JPS5811929B2 - 人血漿コリンエステラ−ゼの製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は人血漿あるいはこれに由来するコリンエステラ
ーゼ含有画分からコリンエステラーゼを製造する方法に
係わり、更に詳細には工業的規模で従来よりも高回収率
で高純度のコリンエステラーゼを得、生理学的に受入れ
られる薬剤を提供する方法及びその薬剤に関するもので
ある。

コリンエステラーゼ（以下ＣｈＥと記す）は人血漿中に
微量存在する酵素であり、外科手術時頻用される筋弛緩
剤塩化サクシニールコリンによる無呼吸状態の発現に対
しその投与が有効である。

（第２４回日本輸血学会発表） また有機燐中毒の際生体のＣｈＥは不活性化されること
からＣｈＥ製剤を投与することにより中毒症の治療にも
有効なことが考えられる。

従来人血漿からＣｈＥを製法するには各種の方法が報告
されており、エタノール分画法〔ジャーナル・オブ・ジ
アメリカンケミカル・ソサイエテイ（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ
ｍ、Ｓｏｃ、）７０，６０４９゜（１９５４）、ＤＥＡ
Ｅセルロースクロマトグラフィー法〔カナディアン・ジ
ャーナル・オブ・バイオケミカル・フイジオロジー（Ｃ
ａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈ−ｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、）３９
，１０１３．（１９６１）〕、硫安分画および電気泳動
法の組合せ（Ｂｉｏｃｈｉｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）６７．４４１．（１９６
３）〕、リバノール分画、硫安分画、アルミニウム、ハ
イドロオキサイドゲルによる吸着、ゾーン電気法服およ
びゲルろ過の組合せによる方法〔ブリュート（Ｂｌｕｔ
）１４，６５．（１９６６）〕、ＤＥＡＥセルロースク
ロマトグラフィー、電気泳動（エレクトロフォーカシン
グ）およびゲルろ過による方法〔バイオケミカル・ジャ
ーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ）１１６．８７５．（１９
７０）〕などが主なものである。

しかしながらこれらの方法は低回収率や操作の複雑性か
ら必ずしも工業的製法とは言えない。

発明者等はＣｈＥの製法につき種々研究した結果ポリエ
チレングリコール分画、イオン交換クロマトグラフィー
、硫安および芒硝併用による分画を組み合せることによ
り非常に簡便に従来より高回収率で高純度のＣｈＥを得
ることに成功し、これにより工業的に大量製造が可能と
なることを見い出した。

また血漿画分には血圧降下作用物質の混入がみられる外
、肝炎ウィルス（ＨＢｓＡｇ）による汚染の可能性があ
るが、本発明による方法ではこれらの除去が行え生理学
的に受入れられる薬剤とすることに成功した。

また本発明の方法により得たＣｈＥに中性アミノ酸、単
糖類又は糖アルコール類を安定化剤として添加し凍結乾
燥することにより長期保存安定性を計ることに成功した
。

本発明により人の血漿またはコリンエステラーゼを含む
人の血漿蛋白画分を、 （イ）その蛋白濃度０．５−５％（ｗ／ｖ）において含
む水性媒質にｐＨ３−７においてポリエチレングリコー
ルを加えポリエチレングリコールの濃度を３−５％（ｗ
／ｖ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得、上清にポ
リエチレングリコールを加えポリエチレングリコールの
濃度を５％より大で２５％（ｗ／ｖ）までとし、生ずる
沈澱を集める工程、 （ロ） イオン強度０．０５以下の低塩濃度、そして
ｐＨ４−６において陰イオン交換体に接触させコリンエ
ステラーゼを吸着させ、次いでイオン強度０．０５−０
．５のｐＨ４−１０の塩溶液で溶離する工程、および （ハ）その蛋白濃度０．０１−５％（ｗ／ｖ）において
含む水性媒質よりｐＨ４−１０において硫安の３０−４
０％飽和量および芒硝３−１０％（ｗ／ｖ）濃度量の添
加により生ずる沈澱を除去し、次いで上清より硫安の３
０−６０％飽和量および芒硝１０−２０％（ｗ／ｖ）濃
度量の添加により生ずる沈澱画分を集める工程 上記（イ）（ロ）および（ハ）の工程を任意の順序にお
いて含むことを特徴とする人血漿コリンエステラーゼ製
剤の製法が提供される。

