重値分ｉｒｒ物検定（ｄｕａｌ　＆
鵬ｔｙｔ・−「る。しかしながら相対濃度の決定は２つ
の部分１ｍのａ度比の複雑な関数であり、したがって二
重分析検定は１１１１度比がしきい（ｉｉｊ　Ｋ　：ｌ
Ｉ　したかまたはこれを超えた時を示すために使用する
ことが望ましい。 本発明の目的は、光分な競争的平角の確立を許拝しかつ
嘱２の抗慮溶寅よりも看るしく低い一度で存在する抗庫
装置に対する感度を高めた二重微分町物横定を提供する
ことな目的とする。 本発明によれば、次の検定が提供される。 構成Ｗ素として、 ａ）第１の抗原浴貞と第２の抗原静置とを含む試料浴液 ｂ）前記第１の抗原静置の決定基に可逆的に結合しうる
第１の抗体であって、浴液中にある抗体Ｃ）前記第２の
抗原静置の決定基に可逆的に結合し５る＠２の抗体であ
って、固相支持体に可逆的に結合している抗体 ｄ）罰Ｈピ第１の抗体がｉ」逆円に結合し５る第１の抗
原と、前記＃！２の抗体が可逆的に結合し５る第２の抗
原とを含み、該第１の抗原と該第２の抗原は架ｒｍｆ持
分子を介して相互ＫＧｉＴ逆的に結合している配位子分
子であって、浴液中にある配位子分子 ・）抗体に対し可逆的に結合し５る標識を何した抗体 を儂え、次の工程を含む検定 ａ）前記１１！１の抗体、前記第２の抗体および前記配
位子分子のすべてが前配賦科との混合＃に相互に混合し
ていない場合に、前配賦科溶液、前記第１の抗体、ＩＩ
Ｊ記第２の抗体および前記配位子分子の混合物を形成す
る工程 ｂ）　ｄ混合物をインキュベートするととによって。 剖紀配位子分子と前記第１の抗原溶質との関にＡｌｌ紀
第１の抗体と会合すべく填合Ｖ詐容し、かつ前記配位子
分子と前記第２の抗家厳買との蘭に前記第２の抗体と会
合すべく一合を許容する工程 ｅ）前記同相支持体を前記標識を何した抗体に接触させ
るととＫより、該標識を何した抗体と禾結合第１抗原と
の閣の会合’ｉ’ＷｆＷする工程ｄ）前記配位子分子お
よび前記第２の抗体を介して前記固相支持体Ｋｍ合した
標線を付した抗体の瞳を決定する１機。 配位子分子は１櫨拳の第１の抗原と１檀拳の第２の抗原
を含み、２つの抗ノ京は架！ＩＩＡ支持分子を介して不
ロ１逆的に相互に結合していることが望ましい。配位子
分子中にただ１檀のｔａｌの抗原とただｌ檀の第２の抗
原が存在することは有効な競争反応を嗜沫する。 不明ａｌｌＩＦにおいて、「不可逆的結合」という用語
は、＠合のｗ４＋１１１定数が免疫化学的結合の解離定
数よりも低い結合を意味する。特に固定相と第２の抗体
との闇の結合は１ｍｌの抗体および第２の抗体を配位子
分子に結合させる免疫化学的結合のＰ！４Ｉｌｌｌ定数
よりも低いＳ＊定数を有する。 検定の成分の混合およびインキュベーションのＩｋ序と
組合せは検定の感匿および検定を実行する猷の容易さに
影響を与える。混合物は別々の成分１に：１工程で混合
することにより形成することが城ましい。こうすること
Ｋより別々の成分がそれぞれ同時に競争性ＫｒＩＩｔか
れ、その結果有効なＩＩ！苧反応が生じる。実用旧兇庵
からはこの技術はある制限を有している。他の望ましい
方法においては、混合物は、試料浴液と配位子分子との
混合物を形成し、この混合物をさらに第１の抗体と第２
の抗体との混合物と混合することによつ′ｆ：形成され
る轟こうすることＫよって、検定の抗原成分（試料およ
び配位子分子）をｔＡ整することができるが相互に反応
することはなく、また検定の抗体成分（第１および第２
の抗体）を調書することができるが相互に反応すること
はない６反応は抗原と抗体とが混合される時にのみ生じ
る。 同相は検電の適当な段階で洗浄し、固相に結合していな
い橿を除去する。 第１．第２および標識を何した抗体の１または２以上は
関連する抗原に対する抗血清の純化免役グロブリンで強
化した分−または関連抗体に対するモノクローナル抗体
を用いることができる。 ＊練を付した抗体は適当な基質を有しまたはこのような
Ａｌ［なしに６■祝信号を発生しうるものであることが
望ましい６％に標識を付した抗体は酵素、螢光または化
学発光基で標識することが望ましい。たとえば西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β
−ガラタトシダーゼまたはグルコースオキシダーゼを用
いることができる。もつとも好ましいものは西洋ワすピ
ノ臂ルオキシダーゼで標識した抗体である。 固相支持体はマイクロテストプレート（ｍ１ｅｒ＠ｔ・
ａｔｐｌａｔｅ　）のような砿量―定板（ｍ１ｅｒｏｔ
ｒｔｒａｔｌｏｎ　ｐｌａｔｏ）、マイクロタイタブレ
ート（ｍ１ｅｒｏｔｌｔｒ＠ｐｌａｔｅ　）、プラスチ
ック管またはガラス！１球またはビード。 乳清脂粒子、′ａ倣−スライ・ド、粒状セルローズ望ま
しくは徴晶賞のセルローズ、アガロース、セファロース
、セファクリル、ボリアクリルアミド粒状ゲル、シリカ
ゲル、アルンナ、ゼオライト、またはたとえばＰ紙等の
形状のセルローズ等の繊維状物賞を用いることができる
。 ＋＋６１７Ｆ＠文神体は倣普簡定板な用いることが望ま
しい１ ｉ＠２の抗体の面相に対する結合は、たとえば化学的に
または抗免役グロブリン抗体等のポリペプチド、プロテ
ィンＡ　（ｐｒｏｔ＠ｉｎ　Ａ　）または殺しもしくは
固定したスタフイロコックス　オーレウス（８ｔａｐｈ
ｙｌｏｃｏｅａｕｓ　Ａｕｒｓ＋ｕｓ　）等の公知の手
段によって行うことができる。 本検定は月経周期中の妊娠可能期間を決定する１方法に
おいて使用することができる。この場合本検定は、尿中
のエストロン−３−グルクロニドおよびプレグナンジオ
ール−３−グルクロニドの相対濃度を検知するために使
用される。この好ましい本検定の利用にＫい

【は、配位
子分子は架ＷＩ４支持分子１に片して不ｃｉＪ逆的に結
合した少くとも１分子のエストロン−３−グルクロニド
と少くと４１分子のプレグナンジオール−３−グルクロ
ニドをよむ。 配位子分子は好ましくは次の式のものである。 ＨＯＨ また本発明は本発明の倹定または上記の方法を実施する
ための試薬キットを提供する。このため。 第１の抗体と、第２の抗体と配位子分子とを別々に備え
る試薬キットが提供される。また第１の抗体と第２の抗
体との混合物とそれとは別個の配位子分子とを備える試
薬キットが提供される。 本発明は、さらに、架横支愕分子を介して不可逆的に結
合した２つの異る抗原響を含み、との架慟−ｆ：待分子
は２つの反応性１”能基を自する有機化合物から優られ
る２１曲の基である。この２１曲の１としては炭素原子
２−１０ｖ有するアルキル、炭素原子２−１Ｏを有する
アルケン、炭素原子２−１Ｏを有するアルキンまたはフ
エニールジアルキルヲ用いることができる。好ましくは
２ｉ０ｔｉの基は一般式％式％） （ただしＲは−ＮＨ，、ハロゲンまたは−Ｏ−ＣＯ−ア
ルキル、ｈは２〜１０　）の化合物から優られる。Ｒは
一洲、であることが・好ましく、１は６であることが好
ましい、最も好ましい配位子分子は次式のものである。 本発明の試薬系は、２価の配位子の一部を含むたん１實
性の支持分子のかわりに２つの反応性官舵基ｖ有する有
機化合物から優られる簡単な条横ゲ待シナ子を用いるこ
とにより、英１籍許Ｇ藤第２０２９０１１Ｂ号に記載さ
