JPS5811997B2 - 菌体培養物の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、メタノールを主炭素源とする培地に細菌を培
養し、菌体・培養物を製造する方法に関する。

更に詳しくは、メタノールを主炭素源とする培地に、メ
チロモナス属に属し、メタノール資化性を有する細菌を
培養し、増殖させて得られた菌体培養物を分離・採取す
ることを特徴とする菌体培養物の製造法に関するもので
あり、その目的とするところは、安価且つ多量に入手し
得るメタノールを原料として、食料や飼料として利用価
値の高い菌体培養物、特に菌体蛋白質を工業的に有利に
製造するにある。

近年、石油特にノルマルパラフィンを主炭素源とする微
生物培養物を飼料として利用する試みがなされてきたが
、ノルマルパラフィンは水に不溶であり、又、糖類な炭
素源とする微生物培養法と比べて大量の酸素を要求し、
かつ生成培養物中に混入する不純物による毒性の問題な
ど種々の難点がある。

本発明者等は、安価且大量に入手することができ、しか
も上記諸問題を解決し得る炭素源としてメタノールを選
び種々研究を重ねた結果、メタノールを炭素源とする培
地で極めて良好な生育を示す、メタノール資化性細菌を
下水中より分離し、その細菌を利用して菌体培養物を製
造する本発明を完成した。

本発明者等の分離したメタノール資化性細菌は、メチロ
モナス属に属する新菌種であり、その菌株は、工業技術
院・微生物工業技術研究所（以下微工研という）に微工
研菌寄第４９０９号として寄託されている。

その菌学的性質は以下の通りである。

１、菌学的性質 １−１ 形態学的性質 ０１％メタノール無機塩・寒天斜面に３０℃２４時間培
養、０．４〜０．５×１．Ｏ〜１．３ミクロンの単独ま
たはまれに数回連鎖した桿菌、単極鞭毛により運動し、
ダラム染色陰性、胞子形成なし、抗酸性陰性。

１−２ 培養的性質 ０１％メタノール無機塩寒天コロニー、３７℃４８時間
培養、生育良好、円形、平滑、全綴、扁平状、均質、半
透明、やや黄味を帯びた白色、鈍光。

０１％メタノール無機塩寒天斜面３７℃２４時間培養、
生育良好、糸状、扁平状、鈍光粘調、可溶性色素生産せ
ず。

０１％メタノール無機塩液体、３７℃、２４時間培養、
僅かに菌環を作る、強く濁、粉状沈査少量、 〇肉汁寒天平板及び斜面培養、生育せず ０肉汁液体培養、 生育せず ０肉汁ゼラチン穿刺培養、 生育せず ｏリドマス・ミルク 生育せず １％メタノールゼラチン穿刺培養、上面に良く生育、糸
状、液化せず。

Ｏ培地一般的要件 Ｃ：メタノールのみ、好ましくは３％以下（３％以上で
は生育が極めて遅い） Ｎ：ＮＨ４塩、（ＮＯ３塩、尿素では生育しない、ペプ
トン、カザミノ酸では非 常に生育が遅い） 他 ミネラル、ビタミンＢ１（他のビタミンは必要とし
ない） 培養条件 ２０〜４．０℃、好ましくは３０〜３７℃（４２℃以上
では生育せず）ｐＨ６，０〜８．５、好ましくは６．５
〜７．５゜ １−３ 生理学的性質 （１）硝酸塩の還元 なしく２）脱窒反
応 なし く３）ＭＲテスト（メタノールを含む） 陰性 （４）ＶＰテスト（メタノールを含む） 陰性 （５）インドールの生成 生産せず（６）硫
化水素の生成 生産せず（７）デンプンの
加水分解 陰性（８）クエン酸の利用
利用せず（９）無機窒素源 ＮＨ４のみ利
用する（ＮＯ３、ＮＯ２、尿素／は利用せず） （１０）色素の生成（メタノール培地） 水溶性色素なし、菌体色素、薄桃色 （１１）ウレ・アーゼ 陰性（１２）オ
キシダーゼ 陽性（１３）カタラーゼ
陽性（１４）生育の範囲（ｐＨ１温度
） （１５） 酸素に対する態度 好気性（１６
）炭素源の利用 ○メタノール、メチルアミンを利用する ○グルコース、フラクトース、ガラクトース、マンノー
ス、キシロース、シュクロ ース、マルトース、ラクトース、アラビ ノース、トレハロース、ソルビット、イ ノジット、マンニット、デンプン、エタ ノール、プロパツール、ブタノール、グ リセロール、ホルムアルデヒド、アセト アルデヒド、ギ酸、酢酸、クエン酸、コ ハク酸、リンゴ酸、乳酸、グリコネート、プロピオン酸
を利用できない。

