JPH1164279A - マイクロチップ電気泳動装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 マイクロチップ電気泳動で検出感度を高め、
かつ測定対象への汎用性を広げる。 【構成】 マイクロチップ２はベースプレート４とカバ
ープレート６から構成されており、ベースプレート４表
面には互いに交差する分離流路８、サンプル流路１０が
泳動用キャピラリー溝として形成されている。カバープ
レート６にはリザーバ１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ
及びプリズム１４が設けられており、プリズム１４はカ
バープレート６の役割をするようにベースプレート４に
接している。分離流路８上に位置するプリズム１４の面
にはＡｕ薄膜１６が５０ｎｍの厚みで蒸着されている。
分離流路８の吸光度検出領域１では吸光度検出を行な
い、分離流路８の屈折率検出領域３では表面プラズモン
共鳴屈折率測定を行なう。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、極微量のサンプル
を超高速かつ高分離で分析する電気泳動装置に関し、さ
らに詳しくは２枚の透明板状部材を貼り合わせて内側に
分離流路を形成させたマイクロチップを用いるマイクロ
チップ電気泳動装置に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】極微量のタンパク質や核酸などを分析す
る場合には、従来から電気泳動法が用いられており、そ
の装置化技術の例としてキャピラリ電気泳動装置があ
る。キャピラリ電気泳動装置は、内径が１００μｍ以下
のガラスキャピラリー内に泳動バッファを充填し、一端
側に試料を導入した後、両端間に高電圧を印加して分析
対象物をキャピラリー内で展開させるものである。キャ
ピラリー内は容積に対して表面積が大きい、すなわち冷
却効率が高いことから、高電圧の印加が可能となり、Ｄ
ＮＡなどの極微量試料を高速、かつ高分解能にて分析す
ることができる。

【０００３】近年、取扱いが煩雑なフューズドシリカ・
キャピラリーに代わって、分析の高速化、装置の小型化
が期待できる形態として、D. J. Harrison et al./ Ana
l. Chim. Acta 283 (1993) 361-366に示されているよう
に、２枚の基板を接合して形成されたキャピラリー電気
泳動チップ（マイクロチップという）が提案されてい
る。そのマイクロチップの例を図１に示す。一対の透明
基板（一般にはガラス、石英、樹脂など）５１，５２か
らなり、一方の基板５２の表面に互いに交差する泳動用
キャピラリー溝５４，５５を形成し、他方の基板５１に
はその溝５４，５５の端に対応する位置にリザーバ５３
を貫通穴として設けたものである。

【０００４】このマイクロチップを使用するときは、両
基板５１，５２を（Ｃ）に示すように重ね、いずれかの
リザーバ５３から泳動液を溝５４，５５中に注入する。
その後、短い方の溝５４の一方の端のリザーバ５３に試
料を注入しその溝５４の両端のリザーバ５３，５３間に
電極を差し込んで所定時間だけ高電圧を印加する。これ
により、試料は溝５４中に分散される。次に、長い方の
溝５５の両端のリザーバ５３，５３に電極を差し込み、
泳動電圧を印加する。これにより、両溝５４，５５の交
差部分５６に存在する試料が溝５５内を電気泳動する。
溝５５の適当な位置に検出器を配置しておくことによ
り、分離成分の検出を行なう。

【０００５】従来のマイクロチップ電気泳動装置におい
て、検出部に光学的検出器を採用したものは、検出手段
としてレーザ蛍光検出が行なわれており、紫外可視領域
での吸収による検出を行なっているものはない。紫外可
視吸収検出を適応しようとすれば、汎用のキャピラリー
電気泳動装置と同様に、入射光を流路と垂直に入射さ
せ、出射光をフォトセルなどの検出手段を用いてその検
出部のある特定位置を通過する目的成分を検出すること
により、分離を確認する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】マイクロチップ電気泳
動の場合、光路長は汎用キャピラリー電気泳動と比べて
も約１／５程度の１０〜２０μｍ程度しか得られず、感
度の低さが大きな欠点となっている。キャピラリー電気
泳動の場合、キャピラリーカラムは曲面をもつので流路
方向に直角に光を当てたとき、流路を全く通らずキャピ
ラリーカラムの肉厚部のみを透過する光や、キャピラリ
ーカラムの内部壁面を溶液界面で反射する光など、キャ
ピラリーカラムの流路部分を透過する光以外の迷光や散
乱光が顕著になり、溶液の屈折率変化に伴って光路長が
変化するためにダイナミックレンジが狭くなるという問
題があった。

