JP3608823B2 - Oligonucleotides for fungal detection and fungal species identification - Google Patents

Oligonucleotides for fungal detection and fungal species identification Download PDF

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Description

【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は真菌症の検出・診断に有効なオリゴヌクレオチドに関する。更に詳しくは、臨床診断上、カンジダ症、アスペルギルス症等の病原真菌を迅速、確実かつ簡便に検出するための、および病原真菌を同定するためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドを用いて病原真菌を検出する方法、ならびに病原真菌の検出・同定のための試薬に関する。
【0002】
【従来の技術】
高度医療の普及に伴い、易感染患者は増加の一途をたどっている。カンジダ症およびアスペルギルス症をはじめとする深在性(全身性)真菌症は、易感染患者が高率に罹患する重要な感染症として医療上の問題となっている。真菌症の治療には、様々な抗真菌剤が開発されている。しかし、真菌剤は開発されていても、真菌症であると診断するための迅速かつ確実な方法は未だ開発されていないのが現状である。現在使用されている深在性真菌症の診断法としては、病原真菌の検出、病原真菌の抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出する方法、病原真菌の菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法などがある。例えば、カンジダ症の診断には、カンジダ抗原またはこれに対する抗体を検出する方法がある。しかし、病理学的に真菌感染が認められない患者(健康人を含む)をも検出するという擬陽性の問題があり、また感度の点でも臨床的な要請に十分答えていない。
【0003】
アスペルギルス症の診断は、臨床検体から得られた培養、同定によって行われるが、たとえ病理学的にアスペルギルスの感染が明かな症例であったとしても、患者の検体からアスペルギルスが培養される割合(陽性率)は低く、さらに培養が出来たとしてもアスペルギルス属の同定の根拠となる分生子頭が形成されるまでに2週間以上かかるのが普通であり、このことがアスペルギルス症の発症前診断を困難にしている。現在のところ、アスペルギルス症の診断キットとして現在までに認可されているものはなく、実験室的な診断法としてアスペルギルス抗原またはこれに対する抗体を免疫学的に検出する方法、アスペルギルスの菌体成分または代謝産物を生化学的に検出する方法があるが、いずれの方法も、病理学的に真菌感染が認められない患者(健康人を含む)をも検出してしまう欠点がある。
【0004】
カンジダ症およびアスペルギルス症のほかにも、クリプトコッカス症およびカリニ原虫による感染症はAIDSおよび移植患者などの易感染性宿主における重要な病原微生物による疾患である。クリプトコッカス症の診断には、免疫凝集反応を用いる方法があるが、この方法はトリコスポロン・クタネウム(Trichosporon cutaneum)が病原と考えられる夏型過敏性肺臓炎の患者をも検出して擬陽性反応を示すことがあり、更に鑑別が必要となっている。また、カリニ原虫の培養は一般的には不可能であり、グロコット染色により虫体を顕微鏡で検出する方法に頼っている。さらに虫体総数の大部分を占めるトロフォゾイトを染めることは難しく、確実な診断のためには多量の虫体を必要としているのが現状である。
【0005】
さらに、広範囲の深在性病原性真菌を迅速、確実に検出する事の重要性は深在性真菌症に対する薬剤の開発とも密接に関係する。病原真菌の菌種によって抗菌剤を選択する必要があるからである。そのために、病原真菌の同定が必要とされる場合が少なくない。従って、直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出および真菌の菌種の同定の方法が望まれていた。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出および真菌の菌種の同定の方法と、それに用いる新規のオリゴヌクレオチド、ならびにその検出用試薬を提供することである。
【0007】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題解決のため真菌およびその他の生物の18SリボゾームRNA(以下18SrRNAという)遺伝子に関して種々の検討を重ねた結果、真菌の検出および真菌の菌種の同定に適当な核酸配列を得、それを用いた検出方法を確立して本発明を完成させるに至った。
【0008】
本発明は、真菌の18SrRNA遺伝子の核酸配列とハイブリダイズする、真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドである。
【0009】
本発明における真菌とは、カンジダ属、ハンセヌラ属、サッカロマイセス属、トリコスポロン属、クリプトコッカス属、アスペルギルス属、ペニシリウム属、ブラストマイセス属、コクシジオイデス属、ニュウモシスチス属、マラセジア属およびデバリオマイセス属を含む。上記オリゴヌレオチドは、好ましくは、配列番号1に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する(以下、核酸配列を示す場合に、Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを表す。また、いずれの位置のTがウラシル(U)と置換されていてもよい)。以下、核酸配列の一部は、少なくとも5塩基以上、好ましくは10塩基以上、さらに好ましくは20塩基以上の長さを有する。
【0010】
好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドは、配列番号1に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0011】
さらに好ましい実施態様においては、オリゴヌクレオチドは配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはそれらの相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0012】
また本発明は、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
【0013】
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドが配列番号6に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0014】
また本発明は、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号7に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0015】
また本発明は、カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号8に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0016】
また本発明は、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。 好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号9に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0017】
また本発明は、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号10に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0018】
また本発明は、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号5または配列番号11に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0019】
また本発明は、ニュウモシスチス・カリニ(Pneumocistis carinii)の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドである。
好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドは配列番号12に記載の核酸配列の一部または全部、あるいはその相補配列の一部または全部、から選択される配列を含有する。
【0020】
また本発明は、真菌の18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドであり、好ましい実施態様においては、そのオリゴヌクレオチドが配列番号1に記載の核酸配列の一部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の菌種に応じて改変した配列を含有する。
【0021】
また本発明は、上記オリゴヌクレオチドをプローブまたはプライマーとして使用する真菌の検出および真菌の菌種同定方法である。
さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドを含有する標識プローブである。
さらに本発明は、上記オリゴヌクレオチドを含有する核酸プライマーである。
本発明は、上記標識プローブを含む、真菌の検出および真菌の菌種同定用試薬キットである。
さらに本発明は、上記核酸プライマーを含む、真菌の検出および真菌の菌種同定用試薬キットである。
【0022】
以下、本発明を詳細に説明する。
【0023】
