JPS58111682A - 正常二倍体細胞の培養法 - Google Patents
正常二倍体細胞の培養法Info
- Publication number
- JPS58111682A JPS58111682A JP56212619A JP21261981A JPS58111682A JP S58111682 A JPS58111682 A JP S58111682A JP 56212619 A JP56212619 A JP 56212619A JP 21261981 A JP21261981 A JP 21261981A JP S58111682 A JPS58111682 A JP S58111682A
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- JP
- Japan
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- normal diploid
- medium
- serum
- culture
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は動物に由来する正常二倍体細胞の培養法に関す
るものである。
るものである。
動物細胞を培養することは生物科学的実験研究およびホ
ルモン、ワクチン、酵素などの工業的生産の内面におい
てますます重１’になりつつある。
ルモン、ワクチン、酵素などの工業的生産の内面におい
てますます重１’になりつつある。
これらの細胞の培養においては、血清の培地中への添加
がほとんどの場合必須であることは良く知られている。
がほとんどの場合必須であることは良く知られている。
しかしながら血清はその供給が不安定であり、品質の一
定したものが得られＫ＜＜、液体であるために保存・取
扱いが困難で、また非常に高価であるという欠点を持っ
ている。そのため生物科学的実験研究やホルモンなどの
工業的生産における細胞培養の発展が大きく阻害されて
ぎた。このような欠点を解決するためこれまで各種のホ
ルモンやタンパク質を添加するととによって培養に盛装
な血清量を低減しようとする研究は数多く知られている
。しかしながら、これらの従来の無血清または低血清培
地に関２．する研究は嫌とんどすべて樹立細胞株や異数
体細胞に関するものであった。このような細胞は無限に
増殖する能力を持つことが多いが・多くは腫瘍鋳起能を
持ったり、その性質が容易に変化することなどから工業
的応用は困−である。これに対して正常：１倍体細胞は
、動物の正常な組織に山来し、その染色体数が２３本（
たとえばヒトの場合であれば≠６本）であり、有限の分
裂、回数を持ち、吸着する固体表向を必要とすることを
％黴とする細胞である。このような正常二倍体細胞は朧
瘍鋳起能を持たず、その性質が容易ＫＷ化しないことか
らホルモン、ワクチン、酵素などの工業的生産に適した
安全な細胞権として期待されている。しかしながら、正
常二倍体細胞は樹立細胞株や異数体細胞と比較して栄養
要求性が嶺雑であるためにこれら正常二倍体細胞に適し
た無血清または低血清培地はいまだに確立されていない
。
定したものが得られＫ＜＜、液体であるために保存・取
扱いが困難で、また非常に高価であるという欠点を持っ
ている。そのため生物科学的実験研究やホルモンなどの
工業的生産における細胞培養の発展が大きく阻害されて
ぎた。このような欠点を解決するためこれまで各種のホ
ルモンやタンパク質を添加するととによって培養に盛装
な血清量を低減しようとする研究は数多く知られている
。しかしながら、これらの従来の無血清または低血清培
地に関２．する研究は嫌とんどすべて樹立細胞株や異数
体細胞に関するものであった。このような細胞は無限に
増殖する能力を持つことが多いが・多くは腫瘍鋳起能を
持ったり、その性質が容易に変化することなどから工業
的応用は困−である。これに対して正常：１倍体細胞は
、動物の正常な組織に山来し、その染色体数が２３本（
たとえばヒトの場合であれば≠６本）であり、有限の分
裂、回数を持ち、吸着する固体表向を必要とすることを
％黴とする細胞である。このような正常二倍体細胞は朧
瘍鋳起能を持たず、その性質が容易ＫＷ化しないことか
らホルモン、ワクチン、酵素などの工業的生産に適した
安全な細胞権として期待されている。しかしながら、正
常二倍体細胞は樹立細胞株や異数体細胞と比較して栄養