（１７）栄養要求性 ビタミンＢ１（１８
）ＮＤＡのＧ＋Ｃ含量 ５２．６ ｍｏｌｅｓ％（１
９）メタノールの資化経路 リブロースモノリン酸経路 （２０） Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏ
ｎ法）陰性 上述のメタノール無機塩培地の組成は次の通りである。

燐酸２ナトリウム１２水塩４ｇ、燐酸１カリウム２ｇ、
燐酸２アンモニウム３ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．
５ｇ、塩化カルシウム２水塩５０ｍｇ、塩化第二鉄６水
塩５ｍｇ、硫酸マンガン４〜６水塩２ｍ９、サイアミン
塩酸塩１００γ、水道水１１゜ｐＨ６，８〜７．０、メ
タノール１０ｍ１゜炭素源資化性については、上記培地
に寒天１．５％、被験炭素源を１％（ホルマリンは０．
０５％）を加え、３０℃で１４日間培養した。

生育の範囲についてはメタノール無機塩寒天培地を用い
た。

硝酸の還元性についてはメタノール無機塩培地のリン酸
２アンモニウムの代りに硝酸ソーダ３ｇ／ｌ加えた培地
を用いた。

（その他の試験は長谷用武編著東大出版会発行（１９７
５）「微生物の分類と同定」２０１〜２４５頁に準じた
。

）上記の諸性質をバージ−（Ｂｅｒｇｅｙ ）のマニュ
アル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロブ第８
版の分類基準にしたがい公知の菌群比較検討した結果、
形態学的性質（菌体の大きさ、運動性、特に極鞭毛の存
在、ダラム染色陰性）及び培養的体性質（資化すべき唯
一の炭素源としてメタノールを利用すること）からメチ
ロモナス属に属すると考えられるが、上記バージ−のマ
ニュアル第８版にはメチロモナス属の菌種としてはＭ・
メタニカ、Ｍ・メタノオキジダンス及びＭ・メタニトリ
フイカンスの３種が記′されているのみで本菌と近似の
菌種の記載がなく、更には、従来公開された特許に記載
された木菌と類縁のメチロモナス属の菌株と比較しても
袈に示すとおりいずれの菌株とも異なり、従って、メチ
ロモナス属に属する新菌種と考え、仮にメ≠ｆ：１皐ナ
ス５Ｄ−１３と命名した。

但し Ａ：メチロモナス５Ｄ１３
（本願発明）なお、上記分類に際しての実験方法
は次の如き方法を用いた。

メタノール無機塩培地：燐酸２ナトリウム１２水塩４ｇ
、燐酸１カリウム２ｇ、燐酸２アンモニウム３ｇ、硫酸
マグネシウム７水塩０．５ｇ、塩化カルシウム２水塩５
０〜、塩化第二鉄６水塩５ｍｇ、硫酸マンガン４〜６水
塩２ｍｇ、サイアミン塩酸塩１００ ｇ、水道水１１ｐ
Ｈ６，８〜７．０、メタノール１０ｍ１、炭素源の資化
性はメタノールを除いた上記培地に寒天１．５％及び被
験炭素源を１％加え３０℃で７日間培養。

本発明に使用するｉ地は、主炭素源としてのメタノール
、窒素源、無機物、ビタミンその他の生育促進物質を含
有する培地であれば、合成培地または天然培地の何れで
も使用可能であるが、本発明を実施するにあたってのよ
り好ましい培地の要件を２．３掲げると、主炭素源とし
てのメタノールは培地に対して３％以下が好ましく、３
％以上では生育が非常に遅く、６％では生育は完全に阻
害される。

また窒素源としてはアンモニウム塩以外の使用は好まし
くない。

例えば硝酸塩や尿素を使用した場合には殆んど生育しな
い等、本使用菌は従来のメタノール資化性細菌とは−か
なり異なった性質を有していることがわかる。

更に、本発明の方法において用いる菌は、ビタミンＢ１
要求性が明瞭であり、他のレタミンを必要としない。

しかしＢ１以外のビタミンが混在しても別設差支えはな
い。

次に、本発明を実施する場合の培養条件としては先に菌
学的性質の項において述べた一般的培養条件が使用され
る。

前述したような、培地および培養条件の下で培養を行な
った後、培養液中の菌体培養物は通常の遠心分離法、ろ
過性、凝集法等を単独でまたは合わせて用いることによ
り採取される。