れた試薬系に内在する限界を克服することができる。１
井連するステロイド中間代ｌ！ｌｌｔ物（実馬例におい
てはエストロン−３−グルクロニドおよびプレグナンジ
オール−３−グルクロニド）は化学的にこのような架４
９１１９分子に何着させて、以涜［混合ステロイド抗原
］または「Ｍ８ＡＪと称する配位子分子を形成させるこ
とができる。過当な架４１１１叉侍分子の１例はたとえ
ば１．６−ジアンノヘキサン等のアルキルジアミンであ
る。このような合成支持分子を用いる混合ステロイド抗
原は多価免疫複合体を形成する＃Ｉ＠　−がより少く、
系中に不純物として存在する抗体ＫＲ−ｆる兇役学的ア
フィニティーは無視しうる′ｌｊＡ度のものである。 本発明の方法は複数の抗ｙＡ装置の中で一般により低い
レベルのものを考［Ｋ入れる（実施例ではエストロン−
３−プルクロニドフ。低ｍ度の抗原ｍ電に対する本方法
の感度を比例的に増大する必要があることが判明した。 これは問題の抗ｊｌｌＬ浴質に対する抗体と複合しよう
とするＭ８ムと当該抗原との真に−や的な反応を考慮す
ることＫよって達成された。英１ｆ１ｉ特許ＧＢ第２０
２９０１１Ｂ号記載の方法においては、真の競争が開始
しうる以前に抗体とＭ８Ａとの間に杉成された免役複合
体を解畷することが必要である。 いずれかの抗体ＫＷ１合するためＫＭ８ムが試料と競争
しなければならないように試薬系の成分な添加すると、
より感度の良い検定を行えることが判った。 以下に記載の実施例においては、上記の試薬系と方法は
、月経周期中で尿中のプレグナンジオール−３−／ル３
ｙ　ｏ二）’に’Ｒｆ６エストロンー３−グルクロニド
の一度比が上昇する１日または豪数日を決定するために
用いられるニジたがって月経周期中毎日尿を横置すれば
、妊娠ａＴ能期閣の開始。 継続期間および終ｆを示すことができる。さらＫ。 この−腋比は排卵日頃にビーク櫨に達するので。 ピークｔｌｌケ測定することにより受精町乾性が最大の
時を示すことができる。 以Ｆｍ何図面を参照して本発明の試薬系および二ＩＩＩ
破分析ｖＩ検定を砕細に説明する。 第１図は本発明の試薬系および二重鎖分析物検定の１実
施例を模式的に示す、なお図中以下の記号な用いる。 ＼＼、　ステロイド中間代謝物（エストロン−３−グル
クロニド） ＼　ステロイド中間代−物（プレグナンジオール−３−
グルクロニド） 一〇−混合ステロイド抗原 第１図には２つの抗原浴寅の＃ｇの４つの檎限例が示さ
れている。 １）エストロン−３−グルクロニド（１：／３Ｇ）ｄｆ
ｌ＆、プレグナンジオール−３−グルクロニド（ＰＤ３
Ｇ）一度低・ これは月経周期の中排卵周辺期関の状−を表しており、
したがって％に関心のある吠轢である。 尿の試料をとり、必要に応じ希釈した瞳、エストロン−
３−グルクロニドとプレグナンジオール−３−グルクロ
ニドの双方の抗原決定基を有する混合ステロイド抗原を
含む緩備浴８に添加する。次いでこの抗原混合物を溶液
中のエストロン−３−抗原上に存在する複数の抗原は各
自の対応する抗体に結合すべく抗原被分析物と競争する
。この場合試料中のエストロン−３−グルクロニドは比
較的高い濃度であるためエストロン−３−グルクロニド
に対する抗体の大部分は被分析物ＫＭ合し、混合ステロ
イド抗原はエストロン−３−グルクロニドに対応する自
由な抗原なＭしたまへ同相に何増する。 緩責液による洗伊（必漠ではない）およびエストロン−
３−グルクロニドに対する標識を何した抗体を加えてイ
ンキュベーションを行うと、標識を何した抗体は同相に
会合し固相において検知することができる。 鹸）　　エストロン−３−グルクロニｌ’（Ｅ１３Ｇ）
Ｉｌｌ廣低、グレダナンジオールー３−グルクロニド（
１’０３Ｇ　）　ｔｉ１１度低・ この場合は月経周期中の初期卵抱期を表す。テストエ楊
は上記ｌ）と同一であるが、８２１図に示すように、尿
中のエストロン−３−グルクロニドの駿は混合ステロイ
ド抗原と有意な程度に競争するには不光分であるため、
なんらの信号も発生しない。その＃東、＊終的に固相に
結合する混合ステロイド抗原上のエストロン−３−グル
クロニドの会合を妨げられ、信号は発生しない。 １１１）エストロン−３−グルクロニド（ｇＭＧ）ｌｌ
ｌｌｆｉ＆　グレダナンジオールー３−グルクロニド（
ＰＤ３Ｇ）ｍｙ高。 この場合は月経周期中の黄体中期の状轢を表す。 テスト工程は上記と同一であるが、図示のように、混合
ステロイド抗原は、尿中のスｙ″ロイド中間代−物の製
置が高いためにプレグチンジオール−３−グルクロニド
抗捧およびエストロン−３−グルクロニド抗体のいずれ
とも有意な程ｆに会合することができす、信号は発生し
ない。その結果混合スデロイド抗原分子の大部分は固相
ＫＷ１合することなく１ｌｉＩ＃ＩＲを付した抗体との
インキユベーシヨンの＃に洗い流されてしまう。 〜）エストロン−３−グルクロニド（Ｅ１３Ｇ）ｌＩＩ
屓低、プレグナンジオール−３−グルクロニド（ＰＤ３
Ｇ）Ｉｌｆ高。 シ この場合プレグナンヂ峠オールー３−グルクロニドの＊
ｉは１甑な程度に比較的高いので混合ステロイド抗原の
同相との会合は妨げられ、したがって信号は発生しない
。 次に試薬系の檀々の成分の１Ｉ４ＩＩｋと特性について
説明する。 他に％配しない限り、１と学品と浴媒はすべて英１ｔｈ
ｌドーセット、ツールのビー、ディー、エイチ、ケミカ
ルズ、リミテッド（８Ｄ　ＨＣｈ＊ｍｌ＠ａｌｓ　Ｌｉ
ｄ、）から入手したものである。緩衝液はすべ【蒸溜水
中でＰＪ４整した。 づＡヱ！ パルビトンナトリウＡ　（８ｏｄｌａｍ　１ｌａｒｂｌ
ｔｏｎ＠）を０．１％（豐／ν）アジ化ナトリウムとと
４ＫｔＭ！ａ　ｍ　０．０７　Ｍ　Ｋ調整した。最終容
積にｖＩ４帯する前にこの溶液の−を濃塩酸で８．４に
調節した。 週断緩備液 迩１ｉｌｙ緩債液は０．１Ｍ塩化ナトリウムおよび０．
１ＭリンＩＬ塩（１１，５３Ｐ／を無水リン酸水素第２
ナトリウムおよび２．２５ｆ／を無水リン酸第２水素ナ
トリウムから調整したもの）を含む。ウシ血清アルブミ
ン（グレードＶ、英国ドーセットプール、ファンシーロ
ードのシグマ、ケミカル、カンノ臂ニー（Ｓ　ｉｇｒｎ
＊　Ｃｈｓｍｌｅａｌ　Ｃｏ、　）をこの＃液に浴かし
製繊５憾（＊／ＶＪとした。 洗浄緩衝液 ０．１Ｍ塩化ナトリウム、０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡおよ
び０．０１Ｍリン酸塩（１，１５３７／４無水リン酸水
素第２ナトＩＪウムおよび０．２２５　ｊＩＰ／　を無
水リン酸第２水素ナトリウムからなる）を含む浴液ヲｕ
４１１シた。この浴液１ｔごとにａ−シタノールｌＱｄ
および７ｖ＠ａａ−加（簡＠）０．２ＭＪを添加した。 こうしてできた況浄緩ｌｌｌ１液をよく躯って、濃塩酸
でｐＨ７，５に調節したー Ｔｒｌｓ　−ＨＣＩ緩曽液 ０．０２Ｍ　ｔｒｌａ　（Ｔｒｉｓｍｍ　　ペース、英
国ビーセット。 プール、ファンシーロード、シグマ、ケミカル、カンパ
ニー）および０．５Ｍ堰化ナトリウム１含む浴液’Ｉ！
ｆ　４４４１しａｌｌ　ｔａｇ　峡でｐＨ７，４にａｌ
ｌｌｌした。 ｇ　ａ　ｐ　ｇｙｇｋ液 ＬＩＯ１ＩＭ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ　　ＥＤＴＡ
