KR100560996B1

KR100560996B1 - A DNA marker for detection of Phytophthora capsici in red pepper

Info

Publication number: KR100560996B1
Application number: KR1020040053293A
Authority: KR
Inventors: 김홍기; 송정영; 남문; 유성준; 남명현
Original assignee: 충남대학교산학협력단
Priority date: 2004-07-09
Filing date: 2004-07-09
Publication date: 2006-03-17
Also published as: KR20060004246A

Abstract

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 증폭된 DNA 단편 및 이를 프로브(probe)로 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이의 작물체내 및 재배 토양내 존재여부를 특이적으로 신속 정확하게 분석할 수 있는 방법과 그 키트에 관한 것이다.The present invention is an oligonucleotide capable of specifically amplifying DNA of a P. phytophthora capsici strain using a polymerase chain reaction (PCR), and these oligonucleotides as primer pairs. By using the amplified DNA fragments and the probe (probe) to the method and the kit that can be specifically and quickly and accurately analyze the presence in the crop body and cultivated soil between the causative bacterium Pytopesora capsi.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 균주, DNA, 중합효소연쇄반응, 프라이머, 프로브Capillary strain of red pepper bacterium phytopobora, DNA, polymerase chain reaction, primer, probe

Description

DNA marker for detection of Phytophthora capsici in red pepper

도 1은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici)의 게놈 DNA 라이브러리(genomic DNA library)로부터 선발된 종특이적 DNA 단편의 염기서열과 파이토프쏘라 캡시사이의 특이적 검출을 위해 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머 CSP-1과 CSP-2 의 위치를 나타낸다.1 shows oligos used for specific detection between nucleotide sequences of species-specific DNA fragments selected from the genomic DNA library of Phytophthora capsici and Phytophthora capsici . The positions of the nucleotide primers CSP-1 and CSP-2 are shown.

도 2는 서열목록 1의 클론 PC22를 프로브(probe)로 11종의 다른 파이토프쏘라속 균들의 genomic DNA와 서던 하이브리다이제이션 교잡(Southern hybridization)시의 반응결과이다.FIG. 2 shows the results of reactions of genomic DNA and Southern hybridization of 11 different phytoplasma strains using the clone PC22 of SEQ ID NO: 1 as a probe.

도 3의 윗 그림은 표2에 기재된 파이토프쏘라 종으로부터 분리된 DNA를 주형 DNA로 하고, CSP-1 및 CSP-2 프라이머쌍으로 PCR한 결과이고, 아래 그림은 증폭된 단편을 프로브로 하여 위에서 사용된 DNA에 대하여 서던 블롯한 결과이다.3 shows the results of PCR using CSP-1 and CSP-2 primer pairs as a template DNA using DNA isolated from the Pytopsora species described in Table 2 below. Southern blot for the DNA used.

도 4는 주형DNA의 양을 달리하였을 때, 본 발명의 검색방법의 민감도를 테스트한 결과로, 프라이머를 이용한 주형DNA의 양에 따른 프라이머의 민감도를 검토한 것이다.Figure 4 shows the sensitivity of the primer according to the amount of template DNA using the primer as a result of testing the sensitivity of the search method of the present invention when the amount of the template DNA is different.

도 5는 파이토프쏘라 캡시사이로부터 분리된 DNA를 유사종의 파이토프쏘라로부터 분리된 DNA와 혼합한 후 이들에 대하여 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하 여 증폭시킨 결과이다.5 is The DNA isolated from the phytotoplascapa capsai was mixed with the DNA isolated from the phytotoplasa of the similar species, and then amplified using CSP-1 and CSP-2 as a primer pair.

도 6은 고추조직으로부터 분리된 DNA의 농도를 달리하여 파이토프쏘라 캡시사이로부터 분리된 DNA와 혼합한 후 이들에 대하여 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.6 is The concentration of DNA isolated from pepper tissue was mixed with the DNA isolated from phytoplasma capsisai and amplified using CSP-1 and CSP-2 as primer pairs.

도 7은 고추 역병에 감염된 식물조직으로부터 DNA를 분리하고 CSP-1 및 CSP-2를 프라이머쌍으로 하여 증폭시킨 결과이다.7 is a result of amplifying the DNA from the plant tissue infected with pepper blight and using CSP-1 and CSP-2 as primer pairs.