【０００７】紫外可視吸収検出を適応した場合、紫外可
視吸収のない物質は検出できず、紫外可視吸収のある物
質と紫外可視吸収のない物質が混合する試料、例えば還
元糖とそれ以外の糖類を同時に測定するには不便であ
る。このような試料を測定するには、例えば紫外可視吸
収物質に変えるために誘導体化するなどの処理を行なう
必要があった。

【０００８】そこで、本発明はマイクロチップ電気泳動
で検出感度を高め、かつ測定対象への汎用性を広げるこ
とを目的とするものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明によるマイクロチ
ップ電気泳動装置は、一対の透明板状部材を備え、少な
くとも一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成さ
れ、他方の板状部材にはその溝上に金属薄膜を介してプ
リズム、及びその溝に対応する位置に貫通する穴が設け
られ、これら板状部材がその溝を内側にして貼り合わさ
れてその溝により分離流路を形成してなるマイクロチッ
プと、分離流路の両端間に流動電圧を印加する泳動電源
装置と、分離流路の所定の範囲にわたって第一の光を照
射する第一の照射手段と、分離流路内で分離された目的
成分による第一の光の吸収又は発光を検出するための、
分離流路にそって配列された複数個の受光素子を有する
第一の光検出手段と、第一の光検出手段による測定を繰
り返して行ない、その測定信号を受光素子ごとに積算し
た後にデータ処理を行なう第一のデータ処理部と、プリ
ズム上面から金属薄膜とプリズムの界面で全反射する条
件で第二の光を照射する第二の照射手段と、第二の光の
反射光を検出するための第二の検出手段と、第二の光検
出手段からの測定信号をデータ処理する第二のデータ処
理部と、を備える。

【００１０】目的成分の分離が完了した後、分離流路に
かけられていた泳動電圧を取り除くと、分離された成分
には液体クロマトグラフィーのような慣性力は働かず、
自然拡散するだけで流路内に留まる。その状態で流路全
体に当てられた光による吸収又は蛍光を第一の検出装置
で繰返し測定する。検出装置の一つ一つの受光素子の位
置が流路の位置と対応しているので、流路各位置の光強
度を測定し、それを繰返し積算していく。

【００１１】さらに泳動を続け、吸光度測定により検出
できなかった試料も含めて屈折率変化の測定により検出
する。プリズムと金属薄膜の界面において、励起光をプ
リズム内面から全反射角で照射すると、金属のプラズマ
振動と入射光が共鳴を起こす入射角度が存在し、入射光
エネルギーの一部がエバネッセント波として流路側にに
じみでる。この時、プリズムと金属薄膜の界面を反射す
る光の強度が低下し、低下の度合いは金属薄膜と流路の
界面近傍の誘電率（屈折率）に影響される。これによっ
て、屈折率変化をマイクロチップの流路深さであっても
測定することができる。

【００１２】

【実施例】図２に一実施例の概略斜視図を示す。マイク
ロチップ２はベースプレート４とカバープレート６から
構成されている。ベースプレート４表面には互いに交差
する分離流路８、サンプル流路１０が泳動用キャピラリ
ー溝として形成され、カバープレート６には分離流路
８、サンプル流路１０の端に対応する位置にそれぞれリ
ザーバ１２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄが貫通穴として
設けられている。また、カバープレート６には分離流路
８の下流側の一末端付近に対応する位置に、高屈折率を
もつプリズム１４が備えられており、プリズム１４はカ
バープレート６の役割をするようにベースプレート４に
接している。分離流路８上に位置するプリズム１４の面
には、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕなどの金属薄膜１６が４０〜５
０ｎｍの厚みで蒸着により形成されている。

