JPH11508137A - Extraction, amplification and sequential hybridization of fungal cell DNA and methods for detecting fungal cells in clinical substances - Google Patents
Extraction, amplification and sequential hybridization of fungal cell DNA and methods for detecting fungal cells in clinical substancesInfo
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Abstract
(57)【要約】 臨床物質中にある真菌細胞の検出のために、真菌ＤＮＡが全血から抽出され、その後抽出された真菌ＤＮＡが検出される。この検出から、真菌感染が判断できる。更に診断のために、真菌種が抽出された真菌ＤＮＡから決定される。全血から真菌ＤＮＡの抽出方法は、全血からの優勢な無傷の真菌細胞の単離と、単離された真菌細胞からのＤＮＡの抽出を含む。真菌ＤＮＡの検出のために、検出される真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメントが増幅され、その後増幅産物が検出される。更に真菌種の同定のために、真菌種に特徴的であるヌクレオチド配列セグメントが検出される。 (57) [Summary] For detection of fungal cells in a clinical substance, fungal DNA is extracted from whole blood, and then the extracted fungal DNA is detected. From this detection, fungal infection can be determined. For further diagnosis, the fungal species is determined from the extracted fungal DNA. Methods for extracting fungal DNA from whole blood include isolating predominant intact fungal cells from whole blood and extracting DNA from the isolated fungal cells. For the detection of fungal DNA, at least one segment of the fungal DNA to be detected is amplified, after which the amplification product is detected. For further identification of the fungal species, nucleotide sequence segments characteristic of the fungal species are detected.
Description
【発明の詳細な説明】 真菌細胞ＤＮＡの抽出、増幅および逐次ハイブリッド形成、並びに 臨床物質中における真菌細胞の検出法 本発明は、一般的に、臨床物質中における真菌細胞の検出方法に関する。 このような方法は実務から知られており、適切な栄養培地で臨床物質からの真 菌種の培養に通常基づいている。 同定の速度および感度は、特に真菌種の遅い増殖のために、例えばペトリ皿で の培養と、増殖したりまたはしなかったりするコロニーに基づく検出により、か なり影響される。このため、侵襲性真菌感染は臓器の極端に複雑な生検により、 または患者の死亡後に診断できるだけである。 真菌細胞の検出方法における関心は、特にここ数年にわたり、真菌病原体が重 要な院内病原体として免疫抑制患者にとって非常に重要になってきた、という事 実に関連させてみられるにちがいない。侵襲性真菌感染は、骨髄移植（ＢＭＴ） 後に、肝臓、腎臓、膵臓と心臓または心‐肺移植後でも、著しく増加した。１９ ９４年に、例えば French ＢＭＴセンターで感染、特にAspergillus 感染が次第 に増加して、数か月にわたりこれらのセンターの閉鎖を招いた。 臓器移植患者の他にも、特に化学療法または手術後のがん患者、火傷した患者 、並びに外科および新生児集中治療室の患者は、侵襲性真菌病原体により次第に 侵襲されていく。１つの臓器系または更にいくつかの臓器系がこれらの患者群で 侵襲されると、これら感染合併症の死亡率は８０〜１００％に高まる。 治療の成功は、このような場合に、早期診断だけで改善されることがある。上 記標準検出方法に伴う欠点のために、全身真菌感染の早期で安全な診断を行える 集中的試みがあった。 分子生物学法に基づく新規技術が、いくつか他の病原体による感染症のより高 感度の診断と、ひいてはある程度より早期の検出および治療とを既に実現させた が、これは真菌病原体についてはなお不可能であった。 しかしながら、文献′Detection of various fungal pathogens in blood sam ples′in: EBMT 1995,Vol.15,Suppl.2,March 1995,Abstract Book,Abstract 432 ,P.103 では、血中でいくつかの真菌病原体を同定するためにＰＣＲ法を用いる 真菌遺伝子のＤＮＡセグメントの増幅について既に記載している。種特異性オリ ゴヌクレオチドとの追加ハイブリッド形成によれば、様々な真菌株間の識別も可 能であった。 分子生物学技術を用いた真菌感染の検出に際して最も重要な問題は、真菌細胞 壁の非常に複雑な組成に起因しており、そのため時間のかかる高価な抽出方法が 今までに必要であった。 別な問題は真菌種の数の増加が免疫抑制患者で危険な感染を引き起こしうると いう事実であり、これらの患者において全範囲の異なる真菌種および株の記録お よび検出が必要となっている。治療法は様々な真菌種で異なるため、すべての真 菌種を記録するだけでなく、これらの種を識別して同定することも必要である。 上記からみて、真菌感染の早期診断を行うために上記方法を改善することが本 発明の目的である。 その方法はできるだけ迅速かつ容易であるべきであり、できるだけ多くの真菌 種を記録すべきであり、しかも開発の別な段階でこれらを同定することができる べきである。 本発明に従って見い出された臨床物質で真菌病原体を検出するための方法は、 下記工程を含む： １）全血からの真菌ＤＮＡの抽出；および ２）抽出された真菌ＤＮＡの検出 臨床物質から真菌種の伝統的培養をやめて、真菌ＤＮＡ自体に向かうことによ り、真菌特異性ＤＮＡの検出から高感度で真菌感染の非常に早期な検出を行える 方法が開発された。検出はＤＮＡレベルで行えるため、少くとも部分的に高感度 で確立された迅速な方法が使用でき、感度および速度に関して既知方法よりも大 きな利点を生じる。真菌ＤＮＡの放出および精製は、高感度を保証して迅速な診 断を行う上で、迅速なだけでなくほぼ完全にかつ比較的純粋にも行えねばならな いことが想起されるべきである。 更に、新規方法はいくつかの真菌種に感度があり、しかも真菌種は最少の可能 な操作工程で同定されるべきである。 この追加目的は、操作工程２）に加えてまたはその代わりに行われる下記操作 工程を介して、前記の新規方法で達成される： ３）抽出された真菌ＤＮＡからの真菌種の決定。 この方法は、例えば既知の配列決定方法が使用できるために、特定の真菌感染 がＤＮＡレベルで非常に迅速に行われて、高い特異性を示せる、という別な利点 を有している。 いくつかの問題が新規方法の個別工程で克服されなければならない。その一部 は真菌細胞壁の組成と、多数の真菌細胞が全血中でフリーに溶解されずに、食作 用後にいくつかの血液細胞群、特に顆粒球およびマクロファージに存在するとい う事実に基づく。 このため、本方法の独立した第一工程、即ち全血から真菌ＤＮＡの抽出も本出 願の目的である。この方法は患者で真菌感染を検出する上で診断学上有利に使用 できるが、真菌ＤＮＡが他の別な処理のために必要とされる場合はいつでも用い ることができる。 例えば新規方法を用いると、真菌ＤＮＡは問題の真菌種で特に感染した動物の 血液から抽出することができる。ＤＮＡプローブはこの手法で得られた真菌 ＤＮＡから切り出されて、その後検出反応に用いられるかまたはプラスミドにク ローニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの 全分野にわたる適用が考えられる。 真菌ＤＮＡの抽出プロセスでは、全血中で非常に少量の真菌でさえも確実に真 菌ＤＮＡを抽出することができるはずである。更に、本方法のこの工程では迅速 かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者により病院における日常の作業に用い ることができる。 この目的は、全血から真菌ＤＮＡを抽出する工程が： １）全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離；および ２）単離された真菌細胞からＤＮＡの抽出 の工程を含む本発明に従い達成される。 本発明の目的はこの手法で完全に達成される。新規方法は、第一工程で全血か らの真菌細胞の単離と、第二工程でこれらの単離真菌細胞からＤＮＡの抽出から なる２段階から構成されていて、こうして抽出されたＤＮＡは真菌感染を検出し て、必要であれば同定するために用いられる。この２段階プロセスではとりわけ 特異性を改善するが、その理由は干渉する他のＤＮＡがその方法の第二工程にほ んの少量でしか存在しないためである。 その方法が下記操作工程： ａ１）全血中における血液細胞の分解； ａ２）細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の単離 ｂ１）単離された真菌細胞の分解；および ｂ２）真菌ＤＮＡの単離 を含むならば、好ましい。 これは細胞ＤＮＡから真菌ＤＮＡの非常に迅速で安全な分離を行える。細胞Ｄ ＮＡは全血中で血液細胞の溶解によりこの初期溶液中に放出されるため、それ までに先の分解プロセスで分解されなかったかまたは少くとも完全には分解され なかった真菌細胞は、迅速で容易なプロセス、例えば遠心により遊離細胞ＤＮＡ から分離できる。この手法で単離された真菌細胞のその後の溶解に際して、溶液 中には細胞ＤＮＡが全く存在しないかまたはわずかな量で存在するだけであると 仮定してもさしつかえない。工程ａ１）における血液細胞の分解は、真菌細胞ま でが溶解されないように行われねばならない。真菌細胞壁は血液細胞の細胞壁よ りもかなり複雑であるため、これは適切で慎重な分解プロセスにより保証するこ とができる。 操作工程ａ１）は別な利点、即ち非常に少量の真菌が特に診断目的のためにな お全血から抽出できるように、食細胞に捕捉された真菌を放出させるという利点 を有している。新規な方法では、少くともいくつかの真菌細胞が全血中でフリー に溶解される必要性はもはやなく、いくつかの真菌細胞が食作用後も例えば顆粒 球またはマクロファージ中に存在していれば十分である。 下記工程が工程ａ）で行われるならば好ましい： ａ１．１）浸透溶血による赤血球の溶解； ａ１．２）白血球の酵素分解；および ａ２．１）この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの使用 ここの利点は、血液細胞が工程ａ１．１）およびａ１．１）で確実に溶解され ていながら、真菌細胞自体はなお損傷をうけていないことである。その後の遠心 では、一方で血液細胞の放出された細胞ＤＮＡおよび細胞フラグメントと、他方 でなおそっくりそのままな真菌細胞との、非常に安全な分離を保証している。こ れは、真菌ＤＮＡがペレット中の真菌細胞中になお存在しているために、真菌Ｄ ＮＡが失われないことも保証している。要約すると、前記工程の利点は、一方で 最少濃度の真菌細胞さえも検出できて、他方で単離された真菌ＤＮＡがせいぜい わずかな細胞ＤＮＡで汚染されているにすぎないことであり、真菌対細胞 ＤＮＡの比率が真菌ＤＮＡの方に有意に改善されたために、後の診断工程で高い 感度および特異性を発揮する。 別な開発では、下記工程が工程ｂ）で行われるならば好ましい： ｂ１．１）真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理。 この単純な操作工程は操作工程ａ２．１）でペレットから回収された真菌細胞 の安全な分解を行えることが示された。 工程ａ１．１）における赤血球の溶解が、好ましくは約１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度で低張液 を用いて行われて、工程ａ１．２）における白血球の酵素消化が、２００μg/ml プロテイナーゼＫ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐ Ｈ８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ＳＤＳの最終濃度を有する溶液 で行われるならば、更に好ましい。 別な開発において、工程ａ１．２）からの溶液は６０〜７０℃、好ましくは６ ５℃で１００〜１４０分間、好ましくは１２０分間にわたりインキュベートされ る。 この手法で血液細胞は真菌細胞を損傷させずに確実かつ完全に分解できるため 、これらの操作工程後に、溶液中でフリーな真菌細胞と、初期血液中で食細胞に 捕捉された真菌細胞とは、双方とも、比較的未損傷のままであり、それらのＤＮ Ａを失わずに遠心により分離できることがわかった。 工程ｂ１．１）が下記工程からなるならば、更に好ましい： ‐５０ｍＭ ＮａＯＨ含有溶液中において、９０〜９８℃、好ましくは９５℃で ５〜１５分間、好ましくは１０分間にわたる、工程ａ２．１）からのペレット中 に存在する真菌細胞のインキュベート ‐１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．０による中和 ‐３０〜４０℃、好ましくは３７℃で５０〜７０分間、好ましくは６０分間に わたるザイモリアーゼでの酵素処理 ‐６０〜７０℃、好ましくは６５℃で１０〜３０分間、好ましくは２０分間にわ たるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡとのインキュベートによるタンパク質変性。 これらの操作工程は、真菌細胞の安全な分解と、その後で真菌ＤＮＡの完全放 出を行うため、真菌ＤＮＡは溶解状態にあり、真菌細胞の細胞フラグメントから 単離できることがわかった。 この関係において、工程ｂ２）が下記工程を含むならば、好ましい： ‐５Ｍ酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および ‐氷冷イソプロパノール中で上澄のＤＮＡ沈降。 これらの操作工程は実施が非常に容易であり、タンパク質は最初に酢酸カリウ ムを加えることにより沈降され、その後上澄が取り出されて、ＤＮＡが沈降され るように氷冷イソプロパノールと混合される。沈降したＤＮＡは、別な操作工程 に、即ち真菌感染を検出および同定するために用いることができる。 今までに記載された操作をまとめると、第一の利点は、真菌種が通常それらの ＤＮＡに基づき検出されて、その後特異的に同定できることである。真菌ＤＮＡ は全血から直接抽出されず、むしろ最初は検出の感度および特異性を改善するた めに細胞ＤＮＡから真菌細胞の分離である。換言すれば、非常にわずかな真菌細 胞が全血中に存在するだけならば、これから抽出された非常に少量の真菌ＤＮＡ が非常に高濃度で存在する細胞ＤＮＡのバックグラウンドに対して検出されたこ とになり、そのため上記された分離は感度の点で大きな利点になる。 新規方法の別な利点は、全血の血液細胞が真菌細胞を損傷させずに最初に分解 されるため、これらが溶解状態にあるかまたは食細胞に捕捉されているかにかか わらず、食細胞に捕捉された真菌細胞も検出目的に利用できることである。真菌 細胞は細胞ＤＮＡから真菌細胞の分離後に分解されて、血液細胞の細胞残渣を残 すだけである。ここで用いられる方法は、やや複雑な真菌細胞壁にもかかわらず 、 真菌ＤＮＡに損傷のない完全な分解を保証する。 上記方法を行うキットも本発明の目的である。このようなキットには上記操作 工程に必要なすべての基本溶液セットを含有させることができる。しかしながら 、検査室には通常みられないそれらの基本溶液のみをこのキットに入れることも 可能であり、例えばＴｒｉｓ緩衝液は使い捨てできるが、少くともプロテイナー ゼＫおよびザイモリアーゼがキットに存在している。 独立したまたは上記方法の第一工程と組み合わされた本方法の第二工程、即ち 抽出された真菌ＤＮＡの検出も、本出願の目的である。検出される真菌ＤＮＡは 、上記のように抽出および単離されることがここでは好ましい。しかしながら、 適切な密度勾配遠心、ＤＮＡプローブとの特異的沈降工程などにより真菌ＤＮＡ を得ることも可能である。 これらすべての場合において、真菌ＤＮＡが更に使用のためにその初期溶液中 に実際に存在しているかどうか調べることが望ましい。 真菌ＤＮＡは真菌感染の診断に有利に使用できるが、それとは異なって用いる こともできる。真菌ＤＮＡは、寒天プレートから、または問題の真菌種に特に感 染した動物の血液から得られる。ＤＮＡプローブはこの手法で得られた真菌ＤＮ Ａから開裂されて、その後で検出反応に用いられるか、またはプラスミドにクロ ーニングされる。基本リサーチ、診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどの全 分野にわたる適用が考えられる。 新規検出工程では単一プロセスで初期溶液中に低濃度であってもいくつかの異 なる真菌種の記録を行えるはずであり、そのため非常に迅速にかつ診断の早期段 階で真菌感染があるかどうかに答えることが可能である。更に、新規操作は迅速 かつ容易に行えるはずであり、そのため熟練者により病院において日常の作業に 用いることができる。 その目的は、抽出された真菌ＤＮＡを検出する工程が下記工程： ｃ）単離された真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメントの増幅；および ｄ）増幅産物の検出 を含む本発明に従い達成される。 