JPS58157799A - Ｄｎａ合成装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明はＤＮＡ合成装置に関し、さらに詳しくは、異
種のＤＮＡを同時に合成することが可能なりＮＡ合成装
置に関する。

ＤＮＡの合成法として、いわゆるジエステル法、トリエ
ステル法、ホスファイト法と改良発展がなされ、さらに
これらの方法を利用し、固形支持体を用いる固形支持体
法が各種の利点を有することから多用されるに到ってい
る。そしてこれらの方法によってＤＮ’Ａ合成を行う装
置も各種提案されている。

一方、多種の核酸の混合物から成る特定のタンパク質の
注産に係る核酸を分離する手法として、そのタンパク質
のアミノ酸シーケンスからその核酸の塩基配列を推測し
、その塩基配列と相補的な塩基配列を持つＤＮＡを合成
１−１これにマークをつけて混合物に加え、合成したＤ
ＮＡを目的核酸に結合させたのちマークを目印に１〜で
、その目的核酸をつり上ける手法がある ところがタンパク質の１つのアミノ酸に対して多くの場
合複数の遺伝暗号が存在し、その結果ＤｌＪＡの塩基配
列に敗多くの可能性が生じる。この場合には、可能性の
ある全てまたは一部のＤＮＡを合成し混合して用いるの
が普通である。

しかし、従来のこの種の装置では、同時に多種のＤＮＡ
を合成することができなかったので、複数台のこの種の
装置を必要とするか、もしくは１台で順に異ったＤＮＡ
を合成しなければならず、非常に不便であった。

この発明の発明者は、種々検討の結果、公知のＤＮＡ合
成装置を改良することに成功した。

かくして、この発明によれば、ペプチドのアミノ酸配列
を入力するだめの入力手段、入力されたアミノ酸配列を
これに対応する１種以上のＤＮＡの塩基配列に変換する
変換手段、および得られた１種以上の塩基配列のそれぞ
れに基いてＤＮＡ合成用試薬を選択し実質的に同時に反
応器に供給可能な試薬供給手段を具備［７てなるＤＮＡ
合成装置が提供される。

この発明の装置の主な特徴は、アミノ酸配列を入力する
ことによって自動的に対応するＤＮＡを合成可能なシス
テムであり、かつ対応するＤＮＡが１種以上あるときに
は複数種のＤＮＡを同時に合成可能なシステムであるこ
とにある。

以下、図に示す実施例に基いて、この発明を詳説する。

ただし、これによりこの発明が限定されるものではない
。

第１図に示す（１）は、この発明を適用したホスホトリ
エステル法によるＤＮＡ自動合成装置である。

反応器（２）は内径８ｆＩＩ＋、高さ１ｏｓｏ＋の円筒
状の本体（３）の上方にすりばち状７ランジ（４）を設
けた容器である。すりばち状フランジ（４）には、多数
の試薬溶液等供給用のノズルが挿着された栓（５）が装
着されている。そこで、本体（３）の頭部開口が試薬溶
液等供給口（６）となる。本体（３）の内部下方にはガ
ラスフィルタのごときフィルタ（７）カ嵌着され、さら
に底部には排液口（８）が設けられている。フィルタ（
′７）は、ポリスチレン、シリカビーズのごとき支持体
（９）を載置できる（透過させない）もので、試薬溶液
、溶媒、ガスを透過させるものである。フィルタ（７）
の上部空間が反応部（１０）になり、約４５０Ｈの容積
の空間である。

試薬溶液は全部で８種類ある。（１２）〜（１５〕は各
種のヌクレオチド試薬で、それぞれベースにアデニン、
シトシン、グアニン、チミンを有して　３− いる。（１１）は縮合剤で、２−４−６−トリメチルベ
ンゼンスルホニルー３−ニトロトリアゾリド（ＭＳＮＴ
　）のピリジン溶液である。（３９）は床誹基脱離剤で
、イングロバノールと塩化メチレンの混合溶媒に臭化亜
鉛を〆解した溶液である。（４０）はマスキング用試薬
で、無水酢酸とピリジンの混合液である。（４１）はマ
スキング用縮合剤で、ジメチルアミノピリジンのピリジ
ン溶液である。

シリンジポンプ（２１）〜（２５）は、それぞれ切換コ
ック（１６）〜（２０）を介して上記試薬溶液（１１）
〜（１５）を吸入し、液溜め（５６）および混合用コイ
ル（５７）からなる混合手段を介して反応器（２）へ供
給しうる。

