DE10048009A1

DE10048009A1 - Method of detecting fungal infections

Info

Publication number: DE10048009A1
Application number: DE10048009A
Authority: DE
Inventors: Erik C Boettger; Phillip Kirschner; Jens Rosenau; Thomas Jack
Original assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Current assignee: Cytonet GmbH and Co KG
Priority date: 2000-09-26
Filing date: 2000-09-26
Publication date: 2002-04-11
Also published as: WO2002027021A8; WO2002027021A3; WO2002027021A2

Abstract

The invention relates to a method for detecting clinically relevant fungal infections. A multiplex amplification reaction is carried out using DNA that has been isolated from patient material in order to detect clinically relevant fungal infections of the <i>Candida</i> and <i>Aspergillus</i> species, a region of the 18s RNA gene of the pathogen being amplified as the target. Only sequences of clinically relevant species are amplified.

Description

Die vorliegende Erfindung entstammt dem Gebiet des Nachweises von pathogenen Pilzinfektionen mithilfe von PCR.The present invention is in the field of detection of pathogenic Fungal infections using PCR.

State of the art

Pilzinfektionen bei gesunden Menschen oder nicht immunsupprimierten Patienten sind gewöhnlich lokale oberflächliche Haut-, Schleimhaut-, und Nagelinfektionen ohne schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen. Pilzinfektionen, die bei immun supprimierten Personen, zum Beispiel nach Transplantationen oder bei HIV Patienten auftreten, sind jedoch immer lebensbedrohlich. Deshalb wird bei diesen immunsupprimierten Patienten meist bei länger bestehendem Fieber ungeklärter Ursache eine Pilzinfektion auch ohne Erregernachweis angenommen und sicherheitshalber therapiert (Lortholary and Dupont, B., Clin. Microbiol. Rev. 10: 477-504, 1997). Zur Vermeidung unnötiger bzw falscher therapeutischer Maßnahmen ist deshalb eine einfache, sichere und sensitive Diagnose einer systemischen Pilzinfektion wünschenswert.Fungal infections in healthy people or non-immunosuppressed patients usually local superficial skin, mucosal, and nail infections without serious health effects. Fungal infections that are immune suppressed individuals, for example after transplantation or in HIV patients but are always life threatening. Therefore, in these immunosuppressed Patients usually with a long-standing fever of unexplained cause a fungal infection too accepted without pathogen detection and therapy for safety (Lortholary and Dupont, B., Clin. Microbiol. Rev. 10: 477-504, 1997). To avoid unnecessary or False therapeutic measures is therefore a simple, safe and sensitive diagnosis a systemic fungal infection desirable.

Das Spektrum möglicher Pilzerreger einer disseminierten Pilzinfektion ist breit. Infektionen mit vorwiegend endemisch vorkommenden obligat pathogenen Erregern primärer Systemmykosen wie Histoplasma capsulatum, Coccidoides immitis, Blastomyces dermatitidis oder Paracoccidoides brasiliensis sind jedoch eher die Ausnahme. Weltweit zunehmende Bedeutung bei invasiven bzw disseminierten Pilzinfektionen besitzten dagegen Infektionen durch die Gattungen Candida und Aspergillus, sodaß insbesondere für diese Gattungen ein zuverlässiger Schnellnachweis wünschenswert ist.The spectrum of possible fungal pathogens of a disseminated fungal infection is wide. infections with predominantly endemic obligate pathogens primary System mycoses such as Histoplasma capsulatum, Coccidoides immitis, Blastomyces dermatitidis or Paracoccidoides brasiliensis are more of an exception. Worldwide increasing Significance in invasive or disseminated fungal infections, however, have infections by the genera Candida and Aspergillus, so especially for these genera reliable quick detection is desirable.

Besondere klinischer Relevanz vor allem im Europäischen Raum besitzen in diesem Zusammenhang die Candida Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei. Als humanpathogene Aspergillus Keime sind insbesondere die Spezies A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavius und A. terreus von Bedeutung.Special clinical relevance especially in the European area possess in this The Candida species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata and C. krusei. As a human pathogen Aspergillus germs are in particular the species A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavius and A. terreus.

Sowohl Candida als auch Aspergillus Pilzinfektionen sind beispielsweise durch den Nachweis disseminierter Pilzzellen im Blut als auf Kulturschalen Kolonie bildende Einheiten (KBE = Koloniebildende Einheiten = PFU) nachweisbar. Dabei liegt die Anzahl der nachzuweisenden Pilzzellen in der Regel im Bereich von 1-10 Kolonie-bildenden Einheiten je ml Blut (Kiehn, Eur. J. Clin. Microbiol. 8, 832-837, (1989)). Für einen Pilznachweis ist deshalb eine Anreicherung der Pilzzellen von Vorteil. Eine Analyse von PFUs in aus Vollblut angereicherten Zellen ist jedoch aufwendig und zeitraubend.Both Candida and Aspergillus fungal infections are, for example, by detection disseminated fungal cells in the blood as colony-forming units on culture dishes (KBE = colony-forming units = PFU) detectable. The number of fungal cells to be detected usually in the range of 1-10 colony-forming units each ml of blood (Kiehn, Eur. J. Clin. Microbiol., 8, 832-837, (1989)). For a fungus proof is therefore an enrichment of the fungal cells of advantage. An analysis of PFUs in whole blood Enriched cells, however, is expensive and time consuming.

Alternativ stellen Verfahren basierend auf der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen infektiöser Keime mithilfe von PCR (U.S. 4,683,195, U.S. 4,683,10) eine sensitive Möglichkeit zum Nachweis von Infektionen dar. Die Identifikation der richtigen Amplifikationsprodukte geschieht dabei entweder mithilfe von Gelelektrophorese oder mithilfe geeigneter Hybridisations-Sonden. Neuerdings haben sich auch Verfahren etabliert, bei denen eine Amplifikaktionsreaktion im Echtzeitmodus detektiert und On-Line verfolgt werden kann (WO 97/46707, WO 97/46712, WO 97/46714).Alternatively, provide methods based on the amplification of nucleic acid sequences infectious germs by PCR (U.S. 4,683,195, U.S. 4,683,10) Possibility to detect infections. The identification of the right one Amplification products occur either by gel electrophoresis or using suitable hybridization probes. Recently, procedures have also been established where an amplification reaction is detected in real-time mode and tracked on-line can be (WO 97/46707, WO 97/46712, WO 97/46714).

Für eine Identifizierung von Spezies auf der Basis von Nukleinsäuresquenzen haben sich Verfahren als besonders geeignet erwiesen, bei denen ribosomale RNA Sequenzen analysiert werden (EP 0 131 052). Dies liegt vor allem daran, daß die ribosomalen RNA Gene in hoher Kopienzahl im Genom vorkommen und mit vergleichsweise hoher Sensitivitität detektiert werden können. Darüber hinaus sind RNA Gene für systematische bzw taxonomische Analysen besonders geeignet, weil die entsprechenden Gene, z. B. die 18s RNA Gene, sowohl Regionen aufweisen, die in der Evolution hochkonserviert sind, als auch Regionen besitzen, die beispielsweise innerhalb einer Gattung hypervariabel sind.For identification of species based on nucleic acid sequences have become Methods have proven particularly suitable in which ribosomal RNA analyzes sequences be (EP 0 131 052). This is mainly because the ribosomal RNA genes in high Copy number occur in the genome and detected with comparatively high sensitivity can be. In addition, RNA genes are systematic or taxonomic Analyzes particularly suitable because the corresponding genes, eg. B. the 18s RNA genes, both Have regions that are highly conserved in evolution, as well as possess regions, which are hypervariable within a genus, for example.

Auch für Candida und Aspegillus sind bereits mehrere, auf der Analyse von 18s RNA Sequenzen beruhende Verfahren publiziert worden (Hopfer et al J. Med. Vet. Mycol. 31: 65-75 (1993)), Makimura et al., J. Med. Microbiol. 40: 358-364 (1994), Einsele et al. J. Clin. Microbiol. 35: 1353-1360 (1997)., mit deren Hilfe die Identität eines pathogenen Erregers festgestellt werden kann. Sämtliche Verfahren sind jedoch nur für den Nachweis jeweils einer einzelnen Spezies geeignet, sodaß das gesamte Spektrum von klinisch relevanten Pilzinfektionen nur mithilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen abgedeckt werden kann.Also, for Candida and Aspegillus are already several, on the analysis of 18s RNA Sequence-based methods have been published (Hopfer et al., J. Med. Vet. Mycol. 31: 65-75 (1993)), Makimura et al., J. Med. Microbiol. 40: 358-364 (1994), Einsele et al. J. Clin. Microbiol. 35: 1353-1360 (1997)., With whose help the identity of a pathogenic agent can be determined. However, all methods are only for the detection of one each suitable species, so that the full range of clinically relevant Fungal infections can only be covered by a variety of different reactions can.

WO 97/07238 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Pilzzellen in klinischem Material, bei dem zunächst intakte Pilzzellen aus Vollblut angereichert werden. Der Nachteil des in WO 97/07238 beschriebenen Verfahren liegt jedoch vor allem darin begründet, daß die verwendeten Primer in einem Background humaner genomischer DNA offensichtlich zu unspezifischen Amplifiaktionsprodukten führen und nur dann spezifisch zum Nachweis klinisch relevanter Pilzspezies eingesetzt werden können, wenn der Amplifikationsreaktion eine aufwendige Probenvorbreitung, d. h. eine Isolation intakter Pilzzellen vorzugsweise aus Vollblut vorausgeht. WO 97/07238 describes a method of detecting fungal cells in clinical material, in which initially intact fungal cells are enriched from whole blood. The disadvantage of WO 97/07238 However, the method described above is mainly due to the fact that the used primers in a background of human genomic DNA lead unspecific Amplifiaktionsprodukten and only then specifically for detection clinically relevant fungal species can be used when the amplification reaction a complex sample preparation, d. H. Isolation of intact fungal cells preferably Full blood precedes.