少量の単離されたＤＮＡであっても最初に増幅されて、その後検出できる、い くつかの標準方法がある。これらの方法は高度に特異的で非常に高感度であるた め、それらは診断、治療、工業遺伝子テクノロジーなどで望ましい特徴を発揮す る。更に、これらの方法は熟練者により行える。 増幅はＰＣＲ、クローニング、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼなどにより行 って、検出はゲル電気泳動、光学密度、核酸と特異的に結合するマーカーでの染 色などにより行える。 別な開発では、増幅はいくつか異なる真菌種のＤＮＡ、好ましくは１８ｓｓｕ ‐ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子と結合する２つのプライマーを用いて、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により行われる。 ここでの利点は、単純でこうして確立された方法が容易に検出される適量のＤ ＮＡを作るために使用できるが、そのＤＮＡは対応真菌種を同定するためにも更 に使用できることである。 配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列が工程ｃ）でプライマーとし て用いられるならば、好ましい。 本出願の発明者は、これら２種のヌクレオチド配列が様々な臨床的に関連した 真菌種についてのプライマーとして用いられることを、意外にも発見した。 ＰＣＲ反応でこれら２種のプライマーの使用は約５００塩基対の鎖長を有する増 幅産物を作り出し、それらがゲル電気泳動により容易に検出できることから、更 に処理していくことが容易である。こうして、２種のプライマー配列が様々な真 菌ＤＮＡと結合することがわかったため、すべての病原性真菌種について同一の 検出方法が存在するのである。 ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル： ｃ１）９０〜９６℃、好ましくは９４℃で０．３〜１分間、好ましくは ０．５分間の変性； ｃ２）５８〜６４℃、好ましくは６２℃で０．５〜１．５分間、好ましくは１分 間のハイブリッド形成； ｃ３）６８〜７５℃、好ましくは７２℃で１．５〜２．５分間、好ましくは２分 間の伸長 で行われるならば、好ましい。 ９０〜９６℃、好ましくは９４℃で５〜９分間、好ましくは３分間の変性工程 がサイクル工程の開始前に行われるならば、好ましい。 ＰＣＲは上記条件下で非常に再現性があり、特に高度に特異性であることがわ かり、そのため増幅産物は実際にオリジナル真菌ＤＮＡのフラグメントであるこ とが保証される。 工程ｄ）において、増幅産物は好ましくはアガロースゲル上でゲル電気泳動に より検出されて、好ましくは臭化エチジウムで染色されるならば、更に好ましい 。 この利点は、真菌感染を示す増幅産物が実際にＰＣＲ反応により生産されるこ とを示すために、既知の確立された検出法が用いられることである。 １８ｓｓｕ‐ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子からのＤＮＡ配列が増幅されるなら ば、更に好ましい。 本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対す る２つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真 菌株および種で示すが、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を 検出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した 。 本発明は、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列に更に関する。こ れら２つのヌクレオチド配列が真菌ＤＮＡのセグメントを増幅させるために用い られるならば、好ましい。 本発明は試験溶液中で真菌ＤＮＡを検出するためのキットにも関し、そのキッ トはいくつかの真菌種のＤＮＡと結合するポリメラーゼ連鎖反応用のプライマー を含有している。キットはプライマーとして配列番号１および配列番号２のヌク レオチド配列を含有していることが好ましい。 本発明は上記方法を行うためのキットにも関する。 このようなキットの利点は、すべての必要な溶液と、特に必要なプライマーが 一緒にされるため、それらがルーチン操作で使用できることである。このため、 これらの新規キットは、試験溶液中で真菌種を検出するために、毎日の検査室作 業で用いることができる。更に、このキットは証明された真菌種のあるセグメン トを増幅させるために使用でき、これは例えば更に同定プロセスに用いることが できる。 上記方法の第一および第二工程と組み合わされたまたは独立した本方法の第三 工程、即ち抽出および検出された真菌ＤＮＡを用いる真菌種の同定も、本出願の 目的である。 種の真菌同定は診断目的に迅速かつ容易に行えるはずで、そのため熟練者によ り病院における日常の作業に用いることができる。 この目的は、下記工程が行われるかぎり、本発明に従い達成される： ｅ）真菌種を特徴付ける、試験溶液中に含有されたＤＮＡのヌクレオチド配列セ クションの同定。 検出プロセスはＤＮＡレベルで行われるため、真菌ＤＮＡのあるセグメントが 同定されれば十分であるが、但しこれらのセグメントは各真菌種に特異的でなけ ればならない。標準方法は、増幅産物の少くとも一部を配列決定して、二本鎖の 融解性質などを研究することにより使用できる。 これらの方法は通常迅速かつ容易に行えるため、それらも熟練者により行える 。 真菌ＤＮＡまたは真菌ＤＮＡのセグメントが工程ｅ）で所定の真菌株および／ または種に特異的なＤＮＡプローブとハイブリッド形成されて、成功したハイブ リッド形成の試験が真菌種の同定につながるならば、好ましい。 この利点は、非常に速くて簡単なハイブリッド形成プロセスが同定に用いられ ることである。各真菌種に特異的であるため、これら真菌種の増幅セグメントと 排他的に結合する特異的プローブが用いられる。このようなプロセスはゲル上で 行われ、例えばハイブリッドは染色により示される。もう１つの別なプロセスは 、一本鎖および二本鎖領域の光学的に異なる性質、例えば光学密度、二色性また は類似特徴を活用することからなる。 プローブが成功したハイブリッド形成の試験のためにジゴキシゲニンで標識さ れて、ハイブリッドが例えばサザンブロット法を用いて検出されるならば、更に 好ましい。 プローブ自体が、好ましくは視覚的に検出可能な色素反応により、周知の方法 を用いて、ハイブリッド形成後にハイブリッドの形成を示す対応マーカーと共に 既に準備されていれば、この工程はそのプロセスを更に簡略化する。 配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列のうち１以上がＤＮＡプローブと して用いられ、そのＤＮＡプローブが好ましくは配列配列番号３、配列番号８、 配列番号６、配列番号７、配列番号４および配列番号５の順序で用いられて、各 ハイブリッド形成が試験されるならば、好ましい。 個別の真菌種は逐次ハイブリッド形成によりそれらの頻度の順序で試験され、 そのため検出プロセスを有意に速めることができる。 本発明は、配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列にも更に関する。 本発明は、真菌種を同定する上で、ＤＮＡプローブとしてこれらヌクレオチド 配列の１以上の使用にも更に関する。 ここでの利点は、６つの特定されたヌクレオチド配列がすべての臨床的に関連 した真菌種間で特異的に識別できることである。 配列番号３のヌクレオチド配列は真菌種Candida albicansを検出し、配列番号 ４のヌクレオチド配列はCandida glabrataを検出し、配列番号５のヌクレオチド 配列はCandida kruseiを検出し、配列番号６のヌクレオチド配列はCandida trop icalisを検出し、配列番号７のヌクレオチド配列はCandida parapsilosisを検出 し、配列番号８のヌクレオチド配列はAspergillus 株に属する真菌種、特に A.f umigatus、A.flavus、A.versiculor、A.niger、A.nidulansおよびA.terreus を 検出する。 本発明は、各真菌種のＤＮＡの特異的ヌクレオチド配列セクションとハイブリ ッド形成するＤＮＡプローブを含有した、真菌種を同定するためのキットにも更 に関する。そのキットは、ＤＮＡプローブとして、配列番号３〜配列番号８のヌ クレオチド配列のうち１以上を含有していることが好ましい。 本発明は、上記方法を行うためのキットにも更に関する。 この利点は、このようなキットにＤＮＡプローブだけかまたは更に適切な追加 溶液を準備しておけることであり、そのため毎日の検査室作業に必要なすべての 一次溶液などがこのキットから直接取り出せる。これは各真菌種の検出または同 定を著しく簡略化するが、それは個別の一次溶液が検査室でもはや別々に作らな くてよいからである。しかしながら、プローブだけか、できればこのキットでポ リメラーゼ連鎖反応のためのプライマーおよび酵素／一次溶液とを含有させるこ とも可能であり、そのためこれとは別に標準一次溶液が使用できる。 有利な手法で上記工程を組み込んだ全血中における真菌細胞の検出方法は、下 記工程を含む： ‐全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離 ‐単離された真菌細胞からのＤＮＡの抽出 ‐単離された真菌ＤＮＡの少くとも１つのセグメント、好ましくは１８ｓｓｕ‐ ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子の少くとも１つのセグメントの増幅 ‐ｙｅｓ／ｎｏ決定による増幅産物の検出、および ‐所定の真菌株および／または種に特異的なＤＮＡプローブと増幅産物をハイブ リッド形成させることによる、それらから個別の真菌種への特定。 この要約された方法の主要利点の１つは、増幅産物が真菌種の決定のためｙｅ ｓ／ｎｏ決定に更に用いられるように、真菌ＤＮＡのセグメント、好ましくは１ ８ｓｓｕ‐ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子のセグメントを増幅させる増幅工程が、 １回だけですむことである。本出願の発明者は、１８ｓｓｕ‐ｒＲＮＡに関する 真菌遺伝子が、一方で対象となるすべての真菌種に同一である２つのプライマー 、他方で様々な真菌種で異なるアンプリコンと少くとも部分的に隣接していて、 そのためそれが真菌種に特徴的な異なるプローブとハイブリッド形成できること を発見した。 したがって、単一の増幅工程があれば、真菌感染が本当にあるのかどうかとい う質問に答えて、どんな真菌種が関与しているかという質問に答える上で十分で ある。したがって、その方法は極端に簡単であり、実施しやすく、専門知識は不 要であるため、熟練者でさえも実施することができる。 別な利点は以下の記載から得られる。 上記特徴と下記で説明される特徴は、特定の組合せだけでなく、他の組合せま たは単独でも、本発明の範囲から逸脱せずに用いることができると理解されてい る。 個別操作工程の性能の例と、臨床試験プログラムのプログラム範囲内における 方法の使用が、以下の記載に示されている。 新規方法の具体的利点は、それが全血を用いて行われる、即ち生検が不要であ り、最初に作られねばならない血清が用いられないという事実である。真菌細胞 は全血中で細胞ＤＮＡから最初に分離される。これは非常に少量で存在するだけ かもしれない真菌ＤＮＡに必要であり、かなり高濃度の細胞ＤＮＡのバックグラ ウンドに対して検出する必要はない。これは検出方法の特異性も増加させる。こ の目的のため、赤血球が最初に浸透溶血により溶解され、その後白血球が酵素消 化される。これら２つの操作工程は、真菌細胞自体がなお損傷をうけずに、食細 胞に捕捉された真菌細胞が損傷をうけずに放出されて、その後の検出にも利用し うるように選択される。例１：浸透溶血による赤血球の溶解 赤血球の溶解は低張液を用いて行う。下記最終濃度を有した下記緩衝液を用い る： Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ５ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ 溶液は室温で１０分間インキュベートして、その後遠心する。 全血３ｍｌの量があれば第一工程に十分である。例２：白血球の酵素消化 真菌細胞を含んでいるかもしれない白血球は、下記最終濃度を有する下記緩衝 液中において、Boehringer Mannheim から得たプロテイナーゼＫ（２０μg/ml） でその細胞を酵素消化させることにより慎重に分解させ、その中に例１のペレッ トを再懸濁させる： Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６ １０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０ １０ｍＭ ＮａＣｌ ５０ｍＭ ＳＤＳ ０．２％ プロテイナーゼＫ ２００μg/ml この緩衝液は６５℃で２時間インキュベートする。例３：細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の分離 血液細胞が例１および２で説明されたように分解されて、細胞ＤＮＡが放出さ れてから、遠心を５０００ｒｐｍで行うと、細胞ＤＮＡはこの遠心速度で沈降し ないため、そのＤＮＡをかなり取ることができる。 沈降物はすべての遊離または放出真菌細胞を含有しており、それを更なる処理 のために緩衝液（Aqua bidest）に再懸濁させる。例４：真菌細胞の分解 真菌細胞をアルカリ中で溶解させ、酵素処理して、真菌ＤＮＡを放出させる。 最初に、アルカリ溶解は９５℃で１０分間にわたり５０ｍＭ ＮａＯＨ ２０ ０ｍｌを用いて行う。 この工程の後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．０を用いて中和工程を続 ける。 次いでSigma ザイモリアーゼ５００μｌ（３００μg/ml）を加え、溶液を３７ ℃で６０分間インキュベートして、真菌細胞を酵素消化させる。 次いでＴｒｉｓ／ＥＤＴＡ５００μｌおよび１０％ＳＤＳ溶液５０μｌを加え 、溶液を６５℃で２０分間インキュベートして、タンパク質を変性させる。例５：真菌ＤＮＡの単離 真菌細胞残渣と、次に単離されねばならない遊離真菌ＤＮＡとが、この溶液中 に存在している。 最初に、タンパク質沈降を５Ｍ酢酸カリウムを用いて行い、その後上澄を除去 して、ＤＮＡは氷冷イソプロパノールを加えることにより沈降させる。次いで沈 降産物を別な操作工程に用いる。 例１〜５に記載された操作工程では、全血から高い選択的手法で真菌ＤＮＡの 抽出を行うが、これは沈降物として利用できて、細胞ＤＮＡでやや汚染されてい るだけであるため、下記検出が非常に高感度でかつ高い特異性で行える。例６：真菌特異性ＤＮＡセグメントの増幅 この操作工程では、真菌ＤＮＡが例５の操作工程から得られた沈降物中に本当 に存在しているかどうかが最初に示される。この工程では、配列リストに配列番 号１および配列番号２として示されたＤＮＡ配列が、多数の真菌株および種の１ ８ｓｓｕ‐ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子上の結合部位と特異的に結合する、とい う事実を利用している。 本出願の発明者は、一方ですべての真菌株および種に同一のプライマーに対す る２つの結合領域と隣接した特異的配列セグメントをこの真菌遺伝子が様々な真 菌株および種で示し、他方でこのセグメントの配列が個別の真菌種および株を検 出するために使用できる程度に様々な真菌株および種で異なることを発見した。 配列番号１のＤＮＡ配列はセンス鎖と結合するが、配列番号２のＤＮＡ配列は アンチセンス鎖と結合して、２つの結合部位間の距離は約５００塩基対である。 そのためこれら２つのＤＮＡ配列配列番号１および配列番号２はポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）用のプライマーとして適しており、鎖長約５００塩基対の増幅 産物（アンプリコン）の生産を行う。 プライマーの位置および各アンプリコンの鎖長は下記表１に示されている。 ２つのプライマー配列番号１および配列番号２を用いて、Candida およびAspe rgillus 株のすべての関連真菌種に関して約５００塩基対のアンプリコンの十分 量の生産がＰＣＲ操作で得られる。 ＰＣＲ条件は下記のとおりである： 緩衝液（５０μｌ）： １０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ９．６ ５０ｍＭ ＮａＣｌ １０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．２mg/ml ＢＳＡ ポリメラーゼ 各０．５ｍＭヌクレオチド 各１００ｐＭプライマー 初期変性：９４℃で３分間 サイクル変性：９４℃で０．５分間 アニーリング：６２℃で１分間 伸長：７２℃で２分間 末端伸長：７２℃で５分間 サイクルの数：３４ 緩衝液中で高いマグネシウム濃度はポリメラーゼの高い特異性を可能として、 これは伸長工程に７２℃のその至適温度で取り扱える。 Candida albicans４０株、Candida tropicalis１０株、Candida parapsilosis ６株、Candida glabrata１１株、Candida krusei８株、Aspergillus fumigatus ８株、Aspergillus flavus６株、Aspergillus terreus ５株、Aspergillus nige r ７株、Aspergillus nidulans５株およびAspergillus versiculor３株を、これ らのプライマーで首尾よく増幅させることができた。例７：例６からの増幅産物の検出 次の工程では、鎖長約５００塩基対のＤＮＡセグメントが例６でＰＣＲ反応中 に実際に増幅されるかどうかが示される。