JPH1169988A - コルチコトロピン放出因子との結合能を有する蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】うつ症、不安症と密接に関連するコルチコトロ
ピン放出因子との結合能を有する蛋白質を提供する。 【解決手段】全２３６アミノ酸残基からなる、コルチコ
トロピン放出因子との結合能を有するサブタイプＣＲＦ
３とそれをコードする遺伝子ｃｒｆ３、並びにコルチコ
トロピン放出因子との結合能を保持するそれらの変異
体。 【効果】本発明のサブタイプＣＲＦ３は、神経性疾患と
密接に関与する脳内部位に特異的に発現しており、向精
神薬開発の評価系として使用することが出来る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新たな蛋白性向精神薬
の提供、疾病原因に基づく向精神薬の探索や評価に利用
可能な、コルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）との結合
能を有する蛋白質に関する。

【０００２】

【従来の技術】従来の精神科領域の薬剤としての抗不安
薬・抗うつ薬は、ベンゾジアゼピン（ＢＺ）／５−ＨＴ
_1A受容体アゴニスト作用、モノアミン再取り込み阻害作
用の様に偶発的にその作用が認められたものや、これら
の薬効機序に基づいた開発によるものであって、不安・
神経症、うつ病の発症原因に基づいたものではない。こ
れら既存の薬剤は、薬物依存性や治療効果、難治性うつ
病には無効であることなど、解決すべき問題が残されて
いる。

【０００３】また、最近になって精神疾患の症状の分類
が細分化されたことにより、それぞれの疾患あるいは症
状に即した治療方法あるいは治療剤が必要となり、各疾
患の発症機序に基づいた新しい観点からの創薬活動への
期待が高まってきた。

【０００４】最近の病態生理学の進歩により、不安・神
経症とうつ病の発症にストレスが深く関与していること
が示唆され、ストレス等をトリガ−として、内因性に生
成（もしくは生成抑制）される不安・うつ症状惹起（も
しくは抑制）物質に関する研究が進められている。

【０００５】ストレスにより引き起こされる不安・うつ
病発現に深く関与することが示唆されている内因性物質
として、コルチコトロピン放出因子（corticotropin re
leasing factor、ＣＲＦ）があることが知られている。
例えば、ストレス時の視床下部でのＣＲＦ分泌亢進がう
つ・不安症状を惹起すること（Recent Prog. Horm. Re
s.、39、245-270、1983他）、うつ・不安症状と関連す
る部位である扁桃体およびエント−リナル皮質（entorh
inal cortex）でも分泌され、同様にストレス時に亢進
されること、等の報告がなされている。また臨床的に
は、うつ症、神経性食欲不振症、不安神経症と脳内ＣＲ
Ｆ過剰分泌が関与していることも示唆されている（スト
レスとホルモン、メジカルビュー社、１９９３）。

【０００６】ＣＲＦは４１アミノ酸残基からなるペプチ
ド因子であるが、その作用はＣＲＦ受容体（ＣＲＦ−
Ｒ）に結合することで発揮されるものと考えられてい
る。ＣＲＦ−Ｒをコードする遺伝子は1993年にクロ−ニ
ングされたが（Proc. Natl. Acad. Sci.、90、8967-897
1、1993）、その後現在までにＣＲＦ−Ｒには３つのサ
ブタイプ、すなわちＣＲＦ１、ＣＲＦ２α、ＣＲＦ２β
の３種類、が存在することが明らかになった（ＣＲＦ１
についてはProc.Natl. Acad. Sci.、92、836-840、199
5；ＣＲＦ２αについてはProc.Natl. Acad. Sci.、92、
2969-2973、1995；ＣＲＦ２βについてはEndocrinol.、
136、4139-4142、1995）。

【０００７】蛋白化学的側面におけるＣＲＦ−Ｒの研究
により、該サブタイプについて幾つかの知見が明らかに
なっている。ＣＲＦ−ＲはＣＲＦ１とＣＲＦ２の２つの
主要クラスに分類され、一般に７回膜貫通（ＴＭ）型と
呼ばれる特徴的な構造を持つ生体膜蛋白質である。ＣＲ
Ｆ１−ＲはＮ末端側の細胞外ドメインに糖鎖結合部位が
５箇所、第１、第２の細胞質内ループ部分並びにＣ末端
の細胞質内ドメインにプロテインキナーゼＣによってリ
ン酸化される部位が、それぞれ存在していると推測され
ている。これらの特徴は、他のＧ蛋白質共役型受容体
（G protein-coupled receptor）に見られるのと同様で
ある。また、ヒト下垂体から、第１細胞質内ループ部分
に２９アミノ酸残基が付加されたＣＲＦ１−Ｒが報告さ
れているが、両者の機能的な相違については明確にされ
ていない。

【０００８】ＣＲＦ２は、更にＣＲＦ２αとＣＲＦ２β
に分けられる。前者は４１１アミノ酸残基からなり、Ｃ
ＲＦ１とアミノ酸配列上で７１％の相同性を有する。こ
のスプライス的な変異体であるＣＲＦ２βは、ＣＲＦ２
αのＮ末端側の細胞外ドメインの３４アミノ酸残基が、
別の５４アミノ酸残基で置き換えられた構造を有してい
る。ＣＲＦ１とＣＲＦ２では、第５膜貫通部位、第６膜
貫通部位の配列において完全に一致しており、この部分
はシグナル伝達に必須のＧ蛋白質の結合部位と考えられ
ている。