Zusammengefaßt sind die gegenwärtigen aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zur rechtzeitigen Diagnose einer derartigen Infektion hinsichtlich ihres experimentellen Aufwands, ihrer Geschwindigkeit, Spezifität und Sensitivität limitiert. Insbesondere existierte zum Zeitpunkt der Erfindung kein Verfahren, mit dem eine Pilzinfektion mit hoher Spezifität nachgewiesen werden konnte.In summary, the current methods known in the art are for timely diagnosis of such an infection in terms of its experimental Costs, their speed, specificity and sensitivity limited. In particular, existed at the time of the invention is not a method with which a fungal infection with high specificity could be detected.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung eines schnellen, einfachen und sensitiven Verfahrens, mit dem sämtliche klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus nachgewiesen werden können.The object of the present invention was therefore to provide a fast, simple and sensitive method, with which all clinically relevant fungal infections of the Genera Candida and Aspergillus can be detected.

Brief description of the invention

Die Aufgabe wird gelöst durch eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von ausschließlich klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß ausschließlich Sequenzen pathogener Candida und Aspergillus Spezies amplifiziert werden.The object is achieved by a multiplex amplification reaction for the detection of exclusively clinically relevant fungal infections of the genera Candida and Aspergillus, at Target amplifies a region of the 18s RNA gene of the pathogen, thereby characterized in that only sequences of pathogenic Candida and Aspergillus species be amplified.

Diese Aufgabe wird insbesondere gelöst durch eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, sodaß Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanathii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus und A. candidus amplifiziert werden.This object is achieved in particular by a multiplex amplification reaction for Detection of clinically relevant fungal infections of the genera Candida and Aspergillus, at as a target, a region of the 18s RNA gene of the pathogen is amplified, so that sequences of the species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanathii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. so-called, A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus and A. candidus.

Für den Fall, daß eine Aspergillose aufgrund anderer klinischer Indikationen unwahrscheinlich ist, besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus einer Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattung Candida, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, wobei Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei amplifiziert werden.In the event that an aspergillosis due to other clinical indications is unlikely, the inventive method consists of a multiplex Amplification reaction for the detection of clinically relevant fungal infections of the genus Candida, in which a target of a region of the 18s RNA gene of the pathogen is amplified, sequences of the species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata and C. krusei.

Vorteilhafterweise wird bei diesen Verfahren genau ein Upstream Primer verwendet, dessen Sequenz einer bestimmten Sequenz des 18s RNA Gens entspricht, die bei allen nachzuweisenden Spezies identisch ist. Ein derartiger Primer besitzt in der Regel eine Länge von 13-25 Nukleotiden. Die Sequenz des Primers ist bevorzugt eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 1.Advantageously, exactly one upstream primer is used in these methods, whose Sequence corresponds to a specific sequence of the 18s RNA gene that is common to all identical to the species to be detected. Such a primer usually has a length of 13-25 nucleotides. The sequence of the primer is preferably a continuous one Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 1.

Als Downstream Primer haben sich Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden als geeignet erwiesen, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 oder Seq. ID. No. 4 oder Seq. ID. No. 5 darstellt. Gegenstand der Erfindung sind somit insbesondere Verfahren, bei denen ein, zwei, drei oder oder alle Downstream Primer mit Teilsequenzen gem. Seq. Id. No 2-5 verwendet werden.As a downstream primer, primers with a length of 13-25 nucleotides as whose sequence is a continuous partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 or seq. ID. No. 4 or seq. ID. No. 5 represents. Subject of the Invention are thus in particular methods in which one, two, three or all Downstream primer with subsequences gem. Seq. Id. No 2-5 can be used.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das Produkt der Amplifikationsreaktion zusätzlich durch Hybridisierung detektiert wird. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei Hybridisierungssonden verwendet, deren Sequenzen identisch mit oder komplementär zu einer Teilsequenz aller 18s RNA Sequenzen sind, die während der Amplifikationsreaktion amplifiziert wurden. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Hybridisations. Sonden mit einer Länge von 15 bis 100 und besonders bevorzugt mit eine Länge von 18-35 Nukleotiden, welche eine kontinuierliche Sequenz gemäß Seq. ID. No. 6 enthalten sowie Verfahren, in denen derartige Sonden verwendet werden.It has proven to be advantageous if the product of the amplification reaction in addition is detected by hybridization. In a particular embodiment of the The method according to the invention uses hybridization probes whose Sequences identical to or complementary to a partial sequence of all 18s RNA sequences which were amplified during the amplification reaction. Subject of the Invention are thus also hybridizations. Probes with a length of 15 to 100 and more preferably having a length of 18-35 nucleotides, which is a continuous Sequence according to Seq. ID. No. 6 included as well as methods in which such probes be used.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden die Amplifikationsprodukte mithilfe von Fluoreszenzdetektion nachgewiesen, wobei in der Regel die Hybridisations- Sonden mit einem Fluorophor markiert sind. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei Ausführungsformen erwiesen, bei denen das Amplifikationsprodukt mithilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) nachgewiesen wird. Dabei werden zwei mit Fluorophoren markierte Hybridisations-Sonden verwendet, die an benachbarte, aber nicht überlappende Sequenzen der Target-Nukleinsäure dergestalt hybridisieren, daß bei Hybridisation der Sonden an das Target-Molekül die beiden Fluorephore in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. Eine Sonde ist dabei mit einem Fluoreszenzresanzenergie- Donor wie beispielsweise Fluorescein markiert. Die andere Sonde ist mit einem Fluoreszenzresonanzenergieakzeptor wie besipielsweise LC-RED-640 oder LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals) markiert. Bevorzugt zum Nachweis von Candida und Aspergillus sind zwei als FRET-Paar zu verwendende Hybridisations-Sonden gemäß Seq. ID. No. 7 und 8.In a specific embodiment of the invention, the amplification products detected by fluorescence detection, usually using the hybridization Probes are labeled with a fluorophore. Be particularly advantageous Embodiments have proven in which the amplification product using Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is detected. There are two with Fluorophores labeled hybridization probes used adjacent but not hybridize overlapping sequences of the target nucleic acid such that at Hybridization of the probes to the target molecule, the two fluorephore in spatial proximity be brought to each other. A probe is equipped with a fluorescence resonance energy Donor such as fluorescein labeled. The other probe is with a Fluorescence resonance energy acceptor such as LC-RED-640 or LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals). Preferably for the detection of Candida and Aspergillus are two FRET pair hybridization probes according to Seq. ID. No. 7 and 8.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich auch Kits zur Durchführung der Erfindungs-gemäßen Verfahren. The present invention finally also kits for carrying out the Inventive method.

Brief description of the pictures Fig. 1

Schematische Darstellung eines Candida-18s-RNA-Gens mit Primern für eine erfindungsgemäße Multiplex-Reaktion zur Detektion von Candida. V1-V8 bezeichnen variable Regionen des 18s-RNA Gens. F3 bezeichnet die Position des Forward Primers mit SeQ: Id. No. 1. F16, F19 und F21 bezeichnen die Positionen der drei Reverse Primer mit SEQ. Id. No. 2-4. "Hybridisierungssonde" bezeichnet eine Sonde gem Seq. Id. No. 6.Schematic representation of a Candida 18s RNA gene with primers for a Multiplex reaction according to the invention for the detection of Candida. Designate V1-V8 variable regions of the 18s RNA gene. F3 denotes the position of the forward primer with SeQ: Id. 1. F16, F19 and F21 denote the positions of the three reverse primers with SEQ. Id. 2-4. "Hybridization Probe" refers to a probe according to Seq. Id. 6th

Fig. 2

Schematische Darstellung eines Aspergillus-18s-RNA-Gens mit Primern zur Detektion von Aspergillus. Erfindungsgemäß wird der Primer F15 (Seq. Id. No. 5 zusammen mit den Candida Primern gem Abb. 1 im Rahmen einer Multiplex-Reaktion eingesetzt. Wiederum gilt: V1-V8 bezeichnen variable Regionen des 18s-RNA Gens. F3 bezeichnet die Position des Forward Primers mit Seq: Id. No. 1. F15 bezeichnet die Position des Reverse Primer mit SEQ. Id. No. 5. "Hybridisierungsssonde" bezeichnet eine Sonde gem Seq. Id. No. 6.Schematic representation of an Aspergillus 18s RNA gene with primers for the detection of Aspergillus. In accordance with the invention, primer F15 (SEQ ID NO: 5) is used in conjunction with the Candida primers as part of a multiplex reaction as shown in Fig. 1. Again, V1-V8 denote variable regions of the 18s RNA gene Id., No. 1. F15 denotes the position of the reverse primer with SEQ ID No. 5. "Hybridization probe" refers to a probe according to SEQ ID No. 6.

Detailed description of the invention

Gegenstand der Erfindung ist zuächst eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von ausschließlich klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird.The subject of the invention is a multiplex amplification reaction for detection of exclusively clinically relevant fungal infections of the genera Candida and Aspergillus, in which as target a region of the 18s RNA gene of the pathogen is amplified.

Dabei werden Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii; C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. krusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus, A. candidus und bevorzugt ausschließlich Sequenzen der genannten Spezies amplifiziert. Somit sind alle klinisch relevanten Spezies der beiden genannten Gattungen umfaßt, die im klinischen Alltag mit einer bestimmten Häufigkeit auftreten und aufgrund ihrer pathogenen Auswirkungen therapiert werden müssen. In this case, sequences of the species C. albicans, C. guilliermondii; C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. krusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. so-called A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus, A. candidus and preferred exclusively amplified sequences of the species mentioned. Thus, all are clinical relevant species of the two genera mentioned, which in clinical practice with occur at a certain frequency and because of their pathogenic effects need to be treated.