본 발명은 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 이용하여 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 이들 올리고뉴클레오티드를 프라이머쌍으로 하여 증폭된 DNA 단편 및 이를 프로브(probe)로 재배 포장내 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이의 존재여부를 검출할 수 있는 방법과 그 키트에 관한 것이다.The present invention is an oligonucleotide capable of specifically amplifying DNA of a P. phytophthora capsici strain using a polymerase chain reaction (PCR), and these oligonucleotides as primer pairs. The present invention relates to a method and a kit for detecting the presence of amplified DNA fragments and the presence of Pyrophyll spp.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이는 세계적으로 널리 분포하여 경제적으로 막대한 피해를 일으키는 중요한 병원균으로 국내에서는 거의 모든 고추 재배지역에 전국적으로 분포하며 가지, 토마토, 수박, 오이, 참외, 호박 등 다양한 작물에 병을 일으킨다. 이처럼 다수의 작물에 피해를 주는 파이토프쏘라 캡시사이는 형태적으로 매우 다양하며 유전적으로도 많은 다양성을 나타내 정확한 균동정에 어려움을 주고 있다. The cayenne pepper bacterium phytopobora capsisai is an important pathogen that is widely distributed in the world and causes enormous economic damage.It is widely distributed in almost all pepper growing regions in Korea, and is widely used in various crops such as eggplant, tomatoes, watermelon, cucumber, Cause illness. Pytopsora capsisai, which damages a large number of crops, is very diverse in shape and genetically diverse, which makes it difficult to accurately identify the species.

파이토프쏘라 캡시사이를 포함하는 파이토프쏘라(Phytophthora)속 균의 분류는 형태적 특성과 생리적 특성 및 유·무성 번식기관의 생성방법과 형태를 기준으로 총 67 종으로 분류되며 국내에는 20여종의 발생이 보고 되어 있다. 하지만 이들의 유주자낭의 형태나 형성방법 등은 여러 가지 환경조건에 민감하여 매우 가변적이며 유성생식 기관의 모양이나 형성방법도 균주와 배양조건에 따라 다소 다르게 나타나므로 형태적인 특징만으로 종을 분류하는 것은 많은 시간을 요하며 또한 전문성을 필요로 한다. Phytophthora genus, including phytophthora capsiciaceae, is classified into 67 species based on morphological characteristics, physiological characteristics, and the method and form of sexual and asexual breeding organs. An occurrence is reported. However, their shape and formation method are very variable because they are sensitive to various environmental conditions, and the shape and formation method of sexual reproductive organs appear somewhat different depending on strains and culture conditions. It takes time and also requires expertise.

1980년대부터 분자생물학을 이용한 다양한 방법의 균분류 동정법이 등장하였는데 최근에는 게놈에 존재하는 종특이적 서열을 이용하여 좀 더 신속하고 정확하게 종을 동정할 수 있는 PCR (Polymerase Chain Reaction)법을 많이 이용하고 있다. 최근 형태적 유사종인 P. infestans에 대하여 PCR을 사용하여 특이적으로 검출하고 정량하는 방법이 알려졌지만 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici)에 있어서는 연구결과가 보고된 바 없다. 한편 ribosomal RNA의 전사영역내 ITS DNA 영역을 바탕으로 파이토프쏘라 캡시사이 검출용 primer가 제작되었으나 이 균에만 특이적으로 작용하지 못하고 다른 유사한 병원균들의 DNA와도 반응을 나타내는 문제점이 지적되었으며, 현재 파이토프쏘라 캡시사이 균주에만 특이적으로 반응하는 프라이머들은 국내외에서 개발되지 않은 실정이다.Since the 1980s, a variety of methods for identifying and identifying species using molecular biology have emerged. Recently, many PCR (Polymerase Chain Reaction) methods can be used to identify species faster and more accurately using species-specific sequences in the genome. I use it. Recently, a method of specifically detecting and quantifying P. infestans , which are morphologically similar species, has been known. However, the results of P. capsici have not been reported in P. capsici . On the other hand, primers for the detection of phytophosphorus capcici were produced based on the ITS DNA region in the transcription region of ribosomal RNA. However, it has been pointed out that it does not act specifically on the bacteria and reacts with the DNA of other similar pathogens. Primers that specifically react to the Sola capsaisai strain have not been developed at home and abroad.