【０００９】一方、ＣＲＦ−Ｒのサブタイプに対する多
くの機能的研究により、各サブタイプの薬理学的性質、
組織分布について差異が確認され、ＣＲＦと各サブタイ
プとの相互作用が複数の機能に関与する可能性が示唆さ
れつつある。

【００１０】しかしながら、ＣＲＦ１は下垂体に分布
し、うつ・不安症等の発現に関連している扁桃体および
エントリ−ナル皮質での発現は他の脳部位と比較して必
ずしも多くない（Proc. Natl. Acad. Sci.、 92、 836-
840、 1995）一方、ＣＲＦ２αは下垂体には存在せず、
うつ・不安症状発症に関係する扁桃体およびエントリ−
ナル皮質に多く発現しているものの、ＣＲＦ自体との親
和性は低い（Proc.Natl.Acad. Sci.、92、 836-840、 1
995）など、ＣＲＦ−Ｒの各サブタイプの分布と神経性
疾患発症関連部位とは必ずしも一致していない。さらに
は、ＣＲＦによるうつ・不安惹起作用の発現経路は、視
床下部を中心としたそれとは別に、中枢神経系において
神経伝達物質として機能することによる経路があること
も示唆されている（Pharmacol. Rev.、43、425-473、19
91他）。

【００１１】従って、これまでに報告された受容体の他
に、これら不安・うつ症発症に関連した部位において、
うつ・不安症状に深く関与するＣＲＦ−Ｒの新規サブタ
イプが存在すると想定されるが、未だこの様なサブタイ
プの報告はなされていない。

【００１２】

【課題を解決するための手段】ストレス応答反応に密接
に関与するＣＲＦ−Ｒのサブタイプが同定され、該サブ
タイプのアゴニストやアンタゴニストが見出されれば、
ストレスに起因するうつ・不安症等の症候群を改善させ
得る可能性がある。

【００１３】本発明者らは、ストレスによるうつ・不安
症等の神経症の発現に関与する新たなＣＲＦ−Ｒのサブ
タイプの存在を想定し、該サブタイプが、ＣＲＦによる
生理機能制御機構に基づいた特異的な向精神薬の開発に
有用であると考え、鋭意研究の結果、新規ＣＲＦ−Ｒの
サブタイプの存在を確認し、本発明を完成させるに至っ
た。

【００１４】即ち、本発明は、（ａ）配列番号１に記載
のアミノ酸配列からなる、ＣＲＦとの結合能を有する蛋
白質、（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列におい
て、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付
加されたアミノ酸配列からなり、かつＣＲＦ結合能を有
する蛋白質に関するものであり、また（ｃ）配列番号２
に記載の塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）配列番号２の
ＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、
かつＣＲＦ結合能を有する蛋白質をコードするヒト由来
のＤＮＡ、に関するものである。

【００１５】本発明者らは、ラット脳扁桃体の全ＲＮＡ
を対象として、以下のようにして新規サブタイプの探索
を試みた。逆転写酵素を利用したポリメラーゼ・チェイ
ン・リアクション法（ＲＴ−ＰＣＲ法）によりラット脳
で発現している遺伝子のｃＤＮＡライブラリーを作製
し、さらに公知のラットＣＲＦ２αのｃＤＮＡの部分塩
基配列に相当する合成したＤＮＡオリゴマーを用いて、
ＰＣＲ法で該目的遺伝子を含むと思われるＤＮＡを増幅
させた。発明者らが使用した合成ＤＮＡオリゴマーの配
列は次の通りである オリゴマーＡ；ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧ ＡＧＣＧＣＡＡＴＧ オリゴマーＢ；ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡ ＴＧＡＧＧＡＡ オリゴマーＡはその５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩの認
識配列を含み、オリゴマーＢはその５’末端に制限酵素
ＫｐｎＩの認識配列を含むように設計した。

【００１６】この様にして増幅された遺伝子を０．８％
アガロースゲル電気泳動で分離し、約１．８ｋｂの位置
に検出されるＤＮＡ断片（増幅ｃＤＮＡ）を、適当なク
ローニングベクター、例えばＰＣＲ^TMＩＩ等に組み換え
て宿主（ＰＣＲ^TMＩＩの場合には大腸菌ＤＨ５等）を形
質転換し、クローニングした。

【００１７】クローニングされた増幅ｃＤＮＡの塩基配
列を、市販のＤＮＡシーケンサーを用いて確認したとこ
ろ、該増幅ｃＤＮＡ中に蛋白質をコードする領域（Open
Reading Frame、ＯＲＦ）が認められ、これを遺伝子ｃ
ｒｆ３と、また遺伝子ｃｒｆ３にコードされる蛋白質を
サブタイプＣＲＦ３と命名した。