Häufig als Kontamination in Laborratorien vorkommende Spezies werden durch das erfindungsgemäße Verfahren dagegen nicht detektiert. Der Nachweis von nicht pathogenen Spezies dieser und anderer Gattungen durch das erfindungsgemäße Verfahren kann dagegen nicht vollständig ausgeschlossen werden.Frequently occurring as contamination in laboratories species are by the By contrast, the method according to the invention is not detected. The detection of non-pathogenic Species of these and other genera by the method according to the invention, however, can not be completely excluded.

Unter bestimmten klinischen Voraussetzungen kann eine Aspergillose ausgeschlossen werden, und es ist lediglich erforderlich, den immunsupprimierten Patienten im Hinblick auf eine pathogene Candida Infektion zu testen. In diesem Fall besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus einer Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattung Candida, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, wobei Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei und bevorzugt ausschließlich Sequenzen der genannten Spezies amplifiziert werden.Under certain clinical conditions, aspergillosis may be excluded, and it is only necessary that the immunosuppressed patient with regard to a to test pathogenic Candida infection. In this case, the inventive Method of a multiplex amplification reaction for the detection of clinically relevant Fungal infections of the genus Candida, which target a region of the 18s RNA gene of the Pathogen is amplified, with sequences of the species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata and C. krusei and preferred exclusively amplified sequences of the species mentioned.

Voraussetzung für eine Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist zunächst eine DNA-Isolation aus Patientenmaterial, wobei es sich bei dem Patientenmaterial vorzugsweise um Blut des Patienten handelt. Prinzipiell sind dazu sämtliche aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren einsetzbar. Fakultativ kann in einem ersten Schritt eine Anreicherung der Pilzzelllen erfolgen (WO 97/07238). Alternativ kann in einigen Fällen auch anderes Körpermaterial wie beispilesweise Gewebe, Stuhl, Urin oder Sputum untersucht werden.Prerequisite for carrying out the method according to the invention is first a DNA isolation from patient material, preferably with the patient material is about blood of the patient. In principle, all are from the prior art can be used known methods. Optionally, in a first step, an enrichment of Fungus cells are made (WO 97/07238). Alternatively, in some cases, other Body material such as tissue, stool, urine or sputum are examined.

Zur Isolierung der Pilz-DNA ist in der Regel eine Lyse der Pilzzellen erforderlich, die ebenfalls durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren oder eine Kombination aus dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen kann. Beispielsweise hat sich hierfür eine Methode als besonders effektiv erwiesen, beider die Pilzzellen nach Verdau durch das Enzyms Lyticase und Lyse durch SDS bei 65°C mithilfe von Glaspartikeln mechanisch zerkleinert werden.To isolate the fungal DNA lysis of the fungal cells is usually required, the likewise by various methods known to the person skilled in the art or a combination of The method known to those skilled in the art can be carried out. For example, this has one Method proved to be particularly effective, both the fungal cells after digestion by the Enzyme lyticase and lysis by SDS at 65 ° C using glass particles mechanically be crushed.

Die Amplifikationsreaktion der jeweiligen 18s rRNA Target Sequenz erfolgt vorzugsweise mithilfe einer konventionellen PCR-Reaktion unter Standardbedingungen mithilfe von Taq- Polymerase oder anderen thermostabilen DNA Polymerasen.The amplification reaction of the respective 18 s rRNA target sequence is preferably carried out using a conventional PCR reaction under standard conditions using Taq Polymerase or other thermostable DNA polymerases.

Als Amplifikations-Primer werden in der Regel chemisch synthetisierte deoxy-Ribonukleotide verwendet. Allerdings können im Prinzip auch andere Nukleinsäuremoleküle oder deren Derivate wie beispielsweise PNA (Peptide Nucleic Acids) eingesetzt werden. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Primer auch mit detektierbaren oder immobilisierbaren Molekülen wie beispielsweise Biotin oder Digoxygenin konjugiert sein. As amplification primers are usually chemically synthesized deoxy-ribonucleotides used. However, in principle, other nucleic acid molecules or their Derivatives such as PNA (Peptide Nucleic Acids) can be used. Furthermore For example, primers according to the invention may also be detectable or immobilisable Molecules such as biotin or digoxygenin be conjugated.

Als Primer für eine PCR Reaktion ist mindestens ein sogenanter Upstream Primer sowie ein sogenanter Downstream Primer erforderlich, wobei die Sequenz des Upstream Primes der codierenden Sequenz der Target-Nukleinsäure in 5'-3' Orientierung entspricht. Die Sequenz des Downstream Primers entspricht einer Antisense Sequenz in 5'-3' Orientierung. Erfindungsgemäß werden jedoch nicht nur 2 Primer, sondern im Sinne einer sognenannten Multiplex-Reaktion mehrere Primer verwendet. Dadurch ist es möglich, in einem Reaktionsansatz nicht nur Sequenzen einer einzelnen Spezies, sondern Sequenzen mehrerer Spezies zu amplifizieren.As a primer for a PCR reaction is at least one so-called upstream primer and a so-called downstream primer is required, the sequence of the upstream prime of the coding sequence of the target nucleic acid in 5'-3 'orientation corresponds. The sequence of the downstream primer corresponds to an antisense sequence in 5'-3 'orientation. According to the invention, however, not only 2 primers, but in the sense of a so-called Multiplex reaction used multiple primers. This makes it possible in one Reaction approach not only sequences of a single species, but sequences of several Species to amplify.

Vorteilhafterweise wird bei diesen Verfahren genau ein Upstream Primer verwendet, dessen Sequenz einer bestimmten Sequenz des 18s RNA Gens entspricht, welche bei allen nachzuweisenden Spezies identisch ist. Ein derartiger Primer besitzt in der Regel eine Länge von 13-25 Nukleotiden. Die. Sequenz des Primers ist bevorzugt eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 1.Advantageously, exactly one upstream primer is used in these methods, whose Sequence corresponds to a particular sequence of the 18s RNA gene, which at all identical to the species to be detected. Such a primer usually has a length of 13-25 nucleotides. The. Sequence of the primer is preferably a continuous one Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 1.

Unter einer kontinuierliche Teilsequenz wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Teilsequenz einer Sequnez verstanden, die identisch mit der jeweiligen Sequenz ohne irgendwelche Insertionen oder interne Deletionen ist, aber an einem oder beiden Enden verkürzt sein kann. Eine kontinuierliche 'Teilsequenz im Sinne der Erfindung kann jedoch auch der gesamten jeweiligen Sequenz entsprechen.Under a continuous subsequence in the context of the present invention, the Partial sequence of a sequnez understood identical to the respective sequence without there are any insertions or internal deletions, but at one or both ends can be shortened. However, a continuous subsequence within the meaning of the invention can also correspond to the entire respective sequence.

Als Downstream Primer haben sich Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden als geeignet erwiesen, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 oder Seq. ID. No. 4 oder Seq. ID. No. 5 darstellt. Primer mit Teilsequenzen gem Seq. Id. No. 2-4 dienen dabei zur Amplifikation von Candida-Sequenzen. Ein Primer gem Seq. Id. No. 3 ist essentiell für den Nachweis von C. glabrata; ein Primer gem Seq. Id. No. 4 ist für den Nachweis von C. Krusei erforderlich. Primer mit Teilsequenzen gem Seq. Id. No. 5 dienen der Amplifikation von Aspergillus-Sequenzen. Gegenstand der Erfindung sind somit insbesondere Verfahren, bei denen ein, zwei, drei oder oder alle Downstream Primer mit Teilsequenzen gem. Seq. Id. No 2-5 verwendet werden.As a downstream primer, primers with a length of 13-25 nucleotides as whose sequence is a continuous partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 or seq. ID. No. 4 or seq. ID. No. 5 represents. With primer Partial sequences gemq. Id. 2-4 serve to amplify Candida sequences. A primer according to Seq. Id. 3 is essential for the detection of C. glabrata; a primer acc Seq. Id. 4 is required for the detection of C. Krusei. Primer with subsequences acc Seq. Id. 5 serve to amplify Aspergillus sequences. Subject of the Invention are thus in particular methods in which one, two, three or all Downstream primer with subsequences gem. Seq. Id. No 2-5 can be used.

Die Amplifikationsprodukte können durch unterschiedliche Methoden detektiert werden. Eine klassische Detektionsmethode ist die Agarose-Gelelektrophorese, bei der die PCR- Fragmente nach Größe aufgetrennt und und somit identifiziert werden. Eine andere Alternative bietet der sogenannte PCR-ELISA (Roche Molecular Biochemicals Katalog). The amplification products can be detected by different methods. A classical detection method is agarose gel electrophoresis, in which the PCR Fragments are separated by size and thus identified. Another Alternative offers the so-called PCR ELISA (Roche Molecular Biochemicals catalog).

Bei diesem Verfahren wird mindesten ein mit einer immobilisierbaren Gruppe wie beispielsweise Biotin markierter Primer verwendet, sodaß im Anschluß an die PCR-Reaktion das Amplifikationsprodukt an einer Festphase wie einer ELISA-Platte, welche beispielsweise mit Streptavidin als Bindepartner für Biotin beschichtet ist, gebunden werden kann.In this method, at least one with an immobilizable group such as For example, biotin-labeled primer used, so that following the PCR reaction the amplification product on a solid phase such as an ELISA plate, which for example coated with streptavidin as a binding partner for biotin.

In allen Fällen hat es sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn das Produkt der Amplifikationsreaktion zusätzlich durch Hybridisierung detektiert wird. Dadurch wird eine höhere Sensitivität des Assays erzielt, sodaß Pilzinfektionen auch dann nachgewiesen werden können, wenn der Titer an disseminierten Tumorzellen im Blut oder in einem anderen Patientenmaterial nur sehr niedrig ist.In all cases, however, it has proved to be advantageous if the product of the Amplification reaction is additionally detected by hybridization. This will be a achieved higher sensitivity of the assay, so that fungal infections are detected even then if the titer of disseminated tumor cells in the blood or in another Patient material is only very low.