파이토프쏘라 캡시사이는 한번 발병하면 단시간내에 급속도로 확산되어 전체 고추재배포장에 막대하게 피해를 주기 때문에 조기 진단이 필수적인데 효과적인 병 방제를 위해서는 병발생 초기에 병원균의 유무를 정확히 진단하는 것이 매우 중요하다. 따라서 이러한 종특이적인 PCR 프라이머의 개발은 빠른 시간에 파이토프쏘라 캡시사이를 손쉽게 동정하고 검출하는 것을 가능하게 하여 고추재배에 있어서 예방 및 치료에 큰 효과가 있을 것이다.Early onset of phytosov capassia rapidly spreads within a short time of onset and causes massive damage to the whole pepper cultivation package. Early diagnosis is essential for effective disease control. Do. Therefore, the development of such species-specific PCR primers will make it possible to easily identify and detect the phytopeora capsaisai in a short time, which will have a great effect in the prevention and treatment of pepper cultivation.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하고자, 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 DNA 만을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 균주의 DNA에만 특이적으로 혼성화되는 DNA 프로브를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 프라이머 또는 프로브를 이용하여 이병식물체로부터 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이 균주를 신속하고 정확하게 검출 및 동정하는 방법과 그에 사용되는 키트를 제공하는 것이다.
The present invention to solve the above problems, it is to provide a primer that can specifically amplify the DNA of the pepper bacterium Phytophthora capsici strain ( Phytophthora capsici ). Another object of the present invention is to provide a DNA probe that specifically hybridizes only to DNA of the P. capsici strain of the bacterium bacterium. Still another object of the present invention is to provide a method for rapidly and accurately detecting and identifying a red pepper bacterium Pytopesora capsidsai strain from a diseased plant using the primer or probe and a kit used therein.

본 발명은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 균주의 게놈 DNA(genomic DNA) 서열정보를 이용하여 파이토프쏘라 캡시사이 균주의 DNA에 특이적으로 작용하는 프라이머를 선발하고 증폭된 단편을 프로브로 하여 파이토프쏘라 캡시사이 균주를 효과적으로 탐지 또는 동정방법 및 그에 사용될 수 있는 키트에 관한 것이다.The present invention uses the genomic DNA sequence information of the phytophthora capsici strain of the causative bacterium bacterium Phytophthora capsici to select a primer that specifically acts on the DNA of the phytophthora capsici strain and amplifies the fragment. The present invention relates to a method for effectively detecting or identifying a phytophosphorus capsaisai strain as a probe, and a kit that can be used.

고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 진단용 프라이머 제작은 다음과 같이 한다.The production of P. capsici diagnosing primer for the bacteriophage bacterium P. capsici is as follows.

파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 게놈 DNA 단편의 분리Isolation of Specific Genomic DNA Fragments Between Pytopsora Capsai

파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 게놈 DNA 단편을 분리하고자, 먼저 국내 고추재배포장으로부터 파이토프쏘라 캡시사이의 균주 95CY3119 를 분리하고 그로부터 genomic DNA 라이브러리를 구축하였다. 라이브러리에 삽입된 다양한 단편을 이용하여 11종의 파이토프쏘라 속 균주의 DNA에 대하여 서던 하이브리다이제이션을 행하였다. 그 결과 2.4kb의 단편이 파이토프쏘라 캡시사이에만 특이적으로 결합하는 영역을 포함하는 것을 확인하였다(도면2). 이 단편의 염기서열을 결정한 결과가 도면1 및 서열목록1에 나타나 있다.In order to isolate genomic DNA fragments specific for phytophthora capsaixi, first, strain 95CY3119 of phytophora capsaisai was isolated from the domestic pepper cultivation package and genomic DNA library was constructed therefrom. Southern hybridization was performed on the DNA of 11 strains of the genus Phytopesora using various fragments inserted into the library. As a result, it was confirmed that the 2.4 kb fragment contained a region that specifically binds only between the phytoplasma capsi (Fig. 2). The result of determining the nucleotide sequence of this fragment is shown in Figure 1 and SEQ ID NO: 1.