【００１８】遺伝子ｃｒｆ３の塩基配列は、図１に示し
たＣＲＦ２α遺伝子の塩基配列の６９８番目と６９９番
目の間に４８６塩基対からなる配列が挿入された形とな
っており、その結果、ＣＲＦ２αの第４膜貫通領域途中
からのアミノ酸配列が異なる、全２３６残基の蛋白質を
コードしていることが判明した。すなわち、サブタイプ
ＣＲＦ３のアミノ酸配列は、ＣＲＦ２αの２３３番目の
アミノ酸配列までと完全に一致するが、その後はＣＲＦ
２αには存在しない配列からなる３残基が続いて終了す
るものとなっていた。その構造から、これまでに報告の
ない、神経性疾患に関連性の高い新たなサブタイプであ
ると推察された。

【００１９】この遺伝子ｃｒｆ３を用いて、適当な宿主
ベクター系による一般的な遺伝子組み換え技術によっ
て、組み換え遺伝子を調製することができる。適当なベ
クターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ
３２２、ｐＵＣ１１８その他）、枯草菌由来のプラスミ
ド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４その他）、酵母由来
のプラスミド（例、ｐＳＨ１９その他）、さらにバクテ
リオファージやレトロウィルスやワクシニアウィルス等
の動物ウィルス等が利用できる。組み換えに際しては、
適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや
翻訳終止コドンを付加することも可能である。さらに該
遺伝子を発現させるために、遺伝子の上流に適当な発現
プロモーターを接続する。使用するプロモーターは、宿
主に応じて適宜選択すればよい。例えば、宿主が大腸菌
である場合には、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、
宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ系プロモータ
ー等が、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモータ
ー、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿
主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモータ
ー、レトロウィルスプロモーター等が、それぞれ使用で
きる。 また該遺伝子を他の蛋白質（例、グルタチオン
ＳトランスフェラーゼプロテインＡその他）との融合蛋
白質として発現させることも可能である。このようにし
て発現させた融合型サブタイプＣＲＦ３は、適当なプロ
テアーゼ（例、トロンビンその他）を用いて切り出すこ
とが可能である。

【００２０】宿主としては、エシェリヒア属菌であるＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの各種菌株、バチルス
属菌であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓの各種
菌株、酵母としてはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅの各種菌株、動物細胞としてはＣＯＳ
−７細胞、ＣＨＯ細胞等が利用できる。

【００２１】上記組み換えベクターを用いて宿主細胞を
形質転換する方法としては、各宿主細胞に対して一般的
に用いられる形質転換方法が適用でき、また、形質転換
された細胞は、用いたベクターに存在する選択マーカ
ー、またはベクター上に適当な選択マーカーを付与又は
削除し、これら選択マーカーの有無に基づいて識別する
ことにより、単離することができる。

【００２２】本発明者らは、発現ベクターとしてｐｃＤ
ＮＡ３（５．４ｋｂ）を、宿主細胞としてＣＯＳ−７細
胞をそれぞれ用い、遺伝子ｃｒｆ３の発現を試みた。Ｃ
ＯＳ−７細胞への遺伝子の導入はエレクトロポレーショ
ン法により行い、得られた形質転換細胞を適当な条件下
で培養した後、該細胞で一過性に発現させたサブタイプ
ＣＲＦ３のＣＲＦとの結合能を、放射性ラベルを施した
¹²⁵Ｉ−ＣＲＦを用いて測定した。その結果、図５に示
した様に、サブタイプＣＲＦ３を発現している形質転換
ＣＯＳ−７細胞には、比較コントロールとしてＣＲＦ１
を発現させたＣＯＳ−７細胞と、ほぼ同等の¹²⁵Ｉ−Ｃ
ＲＦ結合が認められた。

【００２３】また、本発明の遺伝子ｃｒｆ３の生体内に
おける発現をノーザンハイブリダイゼーションによって
確認したところ、遺伝子ｃｒｆ３は主として扁桃体、視
床および視床下部において発現が認められ、ＣＲＦ１や
ＣＲＦ２αに比べ、その発現量は有意に多かった。

【００２４】以上から、本発明のサブタイプＣＲＦ３
は、ストレス下でのうつ・不安症等の神経性疾患症状の
発現に密接に関連するサブタイプであると推察される。
また、サブタイプＣＲＦ３を発現させた適当な形質転換
細胞や組み換えサブタイプＣＲＦ３それ自体を、このサ
ブタイプへのアゴニストやアンタゴニストの探索に用い
ることができる。

【００２５】尚、本発明においては、配列番号２に示し
たＤＮＡ配列の他に、該ＤＮＡとハイブリダイズし、か
つＣＲＦと結合能を有する生理活性蛋白質をコードする
ＤＮＡも、本発明の範囲内である。

【００２６】すなわち、遺伝子ｃｒｆ３の全長配列にお
いて、種々の人為的処理、例えば部位特異的変異導入、
変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤ
ＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ
配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体
が、遺伝子ｃｒｆ３とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし、かつＣＲＦとの結合能を有する生理活性
蛋白質をコードするＤＮＡであれば、配列番号２に示し
たＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のも
のである。 上記のＤＮＡ変異の程度は、遺伝子ｃｒｆ
３のＤＮＡ配列と９０％以上の相同性を有するものであ
れば許容範囲内である。