シリンジポンプ（２１）〜（２５）のプランジャはそれ
ぞれプランジャ駆動機構（２６）〜（３０）で駆動され
る。

プランジャ駆動機構（２６）は、パルスモータ（３１）
と、それにより回転されるネジ軸（３２）と、そのネジ
軸（３３〕の回転により移動してプランジャ（２１ａ）
を上下させるナラ）　（３３）とからなっておす、パル
スモータ（３１）　Ｕマイクロコンピュータのごとき制
御回路（３４）でパルス制御されている。

他のプランジャ駆動機構（２７）〜（３０）も同様の構
造である。

（３６）〜（３８）は溶媒で、それぞれ乾燥用揮発性濱
媒のテトラヒビロフラン（’Ｉ’ＨＦ）　、洗浄用溶媒
のピリジン、同じく洗浄用溶媒のイングロバノールと塩
化メチレンの混合液である。これら溶媒（３６）〜（３
日）および前記試薬溶液（３９）〜（４１）は、窒素ガ
ス圧によってそれぞれ弁（４２）〜（４７）を介して反
応器（２〕に供給されうる。

弁（４日）は、窒素ガスで反応器（２）内をブローする
ために、窒素ガスを直接反応器（２〕へ供給するもので
ある。なお窒素ガスは塩化カルシウムのごとき乾燥剤（
４９うで乾燥されている。

制御回路（３４）は、前述のようにプランジャ制御機構
（２６）〜（３０）を制御する外に、切換コック（１６
）〜（２０）ｌ弁（４２〕〜（４Ｂ）　（５０）〜（５
５）の作動を制御する。また、操作卓（３５）を介して
オペレータと対話を行う。

また制御回路（３４）は、内部にアミノ酸をＤＮＡの塩
基配列に変換するためのテーブル（３４ａ）を持ってお
り、操作卓（３５）からアミノ酸配列が入力されたとき
にこれをＤＮＡの塩基配列に変換する機能を持っている
。テーブル（３４ａ）の内容は第２図に示すようである
。ただし、第２図で文字１１　Ａ／′。

１１　Ｃ１１、Ｓ’　Ｇ７／　、　　Ｊ＃はそれぞれ塩
基が＼゛アデニンｒｒ、＼゛シトシンｌ／Ｘ’グアニン
“、”ウラシル“であることを表わしており、壕だアミ
ノ酸は次表の略ちで表わしである。

アラニン　　　　　　　　　　　　ａｌａアルギニン　
　　　　　　　　　　ａｒｇアスパラギン　　　　　　
　　　　ａ８ｎアスパラギン酸　　　　　　　　　ａｓ
ｐ肘止鯨←Ｌ臼わだ中：ニニ＝二づ システィン　　　　　　　　　　　　Ｃｙｓグルタミン
　　　　　　　　　　　　ｇｌｎグルタミン酸　　　　
　　　　　　　ｇｌｕ−−−＝〒−−−−−−−−−−
−−−□グリシン　　　　　　　　　　　　ｇ１３’ヒ
スチジン　　　　　　　　　　　ｈｉｓイソロイシン　
　　　　　　　　　１ｌｅｕロイシン　　　　　　　　
　　　　　ｌｅｕリジン　　　　　　　　　　　　　　
ｌｙｓメチオニン　　　　　　　　　　　ｍｅｔフェニ
ルアラニン　　　　　　　　ｐｈｅプロリン　　　　　
　　　　　　　　ｐｒ。

セリン　　　　　　　　　　　　ｓｅｒスレオニン　　
　　　　　　　　　ｔｈｒトリプトファン　　　　　　
　　　　ｔｒｐチロシン　　　　　　　　　　　　ｔｙ
ｒバリン　　　　　　　　　　　　ｖａｌこのテーブル
（３４ａ）によって、アミノ酸配列をまずｍＲＮＡの塩
基配列に変換し、そのｍＲＮＡの塩基配列に％ｔＧ“−
ゝゝＣ″　、”Ａ″−ゝゝＴ　、　ＩＩ　Ｕ／／−１’
、　Ａ　／／なる変換を施してｃＤＮＡの塩基配列を得
る。このｃＤＮＡの塩基配列はｍＲＮＡをクリ上げるだ
めのプローブＤＮＡの塩基配列をあられしている。