要求性が嶺雑であるためにこれら正常二倍体細胞に適し
た無血清または低血清培地はいまだに確立されていない
。
本発＃４＠らは、この問題を解決すべく、正常二倍体＃
Ａ胞な無血清または低血清培地で培養する方法について
銃ｉｋ研究を重ねた結果、培地中にエタノールアミン誘
導体を添加することＫよって血清を全く含まないかまた
は極めて低濃度の血清しか含まない培地でこれらの細胞
の増殖を著しく向上することができることを見い出し、
この知見に基づいて本発明をなすに至った。
Ａ胞な無血清または低血清培地で培養する方法について
銃ｉｋ研究を重ねた結果、培地中にエタノールアミン誘
導体を添加することＫよって血清を全く含まないかまた
は極めて低濃度の血清しか含まない培地でこれらの細胞
の増殖を著しく向上することができることを見い出し、
この知見に基づいて本発明をなすに至った。
本発明は培養培地中にエタノ−ルア之ン誘導体を添加す
ることを特徴とする動物に由来する正常二倍体細胞の培
養法に関するものである。
ることを特徴とする動物に由来する正常二倍体細胞の培
養法に関するものである。
本発明において用いられるエタノ−ルア處ンー導体とは
エタノールアミン及び７オス７オエタノールアミンであ
る。
エタノールアミン及び７オス７オエタノールアミンであ
る。
細胞の培養のためには通常炭素源、窒素源および無機塩
類などから成る基本培地が必要である。
類などから成る基本培地が必要である。
本発明においてもこの基本培地は必要である。基本培地
には、主二マムエツセンシャル文ディアム（Ｍｌｉｓｌ
ａ＋ｕｍ ＆ｓ＊ｍｔｉｍｌ Ｍ＠ｄｉｕｍ ） ％
／り２培地１ダルベコ改変イーグルミ、ディアム（Ｄｕ
ｌｂ＊ａｓｏ ／ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉりａｇｌｓ
Ｍ＊ｄｉｕｍ ）、”ム（Ｈａｍ ）のＦ−１０培地、
へムのＦ−７−２培地、ＲＰＭＩ ／ｊ≠Ｏ培地など数
多くの種−がある。これらの基本培地の組成はたとえば
ｒ組＠培養」（中井準之助他編集、朝食書店、７９７４
都）Ｋ記載されている。本発明看らは前にこの基本培地
にエビダーマルグロースファクタートトランスフエリン
を添加することで、血清を全く含まないか又は極めて低
濃度の血清しか含まない培地中で、細胞を効率よく培養
できることを見い出している（特願昭＃−を参Ｊ７Ｊ号
）、鋏罹明ではエビダーマルグｐ−ス、ファクターとト
ランス７エ２」ンヲ同時に添加することで血清を完全に
又ぼ大部分代替することができるのであるが、本発明に
よるとエタノ−ルア建ン誘導体なさらに添加することで
動物に由来する正常二倍体細胞の増殖を著しく向上する
ことができる。エタノールアミン誘導体の好ましい添加
濃度は細胞の種１１によって異なるが、ｌ乃至７００μ
飄・１・、４の範囲内である。
には、主二マムエツセンシャル文ディアム（Ｍｌｉｓｌ
ａ＋ｕｍ ＆ｓ＊ｍｔｉｍｌ Ｍ＠ｄｉｕｍ ） ％
／り２培地１ダルベコ改変イーグルミ、ディアム（Ｄｕ
ｌｂ＊ａｓｏ ／ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｉりａｇｌｓ
Ｍ＊ｄｉｕｍ ）、”ム（Ｈａｍ ）のＦ−１０培地、
へムのＦ−７−２培地、ＲＰＭＩ ／ｊ≠Ｏ培地など数
多くの種−がある。これらの基本培地の組成はたとえば
ｒ組＠培養」（中井準之助他編集、朝食書店、７９７４
都）Ｋ記載されている。本発明看らは前にこの基本培地
にエビダーマルグロースファクタートトランスフエリン
を添加することで、血清を全く含まないか又は極めて低
濃度の血清しか含まない培地中で、細胞を効率よく培養
できることを見い出している（特願昭＃−を参Ｊ７Ｊ号
）、鋏罹明ではエビダーマルグｐ−ス、ファクターとト
ランス７エ２」ンヲ同時に添加することで血清を完全に
又ぼ大部分代替することができるのであるが、本発明に
よるとエタノ−ルア建ン誘導体なさらに添加することで
動物に由来する正常二倍体細胞の増殖を著しく向上する
ことができる。エタノールアミン誘導体の好ましい添加
濃度は細胞の種１１によって異なるが、ｌ乃至７００μ
飄・１・、４の範囲内である。
本発１ｊｉＫ用いられる細胞は動物に由来する正常二倍
体細胞であれば何でもよく、とのよ５なものとしてはた
とえばアフリカミドリザル腎＊ｍ、カニクイザル腎細胞
、ウシ胎児腎細胞、ウサギ腎細胞、ウシ胎児肺細胞、ヒ
ト胎児皮膚細胞、ヒト胎児肺細胞、ヒト胎児包皮細胞、