真菌特異性ＤＮＡセグメントの検出は 、２％アガロースゲルで特異的バンドの臭化エチジウム染色により行う。 特異的バンドがここで検出されたら、配列番号１および配列番号２のプライマ ーがすべての前記真菌株と結合しているために、真菌感染と考えられる。このた め、真菌ＤＮＡが例１〜５の操作工程中に抽出されていれば、それは臭化エチジ ウム染色により検出できる程度まで例６のＰＣＲ工程により増幅される。例８：個別真菌種における例６からの増幅産物の分類 工程７で既に証明された真菌感染は、次いで具体的な治療にもっと正確に特定 されねばならない。例６からのＰＣＲ工程の別な利点がここで明らかになってく る。十分な真菌特異性ＤＮＡセグメントを、真菌種の決定に関する別な検出法の ために生産した。 配列リストに掲載された配列番号３〜配列番号８のヌクレオチド配列をここで 用いる。これらは例６で生産されたＤＮＡセグメントの配列セクションと特異的 にハイブリッド形成する種特異性プローブとして働く。 配列番号３のプローブはCandida albicansと、配列番号４のプローブはCandid a glabrataと、配列番号５のプローブはCandida kruseiと、配列番号６のプロー ブはCandida tropicalisと、配列番号７のプローブはCandida parapsilosisと、 配列番号８のプローブはAspergillus fumigatus 、A.flavus、A.versiculor、A. niger 、A.nidulansおよびA.terreus とハイブリッド形成することがわかった。 このため、配列番号８のヌクレオチド配列は全般的Aspergillus プローブである が、配列番号３〜配列番号５のヌクレオチド配列はCandida 株の真菌種間で識別 することができる。 成功したハイブリッド形成を証明できるように、プローブはBoehringer Mannh eim からのトランスフェラーゼキットで標識して、検出は既知の発色反応を用い てサザンブロット法に従い行う。 個別真菌種の頻度に従い段階的に逐次ハイブリッド形成をこれらのプローブで 行い、ハイブリッド形成は配列番号３（C.albicans）から始めて、その後配列番 号８（Aspergillus ）、配列番号６（C.tropicalis）、配列番号７は（C.paraps ilosis）、配列番号４（C.glabrata）、最後に配列番号５（C.krusei）と行う。 こうして、工程例６で生産された増幅産物に従い真菌種を同定して、その後具 体的な治療を開始することが可能である。例９：血液中に散在する真菌細胞の検出 特異的増幅および逐次ハイブリッド形成の助けにより、真菌細胞１〜３個の感 度で真菌種をうまく検出することが可能であった。血液サンプル中における真菌 種の散在から、前記方法はいわゆる１ＣＦＵ（コロニー形成単位）／ｍｌ血液の 感度に達することが証明できた。この検出限界は血液中で臨床上関連した真菌散 在について予想されるよりもかなり下である。例１０：臨床試験のプログラム 臨床試験の大規模プログラムでは、新規方法の高感度が健常試験者６５例から の血液サンプル１６５例の分析に際して示すことができた。１６５例すべての血 液サンプルは陰性のままであった。 次いで不明瞭な発熱の免疫抑制患者９４例を真菌感染の存在について試験した 。侵襲性真菌感染を有しない患者６５例中、２００例以上の血液サンプル（例外 １例は別にして）も陰性であった。 他方、侵襲性真菌感染を有する２５例すべての患者は、第一週目以内に既に陽 性であると判定できた。更に、原因となる真菌病原体はすべての患者で分類する ことができた。 DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Extraction, amplification and sequential hybridization of fungal cell DNA, and Detection of fungal cells in clinical substances The present invention generally relates to a method for detecting fungal cells in a clinical substance. Such methods are known from practice and allow for the isolation of clinical Usually based on the culture of the bacterial species. The speed and sensitivity of identification is particularly high for slow growth of fungal species, e.g. in petri dishes. Culture and detection based on colonies that may or may not grow Be affected. For this reason, invasive fungal infections are caused by extremely complex biopsies of organs. Or it can only be diagnosed after the death of the patient. Interest in methods of detecting fungal cells has been increasing, especially over the last few years, where fungal pathogens That it has become very important for immunosuppressed patients as an important nosocomial pathogen It must be really related. Invasive fungal infections include bone marrow transplantation (BMT) Later, there was a significant increase even after liver, kidney, pancreas and heart or heart-lung transplantation. 19 In 1994, for example, the French BMT center became infected, especially Aspergillus. And led to the closure of these centers for several months. In addition to organ transplant patients, especially cancer patients after chemotherapy or surgery, burned patients And patients in surgical and neonatal intensive care units are increasingly affected by invasive fungal pathogens Being invaded. One organ system or even several organ systems in these patient groups When invasive, the mortality of these infectious complications increases to 80-100%. Successful treatment may improve in such cases with early diagnosis alone. Up Short and safe diagnosis of systemic fungal infections due to disadvantages associated with the standard detection method There were intensive attempts. Novel techniques based on molecular biology are increasing the spread of infections by some other pathogens Diagnosis of sensitivity, and thus some earlier detection and treatment, has already been realized However, this was still not possible for fungal pathogens. However, the literature 'Detection of various fungal pathogens in blood sam ples′in: EBMT 1995, Vol.15, Suppl.2, March 1995, Abstract Book, Abstract 432 , P. 103 uses PCR to identify some fungal pathogens in blood Amplification of a DNA segment of a fungal gene has already been described. Species specificity Additional hybridization with gonucleotides allows discrimination between different fungal strains Noh. The most important issue in detecting fungal infections using molecular biology techniques is fungal cells Due to the very complex composition of the walls, time-consuming and expensive extraction methods Ever needed. Another problem is that increased numbers of fungal species can cause dangerous infections in immunosuppressed patients This is the fact that a full range of different fungal species and strain records and And detection is required. Treatment is different for different fungal species, so all true In addition to recording the species, it is necessary to identify and identify these species. In view of the above, it is essential to improve the above method for early diagnosis of fungal infection. It is an object of the invention. The method should be as quick and easy as possible, and as many fungi as possible Species should be recorded and they can be identified at another stage of development Should. A method for detecting a fungal pathogen with a clinical substance found according to the invention comprises: Including the following steps: 1) extraction of fungal DNA from whole blood; and 2) Detection of extracted fungal DNA By stopping traditional culture of fungal species from clinical substances and going to the fungal DNA itself Detection of fungal infection with very high sensitivity from the detection of fungal-specific DNA A method was developed. Detection can be done at the DNA level, so at least partially sensitive Can use the fast methods established in Results in significant advantages. The release and purification of fungal DNA ensures rapid sensitivity and rapid diagnosis. In making the cut, it must be not only quick, but also almost completely and relatively pure. Should be recalled. In addition, the new method is sensitive to several fungal species, while minimizing fungal species Should be identified in the appropriate operating steps. This additional purpose is the following operation performed in addition to or instead of operation step 2) Through the steps achieved in the new method described above: 3) Determination of fungal species from extracted fungal DNA. This method can be used for certain fungal infections, for example, because known sequencing methods can be used. Advantage of being very rapid at the DNA level and showing high specificity have. Several problems must be overcome in the individual steps of the new method. Part of it Indicates that the composition of the fungal cell wall and the number of fungal cells May be present in some blood cell populations after use, especially in granulocytes and macrophages. Based on the facts. For this reason, an independent first step of the method, namely the extraction of fungal DNA from whole blood, has also been discovered. It is the purpose of the wish. This method is diagnostically advantageous for detecting fungal infections in patients Yes, but should be used whenever fungal DNA is needed for other processing Can be For example, using the new method, fungal DNA can be obtained from animals specifically infected with the fungal species in question. Can be extracted from blood. DNA probe is a fungus obtained by this technique DNA is excised from the DNA and subsequently used in detection reactions or cut into plasmids. Loaned. Basic research, diagnosis, treatment, industrial genetic technology, etc. Applications in all areas are possible. The fungal DNA extraction process ensures that even very small amounts of the fungus in whole blood are true. It should be able to extract bacterial DNA. Furthermore, this step of the method is rapid It should be easy and easy to use, so it can be used by Can be The purpose of this is to extract fungal DNA from whole blood: 1) isolation of substantially intact fungal cells from whole blood; and 2) Extraction of DNA from isolated fungal cells This is achieved