【００１３】分離流路８の吸光度検出領域１では、吸光
度検出領域１を光照射するために、図示しない光源から
の平行光を集光するシリンドリカルレンズの集光レンズ
１８とスリット２０が備えられている。マイクロチップ
２の反対側には分離流路８を透過した光を検出する１０
２４又は２０４８個のフォトダイオード素子を分離流路
８方向に配置したＰＤＡ（フォトダイオードアレイ）２
２が備えられている。分離流路８の屈折率検出領域３で
はＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）屈折率測定を行なう。
プリズム１４の斜め上方から入射する光がプリズム１４
と金属薄膜１６の界面で全反射するように光を照射する
ＳＰＲ励起光源２４と、その反射光を検出するホトディ
テクタ２６が備えられている。ＳＰＲ励起光源２４に
は、例えばＨｅ−Ｎｅレーザや半導体レーザなどが用い
られる。

【００１４】ＳＰＲ励起光源２４によりプリズム１４の
上面からプリズム１４と金属薄膜１６の界面で全反射す
るように光を入射し、入射角を変化させてホトディテク
タ２６により反射率を測定すると、特定の入射角で反射
率が鋭く落ちる現象が起こる。これがプラズモン共鳴現
象であり、金属のプラズマ振動と入射光が共鳴を起こ
し、入射光エネルギーがエバネッセント波として分離流
路８ににじみでることにより生じる。プラズモン共鳴現
象が起こるときの光の入射角は試料の屈折率に影響され
るので、入射角を固定すると、分離流路８の泳動液の屈
折率が変化したとき反射光強度が変化する。これによ
り、屈折率検出領域３を通過する試料を検出することが
できる。ＳＰＲ屈折率変化は、吸光度検出とは異なり、
分離流路８での光路長に依存しないで試料を測定するこ
とができる。

【００１５】図３に同実施例における吸光度検出領域に
用いたＵＶ−Ｖｉｓリニアイメージング検出器の一例の
構成略図を示す。光源としてＤ₂ランプ２８及びタング
ステンランプ３０が備えられており、光源からの光の光
路にはフィルタ３２、ミラー３４が設けられている。光
路のミラー３４による反射光の光路上には、光源から放
射された光を分光するグレーティング３６が設けられて
おり、グレーティング３６により分光された光を集光レ
ンズ１８に導くミラー３８が設けられている。マイクロ
チップ２の分離流路８を光照射するために、集光レンズ
１８とスリット２０（例えば０．５ｍｍ×２５ｍｍスリ
ット）が備えられており、マイクロチップ２の反対側に
は分離流路８を透過した光を検出するＰＤＡ２０が備え
られている。光源２８，３０の点灯やグレーティング３
６の回転角、ＰＤＡ２０の動作などを制御する制御回路
４０が設けられている。また、制御回路４０にはＰＤＡ
２０からの検出信号を処理するＰＣ（パーソナルコンピ
ュータ）４２が接続されている。

【００１６】図４に同実施例の屈折率検出領域に用いた
ＳＰＲ屈折率検出器の一例の構成略図を示す。（Ａ）は
検出部と検出器全体の構成略図、（Ｂ）は検出部を詳細
に表した構成略図である。光源としてＨｅ−Ｎｅレーザ
２４（波長６３２．８ｎｍ）が用いられ、プリズム１４
には屈折率が１．５５のものが用いられている。分離流
路８上に位置するプリズム１４の面にＡｕ薄膜１６が５
０ｎｍの厚さで形成されている。Ｈｅ−Ｎｅレーザ２４
は入射光が４３．４°の角度でプリズム１４に入射し、
その入射光がプリズム１４とＡｕ薄膜１４ａの界面で全
反射するように固定されている。Ｈｅ−Ｎｅレーザ２４
及びホトディテクタ２６の動作を制御する制御回路４４
が設けられている。また、制御回路４４にはホトディテ
クタ２６からの検出信号を処理するＰＣ４２が接続され
ている。

【００１７】図２、図３及び図４を用いて本発明による
マイクロチップ泳動装置の動作の説明をする。あらかじ
めに泳動液を１つのリザーバから送液し、充填後、サン
プルリザーバ１２ａに試料を導入する。リザーバ１２ａ
とリザーバ１２ｂとの間に電圧を所定の時間だけ印加し
て流路交差部に試料を注入する。このとき、リザーバ１
２ｃとリザーバ１２ｄとの間の電圧をコントロールする
ことにより、試料が分離流路に拡散することを防ぐこと
が望ましい。例えば＋電荷をもつ試料を泳動する場合、
リザーバ１２ａに試料を導入し、分離流路８とサンプル
流路１０の交差部に試料を満たすためにリザーバ１２ａ
に正の高電圧＋ＨＶを印加しリザーバ１２ｂをグランド
電位にするが、このときリザーバ１２ｃ，１２ｄにも＋
ＨＶを印加することにより分離流路８への試料の拡散を
防ぐことができる。