本発明に用いられる原料としては人血漿そのものおよび
コリンエステラーゼを含むその各種蛋白分画、特にα−
およびβ−グロブリン画分を用いることが好ましい。

α−およびβ−グロブリン画分は人の血漿よりフィブリ
ノーゲン、γ−グロブリン、アルブミンなど生物学的薬
剤を製造する際、一般に用いられる血漿蛋白分画法にお
ける副産物であることは本発明の工業的意議を高くする
。

このα−およびβ−グロブリン画分は例えば周知のコー
ンの低温アルコール分画法の画分■又は■−４〔ジャー
ナル・オブ・ジアメリカンケミカル・ソサイエテイ（Ｊ
、Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）、６８゜４５９（１９４
６）〕に相当する。

人血漿あるいはコリンエステラーゼを含む血漿蛋白画分
例えばα−およびβ−グロブリン画分を蛋白濃度０．５
−５％好ましくは２−３％に懸濁しｐＨを３〜７、好ま
しくは４〜６に調整する。

これにポリエチレングリコールを３−５ｗ／ｖ％となる
ように加え生じた沈澱を遠心分離機を用いて分離除去し
、得られた上清にさらにポリエチレングリコールを終濃
度５−２０ｗ／ｖ％となるように加え沈澱する画分を分
取する。

この沈澱は非常に上清と分離し易く一般に用いられる分
画法の場合に必要な遠心分離機による分離やろ紙あるい
はろ過剤を用いての分離の必要はなく単に容器を傾斜さ
せ上清を除去できる点で簡便であり大量製造において有
利である。

得られる沈澱を純水に溶解しｐＨ４−６に調整し、同じ
組を示すイオン強度０．０５以下の低イオン強度の緩衝
液例えば酢酸緩衝液で平衡とした陰イオン交換体例えば
ＤＥＡＥ−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロースまた
はＴＥＡＥ−セルロースと接触させる。

ＣｈＥを吸着した陰イオン交換体は要すれば前記低イオ
ン強度の緩衝液の少量で洗浄し次いでイオン強度０．０
５−０．５、ｐＨ４〜１０の緩衝液で溶離処理し溶離液
を得る。

この工程で大部分の不純物、血圧降下使用物質およびＨ
ＢｓＡｇが除去される他、陰イオン交換処理前に比して
著しくその液量が少なくなるので大量処理が非常に容易
となる。

得られた溶離液をｐＨ４−１０に調整し硫安の３０−４
０％飽和に相当する量および芒硝３−１０ｗ／ｖ％に相
当する量を加えて沈澱する画分を除去する。

さらにその上清に硫安３０−６０％飽和相当量芒硝１０
−２０ｗ／ｖ％相当量を添加し沈澱する画分を得る。

この工程で溶離液中に残存している不純物の大部分およ
び血圧降下作用物質が除かれるとともにＣｈＥの濃縮が
行える。

本発明の方法における諸工程の組み合せは、上記のよう
にポリエチレングリコール分画（イ）−イオン交換クロ
マトグラフィ（ロ）−硫安芒硝併用（ハ）の順序による
分画が最も望ましいが、都合によりいかなる組み合せも
適用できる。

例えばイオン交換クロマトグラフィー−ポリエチレング
リコール分画−硫安芒硝併用による分画あるいは、硫安
芒硝分画−イオン交換クロマトグラフィー−ポリエチレ
ングリコール分画等である。

上記（イ）、（ロ）（ハ）の工程の順序が好ましいのは
、ポリエチレングリコールはイオン強度に影響を与えな
いので、続いて行うイオン交換法の工程を行う場合でも
一般に用いられる分画法例えば硫安分画あるいは芒硝分
画の場合に必要な脱塩操作が不要となることである。

この様にして得られた沈澱を適当な溶媒好ましくは生理
学的に受入れられる水性溶媒、例えば生理食塩水の適量
に溶解し同じ溶媒で透析し硫安および芒硝を除去する。

得られたＣｈＥ水溶液は生理学的に受入れられる製剤で
ある。

しかしこの水溶液は製剤としての安定性が短く長期保存
に対して安定な製剤とするためには凍結乾燥することが
好ましい。

さらにより好ましくは、凍結乾燥時及び保存時の安定性
を確保するためには、安定化剤を添加することである。

安定化剤としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイ
シン、イソロイシンなどの中性アミノ酸（モノアミノモ
ノカルボン酸）、グルコース、マンノース、ガラクトー
ス、果糖などの単糖類、ショ糖、麦芽糖、乳糖などの三
糖類およびマンニット、キシリットなどの糖アルコール
類が有効である。