本発明者らは、現在までに決定された真菌およびその他の生物の遺伝子配列データバンク(GenBank)に登録されている18SrRNA遺伝子配列を参考にして各属および種間の遺伝子配列の相同性の理論的検証と実験的検証を重ねた結果、配列番号1に記載の1位から687位までの687塩基対の核酸配列に相当する部分が、真菌の検出および真菌の菌種の同定に関して適当な核酸配列であることを見い出した。この687塩基対の領域に相当する部分(カンジダ・アルビカンスでは673塩基対であるが、他の属では長さが異なる場合がある)は、真菌種間で保存されている相同性の高い部分(以下、真菌共通領域という)と、真菌科内でも属または種によって配列が大きく異なる部分(以下、属または種特異的領域という)とからなり、本発明者らはこれらの領域の配列を検出することで真菌の検出および真菌の菌種の同定を可能にした。
【0024】
上記の真菌共通領域は、真菌種内ではよく保存されているが他の生物とは配列に相違があり、本発明者らはこの領域の真菌に共通する配列を検出して真菌の存在を検出し得ることを実験的に確認した。具体的には、例えば、この真菌共通領域内の核酸配列またはその相補配列である、配列番号2、配列番号3、配列番号4または配列番号5に記載の核酸配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標識プローブとして使用して真菌を検出する。これにより、1回の測定で全ての真菌を検出し得る。しかし、この測定のみでは真菌属および真菌の菌種を同定し得ない。
【0025】
上記の種特異的領域は、真菌属間でも、そして属内の真菌の菌種間でも配列の相違があり、本発明者らはこの領域の特定の真菌種に特有の配列を検出することで、その真菌の存在を検出し得ることを実験的に確認した。具体的には、例えば、カンジダ・アルビカンスの種特異的領域内の核酸配列またはその相補配列である、配列番号6に記載の核酸配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーおよび標識プローブとして使用して、カンジダ・アルビカンスを検出する。
【0026】
真菌の他の菌種についても、それぞれの菌種に特有の配列を検出してカンジダ・アルビカンスと同様に検出し得る。例えば、カンジダ・アルビカンスの場合配列番号6に記載の核酸配列の領域に相当する配列は、カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)では配列番号7に記載の核酸配列であり、カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)では配列番号8に記載の核酸配列であり、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)では配列番号9に記載の核酸配列であり、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)では配列番号10に記載の核酸配列であり、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)では配列番号11に記載の核酸配列であり、ニュウモシスチス・カリニ(Pneumocistis carinii)では配列番号12に記載の核酸配列である。
【0027】
従って、配列番号6から配列番号12のいずれかに記載の核酸配列の一部または全部を含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーまたは標識プローブとして使用すれば、それぞれ、カンジダ・アルビカンス(配列番号6)、カンジダ・ルシタニエ(配列番号7)、カンジダ・クルゼイ(配列番号8)、カンジダ・グラブラータ(配列番号9)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(配列番号10)、アスペルギルス・フミガタス(配列番号11)、およびニュウモシスチス・カリニ(配列番号12)を検出し得る。
【0028】
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、配列表の配列番号1の1位のAから687位のAまでの核酸配列の一部、あるいはその相補配列の一部を、真菌の菌種に応じて改変した配列を含有する。ここで一部の改変とは1または2以上のDNAの欠失・挿入・置換などをいい、部位特異的点突然変異、あるいは欠失突然変異などを含む。
【0029】
本発明における検出には、上記の18SrRNAの遺伝子配列を検出して、血液、喀痰などのような各種臨床検体中に含まれる真菌および真菌の種を検出すること以外に、単離および培養された菌体の真菌種を判定することなども含まれることはいうまでもない。また、本発明における試料には、上記各種臨床検体、上記単離、培養菌体、およびこれらから単離、精製された核酸なども含まれる。また、増幅された核酸も含まれ得る。
【0030】
本発明はまた、標識プローブに関する。標識プローブとして使用するオリゴヌクレオチドは、配列表に記載の配列またはその相補配列の全域を使用する必要はなく、使用する核酸ハイブリダイゼーション条件に合わせて解離温度(Tm値)などを計算し、適当な領域を適当な長さで使用し得る。しかし、十分な特異性を有するプローブは、望ましくは10塩基以上、さらに望ましくは20塩基以上の長さが適当である。本発明の核酸プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドも、配列またはその相補配列から、適当な長さの配列を用いて作製し得る。また、使用する条件および目的などに応じて、オリゴヌクレオチド中に、ある程度の改変を行い得ることは容易に予想できる。
【0031】
本発明のオリゴヌクレオチドは化学合成により調製し得るので、クローン化したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに比べて、容易に、大量にかつ安価に一定品質のオリゴヌクレオチドが得られ得る。本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)のいずれでもあり得る。リボ核酸の場合はチミジン残基(T)をウリジン残基(U)と読み替えることは言うまでもない。あるいは任意の位置のTをUに変えて合成を行ったウリジン残基を含むDNAでもあり得る。同様に任意の位置のUをTに変えたチミジン残基を含むRNAでもあり得る。さらにオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入または置換のような点突然変異、あるいは改変ヌクレオチドがあり得る。
【0032】
本発明の標識プローブとしての標識は放射性物質、酵素、蛍光物質、または発光物質など公知の標識物が用いられ得る。標識の方法は末端標識または配列中の標識のいずれでもあり得る。あるいは糖、リン酸基、または塩基部分への標識もあり得る。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配列中のオリゴヌクレオチドと置換して酵素標識し得る(Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年)。5位にリンカーアームを有するウリジンを、特開昭60−500717号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成し、上記オリゴヌクレオチドに導入し得る。
【0033】
本発明のオリゴヌクレオチドは固相担体に結合して、捕捉プローブとしても用いられ得る。この場合、捕捉プローブと標識プローブとの組合せでサンドイッチアッセイ(特開昭58−40099号公報参照)を行い得る。あるいは、標的核酸を標識して捕捉する方法(特開昭62−265999 号公報参照)も用いられ得る。あるいは、オリゴヌクレオチドをビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後にアビジン結合担体で捕捉する方法も用いられ得る。
【0034】
本発明は更に核酸プライマーに関する。オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する場合、DNAポリメラーゼなどによる核酸増幅(例えばPCR;特開昭60−281号公報参照)を行い、真菌のみについて共通の領域の核酸配列の増幅またはカンジダ・アルビカンスなど特定の菌種に特有の配列のみの増幅がされ得る。PCR反応時に放射性標識ヌクレオチドを取り込ませる方法またはPCR増幅産物を電気泳動により分画して特有のバンドを検出する方法で、容易に18SrRNA遺伝子の核酸配列を検出し得る。あるいは、上記標識オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅産物を直接検出し得る。
【0035】
本発明はまた、真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法である。
【0036】
上記真菌共通領域の配列を利用する真菌の検出と、上記種特異的領域の特定の真菌種に特有の配列を利用する特定の真菌種の検出とは、それぞれのみでも臨床診断上有用であるが、これらを有機的に組み合わせることによりさらにその有用性を高め得る。例えば、配列番号2または配列番号3に記載の核酸配列を含有するオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして用いて臨床検体についてPCRを行えば、真菌についてのみ、18SrRNAの遺伝子配列の一部を有するDNAが増幅される。このDNAを、アガロースゲル電気泳動,または真菌に共通する配列である配列番号4に記載の核酸配列を有する標識プローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイにより検出し、各種真菌の存在を検出し得る。さらに、この増幅したDNAは菌種によって配列が異なる部分を含有しているので、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11および配列番号12などに記載の核酸配列を含む標識プローブを用いるハイブリダイゼーションアッセイによりこれらのDNAを検出し、臨床検体中の真菌の菌種を同定し得る。更に真菌に共通の配列を有するオリゴヌクレオチドと菌種に特異的な配列を有するオリゴヌクレオチドとを同時に用いることにより真菌の検出と菌種の同定が同時に行われ得る。