파이토프쏘라 캡시사이 동정에 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머 선별Selection of Probes and Primers That Can Be Used to Identify Phytotoff Capsaisai

위에서 얻은 2.4Kb의 단편으로부터 파이토프쏘라 캡시사이에 특이적인 단편을 더욱 세밀하게 분리하고자 서열목록1의 서열을 바탕으로 진리너 프로그램을 이용하여 프라이머를 설계하였다. 그 결과 프라이머쌍 CSP-1(염기목록의 서열번호 2): 5′- GACTGTACCAAAGCCCTGA - 3′와 CSP-2(염기목록의 서열번호 3): 5′- TTCATTCAGGACTTACCCG - 3′이 적절한 프라이머로 선택되었다.Primers were designed using the Truthner program based on the sequence of SEQ ID NO: 1 to further isolate the specific fragments between the phytophosphorus capsi from the 2.4Kb fragments obtained above. As a result, primer pairs CSP-1 (SEQ ID NO: 2): 5'- GACTGTACCAAAGCCCTGA-3 'and CSP-2 (SEQ ID NO: 3): 5'-TTCATTCAGGACTTACCCG-3 'were selected as appropriate primers.

CSP-1, CSP-2 프라이머쌍을 이용한 PCR 반응PCR reaction using CSP-1 and CSP-2 primer pairs

표 1, 표 2에서 제시한 수종의 곰팡이들의 게놈 DNA를 추출한 후 선발한 CSP-1과 CSP-2를 이용하여 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA를 사용한 경우에만 350bp의 단편이 증폭되는 것이 관찰되었고 이 단편을 프로브로 하여 서던 하이브리다이제이션하였을 때에도 역시 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA에 대해서만 양성반응을 나타내었다. 이러한 결과는 CSP-1과 CSP-2 프라이머쌍을 이용하거나 또는 이에 의해 증폭되는 단편을 프로브로 사용함으로써 파이토프쏘라 캡시사이의 존재를 동정해낼 수 있음을 구체적으로 뒷받침한다. 이하 실시예에서 구체적으로 설명한다.After extracting genomic DNA of several fungi shown in Table 1 and Table 2, PCR amplification was performed using selected CSP-1 and CSP-2. As a result, it was observed that 350bp fragment was amplified only when the DNA between the phytophora capsaicin was used. When the hybridization was performed using the fragment as a probe, only the DNA between the phytophora capsaicin was also positive. These results specifically support the use of CSP-1 and CSP-2 primer pairs or the fragments amplified by them as probes to identify the presence of the phytophosphorus capcilis. In the following Examples will be described in detail.

[표 1] 본 발명에 사용된 고추역병으로부터 얻어진 파이토프쏘라 캡 시사이 균주TABLE 1 Phytopopesora cap shisai strain obtained from red pepper blight used in the present invention

[표 2] 본 연구에서 사용된 파이토프쏘라 종 및 기타 균주Table 2 Phytopovsora Species and Other Strains Used in the Study

실시예 1 : 파이토프쏘라속 곰팡이 및 기타 식물병원균 DNA에 대한 CSP-1 및 CSP-2 프라이머쌍의 특이성 확인 시험Example 1 Test for Confirmation of Specificity of CSP-1 and CSP-2 Primer Pairs against Phytotoplas fungus and Other Phytopathogenic DNA