【００２７】また、遺伝子ｃｒｆ３とハイブリダイズす
る程度としては、通常の条件下（例えば ＤＩＧ ＤＮ
Ａ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ベーリンガー・マンハ
イム社製Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブを
ラベルした場合に、３２℃のＤＩＧＥａｓｙ Ｈｙｂ溶
液（ベーリンガー・マンハイム社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１
６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、５０℃の０．
５×ＳＳＣ溶液（０．１％[ｗ／ｖ]ＳＤＳを含む）中で
メンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）
でのサザンハイブリダイゼーションで、遺伝子ｃｒｆ３
にハイブリダイズする程度であればよい。

【００２８】また、上記のごとく遺伝子ｃｒｆ３と相同
性の高い変異体遺伝子にコードされる蛋白質であって、
ＣＲＦとの結合能を有する生理活性蛋白質もまた、本発
明の範囲内のものである。

【００２９】蛋白質の構成要素となるアミノ酸の側鎖
は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なる
ものであるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体
構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の
高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測に
より知られている。例えば、アミノ酸残基の置換につい
ては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌ
ｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイ
シン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン
酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸
（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃ
ｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅ
ｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａ
ｒｇ）、等が挙げられる。

【００３０】従って、配列番号１に示したサブタイプＣ
ＲＦ３のアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変
異蛋白質であっても、その変異がサブタイプＣＲＦ３の
３次元構造において保存性が高い変異であって、その変
異蛋白質がサブタイプＣＲＦ３と同様にＣＲＦとの結合
能を有する生理活性蛋白質であれば、これらは本発明の
範囲内にあるものと言うことができる。変異の程度とし
ては、配列番号１に示したアミノ酸配列との相同性が、
９０％以上のものが許容し得る範囲である。

【００３１】すなわち、遺伝子ｃｒｆ３の全長配列にお
いて、部分的にＤＮＡ配列が変化した結果得られる、サ
ブタイプＣＲＦ３のアミノ酸配列の１もしくは複数個の
アミノ酸が変異した、ＣＲＦとの結合能を有する変異蛋
白質は、サブタイプＣＲＦ３と実質的に同一のものであ
って、サブタイプＣＲＦ３と同様に、適当な形質転換細
胞や組み換え変異体それ自体をアゴニストやアンタゴニ
ストの探索に用いることができるのである。

【００３２】以下、実施例を挙げて詳述するが、本発明
はこの実施例に限定されないことは言うまでもない。
尚、以下の全ての実施例における各種操作は、特に断ら
ない限り、生化学分野の最も一般的な実験書であるモレ
キュラー クローニング（Molucularcloning、Cold Spr
ing Harbor Lab.Press, 1989）に記載の方法に準じて行
ったものである。また、各種の酵素処理はその酵素毎の
一般的な反応条件下で、各種実験キットを用いた処理は
そのキットに添付された操作手順書により、それぞれ行
った。

【００３３】

【実施例】

＜実施例１＞ 遺伝子ｃｒｆ３のクローニング １−１． 全ＲＮＡの調製 ラットを断頭により屠殺して脳を取り出し、氷上にて分
離した扁桃体から以下の方法で全ＲＮＡを抽出した。

【００３４】摘出した扁桃体０．２ｇを、扁桃体５０ｍ
ｇ当たり１ｍＬのISOGEN（ニッポンジーン社）を加え、
ホモジナイズした。ホモジネートにISOGENの１／５量の
クロロホルムを加えて激しく撹拌後、３分間室温に放置
した。ホモジネート−クロロホルム混液を４℃で１５分
間、１２、０００×ｇで遠心分離して得た上層に、ISOG
ENの１／２量のイソプロパノールを加え、１０分間室温
に放置した。混液を４℃で１０分間、１２，０００×ｇ
で遠心分離して得られた沈査を７５％エタノールで洗浄
した後、風乾し、滅菌蒸留水に懸濁して全ＲＮＡを調製
した。

【００３５】１−２． 逆転写酵素法による鋳型ｃＤＮ
Ａの調製 １−１により得られた全ＲＮＡからの鋳型ｃＤＮＡ合成
は、ギブコＢＲＬ社から市販されている、SUPERSCRIPT
^TM preamplification systemを用いて行った。滅菌蒸留
水に溶解した全ＲＮＡ５μｇ／１２μｌを、０．５μｇ
／μｌオリゴ（ｄｔ）１μｌと７０℃で１０分間加熱し
て１分間氷上に放置した後、１０×ＰＣＲ緩衝液２μ
ｌ、２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂２μｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｍ
ｉ×１μｌ、０．１Ｍ ＤＴＴ２μｌを加え、４２℃で
５分間加温した。その後、逆転写酵素１μｌ（酵素量20
0units）を加え、さらに４２℃で５０分間加温した。７
０℃で１５分間加熱することにより逆転写酵素反応を停
止させた後、ＲＮａｓｅＨを１μｌ（酵素量2units）加
え、３７℃で２０分間反応させ、鋳型ｃＤＮＡを調製し
た。

【００３６】１−３． ＰＣＲ法によるｃＤＮＡの増幅
とベクターへの組み換え 図１に示した公知のラットＣＲＦ２αをコードする遺伝
子の塩基配列に基づき、ＤＮＡオリゴマーＡ、Ｂを合成
した。