ｃＤＮＡをつり上げるだめのグローブＤＮＡの塩基配列
は、ｍＲＮＡをつり上げるための前記プローブＤＮＡの
塩基配列に′Ｓ　Ｃ“←′ｌ　Ｇ　／／　　、　Ａ　′
／−ｔｌ　Ｔ　／／なる変換を施して得られる。

操作車（３５〕は、英字および数字キーを有しており、
これによってアミノ酸配列を入力可能である。

次にこの装置（１）の動作を説明するが、説明の都合上
、たとえばゝ１アスパラギン酸−リジンーグルタミン−
チロシン“なるアミノ酸配列に対応す　、るｍＲＮＡを
クリ上げるためのプローブＤＮＡを合成する場合を例に
あげて説明する。

まず操作卓（３５）において１−　ａｓｐ　、　２−１
ｙｓ　。

３−　ｇｌｎ　、　４−　ｔｒｙ　／　ｍＲＮＡ　／　
ｃＤＮＡ　／　ｐｒｏｂｅ　（ｍＲＮＡ　）、”と打鍵
する。

そうすると制御回路（３４）は、テーブル（３４ａ）を
参照し、操作車（３５）のディスプレイ上に第３図のよ
うな画面を表示して変換した対応するｍＲＮＡ　。

ｃＤＮＡ　、グローブＤＮＡの塩基配列をオペレータに
知らせる。この画面で最上段の表示（１００）は、入力
したアミノ酸配列であり、ＮＨ２側からの配列であ８− ることを示している。次段の表示（１０１）は、第２図
の内容のテーブル（３４ａ　）から変換されたｍＲＮＡ
の塩基配列であり、画面左側が５′側、右側が３′側で
あることを示している。表示（１０２）は、−ｈ記ｍＲ
ＮＡの塩基配列に基いて得られだｃＤＮＡの塩基配列で
ある。表示（１０３）は、上記ｍＲＮＡをつり上げるだ
めのプローブＤＮＡの塩基配列である。

プローブＤＮＡは、第３図の画面から判るように各アミ
ノ酸に対し２種類の塩基配列の対応があることから計１
６種類考えられることになる。ここでオペレータは、操
作ＪＥ　（３５）の１′力−ソル移ｍｌ′キー　および
”消去″キーを使用してカーソル（１０４）を不要と思
われる塩基表示の下に移動してそれを消去することがで
きる。つまり、これにより合成する種類を減少させるこ
とができる。

オペレータは最終的な表示から合成すべきＤＮＡの塩基
配列を知る。たとえば第３図の画面から塩基にシトシン
を持つヌクレオチドが結合された支持体から合成がスタ
ートされることを知り、栓（５）をはずして反応器（２
）内にこの支持体を入れる。

この址は、たとえば支持体がポリスチレン粉体の場合に
は合計で１Ｏｎｙ〜５０■が好適である。栓（５）を元
に戻した後、入れた支持体の量などを操作卓（３５）を
介して制御回路（３４）に入力し、ついでスタート指令
を入力する。

すると制御回路（３４）は、弁（４４）、（４ｓ）、（
５０）ｔ（５１）を作動してイソプロパツールと［化メ
チレンの混合溶媒（３８）を反応器（２）に供給し、支
持体（９〕を洗浄する。つまり、弁（４４）、（５１）
を開いて溶媒（３８）を供給し、弁（４４）、（５１）
を閉じたのち、しばらくおいて弁（４Ｂ）ｌ（５０）を
開いて排液し、弁（４Ｂ）　、　（５０）を閉じる。こ
れを数回行う。

この洗浄ののち、弁（４５Ｌ（５１）を作動して保護基
脱離剤（３９）を反応器（２）に供給し、所定時間おい
たのち、弁（４Ｂ）、（５０）を作動して排液する。

支持体（９）に結合されていたヌクレオチドの５′水酸
基は、あらかじめ保護基としてジメトキシトリチル基（
ＤＭＴｒ）をつけられて保護されているが、上記動作に
よってその部位のＤＭＴｒが脱離される。

次に制侮回路（３４）は、再び弁（４４）ｌ（４Ｂ）ｌ
（５０）１（５１）を作動してインプロパツールと塩化
メチレンの混合溶媒（３８〕を反応器（２）に供給し、
支持体（９）を洗浄する。さらに弁（４３）　、　（４
Ｂ）　、（５０）ｊ（５１）を作動してピリジン（３７
うで反応器（２）内を洗浄する。