Die dafür geeigneten Hybridisations-Sonden besitzen vorzugsweise eine Länge von 15 bis 100 und besonders bevorzugt eine Länge von 18-35 Nukleotiden. Sie sind somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung., sofern sie eine kontinuierliche Sequenz gemäß Seq. ID. No. 6 enthalten. Darunter werden im Sinne dieser Erfindung sämtliche Sequenzen verstanden, die einen Sequenzabschnit mit der gesamten Sequenz von Seq. Id. No. 6 ohne jegliche Deletion oder Insertion enthalten. Zusätzlich können diese Sonden aber auch noch weitere Sequenzabschnitte enthalten. Bevorzugt hybridisieren derartige Sonden mit allen Amplifikationsprodukten, die mithilfe der erfindungsgemäßen Primer amplifiziert werden können. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren, in denen die beschriebenen Sonden verwendet werdenThe suitable hybridization probes preferably have a length of 15 to 100 and more preferably a length of 18-35 nucleotides. They are thus too Subject matter of the invention, provided that it has a continuous sequence according to Seq. ID. No. 6 contain. For the purposes of this invention, these are to be understood as meaning all sequences which a sequence section with the entire sequence of Seq. Id. 6 without any deletion or insertion included. In addition, these probes can also be more Contain sequence sections. Preferably, such probes hybridize with all Amplification products amplified using the primers of the invention can. The invention also provides methods in which the probes described be used

In der Regel werden als Sonden ebenfalls chemisch synthetisierte deoxy-Ribonukleotide verwendet, die wahlweise durch andere Nukleinsäuremoleküle oder deren Derivate wie beispielsweise PNA (Peptide Nucleic Acids) ersetzt werden können. Definitionsgemäß sind diese Sonden mit einer detektierbaren Markierung konjugiert. Dabei kann es sich zum Beispiel um einen Fluoreszenzfarbstoff, ein Enzym, ein radioaktives Atom oder um eine massenspektrometrisch nachweisbare Gruppe handeln. Die Markierung kann abhängig vom genauen Detektionsformat an jeder beliebigen Ribose- oder Phosphatgruppe des Oligonukleotids eingeführt werden. Bevorzugt sind Markierungen am 5' und 3' Ende des Nukleinsäuremoleküls.In general, as probes also chemically synthesized deoxy-ribonucleotides used optionally by other nucleic acid molecules or their derivatives such as For example, PNA (Peptide Nucleic Acids) can be replaced. By definition these probes are conjugated to a detectable label. It may be to Example, a fluorescent dye, an enzyme, a radioactive atom or a act mass spectrometrically detectable group. The marking may vary depending on exact detection format on any ribose or phosphate group of the Oligonucleotide can be introduced. Preferably, marks are at the 5 'and 3' end of the Nucleic acid molecule.

In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden die Amplifikationsprodukte deshalb mithilfe von Fluoreszenzdetektion nachgewiesen, wobei die Hybridisations-Sonden mit einem Fluorophor markiert sind. In a specific embodiment of the invention, the amplification products therefore detected by fluorescence detection, using the hybridization probes are labeled with a fluorophore.

Besonders bevorzugt können die Amplifikationsprodukte im Real Time PCR Monitoring (WO 97/46707) detektiert werden. Dabei sind verschiedene homogene Testführungen möglich, bei denen entweder mindestens eine Fluoreszenz-markierten Hybridisationssonde oder ein fluoreszierender DNA-Bindefarbstoff sich bereits während der Amplifikation in der zu analysierenden Probe befinden:The amplification products can particularly preferably be used in real-time PCR monitoring (WO 97/46707) are detected. There are different homogeneous test guides possible, in which either at least one fluorescence-labeled hybridization probe or a fluorescent DNA binding dye already in the amplification in the To be analyzed sample are:

(i) DNA binding dye

Das jeweilige Amplifikationsprodukt wird in diesem Fall durch einen DNA-Bindefarbstoff nachgewiesen, welcher bei Interaktion mit doppelsträngiger Nukleinsäure nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge ein entsprechendes Fluoreszenzsignal emmitiert. Als besonders geeignet für diese Anwendung haben sich die Farbstoffe SybrGreen und SybrGold (Molecular Probes) erwiesen. Alternativ können auch interkalierende Farbstoffe verwendet werden.The respective amplification product is in this case by a DNA binding dye which is shown to interact with double-stranded nucleic acid after stimulation with Light emits a corresponding fluorescence signal of a suitable wavelength. When Especially suitable for this application are the dyes SybrGreen and SybrGold (Molecular Probes). Alternatively, intercalating dyes may also be used become.

(ii) TaqMan hybridization probes

Eine einzelsträngige Hybridsidisationssonde wird mit 2 Komponenten markiert. Bei Anregung der ersten Komponente mit Licht einer geeigneten Wellenlänge wird nach dem Prinzip des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers die absorbierte Energie auf die zweite Komponente, den sogenannten Quencher übertragen. Während des Annealing Schrittes der PCR Reaktion bindet die Hybridisationssonde an die Target-DNA und wird während der sich anschließenden Elongationsphase durch die 5'-3' Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase degradiert. Dadurch werden die angeregte Fluoreszenzkomponente und der Quencher räumlich voneinander getrennt, sodass eine Fluoreszenzemission der ersten Komponente in gemessen werden kann.A single-stranded hybrididization probe is labeled with 2 components. at Excitation of the first component with light of a suitable wavelength is after the Principle of fluorescence resonance energy transfer the absorbed energy to the second Component, the so-called quencher transfer. During the annealing step of the PCR reaction binds the hybridization probe to the target DNA and is detected during the subsequent elongation phase by the 5'-3 'exonuclease activity of the Taq polymerase demoted. This will cause the excited fluorescence component and the quencher spatially separated so that a fluorescence emission of the first component in can be measured.

(iii) Molecular Beacons

Diese Hybridisationssonden sind ebenfalls mit einem einer ersten Komponente und einem Quencher markiert, wobei sich die Markierungen vorzugsweise an den beiden Enden der Sonde befinden. In Lösung befinden sich beide Komponenten aufgrund der Sekundärstruktur der Sonde in räumlicher Nähe zueinander. Nach Hybridisierung an die Target-Nukleinsäure werden beide Komponenten von einander getrennt, sodass nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge die Fluoreszenzemission der ersten Komponente gemessen werden kann (Lizardi et al., US 5,118,801). These hybridization probes are also with a first component and a Quencher marks, with the markings preferably at the two ends of the Probe are located. In solution, both components are due to the secondary structure the probe in close proximity to each other. After hybridization to the target nucleic acid Both components are separated from each other, so that after excitation with light one appropriate wavelength the fluorescence emission of the first component can be measured can (Lizardi et al., US 5,118,801).

(iv) FRET hybridization probes

Für dieses Testformat werden 2 einzelsträngige Hybridisationssonden gleichzeitig verwendet, die komplementär zu benachbarten Stellen desselben Strangs der amplifizierten Target- Nukleinsäure sind. Beide Sonden sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzkomponenten markiert. Bei Anregung einer ersten Komponente überträgt diese nach dem Prinzip des Fluoreszenzresonanzenergietransfers die absorbierte Energie auf die zweite Komponente, sodass bei Bindung beider Hybridisationsproben an das Target-Molekül eine Fluoreszenzemission der zweiten Komponente gemessen werden kann (WO 97/46707).For this test format, 2 single-stranded hybridization probes are used simultaneously, complementary to adjacent sites of the same strand of the amplified target Nucleic acid are. Both probes are with different fluorescent components marked. When a first component is excited, it transmits according to the principle of Fluorescence resonance energy transfers the absorbed energy to the second component, so that upon binding of both hybridization probes to the target molecule one Fluorescence emission of the second component can be measured (WO 97/46707).

Dabei wird als sogenannte Donor-Komponente beispielsweise Fluorescein, mit Licht einer geeignetten Wellenlänge angeregt. Bei räumlicher Nähe zu einer geeigneten Akzeptorkomponente wie beispielsweise bestimmten Rhodamin-Derivaten erfolgt dann ein Resonanz-Energie-Transfer auf die Akzeptorkomponente, sodaß das Akzeptormolekül Licht einer bestimmten Emissionswellenlänge emittiert.In this case, as a so-called donor component, for example, fluorescein, with light geeignetten wavelength excited. In close proximity to a suitable Acceptor component such as certain rhodamine derivatives then takes place Resonance energy transfer to the acceptor component, so that the acceptor molecule light emitted at a certain emission wavelength.

Die Markierungen der Hybridisations-Sonden können nach Standardmethoden am 5' Ende, am 3' Ende oder auch intern erfolgen. Die zwei Oligonukleotid-Sonden können dabei bevorzugt an den gleichen Strang der Target-Nukleinsäure hybridisieren, wobei der eine Farbstoff sich vorzugsweise am 3'-terminalen Nukleotid der ersten Sonde befindet und der andere Farbstoff sich vorzugsweise am 5' terminalen Nukleotid der zweiten Sonde befindet, sodaß die Distanz zwischen beiden nur eine geringe Anzahl von Nukleotiden beträgt, wobei diese Anzahl zwischen 0 und 30 liegen kann. Bei Verwendung von Fluorescein in Kombination mit einem Rhodamin-Derivat wie beispielsweise LC-RED-640 oder LC-RED- 705 (Roche Molecular Biochemicals) haben sich Abstände von 0-15, insbesondere 1-5 Nukleotiden und in vielen Fällen von einem Nukleotid als vorteilhaft herausgestellt.The labels of the hybridization probes may be terminated by standard methods at the 5 'end, at the 3 'end or internally. The two oligonucleotide probes can thereby preferably hybridize to the same strand of the target nucleic acid, wherein the one Dye is preferably located at the 3'-terminal nucleotide of the first probe and the other dye is preferably located at the 5 'terminal nucleotide of the second probe, so that the distance between the two is only a small number of nucleotides, wherein this number can be between 0 and 30. When using fluorescein in Combination with a rhodamine derivative such as LC-RED-640 or LC-RED 705 (Roche Molecular Biochemicals) have distances of 0-15, especially 1-5 Nucleotides and in many cases of a nucleotide proved beneficial.