according to the present invention comprising the steps of: The object of the invention is completely achieved in this way. The new method is whole blood in the first step Isolation of these fungal cells and, in a second step, extraction of DNA from these isolated fungal cells Consists of two steps, the DNA thus extracted detects fungal infection And used to identify if necessary. In this two-step process, Improves specificity, because other interfering DNA is more likely in the second step of the method. Because they exist only in small quantities. The method has the following operating steps: a1) Decomposition of blood cells in whole blood; a2) Isolation of almost intact fungal cells from cellular DNA b1) degradation of the isolated fungal cells; and b2) Isolation of fungal DNA Is preferable. This allows for a very rapid and safe separation of fungal DNA from cellular DNA. Cell D NA is released into this initial solution by lysis of blood cells in whole blood, Has not been decomposed by the previous disassembly process or has been at least completely decomposed The free fungal cells can be isolated by a quick and easy process, such as centrifugation. Can be separated from Upon subsequent lysis of the fungal cells isolated in this manner, the solution With no or only small amounts of cellular DNA in it I can assume it. The degradation of blood cells in step a1) is Must be done so as not to be dissolved. The fungal cell wall is the cell wall of blood cells Can be guaranteed by a proper and careful disassembly process. Can be. The operating step a1) has another advantage, that is, very small amounts of fungi are particularly useful for diagnostic purposes. Benefits of releasing fungi captured by phagocytes so that they can be extracted from whole blood have. New method allows at least some fungal cells to be free in whole blood It is no longer necessary to be lysed in It is sufficient to be present in the sphere or macrophage. It is preferred if the following steps are performed in step a): a1.1) Lysis of red blood cells by osmotic hemolysis; a1.2) Enzymatic degradation of leukocytes; and a2.1) Centrifugation of whole blood processed by this method and use of pellet in the next operation step The advantage here is that blood cells are reliably lysed in steps a1.1) and a1.1). However, the fungal cells themselves are still intact. Subsequent centrifugation So, on the one hand, released cellular DNA and cell fragments of blood cells and, on the other hand, This guarantees a very safe separation from fungal cells that are still intact. This This is because the fungal DNA is still present in the fungal cells in the pellet, so that the fungal DNA It also guarantees that NA is not lost. In summary, the advantages of the process are Even the lowest concentration of fungal cells can be detected, while the isolated fungal DNA is at best It is only contaminated with a small amount of cellular DNA, Higher in subsequent diagnostic steps due to significantly improved DNA ratios over fungal DNA Demonstrate sensitivity and specificity. In another development, it is preferred if the following steps are performed in step b): b1.1) Alkaline lysis and enzymatic treatment of fungal cells. This simple operating step consists of the fungal cells recovered from the pellet in operating step a2.1). Can be safely decomposed. The lysis of red blood cells in step a1.1) is preferably about 10 mM Tris pH 7.6, 5 mM MgClTwoAnd a hypotonic solution at a final concentration of 10 mM NaCl. The enzymatic digestion of leukocytes in step a1.2) is performed using 200 μg / ml Proteinase K, 10 mM Tris pH 7.6, 10 mM EDTA p Solution with a final concentration of H8.0, 50 mM NaCl and 0.2% SDS It is more preferable if the reaction is performed in In another development, the solution from step a1.2) is at 60-70 ° C., preferably Incubated at 5 ° C. for 100-140 minutes, preferably 120 minutes You. This technique allows blood cells to be reliably and completely degraded without damaging fungal cells. After these manipulation steps, free fungal cells in solution and phagocytic cells in early blood Both the captured fungal cells remain relatively intact and their DN It was found that separation by centrifugation was possible without losing A. It is further preferred if step b1.1) comprises the following steps: 90-98 ° C, preferably 95 ° C, in a solution containing -50 mM NaOH In the pellet from step a2.1) for 5 to 15 minutes, preferably 10 minutes Incubation of fungal cells present in Neutralization with -1M Tris-HCl pH 7.0 -30 to 40 ° C, preferably at 37 ° C for 50 to 70 minutes, preferably 60 minutes Enzyme treatment with Zymolyase −60 to 70 ° C., preferably 65 ° C. for 10 to 30 minutes, preferably 20 minutes Protein denaturation by incubation with Bars Tris / EDTA. These steps involve the safe destruction of the fungal cells, followed by the complete release of the fungal DNA. The fungal DNA is in a lysed state in order to It turned out that it can be isolated. In this connection, it is preferred if step b2) comprises the following steps: Protein precipitation with -5 M potassium acetate, and -DNA precipitation of the supernatant in ice-cold isopropanol. These steps are very easy to perform and the protein is initially And the supernatant is removed and the DNA is precipitated. And mixed with ice cold isopropanol. The precipitated DNA is used in a separate Or to detect and identify fungal infections. Summarizing the operations described so far, the first advantage is that the fungal species usually That it can be detected based on the DNA and then be specifically identified. Fungal DNA Is not extracted directly from whole blood, but rather improves sensitivity and specificity initially First, the separation of fungal cells from cellular DNA. In other words, very few fungal cells If the vesicle is only present in whole blood, very little fungal DNA extracted from it Was detected against a background of cellular DNA present at very high concentrations. Thus, the separation described above is of great advantage in terms of sensitivity. Another advantage of the new method is that whole blood cells are first broken down without damaging fungal cells Whether they are in solution or trapped in phagocytic cells However, fungal cells captured by phagocytes can also be used for detection purposes. fungus Cells are degraded after separation of fungal cells from cellular DNA, leaving cell debris of blood cells. Just do it. The method used here, despite the somewhat complicated fungal cell wall , Ensures complete and intact degradation of fungal DNA. A kit for performing the above method is also an object of the present invention. The above procedure is included in such a kit. All basic solution sets required for the process can be included. However However, only those base solutions not normally found in the laboratory can be included in this kit. Yes, for example, Tris buffer can be disposable, but at least protein ZeK and Zymolyase are present in the kit. The second step of the present method, either independently or in combination with the first step of the above method, i.e. Detection of the extracted fungal DNA is also an object of the present application. The fungal DNA detected is It is preferred here to be extracted and isolated as described above. However, Fungal DNA by appropriate density gradient centrifugation, specific precipitation with DNA probe, etc. It is also possible to get In all these cases, the fungal DNA is in its initial solution for further use. It is desirable to check whether it actually exists. Fungal DNA can be used to advantage in diagnosing fungal infections, but is used differently You can also. Fungal DNA is particularly sensitive to agar plates or to the fungal species in question. Obtained from the blood of stained animals. The DNA probe is the fungal DN obtained by this technique. A to be cleaved and subsequently used in a detection reaction or cloned into a plasmid. Is trained. Basic research, diagnosis, treatment, industrial genetic technology, etc. Applications across disciplines