【００１８】次いで、リザーバ１２ｃとリザーバ１２ｄ
との間に泳動電圧を印加して試料の分離を行なう。この
とき、リザーバ１２ａとリザーバ１２ｂとの間の電圧を
コントロールすることにより、過剰の試料が分離流路に
リークするのを防ぐことが望ましい。＋電荷をもつ試料
を泳動する場合、リザーバ１２ｃに正の高電圧＋ＨＶを
印加しリザーバ１２ｄをグランド電位にするが、このと
きリザーバ１２ａ，１２ｂに、交差部にかかる電圧より
低い正の電圧＋ＨＶ’を印加することによりサンプル流
路１０からの新たな試料の流れ込みを防ぐことができ
る。

【００１９】分離された試料は、まず、吸光度検出領域
１で吸光度検出される。そこでは、Ｄ₂ランプ２８、タ
ングステンランプ３０又はその両方から放射された光が
フィルタ３２、ミラー３４を介してグレーティング３６
に入射する。グレーティング３６で分光された光はミラ
ー３８、集光レンズ３８を介してマイクロチップ２の分
離流路８にそって備えられたスリット２０に集光され
る。スリット２０を通過した光は分離流路８を通ってＰ
ＤＡ２２に入射する。制御回路４０により、ＰＤＡ２２
のフォトダイオードの接合容量の飽和電荷量を超えない
範囲で繰り返しスキャンされ、得られたデータはＰＣ４
２によって積算平均化処理された後、吸収した試料成分
のバンドがピークとしてイメージング出力される。スキ
ャン中は試料の泳動を一時的に停止させることにより、
スキャン回数の平方根に比例してＳ／Ｎ比が向上でき
る。その後、分離流路８の屈折率検出領域３に試料が到
達するまで泳動を続ける。屈折率検出領域３に試料がさ
しかかると、分離流路８の泳動液の屈折率が変化して反
射光強度が変化する。その屈折率変化はホトディテクタ
２６により検出され、その検出信号はＰＣ４２に送ら
れ、データ処理される。これによって吸光度検出領域１
で検出できなかった試料も検出することができる。

【００２０】屈折率検出領域の他の例を示す。図５
（Ａ）に示すように、カバープレート６を分断して屈折
率検出領域３のカバープレート６を取り除き、プリズム
１４ａを屈折率検出領域３の分離流路８上に設置する。
ＳＰＲを誘起するためのプリズムをマイクロチップの流
路全体に配し、流路内を泳動する試料による屈折率変化
を流路全体で測定する屈折計としてもよい。この場合、
図５（Ｂ）に示すように、吸光度測定用の流路８ａとＳ
ＰＲ屈折率変化測定用の流路８ｂが別々にあることが望
ましい。

【００２１】図５（Ｂ）について詳しく説明すると、ベ
ースプレート４表面には互いに交差する分離流路８ａ、
サンプル流路１０ａと分離流路８ｂ、サンプル流路１０
ｂの２組の泳動用キャピラリー溝が形成されている。分
離流路８ａ、サンプル流路１０ａ上はカバープレート６
ａにより覆われ、分離流路８ｂ、サンプル流路１０ｂ上
はプリズム１４ｂに覆われており、分離流路８ｂに位置
するプリズム１４ｂの面には金属薄膜が形成されてい
る。分離流路８ａ、サンプル流路１０ａが位置するベー
スプレート４の反対側には、分離流路８ａからの透過光
を測定する吸光度測定用ＰＤＡ２２ａが設けられてい
る。