【００３７】 オリゴマーＡ；ＡＴＡＴＧＡＡＴＴＣＣＡＡＣＧＣＧＣＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧ ＡＧＣＧＣＡＡＴＧ オリゴマーＢ；ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＡ ＴＧＡＧＧＡＡ オリゴマーＡは５’末端に制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配
列を含み、オリゴマーＢは５’末端に制限酵素ＫｐｎＩ
の認識配列を含むオリゴマーである。このオリゴマーを
用いて、以下の反応液組成にて１−２で調製した鋳型ｃ
ＤＮＡに対してＰＣＲを行った。

【００３８】 鋳型ｃＤＮＡ ２μｌ １０×ＰＣＲ緩衝液 ５μｌ ２５ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ３μｌ １０ｍＭ ｄＮＴＰｍｉｘ １μｌ １０μＭプライマーＡ ５μｌ １０μＭプライマーＢ ５μｌ 滅菌蒸留水 ２８．５μｌ Taq DNA polymerase（宝酒造（株）） ０．５μｌ ＰＣＲ反応は、上記反応液を９５℃で１分間、６５℃で
２分間、７２℃で２分間でそれぞれインキュベーション
する工程を１サイクルとし、このサイクルを３０回繰り
返すことにより行った。

【００３９】処理後の反応液にエタノール沈殿法によ
り、反応生成物である粗増幅ＤＮＡを含む沈査を調製し
た。これを０．８％アガロースゲル電気泳動にかけ、約
１．８ｋｂの位置に検出されるバンド（増幅ｃＤＮＡ）
をアガロースゲルから切り取った。バイオラッド社のPr
ep-A-Gene^TM DNA purification kitを用い、同キットの
操作手順に従ってゲルから目的とする増幅ｃＤＮＡを溶
出、精製した。精製した増幅ｃＤＮＡを、制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩとＫｐｎＩを用いて処理した。同様に制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩとＫｐｎＩで開環、調製したクローニングベク
ターＰＣＲ^TMＩＩと制限酵素処理した増幅ｃＤＮＡと
を、ＴＡＫＡＲＡライゲーションキットを用い、閉環処
理した。この処理液を用いて大腸菌ＤＨ５αを塩化カル
シウム法により形質転換した。抗生物質アンピシリン５
０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレート培地に形質転換処理後
の大腸菌を接種し、３７℃で一夜培養した。プレート上
に現れたコロニーを抗生物質アンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌを含むＬＢ液体培地１０ｍｌに接種して培養後、菌体
からプラスミドＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法で調製し、
該増幅ｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐｃｃ０１を
確認した。以上の操作の概略を、図２に示した。

【００４０】１−４． ＤＮＡ断片の塩基配列の決定 １−３で得た組み換えプラスミドｐｃｃ０１に組み込ま
れている増幅ｃＤＮＡの塩基配列を、蛍光色素を用いた
自動塩基配列解析装置（ＡＬＦｅｘｐｒｅｓｓ、ファル
マシア社）を用いて決定した。

【００４１】組み換え体からアルカリ−ＳＤＳ法により
プラスミドｐｃｃ０１を調製した。このプラスミド５μ
ｇを滅菌蒸留水３２μＬに溶解し、３Ｍの水酸化ナトリ
ウム８μＬを加え、沸騰水中で５分間加熱後氷中に置い
て急冷し、１本鎖型ＤＮＡを調製した。この１本鎖型Ｄ
ＮＡを鋳型として、Cy5 Auto Read Sequencing Kit（フ
ァルマシア社製）を用い、同キットの操作手順に従っ
て、ダイデオキシ法により塩基配列を決定した。

【００４２】上記操作により決定された増幅断片の全塩
基配列を図３に示す。この増幅断片の塩基配列中に、蛋
白質をコードする領域（ＯＲＦ）の存在を確認し、これ
を遺伝子ｃｒｆ３、該遺伝子にコードされる蛋白質をサ
ブタイプＣＲＦ３と命名した。遺伝子ｃｒｆ３の塩基配
列を配列番号２に、サブタイプＣＲＦ３のアミノ酸配列
を配列番号１に示す。

【００４３】遺伝子ｃｒｆ３の塩基配列は、図１に示し
たＣＲＦ２α遺伝子の塩基配列の６９８番目と６９９番
目の間に４８６塩基対の塩基配列が挿入されていた。そ
の結果、遺伝子ｃｒｆ３はＣＲＦ２αの第４膜貫通領域
途中からアミノ酸配列の異なる全２３６残基の蛋白質を
コードしていることが判明した。アミノ酸配列で比較す
ると、サブタイプＣＲＦ３のアミノ酸配列は、ＣＲＦ２
αの２３３番目のアミノ酸配列までと完全に一致する
が、その後はＣＲＦ２αには存在しない３残基が続いて
終了するものであった。このサブタイプＣＲＦ３のアミ
ノ酸配列と同一の配列からなる遺伝子並びに蛋白質をＥ
ＭＢＬやＰＤＢ等のデータベースを用いて検索したが、
該データベース中には一致するものは見あたらなかっ
た。