Unter Wahrung der Nukleotid-Abstände zwischen den Farbstoffkomponenten können auch Sonden verwendet werden, die nicht terminal, sondern intern mit einem der Farbstoffe konjugiert sind. Bei doppelsträngigen Target-Nukleinsäuren können auch Sonden eingesetzt werden, die an verschiedene Stränge des Targets binden, sofern ein bestimmter Nukleotidabstand von 0 bis 30 Nukleotiden zwischen den beiden Farbstoff-Komponenten eingehalten wird. (Bernard et al., Analytical Biochemistry 235, p. 1001-107 (1998)).While maintaining the nucleotide distances between the dye components can also Probes are used that are not terminal but internally with one of the dyes are conjugated. For double-stranded target nucleic acids, probes can also be used which bind to different strands of the target, provided that a certain Nucleotide distance from 0 to 30 nucleotides between the two dye components is complied with. (Bernard et al., Analytical Biochemistry 235, pp. 1001-107 (1998)).

Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz derartiger FRET-Paare zum Nachweis von Amplifikationsprodukten während oder nach einer Multiplex-Amplifikationsreaktion herausgestellt. Dies ermöglicht ein paralleles "Real-Time Monitoring" von PCR-Reaktionen, wobei Daten zur Generierung des Amplifikationsprodukts in Abhängigkeit von der Zahl der durchlaufenen Reaktionszyklen ermittelt werden können. Das geschieht in der Regel dadurch, daß aufgrund der Reaktions- und Temperaturbedingungen während des notwendigen Annealings der Amplifikationsprimer an die nachzuweisende Nukleinsäure auch die Oligonukleotide des FRET-Paares an die Target-Nukleinsäure hybridisieren und bei geeigneter Anregung ein entsprechend messbares Fluoreszenzsignal emittiert wird. Aufgrund der erhaltenen Daten kann somit die Menge der ursprünglich eingesetzten Target- Nukleinsäure quantitativ bestimmt werden.Particularly advantageous is the use of such FRET pairs for the detection of Amplification products during or after a multiplex amplification reaction exposed. This allows parallel "real-time monitoring" of PCR reactions, wherein data for generating the amplification product as a function of the number of durchgetrenen reaction cycles can be determined. This is usually done by that due to the reaction and temperature conditions during the necessary Annealing the amplification primer to the nucleic acid to be detected Also, the oligonucleotides of the FRET pair hybridize to the target nucleic acid and at appropriate excitation, a correspondingly measurable fluorescence signal is emitted. by virtue of The data obtained can thus be used to determine the amount of originally used target Nucleic acid can be determined quantitatively.

In einer anderen, bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion der Multiplex- Amplifikationsprodukte nach Beendigung der Amplifikationsreaktion, wobei nach Hybridisierung des FRET-Paares an die zu detektierende Target-Nukleinsäure die Temperatur im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse kontinuierlich erhöht wird. Gleichzeitig wird die in Abhängigkeit von der Temperatur emittierte Fluoreszenz gemessen und auf diese Weise eine Schmelztemperatur bestimmt, bei dem das eingesetzte FRET-Paar nicht mehr an die nachzuweisende Sequenz hybridisiert. Bei einem Auftreten von Mismatches zwischen dem eingesetzten FRET-Paar und dem Amplifikationsprodukt wird der Schmelzpunkt signifikant erniedrigt. Auf diese Weise können mit einem FRET-Paar verschiedene Target-Nukleinsäuren identifiziert werden, deren Sequenzen sich voneinander geringfügig durch eine oder wenige Punktmutationen unterscheiden, sodaß mit einer Schmelzpunktanalyse auch die Identität eines bestimmten generierten Amplifikationsproduktes bestätigt werden kann.In another preferred embodiment, the detection of the multiplex Amplification products after completion of the amplification reaction, wherein Hybridization of the FRET pair to the target nucleic acid to be detected Temperature is continuously increased during a melting curve analysis. simultaneously the fluorescence emitted as a function of the temperature is measured and recorded on this Melting temperature determined in which the used FRET pair no longer the sequence to be hybridized hybridizes. In the event of mismatches between the FRET pair and amplification product, the melting point becomes significant decreased. In this way, with a FRET pair different target nucleic acids be identified whose sequences are slightly different from each other by one or a few Distinguish point mutations, so that with a melting point analysis, the identity a particular generated amplification product can be confirmed.

Für den Nachweis von Candida und Aspergillus haben sich zwei als FRET-Paar zu verwendende Hybridisations-Sonden gemäß Seq. ID. No. 7 und 8 als geeignet erwiesen. Die erste Sonde mit einer Sequenz gem. Seq. Id. No. 7 wird erfindungsgemäß mit einem Fluoreszenzresanzenergie-Donor wie beispielsweise Fluorescein markiert. Die zweite Sonde wird mit einem Fluoreszenzresonanzenergieakzeptor wie besipielsweise LC-RED-640 oder LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals) markiert und besitzt eine Sequenz gem. Seq. Id. No. 8.For the detection of Candida and Aspergillus, two have as FRET pair too using hybridization probes according to Seq. ID. No. 7 and 8 proved to be suitable. The first probe with a sequence gem. Seq. Id. 7 is according to the invention with a Fluorescence resonance energy donor such as fluorescein labeled. The second probe is coupled with a fluorescence resonance energy acceptor such as LC-RED-640 or LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals) labeled and has a sequence gem. Seq. Id. 8th.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich auch Kits zur Durchführung der Erfindungs-gemäßen Verfahren. Dies Kits enthalten bevorzugt Primer mit Sequenzen gemäß Seq. ID. No. 1-4 oder Seq. ID No. 1-5 sowie optional weitere generische Reagenzien für die Amplifikation von Nukleinsäuren oder die Detektion von PCR-Amplifikationsprodukten. Besonders bevorzugt enthalten diese Kits auch erfindungsgemäße Hybridisations-Sonden, beispielsweise mit Seqeunzen gemäß Seq. Id. No. 6, 7 und 8. Als generische Reagenzien können diese Kits beispielsweise thermostabile DNA-Polymerasen, Desoxynucleotide und geeignete Puffersubstanzen enthalten.The present invention finally also kits for carrying out the Inventive method. These kits preferably contain primers with sequences according to Seq. ID. No. 1-4 or Seq. ID No. 1-5 and optionally further generic reagents for the Amplification of nucleic acids or the detection of PCR amplification products. With particular preference, these kits also contain hybridization probes according to the invention, for example, with Seqeunzen according to Seq. Id. 6, 7 and 8. As generic reagents can these kits include, for example, thermostable DNA polymerases, deoxynucleotides, and appropriate ones Contain buffer substances.

Wie bereits ausgeführt, ist zum Nachweis von Pilzen auf genomischer Ebene ein DNA-Isolierungsverfahren mit mehreren Schritten notwendig. Es hat sich gezeigt, daß im Laboralltag trotz strikter Anwendung von Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung bei der Probenprozessierung mit allen in Frage kommenden Verfahren immer wieder falsch positive Signale auftreten, weil aufgrund des ubiquitären Vorkommens von Pilzsporen, bzw. -DNA in der Umwelt und in den verwendeten Reagenzien, ein universelles Pilz-Nachweisverfahren für die Routinediagnostik nicht geeignet ist.As already stated, the detection of fungi is at the genomic level Multi-step DNA isolation procedure required. It has shown, that in the laboratory everyday life despite strict application of measures for Contamination prevention in the sample processing with all in question coming procedures repeatedly false positive signals occur because due the ubiquitous occurrence of fungal spores, or DNA in the environment and in the used reagents, a universal fungus detection method for the Routine diagnostics is not suitable.

Wegen dieser Problematik besteht die Erfindung aus einem im Spektrum reduzierten PCR-Nachweissystem, welches sich auf den Nachweis klinisch bedeutsamer Pilze beschränkt und frei von Kontaminationsproblemen ist. Bei der Suche nach geeigneten Oligonukleotiden im Bereich der 18S rRNA, die möglichst alle humanpathogen Pilze nachweisen, ergeben sich üblicherweise Probleme, sobald Oligonukleotide zur Ampifikation verwendet werden, die mehrere Pilzgenera im Spektum enthalten. Da die humanpathogenen Spezies des Genus Candida zum Teil phylogenetisch nur entfernt verwandt sind (es gibt keine Signatursequenz für den Genus Candida, die nicht auch andere Genera beinhaltet), treten bei der Amplifikation mit Oligonukleotiden, die alle Candida Spezies im Spektrum enthalten, immer Kontaminationen der Negativkontrollen auf. Erst die Reduktion des Spektrums der PCR auf die phylogenetisch mit C. albicans verwandten Spezies ergibt kontaminations-freie Negativkontrollen, beispielsweise bei einer Verwendung von Primern gem Seq. Id. No. 1 und 2. In dem Spektrum fehlen aber die beiden wichtigen Pathogene C. krusei und C. glabrata, die jedoch phylogenetisch nur relativ entfernt mit Candida albicans verwandt sind.Because of this problem, the invention consists of a reduced in the spectrum PCR detection system, which focuses on the detection of clinically important fungi limited and free from contamination problems. In the search for suitable oligonucleotides in the region of 18S rRNA, all possible Human pathogen fungi usually show problems as soon as possible Oligonucleotides are used for the amplification, the several fungal genera in the Spectrum included. As the human pathogenic species of the genus Candida partially phylogenetically only are distantly related (there is no signature sequence for the Genus Candida, which does not include other genera), occurs in the Amplification with oligonucleotides containing all Candida species in the spectrum Contain, always contaminations of the negative controls. Only the reduction of the spectrum of PCR on species phylogenetically related to C. albicans results in contamination-free negative controls, for example when used of primers according to Seq. Id. 1 and 2. The two are missing in the spectrum important pathogens C. krusei and C. glabrata, which, however, are phylogenetically relative only removed are related to Candida albicans.