得られた菌体培養物は蛋白質含量、ビタミン含量が極め
て高いので、それを飼料成分として用いることができ、
栄養価の高い良質の飼料を安価に提供することができる
。

また、得られた菌体培養物から蛋白質核酸、ビタミン等
を公知の手段により抽出、分離し、飼料、食品等の添加
物、医薬品として使用することも考えられる。

以下、実施例により本発明の方法をより具体的に説明す
るが、これらは単なる例示にすぎず、本発明をなんら制
限するものではない。

実施例 １ 硫酸アンモニウム１．５ｇ、燐酸２ナトリウム１２水塩
２．０ｇ、燐酸１カリウム５．Ｏｇ、硫酸マグネシウ°
ム７水塩１．０？、塩化カルシウム０．１ｇ。

硫酸第一鉄７水塩０．０２Ｆ、硫酸マンガン４〜５水塩
８ｍｇ、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、はう酸、モ
リブデン酸ナトリウム各１ｍｇおよびビタミンＢ１０．
５ｍｇを蒸留水に溶かし１１とし、２１容ジャーファー
メンタ−に入れ１２０℃、３０分間滅菌した。

３６℃に冷却後これにｒ過除菌したメタノールを０．５
％Ｗ／Ｖ加え、メチロモナス５Ｄ−１３を接種し、３Ｎ
アンモニア水を用いｐＨを６．６に保持しながら培養し
た。

この時の攪拌は１０００ ｒｐｍ、通気量は２１／分で
あった。

培養５時間後メタノールを０．７％加え更に３時間後に
０．８％追加して引続き４時間培養を行った。

培養後遠心分離により菌体を集め１回水洗後１０５℃で
恒量になるまで乾燥し、培養液１１当り８．２ｇの菌体
が得られた。

添加メタノールに対する収率は４１％であった。

又、最大比増殖速度（μｍａｘ）は０．５６であった。

実施例 ２ ｌｌ中に硫酸ナトリウム０．８ｇ、硫酸カリウム３．２
す、硫酸マグネシウム（７水塩）２ｇ、塩化カルシウム
０．３ｇ、硫酸第１鉄（７水塩）０．０７グ、塩化カル
シウム０．３ｇ、硫酸マンガン（４〜５水塩）０．０１
５ｇ、塩化コバルト、硫酸亜鉛、硫酸銅、はう酸、モリ
ブテン酸ナトリウム各２ｇ、ビタミンＢ１１ｍｇおよび
８５％りん酸１４ｇを含む酸性培地を調製する。

予め空滅菌した５１容のジャーファーメンタ−に除菌フ
ィルター（ＰＡＬＬ社製つ社製ウルツポアフィルターし
て、この酸性培地２１を入れる。

同様にろ過除菌したメタノールを０．８％Ｗ／Ｖ、３Ｎ
アンモニア水をｐＨ６，６になるまで加えた後、メチロ
モナス５Ｄ−１３を接種し、３７℃で回分培養を行なっ
た。

培養液中のメタノール濃度をガスクロマトグラフ装置で
測定し、メタノール濃度が１１００ＰＰ以下になつた時
から、培養液中のメタノール濃度が０．５％を越えぬよ
う調節しながら連続的にメタノールを加え、菌体濃度Ｘ
が３０ｇ／ｌに達した時点で、連続培養に切換えた。

即ち、培養槽から培養液を１時間当り６００ｍ１連続的
に抜取ると同時に培養液量が常に２１！を保つように上
記組成の酸性培地を加えた。

（希釈率１）＝０．３ｈｒ−１）定常状態における菌体
生産速度ＤＸはほぼ９〜１０ｇ／ｌ・ｈｒで、 消費メタノールに対する菌体の収率は約４０％であった
。

抜取った培養液を遠心分離機にかけ、得られた菌体スラ
リーを集めて噴霧乾燥して乾燥菌体粉末を見た。

このものの粗蛋白質含量は８２．３％、水分５．２％、
粗脂肪０．５％、核酸１５．７％であった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ メタノールを主炭素源とする培地にメチロモナス属
   に属し、メタノール資化性を有する細菌メチロモナス５
   Ｄ−１３を培養し、増殖菌体培養物を分離採取すること
   を特徴とする菌体培養物の製造方法。