【００４４】＜実施例２＞ サブタイプＣＲＦ３の発現 ２−１． 発現ベクターｐＣＣ０４の構築 実施例１で得られた遺伝子ｃｒｆ３を含むｐｃｃ０１を
制限酵素ＫｐｎＩで切断後に切断末端を平滑化し、さら
にＥｃｏＲＩで処理した後、０．８％アガロースゲル電
気泳動を行い、実施例１−３と同様の操作により、遺伝
子ｃｒｆ３を含む１．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
同様に、発現ベクターｐｃＤＮＡ３（５．４ｋｂ、イン
ビトロジェン社）についても、制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＥｃｏＲＶで開環後、０．８％アガロースゲル電気泳
動を行って精製した。この開環ベクターと１．８ｋｂの
ＤＮＡ断片を実施例１−３と同様にして反応させ、反応
液を用いて塩化カルシウム法にて大腸菌ＪＭ１０９を形
質転換した。抗生物質アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含
むＬＢプレート培地に形質転換処理後の大腸菌を接種
し、３７℃で一夜培養した。プレート上に現れたコロニ
ーを抗生物質アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢ液
体培地１０ｍＬに接種して培養後、菌体からプラスミド
ＤＮＡをアルカリ−ＳＤＳ法で調製し、遺伝子ｃｒｆ３
を有する発現ベクターｐＣＣ０４を得た。以上の操作の
概略を図４に示す。

【００４５】２−２． ＣＯＳ−７細胞への組み換えベ
クターｐＣＣ０４の導入 宿主細胞として選択したＣＯＳ−７細胞への遺伝子の導
入は、エレクトロポレーション法（electroporation）
により行った。ＣＯＳ−７細胞を１０％仔ウシ血清（Ｆ
ＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）
を１０ｍｌ加えた１０ｃｍ径のシャーレで、９０％コン
フルエントとなるまで培養した後、トリプシン−ＥＤＴ
Ａを用いて培養細胞をシャーレから剥がし、無血清のＤ
ＭＥＭで２度洗浄した。洗浄後、無血清ＤＭＥＭを細胞
数が１×１０⁷／ｍｌになるように加えて調製した細胞
懸濁液７５０μｌを、０．４ｃｍスリットのエレクトロ
ポレーション用キュベットに移し、２−１で調製した組
み換えベクターｐＣＣ０４を１０μｇ加え、室温で１０
分間静置した。エレクトロポレーションの操作は、ジー
ンパルサー（バイオラッド社）を用いて、電圧２００
Ｖ、９６０μＦＤの条件下で行った。処理後の細胞を室
温に10分間静置してから、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ
中で、４８〜７２時間培養した。

【００４６】２−３． 形質転換体細胞内でのサブタイ
プＣＲＦ３の発現 ２−２で得られた形質転換型ＣＯＳ−７内でのサブタイ
プＣＲＦ３の発現は、該形質転換細胞へのＣＲＦの結合
を測定することで確認した。

【００４７】遺伝子ｃｒｆ３を導入したＣＯＳ−７細胞
を、１０％ＦＣＳを含んだＤＭＥＭを培地として６穴プ
レートまたは１２穴プレートで４８〜７２時間培養し
た。培養後、ＤＭＥＭを吸引により除去し、培養後のＣ
ＯＳ−７細胞を１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、 ０．１％ ＢＳＡ、 ０．１％ バシトラシンを含む
５０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍｌを
加えた。１０ｎＭ[¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ヒツジＣＲＦ（ＮＥ
Ｎ社製）を１０μｌ添加し、２２℃で２時間反応させ
た。反応終了後、緩衝液を吸引により除去し、２ｍｌの
ＰＢＳで２度洗浄した。細胞を０．５Ｎ ＮａＯＨで可
溶化し、放射活性をγカウンターにて測定した。１μＭ
ＣＲＦ存在下における[¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ヒツジＣＲＦ
結合量を非特異的結合とし、特異的結合は１μＭ ＣＲ
Ｆ非存在下での[¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ］ヒツジＣＲＦ結合（総
結合）から非特異的結合を差し引くことにより求めた。

【００４８】ＣＯＳ−７細胞に一過性に発現させた新規
ＣＲＦ受容体への¹²⁵Ｉ−ＣＲＦ結合実験の結果を図５
に示した。サブタイプＣＲＦ３を発現している形質転換
体は、比較コントロールであるＣＲＦ１を発現している
形質転換体と、ほぼ同等の^{12 5}Ｉ−ＣＲＦ結合を有して
いることが認められた。また、非放射性ラベル型ＣＲＦ
を１０^ー6Ｍ〜１０^ー10Ｍ共存させたときの、サブタイプ
ＣＲＦ３への¹²⁵Ｉ−ＣＲＦ結合の抑制曲線を図６に示
した。ＣＲＦは濃度依存的にサブタイプＣＲＦ３への
¹²⁵Ｉ−ＣＲＦ結合を抑制し、¹²⁵Ｉ−ＣＲＦのＣＲＦ３
への結合の５０％を抑制するときのＣＲＦ濃度（ＩＣ５
０値）は、４ｎＭであった。