【0037】
この方法により、長時間を要する従来の培養法に比べて極めて短時間(1日以内)に真菌の検出および真菌の菌種の同定を行い得る。具体的には、易感染性患者などの臨床検体などを配列番号2または配列番号3に記載の核酸配列を含有する核酸プライマーを用いてDNAを増幅し、18SrRNAの遺伝子配列の一部を有するDNAの増幅により真菌の存在が証明される。さらに、この増幅されたDNAがハイブリダイゼーションアッセイにおいて配列番号6に記載の核酸配列を含む標識プローブとの反応により、カンジダ・アルビカンスの存在が証明され、病原体として疑われる。反応しない場合、別の真菌が病原体として疑われる。この真菌の菌種は、増幅したDNAをさらに別の標識プローブで調べて同定し得る。
【0038】
従来、rRNAそのものをハイブリダイゼーションアッセイで検出して真菌の菌種を同定する方法(特表平1−503356号公報参照)などが開発されているが、やはり感度が低く、培養を必要とする。さらにRNAは分解し易いため菌体から抽出する操作が難しく、しかもそのRNAサンプルは保存および扱いが難しい。このため再現性に問題がある。本発明は、18SrRNAの遺伝子DNAを検出し得る。DNAは極めて安定であり、簡単な操作で抽出し得、保存性もよくDNA増幅も容易である。
【0039】
【実施例】
以下に、本発明の実施例を例示して、本発明の効果をより一層明確にする。
【0040】
(実施例1)
(1)真菌検出用PCRプライマーの合成
DNAシンセサイザー392型(ABI社製)を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号2に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、真菌プライマーFという)および配列番号3に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、真菌プライマーRという)を合成した。手法はABI社のマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で55℃、一夜実施した。精製はHPLC(ベックマン社製)を用いて逆相カラムにて実施した。
【0041】
(2)試料の調製
以下に示すDNAをPCRの試料として使用した。カンジダ・アルビカンスの培養、そのスフェロプラストの調製およびゲノムDNAの調製は、阿部らの方法[昭和62年11月10日、(株)ソフトサイエンス社発行、口野嘉幸ほか2名編「遺伝子・タンパク質・実験操作ブロッティング法」(初版)]に従って行った。その他の細菌および生物試料については、それぞれのDNA抽出および精製の常法に従って調製したものを、最終1ng/μl濃度となるようにPCR反応液に加えた。
【0042】
(3)PCR
反応液の組成は、それぞれ1μMのプライマーFおよびプライマーR、10mM Tris−HCl(pH8.9)、1.5mM MgCl、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1%コール酸ナトリウム、0.1% TritonX−100、それぞれ0.2mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、ならびに耐熱性のTth DNAポリメラーゼ(東洋紡製)40単位/ml である。反応条件は次の通りである。
熱変性: 94℃、1分
アニーリング:55℃、2分
重合反応: 72℃、1分
上記操作をDNAサーマルサイクラー(Perkin−Elmer/Cetus社製)を用いて25回行った。
【0043】
(4)検出
5μlの反応液を1.5%アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後、紫外線による蛍光を検出した。泳動は、100vの定電圧で30分間行った。操作方法および他の条件は、ManiatisらのMolecular Cloning(1982年)に記載の方法に従った。反応液と同時に分子量マーカーも泳動し、相対移動度を比較して、検出されたDNA断片の長さを算出した。
【0044】
(5)結果
アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色した後に紫外線で687塩基対の蛍光バンドが確認されたものを陽性とする。この結果、真菌の試料はすべてバンドが確認され、陽性と判定されたのに対して、その他の細菌および生物試料はいずれもバンドがみとめられず、陰性と判定された。
【0045】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドをPCRに用いて、真菌を特異的に検出し得ると判明した。さらにPCRなどのような核酸増幅による検出は高感度が期待できるため、真菌を単離する前の臨床検体などから直接検出し得、従来の培養に必要な時間(数週間)が不要になると考えられる。
【0046】
(実施例2)
(1)リンカーアームを有する真菌の検出および真菌の菌種同定用オリゴヌクレオチドの合成
DNAシンセサイザー392型(ABI社製)を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号6に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ1という)、配列番号7に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ2という)、配列番号8に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ3という)、配列番号9に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ4という)、配列番号10に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ5という)、配列番号11に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ6という)、および配列番号12に記載の配列を有するオリゴヌクレオチド(以下、プローブ7という)を合成した。この合成においては、5位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌクレオチドに導入した。5位にリンカーアームを有するウリジンは、特表昭60−500717号公報に開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成して調製した。このウリジンはオリゴヌクレオチド内の任意のTを置換し得るが、この実施例では5’末端のTを置換した。合成リンカーオリゴヌクレオチドはアンモニア水で50℃、一夜脱保護処理した後、HPLC(ベックマン社製)の逆相カラムを用いて精製した。
【0047】
(2)リンカーオリゴヌクレオチドの酵素(アルカリ性ホスファターゼ)による標識
上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアームを介するアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文献 (Nucleic Acids Res.; 14巻6115頁1986年)に従って行った。
【0048】
リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260を0.2M NaHCO 12.5μlに溶解し、次いで10mg/mlスベリン酸ジスクシニミジル(DSS)25μlを加えて室温で2分間反応させた。反応液を1mM CHCOONa(pH5.0)で平衡化したSephadex G−25(ファルマシア社製)カラム(1cmφx30cm)でゲル濾過して過剰のDSSを除去した。
【0049】
末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオチドを、さらにモル比で2倍量のアルカリ性ホスファターゼ(ベーリンガーマンハイム社製、100mM NaHCO、3M NaClに溶解したもの)と室温で16時間反応させてアルカリ性ホスファターゼ標識プローブを得た。
得られた標識プローブは、FPLC(ファルマシア社製)で陰イオン交換カラムを用いて精製した。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン30K(アミコン社製)を用いて限外濾過法により濃縮した。
【0050】
(3)試料の調製
実施例1の(1)〜(3)の操作で得られたPCR反応液(真菌プライマーFおよび真菌プライマーRによるPCR産物)を使用した。
【0051】
(4)ドットブロットハイブリダイゼーション
実施例1の(1)〜(3)の操作で得られたPCR反応液をナイロン膜(Hybond N+ 、アマシャム社製)に滴下し、0.4N NaOHで核酸を変性させてナイロン膜に固定した。この膜を中和後、ハイブリダイゼーションバック(BRL社製) に移し、上記各アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プローブ液(プロ−ブ1〜7)をそれぞれ含むハイブリダイゼーションバッファー(5xSSC、0.5%ウシ血清アルブミン、0.5%ポリビニルピロリドン、1%ドデシル硫酸ナトリウム)を加えてポリシーラーでシールし、プローブ6は50℃で、他のプローブは42℃で15分間ハイブリダイゼーションを行った。
【0052】
それぞれの膜をハイブリダイゼーションバッグから取り出し、洗浄液1(2xSSC、1%ドデシル硫酸ナトリウム)で50℃、10分間振盪して洗浄した。更に洗浄液2(1xSSC、0.5% TritonX−100)で室温、10分間振盪して洗浄した。最後に洗浄液3(1xSSC)で室温、5分間振盪して洗浄した。
【0053】
膜を新しいハイブリダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M Tris−HCl、0.1M NaCl、0.1M MgCl、0.3mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.3mg/mlブロムクロロインドフェリルホスフェート(pH7.5))を加えてポリシーラーでシールし、37℃で1時間インキュベートした。