ヒト胎児肺細胞、ヒト胎児脳下垂体細胞、ヒト胎児甲状
腺細胞など数多くある。この中でも特にヒト胎児肺細胞
はインターフェロン生産に１ヒト胎児腎細脂はウロキナ
ーゼ生産に１アフリカミドリザル腎細胞はワクチン生産
に用いることができるためその工業的応用価値は高い。
体細胞であれば何でもよく、とのよ５なものとしてはた
とえばアフリカミドリザル腎＊ｍ、カニクイザル腎細胞
、ウシ胎児腎細胞、ウサギ腎細胞、ウシ胎児肺細胞、ヒ
ト胎児皮膚細胞、ヒト胎児肺細胞、ヒト胎児包皮細胞、
ヒト胎児肺細胞、ヒト胎児脳下垂体細胞、ヒト胎児甲状
腺細胞など数多くある。この中でも特にヒト胎児肺細胞
はインターフェロン生産に１ヒト胎児腎細脂はウロキナ
ーゼ生産に１アフリカミドリザル腎細胞はワクチン生産
に用いることができるためその工業的応用価値は高い。
その他の培養条件、方法は通常の細胞培養で用いられる
方法、たとえば前に挙げた「組織培養」１載の方法を適
用することができる。すなわち培地のｐＨ＋培養温度は
目的の細胞増殖に通常期いられる条件でよく、ｐＨはＡ
−１，培養温度は一２ｊ−参〇℃が一般的である。
方法、たとえば前に挙げた「組織培養」１載の方法を適
用することができる。すなわち培地のｐＨ＋培養温度は
目的の細胞増殖に通常期いられる条件でよく、ｐＨはＡ
−１，培養温度は一２ｊ−参〇℃が一般的である。
培養容器も通常の培養用ディシュ、培養フラスコ、ロー
ラーボトル、プラスチックバッグ、ら細状フィルム、
ホローファイバー、キャピラリー、マイクロキャリアー
、ガラスピーズ、多層平板などいずれも本発明の方法に
適用することができる。
ラーボトル、プラスチックバッグ、ら細状フィルム、
ホローファイバー、キャピラリー、マイクロキャリアー
、ガラスピーズ、多層平板などいずれも本発明の方法に
適用することができる。
動物に由来する正常二倍体細胞を培養する際、多重の血
清を用いることによって生じる槽々の障書を本発明によ
って除くことができる。すなわち血清と比較してエタノ
ールアミン酵導体は、安価であり、長期保存可能である
ため、保存・取扱いが簡単で、常に一定の品質のものを
安定して入手することができる。さらにエタノールアミ
ン″ｎ４体によってａ鉋の増殖が著しく向上したことに
より、培養期間が翅剣され、ホルモンや酵素などの生産
性が高、まることから正常二倍体細胞の工業的応用への
寄与が大きい。
清を用いることによって生じる槽々の障書を本発明によ
って除くことができる。すなわち血清と比較してエタノ
ールアミン酵導体は、安価であり、長期保存可能である
ため、保存・取扱いが簡単で、常に一定の品質のものを
安定して入手することができる。さらにエタノールアミ
ン″ｎ４体によってａ鉋の増殖が著しく向上したことに
より、培養期間が翅剣され、ホルモンや酵素などの生産
性が高、まることから正常二倍体細胞の工業的応用への
寄与が大きい。
次Ｋ１１ｍ例によって本発明をさらに詳細に説明する。
実施Ｎｌ
基本培地に虐二マムエツセンシャルミディアムｔｍい、
これにエピダーマルグロースフアクターをｌ！ダｔ／ｗ
ｔ 、）ランス７エリンをｌμＶ−を加え１さらに４！
ｒｉｓ１度のエタノールアミンを加えた培地を準備した
。これらの培地に７７、、リカミドリザル腎ｋｌＡＫ由
来する正常二倍体細胞（フロー・ラボラトリ−社）を患
濁し、組織培養用ディシュにｌ、×１０”個／−の細胞
数になるように植え付けた。３７℃で１日間培養したの
ち、０．Ｏｊ １７４ Ｗ／Ｖのトリプシンな含むリン
酸緩衝生理食塩水で処理して細胞を再層濁した。細胞数
はコールタ−・カウンター（コールタ−・エレクトｐニ
クス社の登録１ｍ４１）で計数した。
これにエピダーマルグロースフアクターをｌ！ダｔ／ｗ
ｔ 、）ランス７エリンをｌμＶ−を加え１さらに４！
ｒｉｓ１度のエタノールアミンを加えた培地を準備した
。これらの培地に７７、、リカミドリザル腎ｋｌＡＫ由
来する正常二倍体細胞（フロー・ラボラトリ−社）を患
濁し、組織培養用ディシュにｌ、×１０”個／−の細胞
数になるように植え付けた。３７℃で１日間培養したの
ち、０．Ｏｊ １７４ Ｗ／Ｖのトリプシンな含むリン
酸緩衝生理食塩水で処理して細胞を再層濁した。細胞数
はコールタ−・カウンター（コールタ−・エレクトｐニ
クス社の登録１ｍ４１）で計数した。
結果を、エタノ−ルア（ンを含まない対照に対する細胞
数の比（増殖度）で第１図に図示した。
数の比（増殖度）で第１図に図示した。
エタノールアミンをｌ〜７００μ■ｏ１・／を含ｔｒｊ