および０．１Ｍリン酸埴（１１，５３ｊｌ／ｊ無水リン
酸水率、第２ナト１７ウムおよび２．２５？／ｊりン酸
第２水素ナトリウム）を含む浴液を調整し、−塩酸で肯
を７．０に調節した。浴液１ｔごとに無水エタノール（
Ａ。 Ｒ，グレード）／７５１ｄおよびＴｗ＠ｎ　−′ｄ５Ｊ
　Ｏ，２Ｍを重加した。 １次緩負液 ウシ血清アルブミン（グレードＶ、英１ドーセット、プ
ール、ファンシーロードのシグマ、ケ１ｔｙｐｂ、ｆ）
ｙノそニー）ＶＥ８ＰＥ綾僑液に浴かして２４（ｗ／マ
）浴液にすることによって１次緩衝液をＡ幣した。 ２次緩衝液 １”ｊ−グレードのウシ血清アルブミンをに８Ｐ）４備
漱に浴かすことＫよってｆ＃度０．２％（ｖ／マ）とす
ることによって２次緩衝液を調整した。 −Ｊ！ｉ電浴液Ａ 蟇両浴液Ａは０．０１Ｍジメチルアンノ安息香酸（梃１
ドーセット、ギリンガム、ニューロード、ジ、オールド
、ブリックヤードのアルドリッチ、ケンカル、カンノ”
二＝　（Ａｌｄｒｌｅｈ　Ｃｈｓｍｌｅａｌ　Ｃｏ、）
）。 ０．１Ｍ硫酸アンモニウム、０．０１Ｍ　　ＥＤＴＡお
よび２水木ナトリウム）からなる。この＄１１８の一ヲ
２Ｍ水酸化ナトリウムで６．０に調節した。最喰に溶ｇ
１ｔにつきｎ−ブタノール１０　ｄ　’ｌ’　ｌ１ｔｉ
加した。 基ｊ［浴液Ｂ ３に電解液Ｂは０．０２Ｍ　　３−メチル−２−ペンゾ
チアゾリニンヒドラゾンヒドロクロリド（３−ｒａａｔ
ｈｙｌ　　−２−ｂｓｎｍｏｔｈｌａｚｏｌｌｎｌｎｅ
　　ｈｙｄｒａｍｏｎ＠　ｈｙｄｒ＊ｅｈｌｏｒｌｄｓ
（アルドリッチ、ケンカル、カンパニー、り建テッド＃
］の水浴喉からなるものであった。 １實＃ｌＣ １實浴液Ｃは（資）憾過酸化水素を水で希釈して】プロ
ティンＡ　（ｐｒｏｔ＠ｉｎ　Ａ　）脱着緩衝液は０．
１５Ｍ堪化す）　１７ウムおよび０．５８鳴（マ／マ）
酢酸からなるものであった。 Ｃｏｎ　−Ａ脱漕緩自液 Ｃｏｗ　−Ａ脱層酸備液は〒ｒｌｓ／ＨＣｊ緩憾液中の
カンパニー＃）からなるものであった。 酢酸塩緩備液 これは０．１Ｍ酢酸す）　ＩＪウムおよび０．１Ｍ堪化
す）　ＩＪウムからなり、塩酸で１．１Ｈ４，５に調整
した。 去乙菫皇臘勇スｌｌ リンｍ堪緩伽食塩水は０．１　Ｍ塩化ナト１７ウムおよ
び０，１Ｍリン酸堪（１１，５３ｊｆ／を無水リン酸水
素）　第２ナトリウムおよび２．２Ｓｆ／を無水リン酸
水素第２ナトリウムｌ含むもので、ｐＨ７，５に調節し
た。 櫨々の混合ステロイド抗原（ＭＳＡ）化合物の１ｉｌｌ
整次に各Ｍ８Ａをｇ４！Ｉシた。 １−〔プレグナンジオール−３−グルクロンアミド〕、
４−〔エストロン−３−グルクロンアミドローフタン（
ＰＤ３Ｇ−１，４（ＤＡＢ）−１ｉ：１３Ｇ）１−〔プ
レグナンジオール−３−グルクロンアミド〕。 ６−［エストロン−３−グルクロンアミド］−ヘクサン
（ＰＤ３Ｇ−１，６（ＤＡＨ）−Ｅ１３Ｇ）】−〔プレ
グナンジオール−３−グルクロンアミド〕、８−〔エス
トロン−３−／ルクロンアミド〕−オクタン（Ｐｉ）３
Ｇ−］　、８（ＤＡＯ）−ｆｆｉ１３Ｇ）ｌ−〔プレグ
ナンジオール−３−グルクロンアミド〕。 ＸＯ−［エストロン−３−グルクロンアミド］−デカン
（ＰＤ３Ｇ−１，１０（ＤＡＤ）−Ｅ１３Ｇ）（以下そ
れぞれＭＳＡ、　、　ＭＳＡ、　、　ＭＳＡ、　、　Ｍ
ＳＡＩｏと略称する） 次のアルキルジアミン％：　８ａｍａｒａｊ・＠ｗ＠Ｐ
、およびに＊１１１＊　Ａ、　Ｅ、　（１９７５年８１
ｏｅｈ＊ｍ、　Ｊ　１５１３６９−５７６）に記載され
た混合無水物法を用いてＥ　１３　Ｇで率＊換（ｍｏｎ
ｏｍｕｂｓｔｌｔｕｔ＊　）　Ｌ、た。 １．４−ジアミノブタン 】、６−ジアミツヘキサン 】、８−ジアミノオクタン 】、１０−ジアミノデカン 逆相−ｓｐ　−ｐａｋ　Ｃ１８カートリッジ（英国デエ
シア、ノーリッジ、ハート７オード、チェスターロード
３２４のクオータース、リミテッド（Ｗａｔｅｒｓ　Ｌ
ｔｄ、）製）を使用することにより単純なｄ齋工程が開
発された。 以下に１滅する方法は率首僕スゲロイドダルクロニルア
ルキルジアミンの一般的な一螢方法である。 Ｅ　１３Ｇ　（１０μｍｏｌ）　＋Ｈ”Ｅ１３Ｇ　（１
０’ｄｐｍ）乾塘ジメチルフォルムアｉド（ＤＭＦ’）
（４００μｔ）乾礫ｔ−Ｎ−ブチルアＺン（７，５μｔ
）インブチルクロロフォルメート（ｉａｏｂｕｔｙｌｅ
ｈｌｏｒｏｆａｒｍａｔ＠）（４，５ｐＬ）　　　　４
青拌、　３０分、−１０℃Ｌ）ＭＦ　６００μを中のア
ルキルジアミン１５０μｍｏｌＫ：＃加攪拌、　１０分
、０℃、　１８時闇静置、４　℃ 水Δ１−冷卯、１８時闇靜装、４℃ 水加−添加、ＣＩ８カートリッジに充填：幻鴫メタノー
ル水浴ｔｉｏａｚで洗浄水ｉｉ１＋Ｌｌで洗浄 １鳴酢嘴を含む（資）噛Ｍ・０Ｈ１Ｏａ／で洗浄１％酢
酸を含む（資）％Ｍ・０Ｈ５０ｄでカートリッジを俗離 心４液を水で１００−に希釈、倉しいＣ１８カートＩＪ
ツジに充積 ｔ）、１Ｍ炭酸ナトリウムｌＯ−で０ｃ沙水１０−で洸
伊 Ｍ・ＯＨりＯｄで浴蟻、乾燥 カートリッジを異る憔性および肯の教壇のメタノール＃
！液で況締することＫよって不純物は大部分取り除かれ
た。最終残基をＴ、Ｌ、Ｃ，Ｋかけたところ各々の場合
においてかなり純粋な生成物が帰られることが判った。 収率は３１嘔〜４３鳴であった。 これらの中間生成物はそれ以上精製することなく次段の
王権に移した。 Ｐ０３Ｇを混合無水物反応により次の１ｃ１３Ｇ単置換
アルキルシアｉン誘導体に結合させた。 Ｅ１３Ｇ−１，４（ＤＡＢ） Ｅ１３Ｇ−１，６（ＤＡＨ） Ｅ１３Ｇ−１，８（ＤＡＯ） １１３Ｇ　−１、１０（ＤＡＣ） 生成物の分＊ｖｇ易にするためｌ叩−ｐａｋ　Ｃ１８カ
ートリツジを書度用いた。 次に示す方法は第２のステロイドグルクロニド−イ ′４を奉１１僕ス１０１トグルタロニルアルキルシアイ
ンに結合する一般的方法である。 乾燥ＤＭＦ（２００Ｐｔ） ｔ−Ｎ−ブチルア建ン（４μｔ） イソブチルクロロフォルメート（３μｔ）攪拌、：切分
、−１０℃ 乾％ｌｌＤＭＦ５００＊を中のＥ１３Ｇ−アルキルシア
イン４μｍｏｌＫ范加　　　　　　攪拌、１時間、θ℃
、１８時閣靜置、４℃ 水加ｄ添加　　　　１８時闇靜装、４℃Ｃ１８カートリ
ッジに充填 水１（１１１１ｊで洗浄 ０．１Ｍ炭盾ナトリウム中の５０憾メタノール１０１１
７で洗浄 １鴫酢＃を含む加傷メタノールｘｏｄで洗浄水１（ｌ　
ｍで洗浄 メタノール１０　ａ／で解離 ｔｔＬ謙 ＨＰＬＣＫより精製 酸素のメタノール俗離液中の生成物の収率は４４ｔ６〜
８１４であった。　Ｔ、Ｌ、Ｃ，はごく漁小の不＄１物
を示した。Ｒｆ値は予懇した範囲のものであり極性は架
橋の長さく　ｂｒｌｄｇ＠ｌ＠ｎｇｔｈ　）が減小する
Ｋつれて増大した。４檎のＭＳＡを高圧液体クロマトグ
ラフィーによりさらに精製した。 Ｃ＠に＠ｎおよびＧ−ｏｍｅｓ　（Ａｎａｌ、　Ｌ＠ｔ
ｔｓ、　１２　、　ｐｐ。 ５８９−６０２　（１９７９）　）は、放射性配位子の
化学的純度は比活性についての肖該放射性配位子のクロ
マトグラムの連続的分画を横歪すること罠より＃ｊ定で
きると報告している。ピークｉ付近の各分画） の存在を示す。 ）ＩＰＬｃクロマトダラムにおいて、ピーク分画（ｐ＠