【００４９】＜実施例３＞ ｃｒｆ３遺伝子の脳内発現
分布の確認 ラット脳を扁桃体、視床下部、視床、海馬、線条体、下
垂体、前頭皮質および小脳の各部位にそれぞれ分離した
後、＜実施例１＞に従って各部位から全ＲＮＡを調製し
た。全ＲＮＡ（２０〜３０μｇ／４μｌ）に１０×ＭＯ
ＰＳ １μｌ、ホルムアルデヒド３μｌおよびホルムア
ミド１０μｌを加えて６５℃で１５分間インキュベート
した。インキュベーション終了後、急冷し、ホルムアル
デヒドgel-loading bufferを２μｌ添加し、１．２％ホ
ルムアルデヒドゲルを用いて、電圧８５ボルトで２〜３
時間泳動した。泳動後、ゲルをＤＥＰＣ水で数回洗浄
し、一晩、ナイロン膜（アマシャム社製ハイボンドＮ
＋）にトランスファーした。トランスファーした膜を乾
燥し、波長２５４ｎｍで５分間ＵＶ照射した。膜をプレ
ハイブリダイゼーション液（１０％ＳＤＳ ２ｍｌ，５
Ｍ ＮａＣｌ ４ｍｌ、５０％デキストラン ４ｍｌ、滅
菌精製水 １０ｍｌ、サケ精子ＤＮＡ ２ｍｇ）中に、６
５℃で１時間、プレハイブリダイズした。実施例１−３
の操作に従い調製した遺伝子ｃｒｆ３を含む１．８ｋｂ
のＤＮＡ断片を、Prime-It（ストラタジーン社）で放射
標識してプローブとし、これをプレハイブリダイゼーシ
ョン液中に添加して６５℃で一晩、ハイブリダイズし
た。ハイブリダイズ終了後、膜を２×ＳＳＣで室温で１
０分洗浄した。さらに、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで
６５℃で３０分、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６
５℃で３０分間洗浄した後、Ｘ線フィルムに露光して確
認した。その結果を表１に示した。

【００５０】ノーザンハイブリダイゼーションの結果、
遺伝子ｃｒｆ３の発現は扁桃体、視床下部および視床な
どに認められ、海馬、線条体、下垂体、前頭皮質および
小脳には認められなかった。

【００５１】

【表１】

【００５２】

【本発明の効果】本発明のサブタイプＣＲＦ３は、神経
性疾患と密接に関与する脳内部位に特異的に発現してお
り、向精神薬開発の評価系として使用することが出来
る。

【００５３】

【配列表】

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：１ 配列の長さ：２３６残基 配列の型 ：アミノ酸 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Ｍｅｔ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｓｅｒ
Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｌａ Ａｓｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ １ ５
１０ １５ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｌｅｕ Ｌｅｕ
Ｌｅｕ Ａｓｐ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｐｒｏ ２０
２５ ３０ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｔｈｒ Ｔｈｒ Ｌｅｕ Ａｓｐ ３５
４０ ４５ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｔｒｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ
Ｓｅｒ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ ５０
５５ ６０ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｔｙｒ Ｐｈｅ
Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｔｈｒ ６５
７０ ７５ Ｔｈｒ Ａｒｇ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｃｙｓ
Ｌｅｕ Ｇｌｕ Ａｓｎ Ｇｌｙ Ｔｈｒ Ｔｒｐ Ａｌａ ８０
８５ ９０ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｈｉｓ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ａｓｐ Ａｓｐ Ｌｙｓ ９５
１００ １０５ Ｇｌｎ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
Ａｒｇ Ｉｌｅ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ａｓｎ １１０
１１５ １２０ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｈｉｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｖａｌ
Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ １２５
１３０ １３５ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｓｅｒ
Ｉｌｅ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｖａｌ １４０
１４５ １５０ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｒｐ Ａｓｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ｔｈｒ Ｔｈｒ
Ｐｈｅ ｌｌｅ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ａｓｎ Ｉｌｅ Ｔｈｒ １５５
１６０ １６５ Ｔｒｐ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｉｌｅ Ａｓｐ
Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ａｓｎ １７０
１７５ １８０ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｔｈｒ
Ｔｈｒ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ａｓｎ Ｔｙｒ Ｐｈｅ Ｖａｌ １８５
１９０ １９５ Ｖａｌ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｔｒｐ Ｍｅｔ Ｐｈｅ
Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｈｉｓ ２００
２０５ ２１０ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｔｙｒ Ｓｅｒ
Ｔｈｒ Ｇｌｕ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｔｒｐ ２１５
２２０ ２２５ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｃｙｓ
Ｇｌｕ Ｇｌｙ Ｐｒｏ ２３０
２３５