安定化剤の添加量は、ＣｈＥを含む蛋白質の１重量部に
対して０．４〜９重量部を含有させることで十分であり
、さらに既知賦形剤を０〜０．５重量部含有させてもよ
い。

これらの添加物は相応する量を適当な水溶液に溶解し混
合する。

なお添加する安定化剤を２種以上混合して使用する場合
においても添加量は総量として上記幅であればよい。

凍結乾燥時の濃度として規定すると、安定化剤は、０．
５％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの水溶液として処理する。

水溶液のｐＨは６．０〜９．０特に好ましくはｐＨ７〜
８に調整し、必要あれば除菌濾過を行った後、包装単位
に従い１００〜１０００単位のＣｈＥを含むように分注
する。

この分注液は急速に凍結乾燥し、凍結乾燥粉末製剤とす
る。

この得られたＣｈＥを主成分とする凍結乾燥製剤の組成
は少なくともＣｈＥを含む蛋白質の１重量部に対して０
．４〜９重量部の安定化剤、必要に応じ０．５重量部ま
での賦形剤を含有するものである。

本発明製剤の使用に際しては、注射用蒸溜水によってＣ
ｈＥの約１〜１０％ｗ／ｖ溶液に調整し、静脈内に投与
する。

投与量は、必要に応じて適時選択できるものであり、一
般的には包装単位に従って使用できる。

本発明によって提供されるＣｈＥの毒性は極めて軽微で
あって、マウス、ラットの動物実験ばかりでなく、人に
対する臨床適応例においても副作用を認めず、例えば成
人に対して４００単位のＣｈＥを点滴注射しても副作用
は認められない。

本発明を実施例によって詳細に説明するが、これらは本
発明を何んら限定するものではない。

実施例中のＣｈＥの活性はヘストリンらの方法に従って
測定し１単位は３７℃１時間で１ミリモルのアセチルコ
リンを分解する酵素量である。

〔ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ）１８０，２４９（１９４９）
〕急性毒性はマウスおよびラットに静脈内注射した場合
のＬＤ５０より求め血圧降下作用物質の測定は成因を用
い薬液投与前の平均動脈圧に対する降下率によって行っ
た。

ＨＢｓＡｇの測定はＫＫミドトリ十字製試薬アンティジ
ブセル商品名）を用いたＲＰＨＡ法（逆受身赤血球凝集
反応法）により行った。

実施例 １ 人血漿よりコーンの低温エタノール分画法で得た画分■
３０ｋｇに水２５０１を加え懸濁した。

この懸濁液を１Ｎ−塩酸でｐＨ６とした後ポリエチレン
グリコール＃４０００を４ｗ／ｖ％となるように加え１
時間かきまぜ２時間静置後シャープレス遠心分離機を用
いて沈澱を分離除去し、得られた上清にさらにポリエチ
レングリコール＃４０００を終濃度１０ｗ／ｖ％に加え
て１時間かきまぜ３時間静置した。

容器を傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。

この沈澱を水２５１で溶解し１Ｎ−酢酸でｐＨ４，３に
した後あらかじめｐＨ４，３，０，０１Ｍ−酢酸緩衝液
で平衝化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０（乾燥
重量１５０ｇ）を加えて３０分間かきまぜＣｈＥを吸着
させた。

ＣｈＥを吸着した上記ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５
０をｐＨ４，３，０，０１Ｍ酢酸緩衝液３１で洗った後
ｐＨ６，００，２Ｍ食塩を含む０．０１Ｍ−酢酸緩衝液
でＣｈＥを溶離した。

溶離液を１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７，０にした後硫安３５
％飽和量および芒硝５ｗ／ｖ％加えて生じた沈澱を遠心
分離機によって分離除去した。

得られた上清はさらに終濃度として硫安５０％飽和量お
よび芒硝１５ｗ／ｖ％量加えて生じた沈澱を遠心分離機
によって分取した。

得られた沈澱を生理食塩水２００ｍ１に溶解後生理食塩
水に対し透析を行った。

透析後０．２μのミリポアフィルタ−でろ過しＣｈＥ水
溶液を得た。

この場合のＣｈＥの回収率は画分■から７０％で比活性
は３２単位／ｍｇであった。

この純度は人血漿中のＣｈＥのそれの約１１２００倍に
相当する。

得られたＣｈＥ水溶液の性状を表１に示す。

血圧降下率は画分■では３２％であったが本発明の方法
により得られたＣｈＥ水溶液では１．２％にまで血圧降
下作用物質は除かれた。

またＨＢｓＡｇも陰性であった。

実施例 ２ 人血漿１０１／に水１０１を加えた後１Ｎ−塩酸でｐＨ
７，０とした。

これにポリエチレングリコール＃４０００を４ｗ／ｖ％
加え１時間かきまぜ２時間静置後遠心機を用いて沈澱を
除去し、得られた上清にさらにポリエチレングリコール
＃４０００を終濃度６ｗ／ｖ％加えて１時間かきまぜ３
時間静置した。