ついで弁（４２）、（４Ｂ）Ｉ（５０）、（５１）を作
動してＴＨＦ　（３６）で反応器（２）内を洗浄し、次
に弁（４日）。

（５ｏ）、（５１）を作動して窒素ガスで反応器（２）
内を数分間ブローする。これにより反応器（２〕内は完
全に乾燥される。

制御回路（３４）は、次に結合すべきヌクレオチドは塩
基にチミンを持つものであるから、切換コック（２０）
およびプランジャ駆動機構（３０）を作動し、また排気
弁（５４）を作動してヌクレオチド試薬溶液（１５）を
液溜め（５りに供給する。一般的には次に結合すべきヌ
クレオチドの塩基に応じたヌクレオチド試薬溶液を（１
２）〜（１５）の中から選択し、それに対応する切換コ
ック、プランジャ駆動機構および排気弁（５４）を作動
してそのヌクレオチド試薬溶液を液溜め（５りに供給す
る。注意すべき−１１− ことは、次に結合すべきヌクレオチドの塩基が複数種あ
るときにはこれらに対応するヌクレオチド試薬溶液をす
べて供給することである。つまり、第３図の下段の表示
（１０３）　Ｋ示されているように、第２回目の合成サ
イクルでは、塩基にアデニンを持つヌクレオチドと塩基
にグアニンを持つヌクレオチドとが必要であるから、こ
のときにはヌクレオチド試薬溶液（１２）および（１４
）を共に液溜め（５りに供給する。

必要なヌクレオチド試薬溶液が液溜めＣ５６）Ｋ供給さ
れたら、弁（５１）（５ｚ）（５ｓ）を作動して、液溜
め（５６）内のヌクレオナト試薬溶液を反応器（２）に
供給する。ヌクレオチド試薬溶液が複数種あっても、混
合用コイル（５７）で均一に混合されたのち供給される
ことになる。

上記ヌクレオチド試薬溶液の供給と同時に、制御回路（
３４）は切換コック（１りおよびプランジャ駆動機構（
２６）を作動し、シリンジポンプ（２１）によって縮合
剤〆液（１１）を反応器（２）に供給する。

供給量は、ヌクレオチド試薬溶液と縮合剤の合　１２− 計量が支持体（９）を膨潤するのに充分な最低量となる
ように制御される。具体的にはたとえば支持体（９）が
ポリスチレン粉体の場合には支持体ｌｙ当りに、ヌクレ
オチド試薬的３１．縮合剛的２ｒｎｌとする。言うまで
もなく、これら最低量の試薬溶液中に充分に試薬を含む
ように濃度調整しておくことが必要である。

上記動作によって、支持体（９）に結合されていたヌク
レオチドの所定部位に所望のベースをもつ新たなヌクレ
オチドが連結される。複数種のヌクレオチド試薬溶液を
混合して供給した場合には、塩基の異なるヌクレオチド
を連結されたものが混在することになる。なお新たに連
結されるヌクレオチドの５′水酸基は、予め保護基のＤ
ＭＴｒによりブロックされている。

一定時間の後、弁（５０）〜（５５）を作動してピリジ
ン（３’７．ｌ［て液溜め（５６）　、混合用コイル（
５７）および反応器（２）内を洗浄する。

支持体（９）がポリスチレン粉体の場合、支持体１７当
りに約０．１　ｍ　ｍｏｌのＤＮＡ分子の末端部分が結
合されており、そのほとんどには上記のように新たなヌ
クレオチドが連結される。しかしながら数％以上は未反
応で残る。このため制御回路（３４）は次のように未反
応の反応基にマスキングを行う。

すなわち、弁（４６に４ツ）（５１）を作動してマスキ
ング用試薬溶液（４０）およびマスキング用縮合剤沿液
（４］、）を反応器（２）　Ｋ供給する。

マスキング後、制御回路（３４）は弁（４３）（４Ｂ）
（５０）（５１）を作動して反応器（２）内をピリジン
（３７）にて洗浄する。

こと１での動作により、予め支持体（９）に結合されて
いたヌクレオチドに新たにヌクレオチドを連結する１つ
のサイクルが終了する。

制御回路（３４）は、弁（４４）＋（４Ｂ）＋（５０）
、（５１）を作動してインブロパノールと塩化メチレン
の混合溶媒（３８）を供給する前記保護基脱離動作から
上記マスキング動作までの合成サイクルを繰返し、目的
ＤＮＡを合成する。