吐むａｅｔｌｏｎ　）およびピーク分−の両側の２つの
分−についてＭＳＡ６の比活性を測定した。各号１ｄｌ
ｌＫおける放射能はｌＯμｌを２圓カウントすることに
より決だした。各号−のＭＳＡの買置は、Ｅ１３ＧＲＩ
Ａ系およびＰＤ３Ｇ　Ｒ１ム系により、ＲＩＡ（放射−
兜役債定法）によって決定した。Ｒ１ム糸においては僚
分析物と懺単−買との併存は純皺を示す他の漬水方法で
あるので、一連の分画希釈液についてＩり足を行った。 各号ｌ１ｋｌを５つの（２倍］希釈液について模建し、
各検定を２回行った。 本嘴だの結果を第１表に示す、各号−についての５つの
結果の平均値からの谷標準偏差は１分画＋２を除いて、
分画希釈度とは無関係Ｋがなり一致した結果を示してい
る０分ｍ−２，−１，０゜＋１の比活性は計算された誤
差範囲内で一定であった。分画＋２は自首な程度に毀る
比活性を示し、そのため調剤から外した。 上ｄ己の結果に＠ｔ、て顧著なことは、２橿の異るＲＩ
Ａによって計算した比活性が非富に一致していたという
ことである。分画−２，−１，０，＋１の平均比活性（
両方のＲＩＡにより決定したもの）ｉ！２１．５±３．
９　ｅｐｍ／ｐｍｏｌであった。これＫよって以煉の免
疫化学的作業に用いるＭ８Ａは純粋であるとの失調和達
した。 抗Ｐｌ）３Ｇ固相（８ＰＡＰ　）の、１ｍ幣ウサギ抗血
清はロンドン、ダブリュ１、クリーブランドストリート
のコートールド、インスチチュート、オブ、バイオケン
ストリ（βｏｕｒｔａｕｌｄＩｎａｔｌｔｕｔ＊　ｏｆ
　Ｂｉｏｅｈ＊ｍ１ｓｔｒｙ）Ｋよって供給された（−
削ＰＧＯ］　／２００、採血ＶＩ　Ｉ　Ｉ　）　ａ　コ
（’）抗血清は８ｄｍａｒａｎｊｓｓｗａ、Ｃｏｏｌ＠
ｙおよびに＠Ｉｌｌ＠の１載（１９７９年）（［プレグ
ナンジオール−５ａ−グルクロニドの放射−免役検定Ｊ
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　８ｔｅｒ＠ｌｄ　Ｂｌｏｃｈ
＠ｍ１ｓｔｒｙ１１　１１６５−１１７１　）に従い、
ウシ血清アルブミンのアミノ−リシルｆｉＡＫ対するＰ
Ｄ３Ｇのカルボキシル基の共有結合を弁してＤ４幣され
た免疫原に対して作られたものであった。 この抗血清のＩｇＧ分画は次のようＫＦＪ４１１Ｉ！、
シた。 担体に対し時異的な抗体な取除くため、抗ＰＤ３Ｇ抗血
嘴１（１１１ｊＫ対しａ断緩鴫液０．４ｄを鑑別した。 混合物ｙＩｌ″ｎ℃で３時間インキュベートした恢４℃
で］晩靜直した。生成した沈殿物を遠心分層により取除
きリン＃２塩緩備食塩水１０１１７で２回洗浄した。 混合物の上澄み（３０，５ａｌｌｊ　）を４℃まで冷却
し、す／？ノーｋ　（ｒｌｖａｎｏｌ　）　（ｔｋｇ−
シアイノ−２−エトキシ乳酸アクリジン０．１６Ｎ／１
９．５１１７）の冷却した溶液を攪拌しながらゆっくり
添加した。混合１１！Ｊｖ２Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨ
８，４ＫＩｉ１１１節した。４℃で屓）分間攪拌を続け
、その間粉末木炭（Ｎｏｒロム）２５ａｙを加えた。 懸濁液を遠心分離Ｋかけて得た上澄みを０．２μ翼。 使い捨てフィルターカートリッジ（西独ダッセル郵ｌ私
書−４Ｄ−５３５４のシュライヒヤー、ウント、シェル
、グゼルシャフト、Ｚット、ペシュレ（ ンクター、ハフラング（８ｅｈｌ＠ｉｅｈ＠ｒ　＆　８
ｅｈｔｌｌ　ＧＭＩＩＭ）＃）を通過させた。さらにプ
ロティンＡセファロースアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精ａを行った。 プロティンＡセファロース（シグマ、ケイカル、カンノ
ぐニー、リミテッドｌｌｉりを入れた小カラムをリンＩ
ＩＲ虐１１嚢賞壌水中で尤鷹し直径１５Ｘｊｍのベッド
専横とした。抗ＰＤ３Ｇを含む上記濾過液をカラムの上
部に１１により絵加し、仄いでりン績塩緩１１１ｇ賞塩
水２００−を加えて納会していないたん白をゲルから取
除いた。 次にプロティンＡ脱看緩備液７に：逆方向からカラムに
加え、浴１１液な合計７Ｑｍ収果した。この溶喝したた
ん自分−の−を２Ｍ水嘴化す）　１７ウムで７、ＯＫ調
節した。この浴液についての吸光度測定は純化ＩｇＧ６
２雫が１１！されたことを示した。この抗ＰＤ３Ｇ浴液
は必要があるまで一７０℃で貯蔵した。 ５ＰＡＰ’ｋａＪ！Ｉ督するための固相として１イクロ
テストプレート（英１８ヘイズリ−、ワシントンロード
、＠ＩＪｌ！私書−あのジブコ、ニーロープ、リミテッ
ド（Ｇｌｂｅｏ　Ｅｕｒｏｐ＠Ｌｔｄ、　　）製のＮｕ
ｎｅ　−ＩｍｍｕｎｏｐｌａｔｓＩ）’Ｙ便川用た。プ
レートのウェル中の抗体浴液をインキュベートすること
により抗Ｐ０３Ｇをウェルに吸増させた。 ＃震約３μｆ　／ａｔ　のたん白を得るよ５に抗ＰＤ３
Ｇ浴液をパルビトン緩備液中でｒＡ！１した。この−震
は、ウェル表面にたん白が高い吸Ｎ率で１＆看する一万
グチ浴漱として比較的経済的であるように実−によって
決定した。 抗ＰＤ３Ｇ浴液２ｏｏｐｔを１２チャンネルピペ７１（
英国アイアンア、アービン、セカンドアベニュー、郵便
部ＩＩＦ函１７のフロー、ラボラトリーズ、リミテッド
（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ＠ｓ　Ｌｔｄ、　）
製Ｔｌｔ＊ｒｔ＠ｋ）を使ってウェル中にピペットで加
えることＫよってマイクロテストプレートを抗体でｌｌ
［ａシた。プラスチックフィルムでウェルｖ密封し室温
で２４１＃闇靜瞳し１こ、この時間が経過したＱ９エル
の内容書をアスピレートし、ウェルを遮断緩衝液で溢れ
させた１次いでウェルなもう一度密封し室温で１８時間
靜装した。 Ｉ＆優に、ウェルの内容書をアスピレートし、ウェルな
蒸溜水で４ｆ洗浄した。谷プレートなｌｌ返し、デイシ
ュペーノＲ−で横ったベンチ向上で数回軽くたたいた。 ウェルに残った水の薄膜は室温で２時間かけてＡ発させ
た６次いでウェルなプラスチックフィルムでｆｆ１ｌｔ
し必１！になるまで−１８℃で貯蔵した。 抗Ｅ１３Ｇ抗体の梢 ウサギ抗ｇｔ３ａａ渭はロンドン、ダゾリュ１、クリー
ブランドストリートのコートールド、インスチチュート
、オノ、）９イオケミストリによって供給され・　８ａ
ｍａｒａｊ・ｆｆ＆およびに・ｌｌ量・によって記載さ
れた方法（１９７５年）　（８ａｍａｒａｊｅ＊ｗａ　
Ｐ、およびに＠ｌｌ量・Ａ、Ｅ、（１９７５）ｒステロ
イドグルクロニドの放射巌免疫検定、ハプテンとしての
エストロゲンＣ−３グルクｏニドＪ　Ｂｌｏｃｈｓｍｌ
ｅａｌ　Ｊｏｕｒｎａ１月は　３６９−３７６　）　　
によってＩＪＩＩＥされた。二ｍｍ分析物検定の第１次
反応は希釈抗Ｅ　１３　Ｇを必要とし、これはさらＫｍ
ｌｉｉを行うことなく用いられた。 しかし、ペルオキシダーゼ樟陳抗Ｅ　１３　Ｇを調整す
るため、抗Ｐ０３Ｇ固相の調整について説明した方法と
同一の方法で、ウシ血清アルジミンおよびリノ々ノール
との処理およびプロティンＡセファロースを用いるアフ
ィニティークロマトグラフィーにより、１（ｌａｊの抗
血清を分画した。この方法により、抗ｇ　１３　Ｇの純