容器を傾斜させて上清を除去し沈澱を分取した。

この沈澱を水で溶解して１Ｎ−酢酸でｐＨ４，３にした
後、あらかじめｐＨ４，３，０，００５Ｍ−酢酸緩衝液
で平衡化したＴＥＡＥ−セルロース（乾燥重量７０ｇ）
を加え３０分間かきまぜＣｈＥを吸着させた。

ＣｈＥを吸着した上記ＴＥＡＥ−セルロースをｐＨ４，
３，０，００５Ｍ酢酸緩衝液１１で洗った後ｐＨ６，０
，０，１５Ｍ−食塩を含む０．００５Ｍ酢酸緩衝液でＣ
ｈＥを溶離した。

溶離液を１Ｎ−ＮａＯＨでｐＨ７，４にした後硫安３５
％飽和量および芒硝７ｗ／ｖ％加えて生じた沈澱を遠心
分離機によって除去した。

得られた上清に終濃度として硫安５０％飽和量および芒
硝１３ｗ／ｖ％量に加えて生じた沈殿を遠心分離機によ
って分取した。

得られた沈澱を生理食塩水３ｍｌに溶解後生理食塩水に
対して透析した。

透析後０．２μのミリポアフィルタ−でろ過しＣｈＥ水
溶液を得た。

この場合のＣｈＥの人血漿からの回収率は６５％で比活
性は３０単位／ｍｇであった。

この純度は人血漿の約１０５００倍である。

得られた水溶液の性状を表２に示す。

比較実験 次に本方法による結果と従来法（前述）追試の結果とを
表３に示し回収率、比活性および工業的大量製造の可能
性についての比較を検討した。

出発物は血漿を使用し、回収率は、血漿からの値を示し
た。

（参考例） ＣｈＥは比較的安定な酵素であるが、液状で長期の保存
では徐々に失活してゆく。

そこで実施例１で得たＣｈＥ水溶液を凍結乾燥したもの
および各種安定化剤を添加し凍結乾燥したものについて
保存安定性を見た。

安定化剤は、中性アミノ酸としてグリシンおよびアラニ
ンを、糖類としてグルコース、ショ糖、マンニットをそ
れぞれ表４に示す割合に添加して、凍結乾燥直後４℃お
よび室温で６ケ月間保存した後ＣｈＥ活性を測定し安定
剤を添加しない凍結乾燥前の値との比を％で示した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 人の血漿またはコリンエステラーゼを含む人の血漿
   蛋白画分を、 （イ）その蛋白濃度０．５−５％（ｗ／ｖ）において含
   む水性媒質にｐＨ３−７においてポリエチレングリコー
   ルを加えポリエチレングリコールの濃度を３−５％（ｗ
   ／ｖ）とし、生ずる沈澱を除去し、上清を得、上清にポ
   リエチレングリコールを加え、ポリエチレングリコール
   の濃度を５％より大で２５％（ｗ／ｖ）までとし、生ず
   る沈澱を集める工程、 （ロ）イオン強度０．０５以下の低塩濃度、そしてｐＨ
   ４−６において陰イオン交換体に接触させコリンエステ
   ラーゼを吸着させ、次いでイオン強度０．０５−０．５
   のｐＨ４−１０の塩溶液で溶離する工程、および （ハ）その蛋白濃度０．０１−５％（ｗ／ｖ）の水性媒
   質よりｐＨ４−１０において硫安の３０−４０％飽和量
   および芒硝３−１０％（ｗ／ｖ）濃度量の添加により生
   ずる沈澱を除去し、次いで上清より硫安の３０−６０％
   飽和量および芒硝１０−２０％（ｗ／ｖ）濃度量の添加
   により生ずる沈澱画分を集める工程 上記（イ）（ロ）および（ハ）の工程を任意の順序にお
   いて含むことを特徴とする人血漿コリンエステラーゼ製
   剤の製法。 ２ 工程が（イ）、（ロ）および（ハ）の順序である特
   許請求の範囲第１項による方法。 ３ 人の血漿が（イ）、（ロ）及び（ハ）の工程にかけ
   られる特許請求の範囲の項第１項による方法。 ４ コリンエステラーゼを含む人の血漿蛋白画分がα−
   およびβ−グロブリン画分である特許請求の範囲の項第
   １項による方法。