【００２２】分離流路８ｂのＳＰＲ屈折率変化を検出す
るために、分離流路８ｂからの全反射光を検出するＳＰ
Ｒ屈折率変化測定用ＰＤＡ２２ｂが設けられている。Ｓ
ＰＲ屈折率測定の光源にはＨｅ−Ｎｅレーザが用いら
れ、光源からのレーザ光はビームエキスパンダにより広
げられ、その広げられたレーザ光はシリンドリカルレン
ズ，スリットを介して平行光にされて分離流路８ａに集
光される。図２や図５（Ａ）の実施例では屈折率検出領
域に目的成分が泳動されるまで分析終了とならないが、
図５（Ｂ）の実施例では目的成分が分離を完了した時点
で屈折率変化測定を実行でき、測定時間が短縮される。
全ての実施例において、プリズムはベースプレートに形
成された分離流路上を覆ってカバープレートの役割も果
たしているが、金属薄膜を形成したカバープレートによ
って分離流路を覆い、そのカバープレート上の金属薄膜
に対応した位置にプリズムを設置してもよい。

【００２３】

【発明の効果】吸光度検出を分離流路のほぼ全域にわた
って行ない、さらに信号を積算平均化処理することによ
り、分離した成分を高感度に検出することができ、ま
た、試料の分離過程を知ることができる。しかも、目的
成分に着目すれば、全成分が分離するまで試料を泳動す
る必要がなくなり、分析時間の短縮につながる。屈折率
変化を検出する際、表面プラズモン共鳴を利用するた
め、光路長が数μｍであっても感度が低下することなく
試料を検出することができる。また、センシング部分が
流路の一部で行なうオンチップ検出であるため、カラム
外効果を最小に抑えた条件で試料の分析をすることがで
きる。

【００２４】吸光度検出と屈折率変化検出を同一チップ
上で行なうため、一回の分析で吸光度検出による選択的
な情報と屈折率変化検出による非特異的な情報を得るこ
とができる。これにより、例えば糖類（還元糖とそれ以
外の糖類）を誘導体化しないで同時に検出することがで
きる。このように、本発明はマイクロチップ電気泳動で
検出感度を高め、かつ測定対象への汎用性を広げること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】マイクロチップを示す図であり、（Ａ）と
（Ｂ）はマイクロチップを構成する透明板状部材を示す
平面図、（Ｃ）はマイクロチップの正面図である。

【図２】一実施例を示す概略斜視図である。

【図３】同実施例の吸光度検出領域に用いたＵＶ−Ｖｉ
ｓリニアイメージング検出器の一例の構成略図である。

【図４】同実施例の屈折率検出領域に用いたＳＰＲ屈折
率検出器の一例の構成略図であり、（Ａ）は検出部と検
出器全体の構成略図、（Ｂ）は検出部を詳細に表した構
成略図である。

【図５】他の実施例を示す概略斜視図である。

【符号の説明】

１ 吸光度検出領域 ２ マイクロチップ ３ 屈折率検出領域 ４ ベースプレート ６ カバープレート ８ 分離流路 １０ サンプル流路 １２ａ，１２ｂ，１２ｃ，１２ｄ リザーバ １４ プリズム １６ 金属薄膜

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一対の透明板状部材を備え、少なくとも
   一方の板状部材の表面に液が流れる溝が形成され、他方
   の板状部材にはその溝上に金属薄膜を介してプリズム、
   及びその溝に対応する位置に貫通する穴が設けられ、こ
   れら板状部材が前記溝を内側にして貼り合わされてその
   溝により分離流路を形成してなるマイクロチップと、 分離流路の両端間に流動電圧を印加する泳動電源装置
   と、 分離流路の所定の範囲にわたって第一の光を照射する第
   一の照射手段と、 分離流路内で分離された目的成分による前記第一の光の
   吸収又は発光を検出するための、分離流路にそって配列
   された複数個の受光素子を有する第一の光検出手段と、 前記第一の光検出手段による測定を繰り返して行ない、
   その測定信号を受光素子ごとに積算した後にデータ処理
   を行なう第一のデータ処理部と、 前記プリズム上面から前記金属薄膜と前記プリズムの界
   面で全反射する条件で第二の光を照射する第二の照射手
   段と、 前記第二の光の反射光を検出するための第二の検出手段
   と、 前記第二の光検出手段からの測定信号をデータ処理する
   第二のデータ処理部と、を備えたことを特徴とするマイ
   クロチップ電気泳動装置。