化ＩｇＧ分画７０ツを優ることができた。 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ　）の梢製西洋ワ
サビベルオキシグーゼ（シグマ、ケミカル、カンフ９ニ
ー、リミテッド１ｌＴｙｐｅＷ、Ｅ、Ｃ，Ａ１、１１．
　］、　７．）をコンカナノ９リンＡ−セファロース（
Ｃｏｎｃａｎａｖａｌｌｎ　Ａ　−ｍ＊ｐｈａｒ＠ａ＊
バシダマ、ケイカル。 カンパニー、リミテッド製）を用いたアフィニティー、
クロマトグラフィーによって梢羨した。ゲルをｔｒ１ｓ
／ＨＣ４ＩＩ働液で平向し、直径ご×１儂のベッドを作
るようにカラムに充填した。このペルオキシダーゼ８ｏ
僧をｔｒｌｍ　−ＨＣ４緩衝液５−に浴かしカラムに加
えた。カラムをｔｒｓｓ／ａｃｚ２５＊を用いて１東に
より俗離させた。浴喝図を分光光度計により２８０　ｎ
ｍおよび４０３ｎｍで測定した。 Ｃｏｎ　−Ａ脱増緩衝液を使用して静−を継続し、さら
［５１１ｊが＃艦した＃Ａ　４０３／Ａ　２８０１ｍ＋
３．１〜３．５の分−が優られた。これらの分ｌｌ１ｉ
を収集しプールして合計１８１１４とした。この中には
推定６４１１Ｆのペルオキシダーゼが含まれていた。こ
のペルオキ・　シダーぜをセファクリル８−２００　（
（ｓ＠ｐｈａａｒｙ１８−２００）英ｉミドックス、バ
ウンスロー、プリンス、リージエント、ロードのファー
マシア、リミテッド（Ｐｈａｒｍａｅｌａ　Ｌｉｄ、　
）　＃！　）　ｔ’用いてゲル１通にさらＫｎｔ製した
。セファクリルのゲルｋ　ｔｒｌｓ／ａｃｔ毅４に液中
で平傭させ、直径７２Ｘ３．２傷のペッドを作るために
カラムに光種した。ペルオキシダーゼ浴液をカラムに〃
口え、カラムｖｔｒｌｓ　／ＨＣ６を便ってヘッド１．
２１１で＃！離した。カラムを波長２８０鵡および４０
３ｍ１１１で測定し、１１！！喝物２４０ｄを収集した
瞳、各号−を約３．３のＡ　４０３　／Ａ　２８０１曲
でｍ　ｆｆ１ｌｌ　Ｌ、た、これらの分−をプールし合
計６３ａｌｊとし１こ。コレはペルオキシダーゼ約５７
Ｉｎｆに相嶺する。 この浴液の中５５　ａ（１にとり最終容積５１１ｊＫ濃
縮し。 ｆａ瞳限外濾過エニット（ｍ１ｅｒｏｕｌｔｒａ　ｆｉ
ｌｔｒａｔｉｏｎｕｎｉｔ　）　（’Ａｍ　／ロスター
、ストーンハウス、アッパーミルのアミコン、すＺテッ
ド（Ａｌ１１ｌｌｌ！＠ｎｏ　ＬｔｄＪ製Ｍｅｄ＠ｌ　
８ＭＣ）によりリン酸堪緩當食塩水に対して透析した。 抗Ｅ１３Ｇ−ペルオキシダーゼ（ＡＥＰ　）の１１１９
１へテロ２１曲拭薬（ｈ＠ｔ＠ｒｏｂｉｆｕｎｃｔｌｏ
ｎａｌ　ｒｅａｇ＊ｎｔ　）としてＮ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）フロＶオン酸（Ｎ　−ｓ
ｕａｅｉｎｌｍｉｄｙｌ　３−　（２−ｐｙｒｌｄｙｌ
ｄｉｔｈｌｏ　）　ｐｒｏｐｌ＠ｍａｔ＠）　（８ＰＤ
Ｐ、ファーマシア、リミテッド製）を使用して、ｍ１ｌ
ｌｌしたペルオキシダーゼを梢製した抗ｍｅ　１３　Ｇ
に対し共有結合的に付着させた。この試薬を用いる利点
は酵素と酵素および抗体と抗体との間のｒｗ＋＊複合物
複合酸を防止し５ることである。この賦４Ｉ＆による反
応機構については詳細に記載した文献がある（ファー１
シア、りンテツドの製品説明書「５ｐｏｐ　　ヘテロ２
１曲賦礪」　、　またＣａｒｌｓｓｏｎ　Ｊ、、Ｄｒ＊
ｖ１ｍ　Ｈ，、ムｘｅｎＫ、（１９７８）　Ｂｌｏｃｈ
ａｍ、　Ｊ、　１７３７２３−７３７　）。 酵素と抗体の双方が８ＰＤＰとの別個の反応の結果活性
化した。次いで】つの成分（この場合誘導体トナったベ
ルオキシダーゼ）をジチオトレイトールで還元した０次
いで自由なチオ基ｖ！にするベルオキシダーぜ＃ｓ４体
ｖｔｓ導体となった抗体と反工６させ、その結果抗体と
酵素量にジチオール架構（ｄムｔｈｌｏｌ　ｂｒｌｄｇ
＊）を形成させた。＊僕の鍵合いを分元光度針で測定す
るため、いずれかの中間生成物を還元することによって
ピリジン−２−チオンの解放を行った。 （資）僧のたん白を含む精製した抗Ｅ１３Ｇ（ＪＬ＋ｓ
Ｊ）の浴液をリンｉ！１２塩緩備負堪水に対して透析し
た。 エタノール０．５ｄ中の５０惜モｋａ１１度の過剰の８
Ｐ口Ｐを攪拌した抗体浴液にゆっくり〃口えた。この浴
液ン２；１℃で加分間維持した。混合物を合計１６のセ
ファデックス（ｓ＠ｐｈａｄ＊ｘ　３　Ｇ　−２５ＰＤ
　ＨＪ　ｖ予め充填したカラム（ファー１シア、リミテ
ッド１ｕｌｌ）Ｋ２．５ｍアリコツトずつ加えることに
より、混合物をゲル濾過した。これらのカラムはリン酸
堪緩衛曳塙水中で予め平向させておいた。ｆｓ４体とし
た抗Ｗ１３Ｇを同じ緩衝液３．５ｄを使用して各カラム
から府：心し合ｔｉ浦Ｗｌｌを慢Ｔこ、抗１１３Ｇの置
換はＩｇＧ１分子あ１こり２−ピリジル２４ａ化物基１
１個と測定された。 上記と平行して、エタノール０．８ｄ中の５ｐｏｐ（３
２μｎａｏｌ）溶液を攪拌したペルオキシダーゼ（５１
ｒｎｆＩ１５ｄ）に）ＪＥＩえることによって精製した
ペルオキシダーゼを活性化し、久℃で加分間維持した。 その醗反応混合物′４を砿普限外ｐ通ユニット中でリン
＃Ｉ堪緩４ｋｊＩ−塩水に対して邊析した。 −擲体としたペルオキシダーゼを、酢酸塩蝦僑液中で＋
関したセファデックスＧＺ５ＰＤｌＯの５本のカラム（
谷カラムあたり２．５ｄ）を用いてゲル濾過した。！ｒ
カラムあたり３．５−の緩伽液でたん白をｍ−し合ｉｉ
　１７．５−を侵た。このペルオキシダーゼ浴液をジチ
オトレイトール１３５．雫で処理することによって自由
なチオール基を作り、混合１１１１ｖＸ℃で本）分間攪
拌した。 リン酸塩緩備賞を証本で平向させた７個のセファデック
スＧδＰＤ　１０カートリツジを使って反応混ン 合物をゲル濾過した６各カラムを緩負液ｊ、５ａＪでて
ｌｌ１ｋ終容横５．６ｄに濃縮し、リン酸塩緩衝食塩水
２５１１４に対して透析した。ペルオキシダーゼ１分子
当りの解放されたピリジン−２−チオンの基数は１．７
と測定され１こ。 この修正したペルオキシダーゼ浴液（５，６１ａＪ　）
１ｋｆｓ導体とした抗Ｅ１３Ｇ浴液（４ｄ）と混合し。 る℃で２４時間攪拌した。上記反応の閣ＫＩｇＧ１分子
あたりピリジン−２−チオン１．６す子が解放されたも
のと測定され１こ。 生成複合体を以下に述べるように二車アフィニティーク
ロマトグラフィーにより非腹合ペルオキシダーゼおよび
非煩合抗Ｅ１３Ｇから純化した。反応混合′４Ｉｊ′４
ｒ：再生コンカナツマリンＡ−セファロースのカラムに
加えｔｒｌｓ／ＨＣ４緩備液１３６−でｆ＃喝した１次
に書生プロティンＡ−セファロースカラムを前のカラム
の出口にそれぞれ１１列接続し、Ｃｏ１１−Ａ呪看緩備
液を使用してｍ１１Ｍを継続し、さらに６０ａｔを収集
した。 ａＫコンカナノ々リンＡ−セファロースのカラムを取外
し、ｔｒｉ・／ＨＣ１＃備液を使用してプロティンｍＡ
−セファロースのカラムを介して＃４雌を続け、さらＫ
］００ｄ１に侵た。次にこのカラムを通る湧ｔｎを逆に
し、浴喘剤をプロティンＡ脱着緩衝液Ｋｆえた。頷合物
の溶離は５０ＩＬｌを収集した後終了しＴこ。約０．６
のＡ　４０３　／Ａ　２８０価を有するＡＥＰ含有分Ｉ
［ｉＩＩ′Ｊｋプールし水酸化ナトリウム希釈液で中性
化し、５１ＪａｌＪＫａｌｌ［ｊ贅した。最ｅｌｋ　Ｋ