are possible. The new detection step has several differences even in low concentrations in the initial solution in a single process. Should be able to record different fungal species, and therefore very quickly and early in diagnosis. It is possible to answer if there is a fungal infection on the floor. Furthermore, new operations are quick And should be easy to perform, so that skilled workers can Can be used. The purpose is to detect the extracted fungal DNA by the following steps: c) amplification of at least one segment of the isolated fungal DNA; d) Detection of amplification products This is achieved according to the present invention comprising: Even small amounts of isolated DNA are first amplified and subsequently detectable. There are several standard methods. These methods are highly specific and very sensitive Therefore, they exhibit desirable characteristics in diagnosis, therapy, industrial genetic technology, etc. You. Furthermore, these methods can be performed by a skilled person. Amplification is performed by PCR, cloning, DNA-dependent DNA polymerase, etc. Therefore, detection is performed by gel electrophoresis, optical density, staining with a marker that specifically binds to nucleic acids. It can be done by color. In another development, amplification is performed on DNA of several different fungal species, preferably 18 ssu. -Polymerization using two primers that bind to fungal genes for rRNA It is performed by the polymerase chain reaction (PCR). The advantage here is that a simple and thus established method can easily detect the appropriate amount of D Although it can be used to make NA, its DNA can also be used to identify the corresponding fungal species. It can be used for The nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 are used as primers in step c) It is preferable if used. The inventor of the present application has recognized that these two nucleotide sequences have various clinically relevant It has surprisingly been found to be used as a primer for fungal species. The use of these two primers in a PCR reaction increases the length of the primer to about 500 base pairs. Width products, which can be easily detected by gel electrophoresis, It is easy to process. Thus, the two primer sequences have various true All pathogenic fungal species were found to bind to bacterial DNA There is a detection method. The polymerase chain reaction cycles as follows: c1) at 90 to 96 ° C, preferably 94 ° C for 0.3 to 1 minute, preferably Denaturation for 0.5 minutes; c2) at 58 to 64 ° C, preferably 62 ° C for 0.5 to 1.5 minutes, preferably 1 minute Hybridization between; c3) 1.5-2.5 minutes, preferably 2 minutes at 68-75C, preferably 72C. Extension between It is preferable if it is carried out in. Denaturation step at 90-96 ° C, preferably 94 ° C for 5-9 minutes, preferably 3 minutes Is preferably performed before the start of the cycling process. PCR is very reproducible under the above conditions, and is found to be particularly highly specific. Therefore, the amplification product is actually a fragment of the original fungal DNA. Is guaranteed. In step d), the amplification product is subjected to gel electrophoresis, preferably on an agarose gel. It is more preferable if it is more detected and preferably stained with ethidium bromide. . The advantage is that amplification products indicative of fungal infection are actually produced by the PCR reaction. And a known established detection method is used. If the DNA sequence from the fungal gene for 18ssu-rRNA is amplified Is more preferable. The inventors of the present application have, on the one hand, directed primers identical for all fungal strains and species. A specific sequence segment adjacent to the two binding regions Indicated by strain and species, while the sequence of this segment identifies individual fungal species and strains. Found to be different in different fungal strains and species so that they can be used to detect . The present invention further relates to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. This These two nucleotide sequences are used to amplify a segment of fungal DNA If possible, it is preferable. The invention also relates to a kit for detecting fungal DNA in a test solution, the kit comprising Are primers for polymerase chain reaction that bind to DNA from several fungal species It contains. The kit uses the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 as primers. It preferably contains a reotide sequence. The present invention also relates to a kit for performing the above method. The advantage of such a kit is that all the necessary solutions and especially the necessary primers are Being put together, they can be used in routine operations. For this reason, These new kits provide daily laboratory work to detect fungal species in test solutions. Can be used in industry. In addition, this kit provides a segment of proven fungal Can be used to amplify the protein, for example, for further use in the identification process. it can. Third method of the present invention, combined with or independent of the first and second steps of the above method The process, ie, identification of fungal species using the extracted and detected fungal DNA, is also described in the present application. Is the purpose. Species identification should be quick and easy for diagnostic purposes, and should therefore be Can be used for daily work in hospitals. This object is achieved according to the present invention as long as the following steps are performed: e) the nucleotide sequence of the DNA contained in the test solution, which characterizes the fungal species; Action identification. Because the detection process is performed at the DNA level, certain segments of fungal DNA Identification is sufficient, provided that these segments are not specific to each fungal species. I have to. Standard methods involve sequencing at least a portion of the amplification product and It can be used by studying melting properties and the like. Since these methods are usually quick and easy, they can also be performed by skilled personnel. . The fungal DNA or a segment of the fungal DNA is transformed in step e) with a given fungal strain and / or Or hybrids with species-specific DNA probes It is preferred if the test for lid formation leads to the identification of a fungal species. The advantage is that a very fast and simple hybridization process is used for identification. Is Rukoto. Because it is specific to each fungal species, A specific probe that binds exclusively is used. Such a process is performed on a gel Performed, for example, hybrids are indicated by staining. Another alternative process is , The optically different properties of single- and double-stranded regions, such as optical density, dichroism or Consists of exploiting similar features. Probes labeled with digoxigenin for testing successful hybridization If the hybrid is detected using, for example, Southern blotting, preferable. The probe itself is preferably used in a well-known method, preferably by a visually detectable dye reaction. With the corresponding marker indicating hybrid formation after hybridization If already prepared, this step further simplifies the process. One or more of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 3 to 8 correspond to a DNA probe. And the DNA probe is preferably SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, Used in the order of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, each It is preferred if hybridization is to be tested. Individual fungal species are tested in order of their frequency by sequential hybridization, This can significantly speed up the detection process. The present invention further relates to the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8. In the present invention, these nucleotides are used as DNA probes in identifying fungal species. It further relates to the use of one or more of the sequences. The advantage here is that the six specified nucleotide sequences are all clinically relevant That can be specifically distinguished among the different fungal species. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 detects the fungal species Candida albicans, The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 detected Candida glabrata and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 The sequence detected Candida krusei, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 was Candida trop icalis, and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 detects Candida parapsilosis The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is a fungal species belonging to the Aspergillus strain, in particular, A.f. umigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans and A. terreus To detect. The present invention relates to the hybridization of specific fungal species with specific nucleotide sequence sections of DNA. Kits for identifying fungal species containing DNA probes that form About. The kit comprises, as DNA probes, the nucleotides of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8. It preferably contains one or more of the nucleotide sequences. The invention further relates to a kit for performing the above method. The advantage is that only DNA probes or more appropriate additions to such kits The ability to have a solution ready, so that all necessary Primary solution, etc. can be taken directly from this kit. This can be done by detecting or identifying each fungal species. Greatly simplifies the measurement, but it is important that the individual primary solutions are no longer made separately in the laboratory. Because it is fine. However, only the probe, or preferably the kit Include primers and enzymes / primary solution for remerase chain reaction It is also possible, so that a standard primary solution can be used separately. The method for detecting fungal cells in whole blood, which incorporates the above steps in an advantageous manner, is as follows. Including the notation step: -Isolation of nearly intact fungal cells from whole blood -DNA extraction from isolated fungal cells -At least one segment of the isolated fungal DNA, preferably 18 ssu- Amplification of at least one segment of a fungal gene for rRNA Detection of amplification products by yes / no determination, and -Hybridize DNA probes and amplification products specific for a given fungal strain and / or species Identification of them to individual fungal species by lid formation. One of the major advantages of this summarized method is that the amplification product is As further used for s / no determination, a segment of fungal DNA, preferably 1 An amplification step of amplifying a segment of the fungal gene for 8ssu-rRNA, You only need to do it once. The inventor of the present application relates to 18ssu-rRNA Two primers whose fungal genes are on the one hand identical to all fungal species of interest , On the other hand, at least partially adjacent to different amplicons of different fungal species, So that it can hybridize with different probes characteristic of the fungal species Was found. Therefore, with a single amplification step, it is questionable whether a fungal infection is really present. Is sufficient to answer questions about what fungal species are involved. is there. Therefore, the method is extremely simple, easy to implement, and lacks expertise. That is why even a skilled person can carry out the operation. Further advantages result from the following description. The above features and the features described below are not only in certain combinations, but also in other combinations. Or it can be used alone or without departing from the scope of the invention. You. Examples of the performance of individual operation steps and within the scope of the clinical trial program The use of the method is illustrated in the description below. A particular advantage of the new method is that it is performed with whole blood, i.e. no biopsy is required. The fact is that the serum that must be made first is not used. Fungal cells Is first separated from cellular DNA in whole blood. It only exists in very small quantities The background of cellular DNA, which is necessary for fungal DNA that may be There is no need to detect for rounds. This also increases the specificity of the detection method. This Erythrocytes are first lysed by osmotic hemolysis and then leukocytes are Be transformed into These two steps are performed in a manner that the fungal cells themselves are not damaged yet The fungal cells trapped in the vesicles are released without damage and used for subsequent detection. To be selected.Example 1: Lysis of red blood cells by osmotic hemolysis Lysis of red blood cells is performed using a hypotonic solution. Using the following buffer having the following final concentration RU: Tris pH 7.6 10 mM MgClTwo 5 mM NaCl 10 mM The solution is incubated at room temperature for 10 minutes and then centrifuged. A volume of 3 ml of whole blood is sufficient for the first step.Example 2: Enzymatic digestion of leukocytes Leukocytes, which may contain fungal cells, are buffered with the following final concentrations: In solution, proteinase K (20 μg / ml) obtained from Boehringer Mannheim The cells are carefully degraded by enzymatic digestion with the pellet of Example 1. Resuspend the sample: Tris pH 7.6 10 mM EDTA pH 8.0 10 mM NaCl 50 mM SDS 0.2% Proteinase K 200μg / ml This buffer is incubated at 65 ° C. for 2 hours.Example 3: Isolation of nearly intact fungal cells from cellular DNA Blood cells are degraded as described in Examples 1 and 2 and cellular DNA is released. After centrifugation at 5000 rpm, cell DNA sediments at this speed. Not so much DNA can be taken. The sediment contains all free or released fungal cells, which can be further processed Resuspend in buffer (Aqua bidest).Example 4: Degradation of fungal cells The fungal cells are lysed in alkali and treated with enzymes to release the fungal DNA. Initially, alkaline lysis was performed at 95 ° C. for 10 minutes with 50 mM NaOH 20 Perform using 0 ml. This step is followed by a neutralization step using 1 M Tris-HCl pH 7.0. I can. Then 500 μl (300 μg / ml) of Sigma zymolyase was added and the solution was Incubate at 60 ° C for 60 minutes to enzymatically digest the fungal cells. Then, 500 μl of Tris / EDTA and 50 μl of 10% SDS solution were added. Incubate the solution at 65 ° C. for 20 minutes to denature the protein.Example 5: Isolation of fungal DNA The fungal cell debris and the free fungal DNA that must then be isolated Exists. First, protein precipitation was performed using 5M potassium acetate, and then the supernatant was removed. The DNA is then precipitated by adding ice-cold isopropanol. Then settle The yield is used for another operating step. In the operating steps described in Examples 1 to 5, fungal DNA was obtained from whole blood in a highly selective manner. Perform the extraction, which is available as a sediment and is slightly contaminated with cellular DNA. The following detection can be performed with very high sensitivity and high specificity.Example 6: Amplification of a fungal-specific DNA segment In this operating step, the fungal DNA was found in the sediment obtained from the operating step of Example 5. Is first shown. In this step, the sequence number is The DNA sequences shown as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 correspond to one of many fungal strains and species. Specifically binds to the binding site on the fungal gene for 8ssu-rRNA Utilize the facts. The inventors of the present application have, on the one hand, directed primers identical for all fungal strains and species. A specific sequence segment adjacent to the two binding regions Indicated by strain and species, while the sequence of this segment identifies individual fungal species and strains. It has been found that different fungal strains and species are so different that they can be used to produce. The DNA sequence of SEQ ID NO: 1 binds to the sense strand, while the DNA sequence of SEQ ID NO: 2 In combination