【0054】
(4)結果
アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫色色素のスポットを目視判定した。スポットが確認できたものを陽性とした。
【0055】
この結果、プローブ1はカンジダ・アルビカンス、プローブ2はカンジダ・ルシタニエ、プロ−ブ3はカンジダ・クルゼイ、プローブ5はクリプトコッカス・ネオフォルマンス、そしてプローブ7はニュウモシスチス・カリニと特異的に反応して同程度の紫色色素のスポットが確認され、陽性と判定されたのに対して、その他の真菌はいずれもスポットが見られず、すべて陰性と判定された。
【0056】
次に、プロ−ブ4はカンジダ・グラブラータおよびサッカロマイセス・セレビシエと特異的に反応した。また、プローブ6はアスペルギルス属およびペニシリウム属と反応し陽性と判定された。
【0057】
従って、本発明のオリゴヌクレオチドを標識プローブに用いて、真菌の検出や真菌の菌種の同定が可能であることが判明した。さらに、実施例1の(1)〜(3)の操作で得られるPCR反応液1種類で、その後のハイブリダイゼーション操作により多種類の真菌の菌種を同定し得る。これは、高価な試薬および酵素が必要なPCR反応を、各菌種毎ではなく1回で行えることを意味し、検査費用の低減とさらなる検査時間の短縮を可能にする。この方法により、従来、培養などで数日から数週間かかっていた真菌の検出および真菌の菌種の同定を1日以内に終わらせ得る。
【0058】
【発明の効果】
本発明により、直接的で簡便、迅速かつ確実な真菌の検出および真菌の菌種の同定が可能となった。本発明の配列またはその相補配列の一部または全部を有するオリゴヌクレオチドをDNA増幅反応のプライマーまたは直接検出用のプローブ、あるいはその組合せとして用い、従来、数日から数週間かかっていた培養およびその後の生化学的試験などに比べて、時間を大幅に短縮し、簡便で、かつ再現性のある確実な結果が得られ、さらに核酸増幅などにより、血液および喀痰などの臨床検体から直接検出し得るので、その臨床的意義は大きい。
【0059】
【配列表】
【0060】
【配列番号:1】
【0061】
【配列番号:2】
【0062】
【配列番号:3】
【0063】
【配列番号:4】
【0064】
【配列番号:5】
【0065】
【配列番号:6】
【0066】
【配列番号:7】
【0067】
【配列番号:8】
【0068】
【配列番号:9】
【0069】
【配列番号:10】
【0070】
【配列番号:11】
【0071】
【配列番号:12】
[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an oligonucleotide effective for detection and diagnosis of mycosis. More specifically, for clinical diagnosis, for detecting pathogenic fungi such as candidiasis and aspergillosis quickly, reliably and simply, and for detecting pathogenic fungi, detecting pathogenic fungi using oligonucleotides and oligonucleotides The present invention relates to a method and a reagent for detection and identification of pathogenic fungi.
[0002]
[Prior art]
With the spread of advanced medical care, the number of easily infected patients continues to increase. Deep (systemic) mycosis, including candidiasis and aspergillosis, has become a medical problem as an important infectious disease that affects highly susceptible patients at a high rate. Various antifungal agents have been developed for the treatment of mycosis. However, even if a fungal agent has been developed, a rapid and reliable method for diagnosing it as a mycosis has not yet been developed. Current diagnostic methods for deep mycosis include detection of pathogenic fungi, immunological detection of pathogenic fungal antigens or antibodies thereto, biochemistry of pathogenic fungal components or metabolites There is a method to detect automatically. For example, in the diagnosis of candidiasis, there is a method for detecting a candida antigen or an antibody thereto. However, there is a false positive problem of detecting patients (including healthy people) who are not pathologically found to have fungal infection, and the clinical request is not fully answered in terms of sensitivity.
[0003]
Diagnosis of aspergillosis is based on culture and identification from clinical specimens, but the rate at which Aspergillus is cultured from patient specimens, even if the pathologically evident case of Aspergillus infection is positive (positive) The rate is low, and even if it can be cultured, it usually takes 2 weeks or more to form a conidial head that is the basis for identifying Aspergillus, which makes it difficult to diagnose aspergillosis before onset I have to. At present, no diagnostic kit for aspergillosis has been approved so far, and as a laboratory diagnostic method, immunological detection of Aspergillus antigen or antibody thereto, bacterial component or metabolism of Aspergillus There are methods for biochemically detecting the product, but each method has a drawback in that it detects even patients (including healthy people) who have no pathologically fungal infection.
[0004]
In addition to candidiasis and aspergillosis, cryptococcosis and infectious diseases due to protozoan parasites are diseases caused by important pathogenic microorganisms in AIDS and susceptible hosts such as transplant patients. There is a method using immunoagglutination for the diagnosis of cryptococcosis, but this method also detects false positive reactions by detecting patients with summer hypersensitivity pneumonitis in which Trichosporon cutaneum is thought to be a pathogen There is a need for further identification. In addition, culturing of the protozoan parasite is generally impossible, and relies on a method of detecting the worm body with a microscope by grocot staining. In addition, it is difficult to dye trophozoites, which account for the majority of the total number of worms, and a large amount of worms is required for reliable diagnosis.