【００５４】

【配列表】

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）：２ 配列の長さ：７１１塩基 配列の型 ：二本鎖 トポロジ−：直鎖状 配列の種類：核酸 配列 ＡＴＧ ＧＡＣ ＧＣＧ ＧＣＧ ＣＴＧ ＣＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＴＧ
ＣＴＧ ＧＡＧ ＧＣＣ ＡＡＣ ＴＧＣ ＡＧＣ ４５ ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＧ ＧＣＣ ＧＡＡ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＧ
ＧＡＣ ＧＧＣ ＴＧＧ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ９０ ＣＣＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＧＡＡ ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＡＣ ＴＣＣ ＴＡＣ
ＴＧＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＧＡＣ １３５ ＣＡＧ ＡＴＣ ＧＧＧ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＣＣ ＣＡＧ ＡＧＣ
ＧＣＧ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ＣＴＡ ＧＴＧ １８０ ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＣＡ ＴＧＣ ＣＣＣ ＧＡＡ ＴＡＣ ＴＴＣ ＡＡＣ
ＧＧＣ ＡＴＣ ＡＡＧ ＴＡＣ ＡＡＣ ＡＣＧ ２２５ ＡＣＣ ＣＧＧ ＡＡＴ ＧＣＣ ＴＡＣ ＡＧＡ ＧＡＡ ＴＧＣ ＣＴＧ
ＧＡＧ ＡＡＴ ＧＧＧ ＡＣＣ ＴＧＧ ＧＣＣ ２７０ ＴＣＡ ＡＧＧ ＡＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＣＡ ＣＡＣ ＴＧＴ ＧＡＡ
ＣＣＣ ＡＴＴ ＴＴＧ ＧＡＴ ＧＡＣ ＡＡＧ ３１５ ＣＡＧ ＡＧＧ ＡＡＧ ＴＡＴ ＧＡＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＴＡＣ ＣＧＡ
ＡＴＣ ＧＣＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＴＣ ＡＡＣ ３６０ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＧＣ ＣＡＣ ＴＧＴ ＧＴＴ ＴＣＣ ＧＴＧ ＧＴＧ
ＧＣＣ ＣＴＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＧＣＴ ＴＴＣ ４０５ ＣＴＧ ＣＴＴ ＴＴＣ ＣＴＡ ＧＴＧ ＣＴＧ ＣＧＧ ＡＧＴ ＡＴＣ
ＣＧＣ ＴＧＣ ＣＴＧ ＣＧＧ ＡＡＴ ＧＴＧ ４５０ ＡＴＣ ＣＡＣ ＴＧＧ ＡＡＣ ＣＴＣ ＡＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ ＴＴＣ
ＡＴＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＡＡＣ ＡＴＣ ＡＣＧ ４９５ ＴＧＧ ＴＴＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＡＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＧＡＣ ＣＡＣ
ＧＡＡ ＧＴＧ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＧＣ ＡＡＴ ５４０ ＧＡＧ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＣＣ
ＡＴＡ ＴＴＣ ＡＡＣ ＴＡＣ ＴＴＴ ＧＴＧ ５８５ ＧＴＣ ＡＣＣ ＡＡＣ ＴＴＣ ＴＴＣ ＴＧＧ ＡＴＧ ＴＴＴ ＧＴＧ
ＧＡＡ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＣ ６３０ ＡＣＧ ＧＣＣ ＡＴＣ ＧＴＣ ＡＴＧ ＡＣＧ ＴＡＣ ＴＣＣ ＡＣＧ
ＧＡＧ ＣＡＴ ＣＴＧ ＣＧＣ ＡＡＧ ＴＧＧ ６７５ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＴＣ ＡＴＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＴ ＧＡＧ
ＧＧＴ ＣＣＣ ＴＧＡ ７１１

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＲＦ２αをコードする遺伝子の塩基配列を示
す。

【図２】本発明の遺伝子ｃｒｆ３のクローニング操作と
ｐｃｃ０１の構築の概略を示す。

【図３】クローニング操作によって得られた、ｃｒｆ３
遺伝子を含む全長約１．８ｋｂのＤＮＡ断片の全塩基配
列を示す。

【図４】遺伝子ｃｒｆ３を組み込んだ、サブタイプＣＲ
Ｆ３の発現ベクターｐＣＣ０４の構築の概略を示す。

【図５】ＣＯＳ−７細胞に一過性に発現させたサブタイ
プＣＲＦ３への、¹²⁵Ｉ−ＣＲＦ結合能実験の結果であ
り、縦軸は¹²⁵Ｉの放射活性を示している。

【図６】ＣＯＳ−７細胞に一過性に発現させたサブタイ
プＣＲＦ３への、¹²⁵Ｉ−ＣＲＦ結合のＣＲＦによる抑
制曲線であり、横軸は放射性ラベルをしていないＣＲＦ
の濃度のＬｏｇ値を、縦軸はＣＲＦの各濃度における
¹²⁵Ｉ−ＣＲＦのＣＲＦ３への結合の抑制率を示してい
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 奥山 茂 東京都豊島区高田３丁目24番１号 大正製 薬株式会社内

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質。 （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなる、コル
   チコトロピン放出因子との結合能を有する蛋白質。 （ｂ）配列番号１のアミノ酸配列において１もしくは数
   個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸
   配列からなり、かつコルチコトロピン放出因子との結合
   能を有する蛋白質。
2. 【請求項２】以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡからな
   る遺伝子。 （ａ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。 （ｂ）配列番号２のＤＮＡとストリンジェントな条件で
   ハイブリダイズし、かつコルチコトロピン放出因子との
   結合能を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。