ｌ１Ｍでは対照にくらべ約／、／ 、 ／、２倍の増殖
度を示し、アフリカミドリザル腎細胞の増殖が著しく向
上することが認められた。
ｌ１Ｍでは対照にくらべ約／、／ 、 ／、２倍の増殖
度を示し、アフリカミドリザル腎細胞の増殖が著しく向
上することが認められた。
実施例コ
基本培地にミニマムエッセンシャルミディアムを用い、
これにエビダーマルグ四−スファクターをｉｓダｇ／ｗ
ｌｓ ）ランス７エリンをｌμｇ／−を加え、さらに各
濃度の７オスフオエタノールア之ンを加えた培地を準備
した。これらの培地にアフリカ建トリザル腎臓に由来す
□る正常二倍体細胞（フロー・ラボラトリ−社）を懸濁
し、組織培養用ディシュにｔｘ１０８個、−の細胞数に
なるよ５に植え付けた。３７℃で参日間培養したのち、
ｏ、ｏｚｔｓＷ／Ｖのトリプシンを含むリン酸緩衝生理
食塩水で処理して細胞を再懸濁した。細胞数はコールタ
−・カウンター（フールター・エレクトロニクス社の登
録−ＩＩ）で計数した。
これにエビダーマルグ四−スファクターをｉｓダｇ／ｗ
ｌｓ ）ランス７エリンをｌμｇ／−を加え、さらに各
濃度の７オスフオエタノールア之ンを加えた培地を準備
した。これらの培地にアフリカ建トリザル腎臓に由来す
□る正常二倍体細胞（フロー・ラボラトリ−社）を懸濁
し、組織培養用ディシュにｔｘ１０８個、−の細胞数に
なるよ５に植え付けた。３７℃で参日間培養したのち、
ｏ、ｏｚｔｓＷ／Ｖのトリプシンを含むリン酸緩衝生理
食塩水で処理して細胞を再懸濁した。細胞数はコールタ
−・カウンター（フールター・エレクトロニクス社の登
録−ＩＩ）で計数した。
結果を、７オス７オエタノールアセンヲ含まない対照に
対する細胞数の比（増殖度）で第２図に図示した。−７
オス７オエタノールアミンを／ −１００声ｍ・ｌ・／
を含む培地では対照にくらべ約へ７〜八λ倍の増殖度を
示し、アフリカミドリザル腎細胞の増殖が著しく向上す
ることが１められた。
対する細胞数の比（増殖度）で第２図に図示した。−７
オス７オエタノールアミンを／ −１００声ｍ・ｌ・／
を含む培地では対照にくらべ約へ７〜八λ倍の増殖度を
示し、アフリカミドリザル腎細胞の増殖が著しく向上す
ることが１められた。
涜施例３
本実施例ではヒト胎児の肺臓に由来する正常二倍体ＩＩ
ｓ胞であるＭＲＣｊ細胞（フロー・ラボラトリ−社）の
増殖に対するエタノールアミン及びフオスフオエタノー
ルアミンの効９１． ヲｊｌｉ ヘる。
ｓ胞であるＭＲＣｊ細胞（フロー・ラボラトリ−社）の
増殖に対するエタノールアミン及びフオスフオエタノー
ルアミンの効９１． ヲｊｌｉ ヘる。
方法は各培地にウシ胎児血清な０．’ｉ％Ｗ／Ｗ加える
ことを除けば実施例１と同様である。
ことを除けば実施例１と同様である。
第３図に結果を示したように、ヒト胎児肺細胞において
もエタノールアミン又はフォス７オエタノールア々ンを
／ 、 １００ハｏ １ ｅ ／を加えることｋよって
増殖は著しく向上した。
もエタノールアミン又はフォス７オエタノールア々ンを
／ 、 １００ハｏ １ ｅ ／を加えることｋよって
増殖は著しく向上した。
実施例ダ
本実施例ではヒ′ト胎先の腎臓に由来する正常二倍体細
胞（マイクロバイオｐジカル・アソシエイツ社）の増殖
に対するエタノールアミン及び７オスフオエタノールア
ミンの効果を述べる。
胞（マイクロバイオｐジカル・アソシエイツ社）の増殖
に対するエタノールアミン及び７オスフオエタノールア
ミンの効果を述べる。
方法は各培地にウシ胎児血清な０．参＄ Ｗ／Ｗ加える
ことを除けば実施例１と同様である。
ことを除けば実施例１と同様である。
第参図に結果を示したよ５に、ヒト胎児腎細胞において
もエタノ−ルア瑠ン又はフオスフオエタノールアミンを
／ 、 １００μｍ・ｌ・／を加えるととＫよって増殖
は著しく向上した。
もエタノ−ルア瑠ン又はフオスフオエタノールアミンを
／ 、 １００μｍ・ｌ・／を加えるととＫよって増殖
は著しく向上した。
＃Ｉ１図はアフリカミドリザル腎細胞の増殖に対するエ
タノ−ルア之ンの効果を示す。 第２図はアフリカミドリザル腎細胞の増殖に対スルフオ
スフオエタノールアミンの効果を示ス。 第３図はヒト胎児肺細胞の増殖に対するエタノールアミ
ン及びフォス７オエタノールア々ンの効果を示す。 第参図はヒト胎児腎細胞の増殖に対するエタノールアミ
ン及びフォス７オエタノールアミンの効果を示す。 各回部、縦軸はエタ／−ルアミン誘導捧を添加しない一