[0005]
Furthermore, the importance of detecting a wide range of deep pathogenic fungi quickly and reliably is also closely related to the development of drugs for deep mycosis. This is because it is necessary to select an antibacterial agent depending on the species of the pathogenic fungus. Therefore, identification of pathogenic fungi is often required. Therefore, a direct, simple, rapid and reliable method for detecting fungi and identifying fungal species has been desired.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a direct, simple, rapid and reliable method for detecting fungi and identifying fungal species, a novel oligonucleotide used therefor, and a reagent for detection thereof.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies on the 18S ribosomal RNA (hereinafter referred to as 18S rRNA) genes of fungi and other organisms to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found that nucleic acid sequences suitable for detecting fungi and identifying fungal species. And a detection method using the same was established to complete the present invention.
[0008]
The present invention is an oligonucleotide for detecting a fungus and identifying a fungal species, which hybridizes with a nucleic acid sequence of a fungal 18S rRNA gene.
[0009]
The fungi in the present invention include the genus Candida, Hansenula, Saccharomyces, Trichosporon, Cryptococcus, Aspergillus, Penicillium, Blastmyces, Coccidioides, Nyumocystis, Marasedia and Debariomyces. The oligonucleotide preferably contains a sequence selected from a part or the whole of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part or the whole of its complementary sequence (hereinafter referred to as A Represents adenine, C represents cytosine, G represents guanine, T represents thymine, and T at any position may be substituted with uracil (U)). Hereinafter, a part of the nucleic acid sequence has a length of at least 5 bases, preferably 10 bases or more, more preferably 20 bases or more.
[0010]
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or part or all of its complementary sequence.
[0011]
In a further preferred embodiment, the oligonucleotide is selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, or part or all of their complementary sequences. Containing sequences.
[0012]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Candida albicans.
[0013]
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6, or part or all of its complementary sequence.
[0014]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Candida lusitaniae. In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 7, or part or all of its complementary sequence.
[0015]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of Candida krusei's 18S rRNA gene.
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8, or part or all of its complementary sequence.
[0016]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Candida glabrata. In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or part or all of its complementary sequence.
[0017]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Cryptococcus neoformans.
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10, or part or all of its complementary sequence.
[0018]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Aspergillus fumigatus.
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 11, or part or all of its complementary sequence.
[0019]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Pneumocystis carinii.
In a preferred embodiment, the oligonucleotide contains a sequence selected from part or all of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, or part or all of its complementary sequence.
[0020]
The present invention also relates to an oligonucleotide that specifically hybridizes with a nucleic acid sequence of a fungal 18S rRNA gene. In a preferred embodiment, the oligonucleotide is a part of the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or its complement. A part of the sequence contains a sequence modified according to the fungal species.
[0021]
The present invention also relates to a method for detecting a fungus and identifying a fungal species using the oligonucleotide as a probe or primer.
Furthermore, the present invention is a labeled probe containing the above oligonucleotide.
Furthermore, this invention is a nucleic acid primer containing the said oligonucleotide.
The present invention is a reagent kit for fungal detection and fungal species identification, comprising the labeled probe.
Furthermore, the present invention is a reagent kit for fungal detection and fungal species identification comprising the nucleic acid primer.
[0022]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0023]
The present inventors refer to the 18S rRNA gene sequences registered in the gene sequence data bank (GenBank) of fungi and other organisms determined to date, and the theory of gene sequence homology between each genus and species. As a result of repeated experimental verification and experimental verification, a portion corresponding to the nucleic acid sequence of 687 base pairs from position 1 to position 687 shown in SEQ ID NO: 1 is a nucleic acid suitable for fungal detection and fungal species identification. I found out that it was an array. The portion corresponding to this region of 687 base pairs (673 base pairs in Candida albicans, but may differ in length in other genera) is a highly homologous portion conserved among fungal species ( Hereinafter referred to as a fungal common region) and a portion whose sequence varies greatly depending on the genus or species (hereinafter referred to as a genus or species-specific region) within the family of fungi, and the present inventors detect the sequences of these regions. This enabled detection of fungi and identification of fungal species.
[0024]
The above fungal common region is well conserved within the fungal species, but the sequence is different from other organisms, and the present inventors detect the sequence common to the fungi in this region to detect the presence of the fungus It was confirmed experimentally. Specifically, for example, it contains a part or all of the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5, which is a nucleic acid sequence in this fungal common region or its complementary sequence Oligonucleotides are used as nucleic acid primers or labeled probes to detect fungi. Thereby, all the fungi can be detected by one measurement. However, this measurement alone cannot identify the fungal genus and fungal species.
[0025]
The above species-specific regions have sequence differences between fungal genera and between fungal species within the genus, and we have detected sequences unique to specific fungal species in this region. It was experimentally confirmed that the presence of the fungus could be detected. Specifically, for example, an oligonucleotide containing a part or all of the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 6, which is a nucleic acid sequence in the species-specific region of Candida albicans or a complementary sequence thereof, is used as a nucleic acid primer and a labeled probe. Use as a to detect Candida albicans.
[0026]
Other fungal species can also be detected in the same manner as Candida albicans by detecting a sequence unique to each fungus. For example, in the case of Candida albicans, the sequence corresponding to the region of the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 6 is the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 7 in Candida lusitanie, and in Candida krusei The nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 8, the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 9 in Candida glabrata, and the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 10 in Cryptococcus neoformans Aspergillus fumigatus is the nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11, and Pneumocystis carinii The nucleic acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12.
[0027]
Therefore, when an oligonucleotide containing a part or all of the nucleic acid sequence described in any one of SEQ ID NO: 6 to SEQ ID NO: 12 is used as a nucleic acid primer or a labeled probe, Candida albicans (SEQ ID NO: 6), Candida respectively • Lucitanie (SEQ ID NO: 7), Candida cruzei (SEQ ID NO: 8), Candida glabrata (SEQ ID NO: 9), Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 10), Aspergillus fumigatus (SEQ ID NO: 11), and N. cystis carini (SEQ ID NO: 12) may be detected.
[0028]
The oligonucleotide in the present invention is a sequence obtained by modifying a part of the nucleic acid sequence from A in position 1 to A in position 687 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a part of its complementary sequence, depending on the fungal species Containing. Here, the partial modification refers to deletion, insertion, substitution or the like of one or more DNAs, and includes site-specific point mutation or deletion mutation.
[0029]
For the detection in the present invention, the above 18S rRNA gene sequence was detected, and in addition to detecting fungi and fungal species contained in various clinical specimens such as blood, sputum, etc., they were isolated and cultured. Needless to say, determining the fungal species of the fungus body is also included. Samples in the present invention also include the above various clinical specimens, the above isolated and cultured cells, and nucleic acids isolated and purified from these. Amplified nucleic acids can also be included.