CSP-1: 5′- GACTGTACCAAAGCCCTGA - 3′와 CSP-2: 5′- TTCATTCAGGACTTACCCG - 3′를 프라이머쌍으로 이용하여 표 1 및 표2에 제시된 수 종의 곰팡이 분리균주에 대하여 다음과 같은 방법으로 DNA를 분리하였다. 동결건조된 균사체 소량을 파쇄한 뒤 400㎕의 extraction buffer [200mM Tris-HCl (pH8.0), 200mM NaCl, 30mM EDTA, 0.5% SDS]에 현탁하고 proteinase K 50㎍을 첨가, 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 여기에 400㎕의 2× CTAB solution을 첨가하여 섞은 뒤, chloroform : isoamyalcohol (24:1)로 추출하고 원심분리하여 얻은 상등액에 0.7 volume의 isopropanol을 첨가하여 DNA를 얻었다. TE buffer에 DNA를 녹이고 RNase를 첨가한 뒤 정량하여 4℃에 보관하였다. PCR을 행하기 위한 조건은 다음과 같다. 즉, preheating을 95℃에서 4분 한 후 95℃ 1분, 60℃ 7분, 72℃ 2분에서 각각 38회 반복하고 이후 72℃에서 8분 동안의 반응을 수행하였다. 반응산물은 total volume을 50㎕로 하고 template DNA 10ng, 각각 primer set 20pmole, 250μM dNTPs, 10× PCR buffer 5㎕, 2mM MgCl2, FastStart Taq DNA Polymerase 2unit (Promega Co.)을 첨가하였다. 그 결과는 다음 도 3에 나타낸 바와 같이, 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici) 균주를 사용한 1 레인의 경우만 350bp의 밴드가 증폭되었으며 그 외 다른 파이토프쏘라 종(Phytophthora sp.), 후자리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)이나 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 등의 다른 진균성 식물병원균들에서는 증폭된 DNA 밴드를 검출할 수 없었다. 또한 증폭된 DNA단편을 프로브로 하여 서던 블롯을 수행한 실험에서도 파이토프쏘라 캡시사이를 사용한 샘플에서만 혼성화반응을 나타냈다. 이러한 사실로부터 증폭된 단편이 실제로 파이토프쏘라 캡시사이에만 특이적으로 존재하는 서열이라는 것을 더욱 구체적으로 확인할 수 있다 (도 3 아래).DNA of the fungal isolates shown in Tables 1 and 2 using CSP-1: 5′- GACTGTACCAAAGCCCTGA-3 ′ and CSP-2: 5′- TTCATTCAGGACTTACCCG-3 ′ as primer pairs Was separated. A small amount of lyophilized mycelium was crushed and suspended in 400 μl of extraction buffer [200 mM Tris-HCl (pH8.0), 200 mM NaCl, 30 mM EDTA, 0.5% SDS] and 50 μg proteinase K was added at 37 ° C. for 1 hour. Reacted for a while. 400 μl of 2 × CTAB solution was added to the mixture, and the mixture was extracted with chloroform: isoamyalcohol (24: 1) and centrifuged to give a DNA obtained by adding 0.7 volume of isopropanol. DNA was dissolved in TE buffer, RNase was added, quantified and stored at 4 ° C. The conditions for performing PCR are as follows. That is, the preheating was performed for 4 minutes at 95 ° C., and then repeated 38 times at 95 ° C. for 1 minute, 60 ° C. for 7 minutes, and 72 ° C. for 2 minutes, and then the reaction was performed at 72 ° C. for 8 minutes. The reaction product was 50 μl of total volume, template DNA 10ng, primer set 20pmole, 250μM dNTPs, 10 × PCR buffer 5μl, 2mM MgCl 2, FastStart Taq DNA Polymerase 2unit (Promega Co.) was added. As a result, as shown in Figure 3, the 350bp band was amplified only in lane 1 using the P. capsici strain, and other phytophthora sp. Amplified DNA bands could not be detected in other fungal phytopathogens , such as Fusarium oxysporum and Rhizoctonia solani . In addition, the experiments in Southern blot using the amplified DNA fragment as a probe showed hybridization only in the sample using the phytoplasma capsaic. From this fact it can be more specifically confirmed that the amplified fragment is actually a sequence that exists only specifically between the phytophorascapsi (see Figure 3).

실시예 2: CSP-1과 CSP-2 프라이머의 민감도 시험Example 2: Sensitivity Test of CSP-1 and CSP-2 Primers

DNA 샘플양에 따른 PCR에 의한 CSP-1과 CSP-2 프라이머쌍의 증폭 민감성 정도를 측정하였다. 본 발명에 따른 파이토프쏘라 캡시사이(P. capsici)의 게놈 DNA 양을 최고 10ng에서 최저 1fg까지 조절한 다음, 여기에 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 연속적으로 반응시켜 확인하였으며, 그 결과는 다음 도 4에 나타내었다. 그 결과, 상기 프라이머쌍을 이용하였을 때 11 레인까지 증폭산물이 나타난 것으로 미루어 최저 검출 수준은 100fg이었음을 알 수 있었다.The amplification sensitivity of CSP-1 and CSP-2 primer pairs by PCR according to the amount of DNA samples was measured. After adjusting the amount of genomic DNA of P. capsici according to the present invention from up to 10 ng to 1 fg, it was confirmed by continuously reacting the CSP-1 and CSP-2 primers. Next, it is shown in FIG. As a result, when the primer pair was used, the amplification products appeared up to lane 11, indicating that the lowest detection level was 100 fg.