　ｋＥＰ　浴液を０．５ｄの部分に分け、液化窒素で冷
凍し、−７０℃で貯蔵し１こ。 ＡＮＰ中に含まれる抗体の収率はｂ８％であり、抗Ｅ１
３Ｇに対するベルオキシダーぜのモル含有率はＡ　４０
２　／Ａ　２８０蜘で１．６であった。　ＡＥＰの最適
作業希釈度は実−により決定した。上記の１ｌＩｌＩ智
は１０００倍〜５０００ｉ希釈というＭ益な爽Ｉ１１範
囲を有している。二ｍ板分析物慣定にとって、複合体を
約２　ｎＭ　、すなわちマイクロテストウェルあたり０
．４ｐｍｏｌ　　の作業ａ度を得るためＫ　ＡＥＰ調整
物を１５００Ｗ！に希釈することが好ましい。 次に本発明の二卓僚分析＠慣定を実施するための工程に
ついて拌細に説明する。この工程は月経周期尿中のＰＤ
３ＧＩｌ！１度に対するＥ１３Ｇ一度の変化を決定する
１こめの最適の方法に関するものである。 Ａ、第１次反応 １、抗Ｐ０３Ｇで被覆したマイクロテストプレートを一
１８℃の貯戚から取出し、保護プラスチックフィルムを
外す前に室温で平情させた０％のつ工０１する各プレー
ト上で４つのウェルなコントロールウェルｔ〔指定し、
他の４つのウェルな非番異同結合ウェルに指定した。 ２、抗Ｅ１３Ｇ抗血清１ｋｇ１次緩衝欲中で３７５０ｖ
４横とじγこ。コントロールウェルを除くプレート上の
もウェルに対し、この杭Ｅ１３Ｇ浴液の１００μｔアリ
コツトをピペットで注入した。コントロールウェルには
第１矢緩嚢液の１００μｔアリコツトをピペットで注入
した。 ３、　　ｍｌ初の尿希釈液または標準試料を試験管また
は１２チヤンネル貯Ｒ器（英国サセックス、ビリンゲス
バースト、トークスロードのグイナテツク、ラボラトリ
ーズ（Ｄｙｎａｔ＠ｅｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｌ＊ｓ　
）製）で調整し１こ。ｆ＆者を１２チヤンネルピペツト
とともに使用した結東試薬と試料をマイクロテストプレ
ートに迅速に移すことがで？！！た。 希釈漱は第１矢緩嚢液中で調整した。希釈度の卸、囲を
ま千申々実験したが、通冨（資）ｐｔの尿または樟４！
浴液を５００μｔＶＣ希釈した。希釈し１こ試料に対し
４．８　ｎＭ　ＭＳＡａおよび４０ｎＭ　ＰＤ３Ｇ　ｖ
ｉ　１次緩衝液中に含む浴液５００　ｐｔを添加した。 この混合物をｆｉ舎ぎ試験管によるかまたは試薬溜めを
少くともＪｔｇｌ憬り動かすことＫＪｌ、つて完全に混
合した。 ４、第１次反応は、抗Ｅ１３Ｇ浴液を収容した８ＰＡＰ
ウエル中にＭＳＡと試料との混合切の１００μｔアリコ
ツトを卯えることにより開始した。この添加は非を異的
結合ウェルＶ除く全ウェルに対し行われ１こ、非番異同
結合ウェルにはＭ１次緩ｌＩ液１００μｔｖ加えた。試
料およびコントロールウェル中のＭＳＡの＊終濃度は１
．２ｎＭであった。試料および非％異的結合つェル中の
抗Ｅ　１３　Ｇの最終希釈度は７５００倍であった。添
加は好ましくは１分間以内に行われ１こ。ウェルはプラ
スチックフィルムまたはプラスチックの儲で覆い、十床
軌遭シェーカー（ｆｌａｔ　ｂ＠ｄ　ｏｒｂｌｔａｌ　
５ｈａｋ＠ｒ　）上で室温で１時閣奈とうした。伽とう
速度は１分間２４０回転、軌道は１．５１径が好ましい
。 ５、ｆ＠１次反１６の終りにシェーカーからプレートを
取外し、好ましくは１２チヤンネルＮｕｎｅ　−Ｉｍｍ
ｕｏｖａａｈ　憤Ｉｔ（フロー、ラボラトリーズ、リミ
テッド製）を用いてｆｃ浄毅備液で洗浄した。この＃ｃ
ｌｔによれば、１列１２１ｉｔのウェル１ｋＩＷＩ　１
ｉｌｉ？　［洗伊することができる。欠いで合判ｔアス
ピレートしｋｆ＆況＃緩貢液で溢れさせた。最後の列を
処理した埃この抗浄工柵をさらに３回（り返した。ｊｌ
ｔ畿にウェルの内容物をアスピレートし、プレート全体
を躾返し、ティシュ−ペーパーの束で覆ったペンチ土で
（”１回か強くたたいた。 Ｂ、第２次反応 抗Ｅ１３Ｇペルオキシダーゼ（ＡＥＰ　）　複合体の貯
戚浴故を−かし、第２矢緩嚢液で１５００倍（２ｎＭ）
に希釈した。この浴液の２００ｐｔアリコクトｖｌｌＪ
工ｍｔｍ、ｉにマイクロタイタブレート中にピペットで
江人した。プレートをＩＷＪ様に撞い前記と同様ＫＶ娘
で１時間損と５した。 第１仄反応のときと同様の方法でウェルを洗浄した。１
こだし４度目の洗浄工種においては、アスピレートおよ
び軽打転線前に合計１０分間洸捗液をウェル中に残して
おいた。 Ｃ０第３次反応 使用した各プレートにつき第３次反応の開始前加分以内
に次の容積のＪ！に實浴液を混合した。 基實浴液Ａ　　　２（ｌｊ 基繊浴ｇＢ　　　２００５１７ ｉ貞浴液Ｃ２０１１７ この混合物２ｕ０１Ｊｔ’ｌ：ピペットで全ウェルに注
入し、プレートを前と同じように再び〜い振と５し１こ
。ただし反１６時間はわずか１５分間であった。 上記時１１１経過時にマイクロエリザ・オートリーダー
（Ｍｌｅｒｏ＠ｌｉｍａ　ａｕｔｏ　ｒｅａｄ＠ｒ　）
　（ダイナチック、ラボラトリーズ、リミテッド＃）ヲ
使用して各ウェルにおける色の変化を測定し１こ。％の
ウェル全部を約１００秒間内に読み取れるので酵素反応
を停止りする必要はなかつ１こ。この装置のテストビー
ムノ波長フィルターは５７０ｔ＋ｍＫセットし、基準ビ
ームのｅ長は４０５ｎｍ　にセットした。また未処理の
マイクロテストプレート中にピペット注入してあった基
貞混合＠　２００μｔに対しこの装置を使用するｌＩＩ
ｍｒｔｃｖｉｔ直をゼロにセットしておいた。 上記反応の４１！を来は狽製された試料に対する平均吸
光度（Ａ　５７０　ｎｍ）の示度として表わされ一通富
コントロールウエルの十Ｘ４　Ａ　５７０　ｎｍ　の自
分単にｆ懐された。 月 年経周期尿においてＥ１３ｂは１（１〜４００　ｎＭで
あり、排卵前のＥ　１３　Ｇの変動を償却するための臨
界範囲は加〜１１００ｎである。Ｐ０３Ｇは月経周期尿
中で遡＄１００〜５０．０００　ｎＭ　の範囲であり、
妊娠ａＪ舵期闇の終了を＋ＩＮ知するための臨界濃度は
１０００〜４０００　ｎＭである。 本慣定系は、画ステロイドの相対１１１１ｆＫ大きな走
があるＫもかかわらず、月経周期尿中に検出される両ス
テロイドの各＃度に同時に応答しうるように岐通化され
ている。また上記の臨界範囲内において、４：ｄＩＮ出
系は、所定の尿希釈度（または希釈範囲）において実施
された場合は、０６０２〜０．１のＥ１３Ｇ／ＰＤ３Ｇ
モル比変化に敢大＠に応答し５るように設計されている
。 これは二ｌＬ被分ＩＩＴ物検定の投与量一応答時性を横
置することによって達成された。Ｅ１３ＧおよびＰ０３
Ｇの標準浴液を生壇学的範囲に対応して第１（′に械債
漱中でａｌｔ４幣し、Ｐ０３Ｇ標準浴液を除いては慣電
工橿にしたかい試験した。Ｐ０３Ｇ標準酒液は第１次緩
ｆｉ＋液中で抗Ｅ１３Ｇの存在しない状態で試験した１
次の事項に対するこれら標準浴液の影響を決定するため
多数の変数を調査した。 ｔａ＋　　ゼロ・ステロイド標準と最高ステロイドＩＩ
ＩＩｉ度との閣の信号強震（吸光度）の変化 ｌｂｌ　　Ｌｂ答の８／Ｎ比 （・）各投与量一応答開−の相対的傾斜（吸光匿対１０
　ｆ投与量としてプロットしたもの）ｌｄｌ　　１０　
ｆ投与賃軸に対するＰＤ３Ｇ投与量一応答曲、ｔＭの位