[0030]
The invention also relates to a labeled probe. The oligonucleotide used as the labeled probe does not need to use the entire sequence shown in the sequence listing or its complementary sequence. The area can be used with any suitable length. However, a probe having sufficient specificity is preferably 10 bases or more, more preferably 20 bases or more. The oligonucleotide used as the nucleic acid primer of the present invention can also be prepared from a sequence or its complementary sequence using a sequence having an appropriate length. Moreover, it can be easily predicted that a certain amount of modification can be performed in the oligonucleotide according to the conditions and purpose of use.
[0031]
Since the oligonucleotide of the present invention can be prepared by chemical synthesis, a certain quality of oligonucleotide can be easily obtained in a large amount and at a low cost as compared with a cloned oligonucleotide or polynucleotide. The oligonucleotides of the present invention can be either deoxyribonucleic acid (DNA) or ribonucleic acid (RNA). In the case of ribonucleic acid, it goes without saying that thymidine residue (T) is read as uridine residue (U). Alternatively, it may be DNA containing a uridine residue synthesized by changing T at any position to U. Similarly, it may be RNA containing a thymidine residue in which U at any position is changed to T. Furthermore, there may be point mutations such as deletions, insertions or substitutions in the oligonucleotide, or modified nucleotides.
[0032]
For the label as the labeled probe of the present invention, a known label such as a radioactive substance, an enzyme, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be used. The labeling method can be either an end label or a label in the sequence. Alternatively, there can be a label on the sugar, phosphate group, or base moiety. For example, a nucleotide having a linker arm can be replaced with an oligonucleotide in the sequence and labeled with an enzyme (Nucleic Acids Res .; 14, 6115, 1986). Uridine having a linker arm at the 5-position can be chemically synthesized from deoxyuridine by the synthesis method disclosed in JP-A-60-500717 and introduced into the oligonucleotide.
[0033]
The oligonucleotide of the present invention can also be used as a capture probe by binding to a solid support. In this case, a sandwich assay (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-40099) can be performed using a combination of a capture probe and a labeled probe. Alternatively, a method of labeling and capturing a target nucleic acid (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-265999) can also be used. Alternatively, a method in which an oligonucleotide is labeled with biotin and captured with an avidin-binding carrier after hybridization can be used.
[0034]
The invention further relates to nucleic acid primers. When an oligonucleotide is used as a primer, nucleic acid amplification by DNA polymerase or the like (for example, PCR; see JP-A-60-281) is performed, and amplification of a nucleic acid sequence in a common region for fungi alone or a specific species such as Candida albicans Only the sequence unique to the bacterial species can be amplified. The nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene can be easily detected by a method of incorporating a radiolabeled nucleotide during a PCR reaction or a method of detecting a unique band by fractionating a PCR amplification product by electrophoresis. Alternatively, the amplified product can be directly detected using the labeled oligonucleotide as a primer.
[0035]
The present invention is also a method for detecting fungi, identifying fungal species, or detecting fungi and identifying species.
[0036]
Although the detection of fungi using the sequence of the fungal common region and the detection of a specific fungal species using a sequence unique to a specific fungal species of the species-specific region are each useful for clinical diagnosis. The usefulness can be further increased by organically combining them. For example, when PCR is performed on a clinical sample using an oligonucleotide containing the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3 as a nucleic acid primer, DNA having a part of the 18S rRNA gene sequence is amplified only for fungi. The The presence of various fungi can be detected by detecting this DNA by agarose gel electrophoresis or a hybridization assay using a labeled probe having the nucleic acid sequence of SEQ ID NO: 4 which is a sequence common to fungi. Furthermore, since this amplified DNA contains a portion whose sequence differs depending on the bacterial species, it is included in SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, etc. These DNAs can be detected by hybridization assays using labeled probes containing the described nucleic acid sequences to identify fungal species in clinical specimens. Further, by simultaneously using an oligonucleotide having a sequence common to fungi and an oligonucleotide having a sequence specific to the fungus species, the detection of the fungus and the identification of the fungus species can be performed simultaneously.
[0037]
By this method, detection of fungi and identification of fungal species can be performed in a very short time (within 1 day) compared to conventional culture methods that require a long time. Specifically, DNA having a part of the 18S rRNA gene sequence is obtained by amplifying DNA from a clinical specimen such as an easily infectious patient using a nucleic acid primer containing the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3. The presence of the fungus is demonstrated by the amplification of. Furthermore, the presence of Candida albicans is proved by the reaction of the amplified DNA with a labeled probe containing the nucleic acid sequence described in SEQ ID NO: 6 in a hybridization assay, and is suspected as a pathogen. If it does not respond, another fungus is suspected as a pathogen. This fungal species can be identified by examining the amplified DNA with yet another labeled probe.
[0038]
Conventionally, a method for detecting fungal species by detecting rRNA itself by a hybridization assay (see Japanese Patent Publication No. 1-503356) has been developed, but it still has low sensitivity and requires culture. Furthermore, since RNA is easily degraded, it is difficult to extract from the cells, and the RNA sample is difficult to store and handle. For this reason, there is a problem in reproducibility. The present invention can detect 18S rRNA gene DNA. DNA is extremely stable, can be extracted by a simple operation, has good storage stability and is easy to amplify DNA.
[0039]
【Example】
Examples of the present invention will be illustrated below to clarify the effects of the present invention.
[0040]
Example 1
(1) Synthesis of PCR primers for fungal detection
An oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 2 (hereinafter referred to as fungal primer F) and an oligonucleotide having the sequence shown in SEQ ID NO: 3 by the phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 392 (ABI) (Hereinafter referred to as fungal primer R) was synthesized. The procedure was according to the manual of ABI, and deprotection of various oligonucleotides was carried out with ammonia water at 55 ° C. overnight. Purification was performed on a reverse phase column using HPLC (Beckman).
[0041]
(2) Sample preparation
The following DNAs were used as PCR samples. Candida albicans culture, spheroplast preparation and genomic DNA preparation were performed by the method of Abe et al. [November 10, 1987, published by Soft Science Co., Ltd., Yoshiyuki Kuchino et al. [Experimental operation blotting method] (first edition)] For other bacteria and biological samples, those prepared according to the conventional methods of DNA extraction and purification were added to the PCR reaction solution to a final concentration of 1 ng / μl.
[0042]
(3) PCR
The composition of the reaction solution was 1 μM primer F and primer R, 10 mM Tris-HCl (pH 8.9), 1.5 mM MgCl, respectively. 2 80 mM KCl, 500 μg / ml BSA, 0.1% sodium cholate, 0.1% Triton X-100, 0.2 mM dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, respectively, and heat-resistant Tth DNA polymerase (Toyobo) 40 units / ml. The reaction conditions are as follows.