さて、上記実施例のＤＮＡ自動合成装置（１）によれば
、ペプチドのアミノ酸配列を入力するだけで対応するＤ
ＮＡ　ｆなわちそのペプチドの生産のだめのＤＮＡおよ
び／又はそれと相補的なりＮＡとを自動合成可能となる
。しかも、複数種のＤＮ’Ａを同時合成可能となる。さ
らにその上、次のような利点を有している。

上記装置（１）では、反応器（２）の反応部（１０）を
小型化すると共に、フィルタ（７）の上に支持体（９）
を載置し、上方から試薬溶液（１１）〜（１５）を供給
し、底部から排液するように反応器（２）を構成してい
る。そこで排液弁（５０〕を閉じたまま試薬溶液を上方
から供給すれば、その試薬溶液は支持体（９）に含まれ
てこれを膨潤すると共にフィルタ（７）より上の反応部
（１０）内にとどまって下方へ落ちない。従って、供給
した全ての試薬溶液が反応に参加し、デッドスペースに
溜まるものが無くなる。この結果、ＤＮＡの微量合成が
可能となり、供給量は最低量（支持体体積の５〜７倍位
）で充分になり、また反応を促進するために反応器を振
盪するなどの混合・接触操作も無用になっている。また
この装置（１）は、新たなヌクレオチド　１５− を連結する反応の前に反応器（２）内をＴＨＦ　（３６
）で洗浄乾燥すると共に乾燥ガスでブローして短時間で
反応器（２）内を完全乾燥できるように構成されている
。この結果、縮合反応を阻害する水分を完全に除去でき
るので反応効率が下がらず、余分な試薬を必要としない
。

結局、上記実施例のＤＮＡ微量自動合成装置（１）は、
多くの観点から有用な装置である。

変形実施例としては、複数のアミノ酸配列を入力可能と
したものが挙げられる。

他の実施例としては、反応器をロート状にしたもの、樽
状にしたもの、また反応部の容積を８０ｐ−０〜８００
局の間で変化したものが挙けられる。

またホスホモノトリアゾール法やホスファイト法、ある
いはジエステル法によるＤＮＡ合成装置にこの発明を適
用したものが挙げられる。

固体支持体の他の例としては、Ｋ’、ｅｌ　−Ｆ−ｇス
チレン、シリカゲル、ポリアクリルモルホリドなどがあ
る。これらの支持体は粒径３０〜３００ミクロン程度の
ものが好ましい。

＝　１６− 以上の説明から理解されるように、この発明のＤＮＡ合
成装置によれば、異種のＤＮＡを同時に合成することが
可能となる。このことが多種の核酸の混合物から特定の
核酸を分離する際に大食イ１用であることは先述したと
おりである。

なお、この発明の装置の応用として、１種以上のＤＮＡ
の塩基配列を直接入力する入力手段を設け、その塩基配
列に基いて試薬供給手段を作動させるようにすれば、直
接的に複数種のＤＮＡを同時合成可能となる。さらに１
種以上のＲＮＡの塩基配列を入力する入力手段を設ける
とともに試薬溶液を適宜変更し、そのＲＮＡの塩基配列
に基いて試薬供給手段を作動させるようにすれば、複数
種のＲＮＡを同時合成することも可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例であるＤＮＡ自動合成装置
の構成説明図、第２図は同装置の有する変換テーブルの
内容を示す説明図、第３図は同装置のディスプレイ画面
の一例を示す説明図である。 （１）・・・・・　ＤＮＡ自動合成装置、（２）・・・
・・反応器、（１２）〜（１５）・・・・・ヌクレオチ
ド試薬溶液、（２１）〜（２５）・・・・・シリンジポ
ンプ、（３４）・・・・・制御回路、（３４ａ）・・・
・・変換テーブル、（３５）・・・・・操作卓、（５６
）・・・・・液溜め、（５７）・・・・・混合用コイル
。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、ベグテドのアミノ酸配列を入力するための入力手段
   、入力されたアミノ酸配列をこれに対応する１種以上の
   ＤＮＡの塩基配列に変換する変換手段、および得られた
   １種以上の塩基配列のそれぞれに基いてＤＮＡ合成用試
   薬を選択し実質的に同時に反応器に供給可能な試薬供給
   手段を具備し、これにより１種以上のＤＮＡを同時に合
   成可能としたことを特徴とするＤＮＡ合成装置。