Da innerhalb der 18S rRNA keine anderen Sequenzbereiche zur Ableitung von geeigneten Oligonukleotiden vorliegen, deren Spektrum diese beiden Spezies beinhaltet, müssen C. krusei und C. glabrata jeweils mit einer speziesspezifischen PCR amplifiziert werden. Erfindungsgemäß geschieht dies durch PCR Reaktionen mit Primern gemäß Seq. Id. Nr. 1 und 3 bzw. 1 und 4.Because within the 18S rRNA no other sequence ranges for the derivation of suitable oligonucleotides are present whose spectrum these two species includes, C. krusei and C. glabrata each with a species-specific PCR be amplified. According to the invention, this is done by PCR reactions with Primers according to Seq. Id. Nos. 1 and 3 or 1 and 4.

Das System mit dem breitesten Spektrum humanpathogener Pilze zum Nachweis von Candida oder Aspergiillus Infektionen, welches keine falsch positiven Ergebnisse durch Kontaminationen der Reagenzien mehr aufweist, besteht aus vier einzelnen Amplifikationsreaktionen, die als Forward Primer alle denselben universellen Primer gem. Seq. 1 verwenden. Neben den drei Reverse Primern mit Seq. Id. No. 2-4 wird für eine zusätzliche Amplifikationsreaktion ein Primer gem Seq. Id. No. 5 zum Nachweis von pathogenen Aspergillus Species eingesetzt. Diese vier Amplifikationsreaktionen sind wegen der Verwendung eines einzigen Forward Primers gem. Seq. Id. No. 1 leicht in einer Multiplex-PCR in einem Reaktionsgefäß zusammenzuführen.The system with the broadest spectrum of human pathogenic fungi for the detection of Candida or Aspergillus infections, which does not give false positive results due to contamination of the reagents more, consists of four individual Amplification reactions using as forward primer all the same universal primer gem. Seq. 1 use. In addition to the three reverse primers with Seq. Id. 2-4 will for an additional amplification reaction, a primer according Seq. Id. 5 to Detection of pathogenic Aspergillus species used. These four Amplification reactions are because of the use of a single forward Primers acc. Seq. Id. 1 easily in a multiplex PCR in a reaction vessel merge.

Da die Sensitivität einer Multiplex-PCR im ELISA-PCR Verfahren häufig mit der Anzahl der verwendeten Oligonukleotide abnimmt, wurde in einer besonderen Ausführungsform die Amplifikation in zwei in separaten Reaktionsgefäßen stattfindende PCR's geteilt:
Since the sensitivity of a multiplex PCR in the ELISA-PCR method often decreases with the number of oligonucleotides used, in a particular embodiment the amplification was divided into two PCR's taking place in separate reaction vessels:

A multiplex PCR comprises the genus Candida: with primers according to Seq. Id. 1-4 The reverse primer according to Seq. Id. 2, for the most part of the genus Candida is specific (C. albicans, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanathii u. a.) is mixed with the species-specific primers gemq. Id. 3 (C. glabrata), and 4 (C. krusei) combined (Fig. 1). With this multiplex PCR The most important human pathogenic Candida species can be amplified. False positive negative controls of the DNA preparation method occur in the Amplification with these oligonucleotides does not occur.
- The detection of Aspergillus fungi takes place in a separate reaction with PCR Primers according to Seq. Id. 1 and 5. With this PCR, you can all do sequenced (18S rDNA) human pathogenic Aspergillus species amplified (A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, and A. terreus, et al.).

Die Identifizierung positiver Proben erfolgt vorzugsweise über eine Hybridisierung beispielsweise im ELISA Format mit einer universellen Sonde gemäß Seq. Id. No. 6 oder im Real Time PCR Modus mit einem Paar Hybridisationssonden gem Seq. Id. No. 7 und 8. Je nach experimenteller Aufgabenstellung können für beide Verfahren erfindungsgemäß auch Aspergillus bzw Candida genusspezifische oder auch Spezies spezifische Oligonukleotide verwendet werden.The identification of positive samples preferably takes place via hybridization for example in ELISA format with a universal probe according to Seq. Id. 6 or im Real Time PCR mode with a pair of hybridization probes according to Seq. Id. 7 and 8. Je According to experimental task can for both methods according to the invention also Aspergillus or Candida genus-specific or species-specific oligonucleotides be used.

Die Sensitivität des Gesamtverfahrens kann mit Verdünnungsreihen von C. albicans ermittelt werden, deren Zellzahl mikroskopisch bestimmt wurde. Die Zellen werden dazu zu 10 ml Blut zugegeben und das gesamte Verfahren bestehend aus einer entsprechenden Probenvorbereitung sowie einer erfindungsgemäßen PCR wird durchgeführt.The sensitivity of the overall procedure can be assessed with serial dilutions of C. albicans be determined whose cell count was determined microscopically. The cells will be added to 10 ml of blood and the entire procedure consisting of a appropriate sample preparation and a PCR according to the invention is carried out.

Nach der Hybridisierung im PCR-ELISA Format ergibt sich üblicherweise eine Nachweisgrenze von ca. 3 Zellen pro 10 ml Blut. Die Nachweisgrenze im Lightcycler PCR Format mit FRET Hybridisierungssonden liegt üblicherweise bei 20 Zellen pro 10 ml Blut.After hybridization in the PCR-ELISA format usually results in a Detection limit of about 3 cells per 10 ml of blood. The detection limit in the Lightcycler PCR format with FRET hybridization probes is usually 20 cells per 10 ml of blood.

Examples example 1 Work-up of blood samples

Mit einem kliniküblichen Blutabnahmesystem wurden 5-10 ml peripheres Venenblut in mit dem Antikoagulans EDTA versetzte Röhrchen abgenommen. Blutproben, die als Positivkontrollen zur Untersuchung der Sensitivität des Nachweisverfahrens verwendet wurden, wurden eine mikroskopisch ausgezählte Anzahl von C. albicans Zellen zugegeben. Nach dem Transport in das Untersuchungslabor wurde das Blut in ein Zentrifugationsgefäße mit 50 ml Volumen umgefüllt und nach Zugabe von 30 ml einer 2%igen SDS Lösung 5 Sek. geschüttelt und 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. In diesem Schritt werden alle zellulären Bestandteile des Blutes mit Ausnahme der Pilzzellen lysiert. In einem anschließenden Zentrifugationsschritt (30 Min., 6000 × g, 15°C) wurden die Pilzzellen von den übrigen Bestandteilen des Blutes getrennt. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Pellet durch Resuspendieren in 1 ml Wasser aufgenommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit Schraubverschluß überführt. Nach Zentrifugation für 10 Min. bei 9.000 RPM (7150 × g) wurde der Überstand abgenommen, 1 ml Wasser zugegeben, erneut wie zuvor zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Im Pellet der Reaktionsgefäße sind alle Pilzzellen aus dem eingesetzten Blut in reiner Form konzentriert. Humane Nukleinsäure und andere Blutbestandteile, die die fogenden enzymatischen Reaktionen hemmen können, wurden durch die oben beschriebene Aufbereitung vollständig entfernt.With a clinically customary blood collection system, 5-10 ml of peripheral venous blood were in taken from the anticoagulant EDTA tubes. Blood samples as Positive controls were used to study the sensitivity of the detection method were added a microscopically counted number of C. albicans cells. After transport to the examination laboratory, the blood was transferred to a centrifugation vessel transferred to 50 ml volume and after addition of 30 ml of a 2% SDS solution for 5 sec. shaken and allowed to stand at room temperature for 10 min. In this step, all lysed cellular components of the blood except the fungal cells. In one subsequent centrifugation step (30 min, 6000 x g, 15 ° C) were fungal cells of separated from the remaining components of the blood. After pouring the supernatant was The pellet is resuspended in 1 ml of water and resuspended in a 1.5 ml Reaction vessel transferred with screw cap. After centrifugation for 10 min. At 9,000 RPM (7150 xg), the supernatant was removed, 1 ml of water added, again as previously centrifuged and the supernatant removed. In the pellet of the reaction vessels are all Fungal cells concentrated from the blood used in pure form. Human nucleic acid and other blood components that can inhibit the following enzymatic reactions, were completely removed by the preparation described above.