置と比較したＥ１３Ｇ投与電一応答１−のｉｏｙ投与量
軸に対する位置 調査したｆａのい（つかは次のとおりである。 １　）　ｄ　：　Ｅ　１３　Ｇ　ｓ分とＰＯ３Ｇｍ分と
の間の異なる架＃４長さの影響 二電被分析物慣定の工程に従い（抗Ｅ１３Ｇの不存在を
除（）　Ｍ８Ａ４、Ｍ８Ａ６、Ｍ８Ａ８、Ｍ８Ａわを濃
度範囲０．２〜ｌ（Ｊ　１１Ｍにおいてテストした。Ｍ
８Ａ＠は８ＰＡＰに対するＡＥＰの最高の結合を示した
（第２図）、Ｍ８Ａ４は結合が２８〜４６鳴低く、まｙ
、−Ｍ８Ａ。 とＭＳム１゜は廊Ａ、が示した結合のｌＯ暢以下であつ
た。Ｍ８Ａの２つのステロイド基の闇の乗積の長さは明
らかに決定的であった。メチレン炭素６１１ｉ１１より
も短い条横の長さはＭ８ＡＫ対する５ＰＡＰとＡＥＰ収
万の１ｆｆＪ時Ｗｉ台を市１１限する。−万メチレン炭
素６１１ａｌより侵い乗積の擾さは架慣がそれ自身を折
りたたむのに元号であり、これまた８ＰＡＰとＡＥＰの
同時結合を立体的に妨げる。したがってへキサメチレン
装備を有するＭｓＡ、は二Ｗ４ｊｋ分析物検定にとって
好ましい試薬として選択された。 ２）　　Ｍｌ嬶０）ｍｔ Ｍ８Ａ、ａｌｌ範囲０．２〜加ｎＭ　　についてＰ０３
Ｇ投与敏一応答特性を―べ１こ、、すべての１庫がＰＤ
３ＧＩＩ＃度と信号強震との間には反比例関係があるこ
とをホした。それらはすべてＰＤ３Ｇの／ａ度がθ〜ｌ
ＯｎＭにおいてＡＥＰ結台が少し下降する高原吠標であ
り、ＰＤ３Ｇ濃震がｌＯ〜１１０００ｎの閣で直線的に
（１０）直線プロットにおいて）下降する時性を有して
いる。２　ｎＭ以下のＭ８Ａ一度はもつとも狗、な勾配
、すなわちより応答性の高い系であることをボし１こ。 しかし１　ｎＭ以下のＭ８１１１ｍにおいては信号Ｉｌ
ｉ！１度は全体に諷少することが観測された。 まｙ：同様のＭｓ＊Ｉｌ＃［＃囲についてＫ１３Ｇ投与
量一応答時性を調べた。この場合はＩ　１３　Ｇ　ＩＩ
Ｉ嵐と吸光度示度との闇に直接の関係が示された。この
場合も谷曲巌の位置は＆１１８ＡＩＪＩＦｊＬにはとん
ど影響されない、もつとも急峻なしたがってもつとも応
答性の良い曲ｍｓ囲は１〜１０　ｗｓＭ　Ｅ　１３　Ｇ
にあった。しかしＩ　ｍＭ未満のＭＳＡａｌｌ嵐におい
ては、勾配はよりゆるやかＫなつｆ、ニー、　１．２ｙ
ｓＭｖ碩えるＭ８ム１１１ｆにおいては曲−のＳ／Ｎ比
が感化した。したがってＭ８Ａ、　ａ度］、２ｎＭ　が
この試薬の好ましい濃度である。 ３）筑」Ｊム［化九良 Ｅ１３Ｇ抗血清については、それが第１次反応における
試薬として添加される＃に、最適の希釈度Ｖ実験的に決
足しなければならない、第１次反応における［終希釈度
として抗１１３　Ｇは５，０００倍〜２５．０００　％
の範囲で希釈した。Ｋ１３Ｇ投与量一応答時性を多くの
抗Ｅ１３Ｇ希釈液について調べた。 抗Ｅ１３Ｇの希釈液が増加するにつれて、Ｋ１３Ｇ投与
量−１６答曲巌の位置は丘へ移動した。すなわちより低
いＥ１３０ｍ度に対し応答性が増大した。 しかし、この効果は１８１３０＃ＩＪｊ変化に対する信
号傾板の変化が減小すること罠より打消された。また８
／Ｎ比も感化した。最適のＫ１３Ｇ投与量一応答ｔ＃性
四−は抗Ｅ　１３　Ｇの７５００　％希釈液において優
られた。 二］［被分析物検定の工程に従いある範囲のＥ１３Ｇお
よびＰＤ３Ｇ樟準浴液をテストした。その結果潜られた
投与量一応答曲線を＋＠３図に示す、各自−のもつとも
急峻な領域は、生理学的にｘｌ！なＥ１３Ｇ／ＰＤ３Ｇ
比範囲に対し良い応答を許容し５る程度に光分啜れてい
る。 たとえば１月経周期尿を５倍希釈尿でテストしたとする
と、初期卵胞期のＥ　１３０　ｍｌ　Ｑｊ　（ａｌ　ｎ
Ｍ　）はＥ１３Ｇ［１１−の下層で０．８　ｎＭ付近に
ある。しかし醗期卵胞期の上昇するＥ　１３　Ｇ　＋１
１１１鍵は、Ｋ１３Ｇ曲−のもつとも急峻な領域におい
て約４　ｎＭ　Ｋあるので容易に検出しうるであろう。 逆に卵胞期の闇１０００　ｎＭ＊　タハソｔＬ以下０）
　ＰＤ３Ｇｉｌｌ＆＆’！ｍ　ｋ　約４０憾Ｊｆ！４Ｉ
ｆＬの１Ｎ号強賞減小を生じるにすぎない、しかし月−
周期の政体中期までＫ　ＰＤ３Ｇａｌｆは信号を約７０
鴫減小させ、初期卵胞期に＠側された吸光度のｔｊＪＫ
近ずく。 月経周期中のＥ１３Ｇ／ＰＤａＧ比の変化を反映する二
慮被分析物横定の投与量一応答特性をシはユレートする
ため、Ｅ１３Ｇ襟単浴液およびＰＤ３ＧＩＩＩ準浴液の
マトリックスを作り標準工種でテストした。 第４図は、低ＰＤＢＧＩｌ共（４０ａＭ）の存在下にお
けるＥ１３Ｇ投与１一応答−ｍを示す、このｖＫ聾はた
とえば２５倍希釈尿試料について卵胞期において光分存
在しうるものである。生理学的ベースラインＶ表す０．
０２以下の些１２Ｇ／ＰＤ３Ｇ置はすべて曲−の底のお
？−むね、平坦な領域にある。典型的な排卵前のエスト
ロゲン変化の関に＠側される０、Ｑ３以上の１１はすべ
てＥ　１３　Ｇ投与量一応答画一のもつとも、甑峻な韻
域にあり、しＴこがって容易に検出しうる。 第２の曲−は＾Ｅ　１３　Ｃｉ　６１度の存在下におい
てＰ０３Ｇ棲度が増加する場合を示す、この［１は月経
周期中の黄体期において存在しうるものである。 ＰＯ２（４［が１０倍増加すると４Ｆ！ｒ号はほとんど
初期卵胞期の埴Ｋまで減小する。 ｒｓＩＩｔ比を決定すること罠よって優られる利点は。 Ｗｉ果が容積の大小に無関係であること、すなわち結果
が試料の希釈度に無関係であることである。 二市被分析物恢定の場合は、投与量一応答画一の応答範
囲はほとんど１桁の大きさ以上のものではないので、結
果は試料の希釈度にまったく無関係ではない。しかし、
ある限界を超えると二重１１分析物検定は試料の希釈度
に対しては相当に寛容である。Ｅ１３ＧとＰ０３Ｇの各
標準溶液は月経周期尿の典嘲的なａ健を表す０．０２と
０．２の間の４つの比率を与えるようにｆＪ＃幣した。 これらの標準浴液な５％、１０倍、５倍および３３ＷＩ
の各希釈度について二事破分析物慣定によってテストし
た。その結果を次にボす。 Ｑ、Ｌ１２　　　　　　　　　　　２２．２　　±２．
２０．０４　　　　　　　　　　２８．５±１．１０．
１２　　　　　３６．２±３．４ ０．２　　　　　　４３．９±６．０ 検定の試料希釈度九対する許容度は尿容積を作る際の１
こいていのバラツキに対処しうるだけの幅を光分に有し
ている。 本二重被分析物検定は多数周期にわたる月経周期にわた
るＥ　１３　Ｇ　／　ＰＤＳＧ比における相対変化な観
測するために１史用された。この期間中尿試料は毎日テ
ストした。典型的な周期中の結果を第５図に示す。この
グラフはコントロールウェル吸″ｙｔ、ｆに対する吸光
度対周期の各月についてプロットしたものである。この
慣査対凌は排卵時を決定するためウルトラソノグラフィ
（ａｌｔｒａｍｏｎｏｇｒａｐｈｙ　）　Ｋよっても観
測し１こ。ウルトラソノグラフィは１日１度行われたの
で、この場合は２４時間の不確実さがあり、これはグラ
フ土岐の破−で示した。 周期を通じての吸光駿の形状は、排卵時直噴の４日間に
わたり明確な急上昇をボしている。それは排卵の１日前
にピークに遅している。吸光度は落ち込んでいる。初期
卵Ｗ＆期疋おいては小さなピークがあるが、これは普通
のことであり卵胞活動を表すものである。しかし、大き