Thermal denaturation: 94 ° C, 1 minute
Annealing: 55 ° C, 2 minutes
Polymerization reaction: 72 ° C, 1 minute
The above operation was performed 25 times using a DNA thermal cycler (Perkin-Elmer / Cetus).
[0043]
(4) Detection
5 μl of the reaction solution was electrophoresed on a 1.5% agarose gel, stained with ethidium bromide, and fluorescence due to ultraviolet rays was detected. Electrophoresis was performed at a constant voltage of 100v for 30 minutes. The operating method and other conditions followed the method described in Maniatis et al., Molecular Cloning (1982). The molecular weight marker was also migrated simultaneously with the reaction solution, the relative mobility was compared, and the length of the detected DNA fragment was calculated.
[0044]
(5) Results
Agarose gel electrophoresis and ethidium bromide staining, after which a fluorescent band of 687 base pairs is confirmed with ultraviolet rays, are positive. As a result, all the fungal samples were confirmed to have positive bands, while the other bacteria and biological samples did not show any bands and were determined to be negative.
[0045]
Therefore, it was found that the oligonucleotide of the present invention can be used for PCR to specifically detect fungi. Furthermore, since detection by nucleic acid amplification such as PCR can be expected to be highly sensitive, it can be detected directly from clinical specimens before isolating fungi, and the time required for conventional culture (several weeks) is considered unnecessary. It is done.
[0046]
(Example 2)
(1) Synthesis of oligonucleotides for detection of fungi having linker arms and identification of fungal species
Using a DNA synthesizer type 392 (manufactured by ABI), an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 6 (hereinafter referred to as probe 1) and an oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 7 (phosphoramidite method) Hereinafter, referred to as probe 2), oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 8 (hereinafter referred to as probe 3), oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 9 (hereinafter referred to as probe 4), described in SEQ ID NO: 10. The oligonucleotide having the sequence (hereinafter referred to as probe 5), the oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 11 (hereinafter referred to as probe 6), and the oligonucleotide having the sequence described in SEQ ID NO: 12 (hereinafter referred to as probe 7) Was synthesized). In this synthesis, uridine having a linker arm at position 5 was introduced into the oligonucleotide. Uridine having a linker arm at the 5-position was prepared by chemical synthesis from deoxyuridine by the synthesis method disclosed in JP-A-60-500717. This uridine can replace any T in the oligonucleotide, but in this example, the T at the 5 'end was replaced. The synthetic linker oligonucleotide was deprotected with aqueous ammonia at 50 ° C. overnight, and then purified using a reverse phase column of HPLC (Beckman).
[0047]
(2) Labeling of linker oligonucleotide with enzyme (alkaline phosphatase)
The linker oligonucleotide was linked to alkaline phosphatase via its linker arm according to the literature (Nucleic Acids Res .; 14: 6115 1986).
[0048]
Linker oligonucleotide 1.5 A260 to 0.2M NaHCO 3 After dissolving in 12.5 μl, 25 μl of 10 mg / ml disuccinimidyl suberate (DSS) was added and allowed to react at room temperature for 2 minutes. The reaction solution is 1 mM CH 3 Excess DSS was removed by gel filtration through a Sephadex G-25 (Pharmacia) column (1 cmφ × 30 cm) equilibrated with COONa (pH 5.0).
[0049]
A linker oligonucleotide having an activated terminal amino group was further diluted with a molar ratio of alkaline phosphatase (Boehringer Mannheim, 100 mM NaHCO 3). 3 And dissolved in 3M NaCl) at room temperature for 16 hours to obtain an alkaline phosphatase labeled probe.
The obtained labeled probe was purified by FPLC (Pharmacia) using an anion exchange column. Fractions containing the labeled probe were collected and concentrated by ultrafiltration using Centricon 30K (Amicon).
[0050]
(3) Sample preparation
The PCR reaction solution (PCR product obtained by fungal primer F and fungal primer R) obtained by the operations of (1) to (3) in Example 1 was used.
[0051]
(4) Dot blot hybridization
The PCR reaction solution obtained by the operations of (1) to (3) in Example 1 was dropped onto a nylon membrane (Hybond N +, manufactured by Amersham), and the nucleic acid was denatured with 0.4 N NaOH and immobilized on the nylon membrane. . After neutralizing this membrane, it was transferred to a hybridization bag (manufactured by BRL) and a hybridization buffer (5 × SSC, 0.5% bovine serum albumin) containing each of the alkaline phosphatase-labeled nucleic acid probe solutions (probes 1 to 7). , 0.5% polyvinylpyrrolidone, 1% sodium dodecyl sulfate) and sealed with policyler. The probe 6 was hybridized at 50 ° C., and the other probes were hybridized at 42 ° C. for 15 minutes.
[0052]
Each membrane was removed from the hybridization bag and washed with washing solution 1 (2 × SSC, 1% sodium dodecyl sulfate) by shaking at 50 ° C. for 10 minutes. Further, the plate was washed by washing with washing solution 2 (1 × SSC, 0.5% Triton X-100) at room temperature for 10 minutes. Finally, it was washed with washing solution 3 (1 × SSC) by shaking at room temperature for 5 minutes.
[0053]
The membrane is transferred to a new hybridization bag and the substrate solution (0.1 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl, 0.1 M MgCl 2 , 0.3 mg / ml nitro blue tetrazolium, 0.3 mg / ml bromochloroindoferyl phosphate (pH 7.5)) was added and sealed with policyler and incubated at 37 ° C. for 1 hour.
[0054]
(4) Results
The spot of purple pigment produced by alkaline phosphatase was visually determined. Positive spots were confirmed.
[0055]
As a result, probe 1 specifically reacted with Candida albicans, probe 2 with Candida lucitanie, probe 3 with Candida cruzei, probe 5 with Cryptococcus neoformans, and probe 7 with N. cerevisiae Carini specifically. A spot of purple pigment of a certain degree was confirmed and judged to be positive, whereas none of the other fungi were spotted, and all were judged to be negative.
[0056]
Probe 4 then reacted specifically with Candida glabrata and Saccharomyces cerevisiae. Probe 6 reacted with Aspergillus and Penicillium and was determined to be positive.
[0057]
Therefore, it has been found that the oligonucleotide of the present invention can be used as a labeled probe to detect fungi and identify fungal species. Furthermore, with one type of PCR reaction solution obtained by the operations of (1) to (3) of Example 1, various types of fungal species can be identified by subsequent hybridization operations. This means that a PCR reaction requiring expensive reagents and enzymes can be performed once instead of for each bacterial species, and it is possible to reduce the inspection cost and further shorten the inspection time. According to this method, detection of fungi and identification of fungal species, which conventionally took several days to several weeks in culture or the like, can be completed within one day.