Example 2 Nucleic acid isolation from fungi

Auf das Pellet in den 1,5 ml Reaktionsgefäßen wurde 90 µl Wasser, 10 µl 10x Puffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 M EDTA; 10% Triton X-100), 1 µl Lyticaselösung (25.000 Units/ml) zugegeben und 45 Min. bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 15 µl 10% SDS Lösung enthaltend Lyticase (Sigma, Endkonzentration (25.000 U/ml) wurden die Proben für 45 Min. bei 65°C inkubiert und nach der Zugabe von 30 µl Glasbeads (100 µm Durchmesser), 2 µg Lachssperma DNA,
330 µl Wasser, 400 µl Phenol/Chloroform/iso-Amylalkohol (Volumenanteile 24/24/1) für 3 Min. in eine Hochfrequenzrüttler (Mickle Laboratory, Gomshall, UK) geschüttelt. Nach Zentrifugation für 10 Min. wurde die obere Phase abgenommen und nach Zugabe von 24 µl 3 M Natriumacetat und 50 µl iso-Propanol
in einem neuen Gefäße innerhalb von 2 Std. bei -20°C präzipitiert. Nach Zentrifugation für 20 Min. bei 15.000 rpm wurde der Überstand abgenommen und das Pellet mit 800 µl 70% Äthanol zweimal gewaschen (Äthanol zugeben, 1 × schwenken, 10 Min. bei 15.000 rpm zentrifugieren und Überstand abnehmen). Anschließend wurde die im Pellet isolierte Nukleinsäure in einer Speedvac Zentrifuge von den restlichen Äthanolspuren befreit und in 75 µl Wasser aufgenommen. Von dieser Nukleinsäurepräparation wurden je 15µ1 in die Aspergillus-spezifische PCR und die Candida-spezifische PCR geben.To the pellet in the 1.5 ml reaction vessels was added 90 μl of water, 10 μl of 10x buffer (0.5 M Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 M EDTA, 10% Triton X-100), 1 μl lyticase solution (25,000 units / ml) was added and incubated at 37 ° C for 45 min. After the addition of 15 μl of 10% SDS solution containing lyticase (Sigma, final concentration (25,000 U / ml)), the samples were incubated for 45 min at 65 ° C and after addition of 30 μl glass beads (100 μm diameter), 2 μg Salmon sperm DNA,
Shake 330 μl of water, 400 μl of phenol / chloroform / iso-amyl alcohol (24/24/1 by volume) in a high frequency shaker (Mickle Laboratory, Gomshall, UK) for 3 min. After centrifugation for 10 min, the upper phase was removed and after addition of 24 μl of 3 M sodium acetate and 50 μl of isopropanol
in a new vessel within 2 hours at -20 ° C precipitated. After centrifugation for 20 min at 15,000 rpm, the supernatant was removed and the pellet washed twice with 800 μl 70% ethanol (ethanol added, pivot 1 ×, centrifuge 10 min at 15,000 rpm and remove supernatant). Subsequently, the nucleic acid isolated in the pellet was freed from the remaining traces of ethanol in a Speedvac centrifuge and taken up in 75 μl of water. From this nucleic acid preparation were each 15μ1 in the Aspergillus-specific PCR and the Candida-specific PCR.

Example 3 Multiplex PCR and detection in ELISA format

Für eine erfindungsgemäße Multiplex-PCR imPCR-ELISA-Format wurde folgender Ansatz hergestellt: For a multiplex PCR according to the invention in PCR ELISA format, the following approach was used manufactured:

Approach for Candida Multiplex PCR

Primer gem. Seq. ID. Nr. 1-biotiniliert:Primer acc. Seq. ID. No. 1-biotinilated: 2,0 µl (12,5 µmol)2.0 μl (12.5 μmol) Primer gem. Seq. ID. Nr. 2Primer acc. Seq. ID. No. 2 0,5 µl (12,5 µmol)0.5 μl (12.5 μmol) Primer gem. Seq. ID. Nr. 3Primer acc. Seq. ID. No. 3 0,5 µl (12,5 µmol)0.5 μl (12.5 μmol) Primer gem. Seq. ID. Nr. 4Primer acc. Seq. ID. No. 4 0,5 µl (12,5 µmol)0.5 μl (12.5 μmol) Primer gem. Seq. ID. Nr. 5Primer acc. Seq. ID. No. 5 0,5 µl (12,5 µmol)0.5 μl (12.5 μmol) dNTP-MixdNTP mix 12 µl12 μl 10 × Puffer10 × buffer 7,5 µl7.5 μl TaqTaq 0,35 µl0.35 μl DNADNA 15 µl15 μl H₂OH ₂ O ad 75 µlad 75 μl

Die Amplifikation der DNA erfolgte über 40 Zyklen in einem Ericomp Thermocyder
The amplification of the DNA took place over 40 cycles in an Ericomp Thermocyder

Denaturierung:denaturation: 10 Sek. bei 96°C;10 sec. At 96 ° C; Annealing:annealing: 120 Sek. bei 54°C;120 sec. At 54 ° C; Extension:extension: 120 Sek. bei 72°C.120 sec. At 72 ° C.

Zur Hybridisierung wurde eine Sonde gem Seq. Id. No. 6 verwendet,. Die Hybridisierung mit den oben genannten Oligonukleotiden erfolgte unter Verwendung von Magnetpartikeln, die mit Digoxigenin markiert sind: Diese Dynabeads (Db) wurden entprechend den Angabewn des Herstellers (Dynal) eingesetzt. Die Bindung der amplifizierten DNA an die Beads erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers: Nach zweimaligen Waschen von 10 µl Db-Suspension mit "Bindungs und Waschpuffer" (BW-Puffer) wurden die Db in 50 µl BW-Puffer aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 10 µl PCR-Produkt zusammengegeben und 20 Min inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit BW-Puffer wurde 100 µl NaOH (0,1 M) zugeben, 10 Min. inkubiert und mit 100 µl TE-Puffer gewaschen. Die Hybridisierung erfolgte nach Zugabe von 6 pM des entsprechenden digoxigenierten Oligonukleotids in 50 µl Hybridisierungslösung über 50 Min. bei 47°C. Nichtgebundene Hybridisierungssonde wurde in drei Schritten mit 4 × SSC, 0,1% Tween 20 bei 52°C weggewaschen. Anschließend wurde 50 µl AK-Reagenz zugegeben, 30 Min. bei RT inkubiert, zweimal mit PBS, 0.05% Tween gewaschen und 50 µl Substratpuffer zugegeben. Nach 90 Min. wurde die Substratumsetzung anhand der Fluoreszenz in einem UV ELISA Reader bei 355 nm/460 nm (Anregung/Emission) gemessen. Proben die den Mittelwert der mitgeführten Negativkontrollen um mehr als die fünffache Standardabweichung der Negativkontrollen überschritten wurden als positiv gewertet. For hybridization, a probe according Seq. Id. 6 used ,. Hybridization with The above-mentioned oligonucleotides were made using magnetic particles which labeled with digoxigenin: These dynabeads (db) were made according to the information provided used by the manufacturer (Dynal). The binding of the amplified DNA to the beads was carried out according to the manufacturer's instructions: After washing twice with 10 μl of Db suspension with "binding and washing buffer" (BW buffer), the Db were dissolved in 50 μl BW buffer and combined in microtiter plates with 10 μl of PCR product and incubated for 20 min incubated. After washing once with BW buffer, 100 μl of NaOH (0.1 M) was added. Add, incubated for 10 min. And washed with 100 ul TE buffer. The hybridization took place after addition of 6 pM of the corresponding digoxigenierten oligonucleotide in 50 ul Hybridization solution over 50 min. At 47 ° C. Unbound hybridization probe was washed away in three steps with 4 x SSC, 0.1% Tween 20 at 52 ° C. Subsequently, 50 μl AK reagent added, incubated at RT for 30 min, twice with PBS, 0.05% Tween washed and 50 ul substrate buffer added. After 90 min, the substrate conversion was based on fluorescence in a UV ELISA reader at 355 nm / 460 nm (excitation / emission) measured. Samples that average the negative controls by more than Five times the standard deviation of the negative controls were exceeded as positive scored.

Folgende Lösungen wurden für dieses Protokoll eingesetzt:The following solutions were used for this protocol:

d-NTP mix for PCR

AL=L<2 × 950 µl H₂ AL = L <2 × 950 μl H ₂ OO 2 × 12,5 µl dATP2 x 12.5 μl of dATP 100 mM100 mM 2 × 12,5 µl dTTP2 x 12.5 μl dTTP 100 mM100 mM 2 × 12,5 µl dCTP2 x 12.5 μl dCTP 100 mM100 mM 2 × 12,5 µl dGTP2 x 12.5 μl dGTP 100 mM100 mM

10x PBS buffer

2 g KCl
2 g KH₂ 2 g KCl
2 g KH ₂

PO₄
PO ₄

80 g NaCl
21,6 g Na₂ 80 g NaCl
21.6 g Na ₂

HPO₄ HPO ₄

.7 H₂ .7 H ₂

O
add 10 l. H₂ O
add 10 l. H ₂

O.O.

TE buffer

Tris 10 mM, pH 7,5 bzw. 8,0
EDTA 1 mMTris 10mM, pH 7.5 and 8.0 respectively
EDTA 1mM

BW Buffer (Binding + Washing Buffer) according to Dynal protocol

5 mM Tris HCL pH 7,5
0,5 mM EDTA
1,0 M NaCL5 mM Tris HCL pH 7.5
0.5mM EDTA
1.0 M NaCl

20 × SSC

3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat-(2-hydrat)3M NaCl
0.3 M Na citrate (2-hydrate)

hybridization solution

5 × SSC,
5 × Denhardt's,
0,1% Tween 20,
100 µg/ml tRNA
6 µmol digoxigeniertes Oligonukleotid/50 µl Lösung 5 × SSC,
5 × Denhardt's,
0.1% Tween 20,
100 μg / ml tRNA
6 μmol digoxigenated oligonucleotide / 50 μl solution

Ak label (AK antiDIG reagent)

Ak 1 : 5000 (Boehringer 1093274) in 1% BSA in PBS verdünntAc 1: 5000 (Boehringer 1093274) diluted in 1% BSA in PBS

Substrate buffer

4-Methyl-Umbelliferylphosphat 40 mg/Liter (Sigma 3368-04-5 M 8883)
100 mM Tris-HCl, pH 9.6, 50 mM MgCl₂
4-methyl umbelliferyl phosphate 40 mg / liter (Sigma 3368-04-5 M 8883)
100mM Tris-HCl, pH 9.6, 50mM MgCl ₂

100 mM NaCl.100 mM NaCl.