with the antisense strand, the distance between the two binding sites is about 500 base pairs. Therefore, these two DNA sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 Suitable as a primer for chain reaction (PCR), amplification of about 500 base pairs in length Produces products (amplicons). The positions of the primers and the chain length of each amplicon are shown in Table 1 below. Using two primers SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, Candida and Aspe About 500 base pairs of amplicon is sufficient for all relevant fungal species of the rgillus strain Volume production is obtained in a PCR operation. The PCR conditions are as follows: Buffer (50 μl): 10 mM Tris pH 9.6 50 mM NaCl 10 mM MgClTwo 0.2mg / ml BSA Polymerase Each 0.5 mM nucleotide 100pM primer each Initial denaturation: 94 ° C for 3 minutes Cycle denaturation: 0.5 minutes at 94 ° C Annealing: 1 minute at 62 ° C Extension: 2 minutes at 72 ° C Terminal extension: 72 ° C for 5 minutes Number of cycles: 34 High magnesium concentration in the buffer allows for high specificity of the polymerase, It can handle the elongation step at its optimal temperature of 72 ° C. Candida albicans 40 strains, Candida tropicalis 10 strains, Candida parapsilosis 6 strains, 11 Candida glabrata strains, 8 strains of Candida krusei, Aspergillus fumigatus 8 strains, 6 Aspergillus flavus strains, 5 Aspergillus terreus strains, Aspergillus nige r7, Aspergillus nidulans5 and Aspergillus versiculor3 Amplification was successful with these primers.Example 7: Detection of amplification product from Example 6 In the next step, a DNA segment of about 500 base pairs in length was used during the PCR reaction in Example 6. Indicates whether it is actually amplified. Detection of fungal-specific DNA segments Performed by ethidium bromide staining of specific bands on a 2% agarose gel. If a specific band is detected here, the primers of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 Is considered to be a fungal infection because it binds to all of said fungal strains. others If the fungal DNA was extracted during the operating steps of Examples 1-5, it was Amplified by the PCR step of Example 6 to the extent that it can be detected by Pt staining.Example 8: Classification of amplification products from Example 6 in individual fungal species Fungal infections already demonstrated in step 7 are then more accurately identified for specific treatments Must be done. Another advantage of the PCR step from Example 6 now becomes apparent You. Sufficient fungal-specific DNA segments are used to identify alternative detection methods for fungal species determination. Produced for. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8 listed in the sequence list is Used. These are specific to the sequence section of the DNA segment produced in Example 6. Acts as a species-specific probe that hybridizes to The probe of SEQ ID NO: 3 is Candida albicans, and the probe of SEQ ID NO: 4 is Candid a glabrata, the probe of SEQ ID NO: 5 was the probe of Candida krusei, and the probe of SEQ ID NO: 6. Is Candida tropicalis, the probe of SEQ ID NO: 7 is Candida parapsilosis, The probe of SEQ ID NO: 8 was obtained from Aspergillus fumigatus, A. flavus, A. versiculor, A. niger, A. nidulans and A. terreus. For this reason, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 is a general Aspergillus probe. However, the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 5 are distinguished among fungal species of Candida strain can do. Probes were used by Boehringer Mannh to prove successful hybridization. Labeled with transferase kit from eim, detection uses known color reaction In accordance with the Southern blot method. Stepwise sequential hybridization with these probes according to the frequency of individual fungal species And hybridization was started with SEQ ID NO: 3 (C. albicans) followed by SEQ ID NO: 3 No. 8 (Aspergillus), SEQ ID NO: 6 (C. tropicalis), SEQ ID NO: 7 are (C. paraps ilosis), SEQ ID NO: 4 (C.glabrata), and finally SEQ ID NO: 5 (C.krusei). Thus, the fungal species was identified in accordance with the amplification product produced in Step 6, and It is possible to start physical treatment.Example 9: Detection of scattered fungal cells in blood With the aid of specific amplification and sequential hybridization, the sensitivity of 1-3 fungal cells It was possible to detect the fungal species successfully. Fungi in blood samples Due to the dispersal of the species, the method is based on so-called 1 CFU (colony forming units) / ml blood The sensitivity could be proved to be reached. This limit of detection is a clinically relevant fungal dispersion in blood. That's well below what you would expect for a location.Example 10: Clinical trial program Large programs in clinical trials show high sensitivity of new method from 65 healthy testers In the analysis of 165 blood samples. 165 all blood Liquid samples remained negative. 94 immunosuppressed patients with vague fever were then tested for the presence of a fungal infection. . More than 200 blood samples out of 65 patients without an invasive fungal infection (exceptions (With one exception). On the other hand, all 25 patients with invasive fungal infections were already positive within the first week. Sex was determined. In addition, the causative fungal pathogen is classified in all patients I was able to.
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１０月１３日 【補正内容】 請求の範囲 １． ａ）全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離； ｂ）ｂ１）単離された真菌細胞の分解；および ｂ２）真菌ＤＮＡの単離 による、単離された真菌細胞からＤＮＡの抽出； の工程を含み、 工程ａ）が更に ａ１）全血中に含有される血液細胞の分解； ａ２）細胞ＤＮＡからのほぼ無傷の真菌細胞の単離 の工程を含む、全血から真菌ＤＮＡの抽出による臨床物質中における真菌ＤＮＡ の検出方法。 ２． 工程ａ）が更に ａ１．１）浸透溶血による赤血球の溶解； ａ１．２）白血球の酵素消化；および ａ２．１）この手法で処理された全血の遠心と、次の操作工程でペレットの 使用 の工程を含む、請求項１に記載の方法。 ３． 工程ａ１．１）において赤血球の溶解が、好ましくは１０ｍＭ Ｔｒｉ ｓ ｐＨ７．６、５ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ ＮａＣｌの最終濃度で、 低張液および界面活性剤を用いて行われる、請求項２に記載の方法。 ４． 工程ａ１．２）において白血球の酵素消化が、２００μg/mlプロテイナ ーゼＫ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、１０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０、 ５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．２％ ＳＤＳの最終濃度の溶液で行われる、請求 項２または３に記載の方法。 ５． 溶液が６０〜７０℃、好ましくは６５℃で１００〜１４０分間、好まし くは１２０分間にわたりインキュベートされる、請求項４に記載の方法。 ６． 工程ｂ１）が ｂ１．１）真菌細胞のアルカリ溶解および酵素処理 の工程を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。 ７． 工程ｂ１．１）が ‐５０ｍＭ ＮａＯＨ含有溶液中において、９０〜９５℃、好ましくは９５℃ で５〜１５分間、好ましくは１０分間にわたる、工程ａ２．１）からのペレット 中に存在する真菌細胞のインキュベート ‐１Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ ｐＨ７．０による中和 ‐３０〜４０℃、好ましくは３７℃で５０〜７０分間、好ましくは６０分間に わたるザイモリアーゼでの酵素処理 ‐６０〜７０℃、好ましくは６５℃で１０〜３０分間、好ましくは２０分間に わたるＴｒｉｓ／ＥＤＴＡとのインキュベートによるタンパク質変性 の工程を含む、請求項６に記載の方法。 ８． 工程ｂ２）が ‐５Ｍ酢酸カリウムによるタンパク質沈降、および ‐氷冷イソプロパノール中で上澄のＤＮＡ沈降 の工程を含む、請求項６または７に記載の方法。 ９． 請求項１〜８のいずれか一項に記載された方法を実施するためのキット 。 １０． 配列番号１のヌクレオチド配列。 １１． 配列番号２のヌクレオチド配列。 １２． ポリメラーゼ連鎖反応によるいくつかの真菌種の１８ｓｓｕ‐ｒＲＮ Ａに関する真菌遺伝子セグメントの増幅用プライマーとしての、請求項１０また は１１に記載されたヌクレオチド配列の使用。 １３． 好ましくは ｃ）ポリメラーゼ連鎖反応による、検出される真菌ＤＮＡの少くとも１つの セグメントの増幅；および ｄ）必要であれば、増幅産物の検出 の工程を含み、 工程ｃ）において、配列番号１および配列番号２のヌクレオチド配列がプライ マーとして用いられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の試験溶液中におけ る真菌細胞の検出方法。 １４． 工程ｃ）において、ポリメラーゼ連鎖反応が下記サイクル： ｃ１）９０〜９６℃、好ましくは９４℃で０．３〜１分間、好ましくは０． ５分間の変性； ｃ２）５８〜６４℃、好ましくは６２℃で０．５〜１．５分間、好ましくは １分間のハイブリッド形成； ｃ３）６８〜７５℃、好ましくは７２℃で１．５〜２．５分間、好ましくは ２分間の伸長 で行われる、請求項１３に記載の方法。 １５． ９０〜９６℃、好ましくは９４℃で５〜９分間、好ましくは３分間の 変性工程がサイクル工程の開始前に行われる、請求項１４に記載の方法。 １６． 工程ｄ）において、増幅産物が好ましくはアガロースゲル上でゲル電 気泳動を用いて検出されて、好ましくは臭化エチジウムを用いて染色される、請 求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。 １７． プライマーとして請求項１０または１１に記載されたヌクレオチド配 列を含有している、試験溶液中における真菌ＤＮＡの検出用キット。 １８． 請求項１〜８、１３〜１６のいずれか一項に記載された方法を実施す るためのキット。 １９． 配列番号３のヌクレオチド配列。 ２０． 配列番号４のヌクレオチド配列。 ２１． 配列番号５のヌクレオチド配列。 ２２． 配列番号６のヌクレオチド配列。 ２３． 配列番号７のヌクレオチド配列。 ２４． 配列番号８のヌクレオチド配列。 ２５． 真菌種の同定のためにＤＮＡプローブとしての請求項１９〜２４のい ずれか一項に記載されたヌクレオチド配列の１以上の使用。 ２６． 真菌種Candida albicansの検出のための、請求項１９に記載されたヌ クレオチド配列の使用。 ２７． 真菌種Candida glabrataの検出のための、請求項２０に記載されたヌ クレオチド配列の使用。 ２８． 真菌種Candida kruseiの検出のための、請求項２１に記載されたヌク レオチド配列の使用。 ２９． 真菌種Candida tropicalisの検出のための、請求項２２に記載された ヌクレオチド配列の使用。 ３０． 真菌種Candida parapsilosisの検出のための、請求項２３に記載され たヌクレオチド配列の使用。 ３１． Aspergillus 株からの真菌種の検出に関する、請求項２４に記載され たヌクレオチド配列の使用。 ３２． 好ましくは、下記追加工程： ｅ）真菌種に特徴的である、試験溶液中に含有されたＤＮＡのヌクレオチド 配列セグメントの決定 を含み、 工程ｅ）において、工程ｃ）により既に増幅された真菌ＤＮＡまたは真菌ＤＮ Ａセグメントを、ある真菌株および／または種に特異的なＤＮＡプローブとハイ ブリッド形成させ、成功したハイブリッド形成の試験により真菌種を同定し、配 列番号３〜配列番号８の１以上のヌクレオチド配列がＤＮＡプローブとして用い られる、請求項１〜８または１３〜１６のいずれか一項に記載の真菌種の同定方 法。 ３３． プローブがジオキシゲニンで標識され、ハイブリッドが成功するハイ ブリッド形成の試験のために例えばサザンブロット法により検出される、請求項 ３２に記載の方法。 ３４． ＤＮＡプローブが、順番に、好ましくは下記順序：配列番号３、配列 番号８、配列番号６、配列番号７、配列番号４および配列番号５で連続順に用い られて、各ハイブリッド形成が試験される、請求項３２または３３に記載の方法 。 ３５． ＤＮＡプローブとして請求項１９〜２４のいずれか一項に記載された １以上のヌクレオチド配列を含有している、真菌種の同定用キット。 ３６． ‐全血からのほぼ無傷の真菌細胞の単離 ‐単離された真菌細胞からＤＮＡの抽出 ‐配列番号１および２のヌクレオチド配列を用いる、抽出された真菌ＤＮＡの 少くとも１つのセグメント（これは１８ｓｓｕ‐ｒＲＮＡに関する真菌遺伝子の セグメントである）の増幅 ‐ｙｅｓ／ｎｏ決定による増幅産物の検出、および ‐ＤＮＡプローブとしてヌクレオチド配列配列番号３〜８の１以上とのハイブ リッド形成による、単一真菌種についての増幅産物の分類 の工程を含む、全血中における真菌細胞の検出方法。 ３７． 請求項３６に記載された方法を実施するためのキット。[Procedure for Amendment] Article 184-8, Paragraph 1 of the Patent Act [Date of Submission] October 13, 1997 [Contents of Amendment] Claims 1. a) isolation of substantially intact fungal cells from whole blood; b) b1) degradation of the isolated fungal cells; and b2) isolation of fungal DNA by extracting DNA from the isolated fungal cells. By extracting fungal DNA from whole blood, wherein step a) further comprises: a1) degrading blood cells contained in whole blood; a2) isolating substantially intact fungal cells from cellular DNA. A method for detecting fungal DNA in clinical substances. 2. Step a) further comprises: a1.1) Lysis of erythrocytes by osmotic hemolysis; a1.2) Enzymatic digestion of leukocytes; The method of claim 1, comprising the step of: 3. Lysis of red blood cells in step a1.1) is preferably at a final concentration of 10 mM Tri s pH 7.6 MgCl 2 and 10 mM NaCl, carried out using a hypotonic solution and a surfactant, according to claim 2 Method. 4. 3. The enzymatic digestion of leukocytes in step a1.2) is performed with a final concentration of 200 μg / ml proteinase K, 10 mM Tris pH 7.6, 10 mM EDTA pH 8.0, 50 mM NaCl and 0.2% SDS. Or the method of 3. 5. Method according to claim 4, wherein the solution is incubated at 60-70C, preferably 65C for 100-140 minutes, preferably 120 minutes. 6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein step b1) comprises the steps of b1.1) alkaline lysis of fungal cells and enzymatic treatment. 7. Step b1.1) is to remove the fungal cells present in the pellet from step a2.1) in a solution containing -50 mM NaOH at 90-95 ° C., preferably 95 ° C. for 5-15 minutes, preferably 10 minutes. Incubation-Neutralization with 1 M Tris-HCl pH 7.0-Enzyme treatment with zymolyase at -30-40C, preferably at 37C for 50-70 minutes, preferably 60 minutes-60-70C, preferably 10 at 65C 7. The method according to claim 6, comprising the step of protein denaturation by incubation with Tris / EDTA for -30 minutes, preferably 20 minutes. 8. 8. The method according to claim 6 or 7, wherein step b2) comprises: protein precipitation with -5 M potassium acetate; and DNA precipitation of the supernatant in ice-cold isopropanol. 9. A kit for performing the method according to any one of claims 1 to 8. 10. SEQ ID NO: 1 nucleotide sequence. 11. SEQ ID NO: 2 nucleotide sequence. 12. Use of the nucleotide sequence according to claim 10 or 11 as a primer for amplification of a fungal gene segment for 18ssu-rRNA of some fungal species by polymerase chain reaction. 13. Preferably c) amplifying at least one segment of the fungal DNA to be detected by the polymerase chain reaction; and d) if necessary, comprising the step of detecting the amplification product, wherein in step c) SEQ ID NO: 1 and the sequence The method for detecting a fungal cell in a test solution according to any one of claims 1 to 8, wherein the nucleotide sequence of No. 2 is used as a primer. 14． In step c), the polymerase chain reaction is cycled as follows: c1) at 90-96 ° C., preferably 94 ° C. for 0.3-1 minute, preferably 0. C2) hybridization at 58-64 ° C, preferably 62 ° C for 0.5-1.5 minutes, preferably 1 minute; c3) 68-75 ° C, preferably 1.5-72 ° C at 72 ° C. 14. The method according to claim 13, wherein the extension is performed for 2.5 minutes, preferably for 2 minutes. 15. The method according to claim 14, wherein the denaturation step at 90-96C, preferably 94C for 5-9 minutes, preferably 3 minutes, is performed before the start of the cycling step. 16. 16. The method according to any one of claims 13 to 15, wherein in step d) the amplification product is preferably detected on agarose gel using gel electrophoresis and stained preferably using ethidium bromide. . 17． A kit for detecting fungal DNA in a test solution, comprising a nucleotide sequence according to claim 10 or 11 as a primer. 18. A kit for performing the method according to any one of claims 1 to 8, 13 to 16. 19. SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence. 20. SEQ ID NO: 4 nucleotide sequence. 21. SEQ ID NO: 5 nucleotide sequence. 22. SEQ ID NO: 6 nucleotide sequence. 23. SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence. 24. SEQ ID NO: 8 nucleotide sequence. 25. Use of one or more of the nucleotide sequences according to any one of claims 19 to 24 as a DNA probe for identification of fungal species. 26. Use of the nucleotide sequence according to claim 19 for the detection of the fungal species Candida albicans. 27. Use of the nucleotide sequence according to claim 20 for the detection of the fungal species Candida glabrata. 28. Use of the nucleotide sequence according to claim 21 for the detection of the fungal species Candida krusei. 29. Use of the nucleotide sequence according to claim 22 for the detection of the fungal species Candida tropicalis. 30. Use of the nucleotide sequence according to claim 23 for the detection of the fungal species Candida parapsilosis. 31. Use of the nucleotide sequence according to claim 24 for the detection of fungal species from Aspergillus strains. 32. Preferably, the following additional steps: e) comprising the determination of the nucleotide sequence segment of the DNA contained in the test solution, which is characteristic of the fungal species, wherein in step e) the fungal DNA already amplified by step c) or The fungal DNA segment is hybridized to a DNA probe specific to a fungal strain and / or species, and a successful hybridization test identifies the fungal species, and one or more nucleotide sequences of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 8. The method for identifying a fungal species according to any one of claims 1 to 8 or 13 to 16, wherein is used as a DNA probe. 33. 33. The method of claim 32, wherein the probe is labeled with dioxygenin and the hybrid is detected for testing for successful hybridization, e.g., by Southern blotting. 34. Each hybridization is tested using the DNA probes in order, preferably in the following order: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5. A method according to claim 32 or 33. 35. A kit for identifying a fungal species, comprising as a DNA probe one or more nucleotide sequences according to any one of claims 19 to 24. 36. -Isolation of substantially intact fungal cells from whole blood-extraction of DNA from isolated fungal cells-at least one segment of the extracted fungal DNA using the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2 Amplification of a fungal gene for 18ssu-rRNA)-Detection of the amplified product by yes / no determination; and-For a single fungal species by hybridization with one or more of nucleotide sequence SEQ ID NOs: 3-8 as a DNA probe A method for detecting a fungal cell in whole blood, comprising the step of classifying an amplification product of 37. A kit for performing the method of claim 36.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９５ ３０ ３３６．９ (32)優先日 1995年８月17日 (33)優先権主張国 ドイツ（ＤＥ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (31) Priority claim number 195 30 336.9 (32) Priority date August 17, 1995 (33) Priority country Germany (DE) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L U, MC, NL, PT, SE), AU, CA, JP, U S
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