なピークは一期を支配し、妊娠町１１期間の決定と排卵
時の接近の予想よ＃Ｊ確な指憚を提供する。 第６Ｉ３ｖ、ｌは本二ｌ［被分析物検定を用いて合計１
７の月経周期の闇毎日ｗ、試料を測定した結果を示す。 第６区１において −横出灯壕の月経周期の開始を示す。 〉　構出対象の月経Ｓ期の終了を示す。 ○　　構出対象のＪｋ＃体温の上昇が観測された日を示
す。 Ｕ　　排卵時がウルトラソノグラフィーにヨリ測定され
た周期を示す。２本の縦の平行な破線によって下″を瀕
時間の期間中卵胞破裂が起った。 ８　　　；！（４２体銀が上昇した日により排卵時が測
定された周期を示す。これは贅の点線によって示す日に
起った。 吸光度の上昇した櫃が１１！醐された日を強−するため
に相対吸光度の任意のしきい厘が選ばれた（コントロー
ルウェルに対シ３５鴫）。 １７人の債出対象全織について排卵日またはその数日１
！ＩＩ（８日前まで）Ｋ吸光麗はこのしきい１１を超え
た。またほとんどの構出対象について排卵後２日醗迄忙
しきい種以上の１婦が曖陶された。黄体期または初期卵
胞期の閣はしきいｔｉｌｔ’超えることはなかった。 これらの結果は、本二１被分析物横定により作られる９
１号のしきい値はすべての月経周期尿に普遍的な＊ＫＩ
４ぶことができることを示している。 したがって不二東仮分析物検定は、女性が月経周期中の
妊娠ＯＴＤ勘開にあるか否かを示すイ看ス・ノー型テス
トの基礎を形成するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は２つの被分析物であるＥ　１３　ＧとＰ０３Ｇ
の檀々の惚磯状寒鐘莢における二重被分析１横定の１実
施例の作用を下す凶、第２−は配位子の乗積ｉ′持分子
の長さを変化させることＫよるｍｔ繊抗％（［ｇ１３Ｇ
ベルオキシダーぜ、ＡＥＰ）の固相抗体（固相抗Ｐ０３
Ｇ　、　８ＰＡＰ　）への結合に対する影響をホす図、
第３図はｇ　１３　ＧとＰ０３ＧＫついての投与電一応
答曲ＩＩＩＩｌｌｖ示す図、＃＆４図はシイユレートし
た月経周期条件下における内被分析物の投与電一応答曲
巌を示す園、ＷＪ５図は典型的な月経周期についての二
ｊＬＭＬ分釘物慣足の結果を示す図、第６図は１７人の
ｆ；ｃ性から各人の全月経周期にわたって毎日採取した
尿試料を二１１８分析物検定を使って測定した結果を示
す棒グラフである。 手　　続　　補　　正　　書 昭和−年４月／２Ｅ１ 特許庁長官　　着　杉　和　失敗 １　事件の表示 昭和ｓ８年特許願第　２１３５１１　　　“す ２　発明の名称 免役横定法 ３　補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 テレンス、シーワード、ペイカー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　構成要素として、 ａ）第１の抗原ｍ＊と＠２の抗原潜員とを含む試料層液 ｂ）　ＩＩＦ記第１の抗ｍ浴實の決定基に可逆的に結合
   し５る第１の抗体であって、＃ｌ液中にある抗体 ６）前記＠２の抗原溶質の決定基に可逆的に結合し５る
   第２の抗体であって、同相支持体に不可逆的に結合して
   いる抗体 ｄ）＃記第１の抗体が可逆的ＫＭ合し５る第１の抗原と
   、前記第２の抗体が可逆的Ｋｍ會しうる襖２の抗原とを
   含み、該第１の抗原と該＃Ｉ２の抗原は架橋支持分子を
   介して相互に小町ＭＥＦＪＫＭ合している配位子分子で
   あって、浴液中にある配位子分子 働）抗原に対し可逆的に結曾しうる４ｍ＋誠を付した抗
   体 を備え１次の工程を含む検定法 ａ）前記第１の抗体、ｍ記第２の抗体および前記配位子
   分子のすべてが前記試料との混合前に相互ＫＡ合してい
   ない場合に、前記試料層液、＃記第１の抗体、前記第２
   の抗体および前記配位子分子の混合物を形成する工程ｂ
   ）　ｆｆ混合物をインキュベートすることによって％ｆ
   ｅＩ記紀位子分子と前記第１の抗原溶質との間に前記第
   １の抗体と会合すべく競合を許容し、かつ前記配位子分
   子と前記［２の抗腺沼貞との関に＃記第２の抗体と会合
   すべく刺合を許容する工程 ｅ）前記同相支持体を前記標識を何した抗体に接触させ
   ることにより、該標識を付した抗体と未結合第１抗原と
   の閣の会合を許容する工程 ｄ）繭紀配位子分子およびｓｔｒ記第２の抗体な介して
   前記固相支持体ＫＮ合した４ＷＩＲｖ何した抗体の童を
   決だする工程。 ２、前記配位子分子は１つの第１の抗原と１つの第２の
   抗原とを含み、該２つの抗原は条横支持分子を介して相
   互に不可逆的に結合している特許請求の範囲第】項記載
   の横定法。 ３、　　ｎｕ紀混合物は前記各構成要承をｌ工程で混合
   することにより形成する特許１ｓ）ＩＣの範囲第１項ま
   たは第２填配械の横定法・ ４、　　ｍ記混合物は、前記試料溶液および前記配位子
   分子の混合物を形成し、この混合物ｖ＃ｉ記第１の抗体
   と＾■記第２の抗体との関に形成した温金物と混合する
   ととくよって形成されるｅ詐情求の範囲第１墳〜第３項
   のいずれかに記載の検定法。 ５、尿中のエストロン−３−グルクロニドとプレグナン
   ジオールー３−グルクロニドの相対ａｍを測定するため
   ％粁情求の範囲第１項〜第４項のいずれかに記載の横定
   法を用いる月経周期中の吐１ｋＲ川−じ期間を決定する
   方法。 ６、前記横定法に使用する前記配位子分子は、架膚叉待
   分子を介して不可逆的Ｋｔ１合した少くとも１分子のエ
   ストロン−３−グルクロニトト少くとも１分子のプレグ
   ナンジオール−３−グルクロニドを含む特許１ｆｉＩ求
   の範囲第５墳紀賊り方法。 ７、　前記配位子分子は次式のものである特許請求の範
   囲第５ＪＡ記載の方法。 ８、％ｆｆｆ曙求の範囲第１項〜第４虜のいずれかに記
   載の慣一定法または％奸晴求の範囲第５項〜第７ＪＪ１
   のいずれかに記載の方法を実施するための試薬キット。 ９、＃Ｉ記第１の抗体と、前記第２の抗体と、前記配位
   子分子とを別１ｉｉＩＫ含む％特許請求のｌＡｓ第１項
   〜＃！３Ｊｉ４のいずれかに紀械の検定法を実施するた
   めの試薬キット。 １０、前記第１の抗体、前記第２の抗体および、これら
   と削個に、前記配位子分子を含む、特許請求の範囲第１
   墳、第２項または第４項記載の横定法を実施するための
   試薬キット。 １１、　　架橋支持分子に不可逆的に結合した２つの異
   る抗原基を含み、該架構支持分子は２つの反応性′１能
   基を有する有機化合物から得た２−の基である配位子分
   子。 １２、　　＠記２＠Ｊの基は次の一般式の化合豐から得
   られる特ｆＦ＃１１求の範囲第１】項記載の一配位子分
   子Ｒ−（ＣＨ２）！ｌ−Ｒ ただし、Ｒは−ＮＨ２、ハロゲン、または−０−ＣＯ−
   アルキルであり亀は２〜ｉｏ。 １３、　　Ｒバー　ＮＯ３である’ｆｔ＃’Ｆｌ１１１
   累の範囲第１１項または第１２項配賊の配位子分子。 １４、ｎは６である特許請求のＩＩｉ！囲第１１墳〜第
   １３項のいずれかに記載の配位子分子。