Eine Vielzahl von Pilzspezies wurde auf diese Art und Weise untersucht.A variety of fungal species have been studied in this way.

Amplifikationsprodukte konnten jedoch nur bei solchen DNA Präparationen nachgewiesen werden, die DNA von pathogenen Pilzspezies der Gattungen Candida oder Aspergillus enthielt.However, amplification products could only be detected in such DNA preparations are the DNA of pathogenic fungal species of the genera Candida or Aspergillus contained.

Example 4 Real Time Multiplex PCR

Die Nukleinsäuren wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben isoliert. Es wurden jedoch nur 5-10 µl DNA in die PCR eingesetzt. Die Multiplex-PCR zum Nachweis von pathogenen Candida-Pilzen wurde im LightCycler System (Roche Molecular Biochemicals) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Der Nachweis des Amplifikationsproduktes erfolgte nach zwei unterschiedlichen Protokollen entweder Mithilfe von SybrGreen als doppelsträngige DNA bindendes Agens oder alternativ Mithilfe von FRET- Hybridisierungssonden. Sämtliche verwendeten Primer und Hybridisierungssonden waren HPLC-gereinigt und wurden in Stocklösungen von 100 pM/µl (Primer) bzw. 3 pM/µl (Sonden) aufbewahrt.The nucleic acids were isolated as described in Examples 1 and 2. There were however, only 5-10 μl of DNA was used in the PCR. The multiplex PCR for the detection of pathogenic candida fungi was used in the LightCycler system (Roche Molecular Biochemicals) carried out according to the manufacturer's instructions. The proof of Amplification product was carried out according to two different protocols either assistance SybrGreen as a double-stranded DNA-binding agent or alternatively using FRET Hybridization probes. All primers and hybridization probes used were HPLC-purified and were in stock solutions of 100 pM / μl (primer) and 3 pM / μl (Probes) kept.

Verification with SvbrGreen

2,0 µl FastStart Buffer DNA-Master SYBR Green (Roche MolecularBiochemicals, enthaltend Puffer, hitzeaktivierbare Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl₂ 2.0 μl FastStart Buffer DNA master SYBR Green (Roche Molecular Biochemicals containing buffer, heat-activated Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl ₂

und SYBR Green I Farbstoff)
10 pM je eingesetztem Primer gemäß Seq Id No 1, 2, 3 und 4
3,2 µl 25 mM MgCl₂ and SYBR Green I dye)
10 pM per primer used according to Seq Id No 1, 2, 3 and 4
3.2 μl of 25 mM MgCl ₂

(Arbeitskonzentration 5 mM)
5 µl Proben-DNA
20 µl Gesamtansatz (Working concentration 5 mM)
5 μl of sample DNA
20 μl total batch

Detection with hybridization probes

Die zur Detektion eingesetzten Hybridisierungssonden wurden nach Standardprotokollen markiert. Zum Nachweis von positiven Proben wurde ein Oligonukleotid gemäß Seq. Id. No. 7 mit Fluorescein am 3' Ende markiert und ein Oligonukleotid gemäß Seq. Id. No. 8 am 5' Ende mit LcRed 640 markiert.
2,0 µl FastStart DNA-Master for Hybridization Probes (Roche Molecular Biochemicals, enthaltend Puffer, hitzeaktivierbare Taq Polymerase, dNTPs. and MgCl₂)
5 pM je eingesetztem Primer gemäß Seq Id. No. 1-5
2 pM je eingesetzter Hybridisierungssonde gemäß Seq Id No 7 und 8
3,2 µl 25 mM MgCl₂ (Endkonzentration 5 mM)
5 µl Proben-DNA
20 µl GesamtansatzThe hybridization probes used for detection were labeled according to standard protocols. For the detection of positive samples, an oligonucleotide according to Seq. Id. 7 labeled with fluorescein at the 3 'end and an oligonucleotide according to Seq. Id. 8 at the 5 'end marked LcRed 640.
2.0 μl FastStart DNA Master for Hybridization Probes (Roche Molecular Biochemicals, containing buffer, heat-activated Taq polymerase, dNTPs., And MgCl ₂ )
5 pM per primer used according to Seq Id. 1-5
2 pM per hybridization probe used according to Seq Id No 7 and 8
3.2 μl 25 mM MgCl ₂ (final concentration 5 mM)
5 μl of sample DNA
20 μl total batch

Beide Arten von Ansätzen wurden mit dem folgenden PCR-Programm gefahren und mit einer Schmelzkurve abgeschlossen.Both types of approaches were run with the following PCR program and with completed a melting curve.

Die Temperaturzyklen des PCR Programms waren:
95°C 600 sec vor dem ersten Zyklus
95°C 10 sec
50°C 10 sec
72°C 30 sec jeweils für 55 ZyklenThe temperature cycles of the PCR program were:
95 ° C 600 sec before the first cycle
95 ° C 10 sec
50 ° C 10 sec
72 ° C 30 sec each for 55 cycles

Die Schmelzkurven wurden nach vorheriger kurzzeitiger Denaturierung bei 95°C in einem Intervall von 65°C bis 95°C in 0,2°C-Schritten mit kontinuierlicher Fluoreszenzmessung auf Kanal 1 (SYBR Green), Kanal 2 (LC-Red 640) oder Kanal 3 (LC-Red 705) mithilfe der LightCycler Software 3.0 erstellt.The melting curves were after previous brief denaturation at 95 ° C in a Interval from 65 ° C to 95 ° C in 0.2 ° C increments with continuous fluorescence measurement Channel 1 (SYBR Green), Channel 2 (LC-Red 640) or Channel 3 (LC-Red 705) using the LightCycler Software 3.0 created.

Im FRET-Hybridisierungssonden-Format wurde die Sensitivität mit 10 ml Blutproben, denen mikroskopisch ausgezählte C. albicans Zellen zugegeben wurde, überprüft. Als Sensitivitätsgrenze ergaben sich 20 Zellen pro 10 ml Blut. Für diese Amplifikation wurden nur 5 µl der DNA (Gesamtvolumen nach Aufreinigung 75 µl) eingesetzt. Entsprechende Experimente mit 200 und 2000 Zellen pro 10 ml Blut ergaben deutlich höhere Hybridisierungssignale. Die Schmelztemperatur lag im FRET Modus bei 63°C.In the FRET hybridization probe format, the sensitivity was measured with 10 ml of blood samples containing microscopically counted C. albicans cells were added. When Sensitivity limit was 20 cells per 10 ml of blood. For this amplification were only 5 μl of the DNA (total volume after purification 75 μl) was used. Appropriate Experiments with 200 and 2000 cells per 10 ml of blood yielded significantly higher Hybridization signals. The melting temperature was 63 ° C in the FRET mode.

DNA aus einer Vielzahl von verschiedenen Pilzuspezies wurde auf diese Art Analysiert. Dabei koonten jedoch sowohl im SybrGreen Modus als auch im FRET/Hybprobe Modus nur Amplifikationen bei Proben nachgewiesen werden, die humanpathogene Pilze der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus oder A. candidus enthielten. DNA from a variety of different fungus species was analyzed in this way. there However, in both the SybrGreen mode and the FRET / Hybprobe mode, they only did Amplifications are detected on samples containing human pathogenic fungi of species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. so-called, A. tamarii A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus or A. candidus.

SEQUENZPROTOKOLL SEQUENCE LISTING

Claims

1. multiplex amplification reaction for the detection of clinically relevant fungal infections of the genera Candida and Aspergillus, in which the target is amplified a region of the 18s RNA gene of the pathogen, characterized in that exclusively sequences of pathogenic Candida or Aspergillus species are amplified.

2. Multiplex amplification reaction for detection of clinically relevant Fungal infections of the genera Candida and Aspergillus, when targeted as a region of the 18s RNA gene of the pathogen is amplified, characterized in that Sequences of the Candida and Aspergillus Species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. so-called, A. tamarii A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus and A. candidus. be amplified.

3. multiplex amplification reaction for detection of clinically relevant Fungal infections of the genus Candida, in which as target a region of the 18s RNA gene of the pathogen is amplified, characterized in that sequences of Candida Species C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata and C. crusei. be amplified.

4. The method according to claim 1-3, characterized in that exactly one upstream primer is used whose sequence is identical to one Sequence of the 18s RNA gene is identical in all species to be detected.

5. primers with a length of 13-25 nucleotides, whose sequence is a continuous Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 1 represents.

6. primers with a length of 13-25 nucleotides, whose sequence is a continuous Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 2 represents.

7. primers with a length of 13-25 nucleotides, whose sequence is a continuous Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 3 represents.

8. Primers of 13-25 nucleotides in length, whose sequence is continuous Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 4 represents.

9. Primer with a length of 13-25 nucleotides, whose sequence is a continuous Partial sequence of a sequence according to Seq. ID. No. 5 represents.

10. The method according to claim 4, characterized in that one, several or all primers according to claims 4-8 are used.

11. The method according to claim 1-4 or 10, characterized in that the product of the amplification reaction additionally detected by hybridization becomes.

12. The method according to claim 11, characterized in that the hybridization probes used are identical or complementary to one Partial sequence of all 18s RNA sequences are those during the amplification reaction were increased.

13. Probe with a length of 20 to 100 and preferably 25-35 nucleotides, which is a continuous sequence according to Seq. ID. No. 6 contains.

14. The method according to claim 12, characterized in that a probe according to claim 13 is used.

15. The method according to claim 1-4, 10-12 or 14, characterized in that the amplification product is detected by fluorescence detection.

16. The method according to claim 15, characterized in that the amplification product using fluorescence resonance energy transfer is detected.

17. The method according to claim 16, characterized in that hybridization probes according to Seq. ID. No. 7 and 8 are used.

18. Kit containing primers with sequences according to Seq. ID. No. 1-4 or Seq. ID No. 1-5.

19. Kit according to claim 18, containing hybridization probes.