[0058]
【The invention's effect】
The present invention has enabled direct, simple, rapid and reliable detection of fungi and identification of fungal species. An oligonucleotide having a part or all of the sequence of the present invention or a complementary sequence thereof is used as a primer for a DNA amplification reaction, a probe for direct detection, or a combination thereof, which has conventionally been cultured for several days to several weeks and thereafter Compared to biochemical tests, etc., the time is greatly shortened, and the results are simple and reproducible, and can be detected directly from clinical specimens such as blood and sputum by nucleic acid amplification. The clinical significance is great.
[0059]
[Sequence Listing]
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[SEQ ID NO: 1]
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[SEQ ID NO: 10]
[0070]
[SEQ ID NO: 11]
[0071]
[SEQ ID NO: 12]

Claims (13)

  1. カンジダ・ルシタニエ(Candida lusitaniae)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列がAGCAATAAGA GGAGGACTGT(配列番号7)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、カンジダ・ルシタニエの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide for detecting and identifying Candida lucitanie, wherein the nucleic acid sequence contains a sequence selected from AGCATAATAGA GGGAGACTGT (SEQ ID NO: 7) or its complementary strand, and the nucleic acid of Candida lucitanier 18S rRNA gene An oligonucleotide capable of specifically hybridizing to a sequence.
  2. カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列TATGGTAAGC ACTGTTGCGG(配列番号8)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、カンジダ・クルゼイの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide for detecting and identifying Candida krusei, comprising a sequence selected from its nucleic acid sequence TATGGGTAAGC ACTGTGGCGG (SEQ ID NO: 8) or its complementary strand, the nucleic acid sequence of Candida krusei's 18S rRNA gene An oligonucleotide that can specifically hybridize with.
  3. カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列CAAGTCCTTG TGGCTTGGCG(配列番号9)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、カンジダ・グラブラータの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide for detecting and identifying Candida glabrata, comprising a sequence selected from its nucleic acid sequence CAAGTCCTTG TGGCTTGCG (SEQ ID NO: 9) or its complementary strand, the nucleic acid sequence of the Candida glabrata 18S rRNA gene An oligonucleotide that can specifically hybridize with.
  4. クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列GTGGTCCTGT ATGCTCTTTA(配列番号10)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、クリプトコッカス・ネオフォルマンスの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide for detecting and identifying Cryptococcus neoformans, comprising a sequence selected from its nucleic acid sequence GTGGTCCTGT ATGCCTCTTA (SEQ ID NO: 10) or its complementary strand, and 18S rRNA of Cryptococcus neoformans An oligonucleotide that can specifically hybridize with the nucleic acid sequence of a gene.
  5. アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigatus)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列ATGGCCTTCA CTGGCTGTGG(配列番号11)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、アスペルギルス・フミガタスの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。Oligonucleotide for detecting and identifying Aspergillus fumigatus, comprising a sequence selected from its nucleic acid sequence ATGGCCTTCA CTGGCTGTGG (SEQ ID NO: 11) or its complementary strand, the nucleic acid sequence of the 18S rRNA gene of Aspergillus fumigatus An oligonucleotide that can specifically hybridize with.
  6. ニュウモシスチス・カリニ(Pneumocistiscarinii)を検出および同定するオリゴヌクレオチドであって、その核酸配列GAAGTTGTGT GCACTGGCGC(配列番号12)あるいはその相補鎖から選択される配列を含有し、ニュウモシスチス・カリニの18SrRNA遺伝子の核酸配列と特異的にハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド。An oligonucleotide for detecting and identifying Pneumocystis carinii, comprising a sequence selected from its nucleic acid sequence GAAGTTGTGT GCACTGGGCC (SEQ ID NO: 12) or its complementary strand, and the nucleic acid sequence of the 18 S rRNA gene of Pneumocystis carini An oligonucleotide capable of specifically hybridizing.
  7. 請求項1から請求項6のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含有する標識プローブ。A labeled probe containing the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 6.
  8. 請求項1から請求項6のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含有する核酸プライマー。A nucleic acid primer containing the oligonucleotide according to any one of claims 1 to 6.
  9. 真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法であって
    (1)請求項1から請求項8のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを標識プローブとして、1または2以上選択する工程;
    (2)該標識プローブとして用いたオリゴヌクレオチドと試料とをハイブリダイズさせる工程;
    (3)ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを検出する工程、
    を含む方法
    A method for detecting a fungus, identifying a fungal species, or detecting a fungus and identifying a fungus ,
    (1) a step of selecting one or more of the oligonucleotides according to any one of claims 1 to 8 as a labeled probe;
    (2) a step of hybridizing the oligonucleotide used as the labeled probe with a sample;
    (3) detecting the hybridized oligonucleotide;
    Including methods .
  10. 真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キットであって、請求項7に記載の標識プローブを含む、キット。A reagent kit for detecting a fungus, identifying a fungal species, or detecting a fungus and identifying a fungus, comprising the labeled probe according to claim 7.
  11. 真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キットであって、請求項8に記載の核酸プライマーを含む、キット。A reagent kit for performing fungal detection, fungal species identification, or fungal detection and bacterial species identification, comprising the nucleic acid primer according to claim 8.
  12. 真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行うための試薬キットであって、請求項7に記載の標識プローブおよび請求項8に記載の核酸プライマーを含む、キット。A reagent kit for detecting a fungus, identifying a fungal species, or detecting a fungus and identifying a fungal species, comprising the labeled probe according to claim 7 and the nucleic acid primer according to claim 8. ,kit.
  13. 真菌の検出、真菌の菌種の同定、あるいは真菌の検出と菌種の同定とを行う方法であって、A method for detecting a fungus, identifying a fungal species, or detecting a fungus and identifying a fungus,
    (1)請求項1から請求項8のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを核酸プライマーとして、1つ選択する工程;  (1) A step of selecting one of the oligonucleotides according to any one of claims 1 to 8 as a nucleic acid primer;
    (2)(1)で選択したオリゴヌクレオチドが記載通りの配列の場合は配列番号3に記載のオリゴヌクレオチドと、相補配列の場合は配列番号2に記載のオリゴヌクレオチドとを組み合わせ、ペアにする工程;  (2) A step of combining the oligonucleotide selected from (1) with the sequence shown in SEQ ID NO: 3 when the sequence is as described, and the oligonucleotide set forth with SEQ ID NO: 2 in the case of a complementary sequence to make a pair ;
    (3)(2)で組み合わせたペアのオリゴヌクレオチド一組を用い、試料を鋳型として核酸を増幅する工程;  (3) Amplifying a nucleic acid using a pair of oligonucleotides combined in (2) using a sample as a template;
    (4)増幅した核酸を検出する工程;  (4) detecting the amplified nucleic acid;
    を含む方法。Including methods.
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