合を１００とした相対増殖度、横軸はエタノ−ルア虐ン
ｔｓ尋体の添加濃度である。 又Ｏはエタノールアミン、・は７オス７オエタノールア
ミンを示す。 特許出願人 旭化成ｒ業株式会社 代理人弁理士 星 野 透 才１図 才２０ 本加壇友（ＰｑＮｔ力）
タノ−ルア之ンの効果を示す。 第２図はアフリカミドリザル腎細胞の増殖に対スルフオ
スフオエタノールアミンの効果を示ス。 第３図はヒト胎児肺細胞の増殖に対するエタノールアミ
ン及びフォス７オエタノールア々ンの効果を示す。 第参図はヒト胎児腎細胞の増殖に対するエタノールアミ
ン及びフォス７オエタノールアミンの効果を示す。 各回部、縦軸はエタ／−ルアミン誘導捧を添加しない一
合を１００とした相対増殖度、横軸はエタノ−ルア虐ン
ｔｓ尋体の添加濃度である。 又Ｏはエタノールアミン、・は７オス７オエタノールア
ミンを示す。 特許出願人 旭化成ｒ業株式会社 代理人弁理士 星 野 透 才１図 才２０ 本加壇友（ＰｑＮｔ力）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １１） 培＊ｔ＠地中にエタノールアミン鰐導体を添
加することを待機とする動物に由来する正常二倍体細胞
の培養法。 （２） 動−に由来する正常二倍体細胞が腎臓に由来
する正常二倍体細胞である特許請求の範囲第１ＩＩｉ記
載の培養法。 １３）腎臓がヒト胎児の腎臓である特許請求の範囲第２
項記載の培養法。 （４）動物に由来する正常二倍体細胞がヒト胎児のＨＫ
由来する正常二倍体細胞である特許請求の範囲結１項記
載の培養法。 （５） エタノールアミン鰐導体の添加濃度がｌ〜ｉ
ｏｏμ醜・ｌ・／ｌである特許請求の範囲＠／項記載の
培養法。 （６） 培養培地がエビダーマルグロースファクター
とトランスフェリンを含む培養培地である特許請求の範
囲第７項記載の機養法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56212619A JPS58111682A (ja) | 1981-12-24 | 1981-12-24 | 正常二倍体細胞の培養法 |
| DE8282111100T DE3271210D1 (en) | 1981-12-24 | 1982-12-01 | Method for the cultivation of normal diploid cells and cultivation medium used therefor |
| EP19820111100 EP0082974B1 (en) | 1981-12-24 | 1982-12-01 | Method for the cultivation of normal diploid cells and cultivation medium used therefor |
| US06/446,144 US4615977A (en) | 1981-12-24 | 1982-12-02 | Method for the cultivation of normal diploid cells and cultivation medium used therefor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56212619A JPS58111682A (ja) | 1981-12-24 | 1981-12-24 | 正常二倍体細胞の培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58111682A true JPS58111682A (ja) | 1983-07-02 |
Family
ID=16625671
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56212619A Pending JPS58111682A (ja) | 1981-12-24 | 1981-12-24 | 正常二倍体細胞の培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58111682A (ja) |
-
1981
- 1981-12-24 JP JP56212619A patent/JPS58111682A/ja active Pending
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