또한 Genomic DNA를 농도별로 희석하여 증폭한 PCR 생성물에 대해 서열목록1의 2.4kb 단편인 PC22 를 프로브로하여 혼성화시킨 결과도 마찬가지로 농도별로 밴드의 강도(intensity)에 차이가 있었다(도 4). 또한 농도가 높은 쪽은 밴드가 굵고 진하게 나타났으며, 농도가 낮아질수록 밴드도 엷어졌다. 특히 이 방법에서는 50fg까지 검출이 가능하였다. In addition, the hybridization of the PCR product amplified by diluting the genomic DNA by the concentration of the 2.4kb fragment PC22 of the probe with the probe was also similar in the intensity (intensity) of the band by concentration (Fig. 4). Also, the higher the concentration, the thicker and darker the band. The lower the concentration, the thinner the band. In particular, this method was able to detect up to 50fg.

대략적으로 병원균 포자1개의 DNA 농도가 100-500fg 사이로 알려져 있으므로 CSP1 및 CSP2를 프라이머쌍으로 사용한다면 파이토프쏘라 캡시사이에 의한 감염여부를 충분히 확인할 수 있을 것이다.The DNA concentration of one pathogen spore is known to be between 100 and 500 fg. Therefore, if CSP1 and CSP2 are used as primer pairs, the infection may be sufficiently confirmed by Pytopsora capsaixi.

실시예 3: 유사종의 파이토프쏘라 DNA 혼합액으로부터 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 의 특이적 검출 Example 3: Specific Detection of Phytophthora capsici from Phytophthora DNA Mixtures of Similar Species

고추역병균(파이토프쏘라 캡시사이)과 형태적으로 유사한 P. parasitica, P. palmivora, P. boehmeriae, P. citrophthora, P. infestans로부터 DNA를 얻고, 이들을 P. capsici의 DNA와 같은 비율로 혼합한 후 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 이용해 위와 동일한 방법으로 PCR 증폭을 실시하였다. 그 결과 P. capsici가 들어있는 샘플에서만 350bp의 PCR 산물이 증폭되는 것을 확인할 수 있었다. 이 결과는 본 발명 의 프라이머를 사용함으로써 파이토프쏘라 캡시사이의 감염여부를 명확하게 판단할 수 있다는 것을 의미한다.(도 5). Obtain DNA from P. parasitica, P. palmivora, P. boehmeriae, P. citrophthora, and P. infestans, which are morphologically similar to the causative bacterium (Pytopovsora capsaicin), and mix them in the same proportion as the DNA of P. capsici After the PCR amplification by the same method as above using CSP-1 and CSP-2 primers. As a result, 350 bp PCR product was amplified only in the sample containing P. capsici . This result means that by using the primer of the present invention it is possible to clearly determine whether the infection between the phytophore capsai (FIG. 5).

실시예 4: 감염 조직을 직접 이용한 파이토프쏘라 캡시사이의 동정방법Example 4 Identification Method of Phytoprosora Capsies Using Infected Tissues Directly

고추역병이 발생한 포장의 병든 고추 조직으로부터 직접 파이토프쏘라 캡시사이의 검출이 가능한지 알아보았다. 고추 조직의 DNA를 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA에 대해 상대적인 농도구배를 한 후 CSP1과 CSP2의 프라이머쌍을 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 파이토프쏘라 캡시사이가 검출될 수 있는 농도를 조사하였다. 파이토프쏘라 캡시사이의 DNA를 0.1ng으로 고정하고 고추(Capsicum annuum)의 genomic DNA의 농도와의 혼합비를 1:0, 1:1, 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 0:1로 높여가며 PCR을 실시한 결과 파이토프쏘라 캡시사이와 고추 DNA의 비율이 1 : 10,000에서도 파이토프쏘라 캡시사이 특이적 증폭반응을 볼 수 있었다(도 6). 또한 파이토프쏘라 캡시사이에 의해 감염된 고추 식물체내에서 본 병원균에 대한 검출력을 조사하기 위해 실제 재배 포장에서 고추역병균에 약하게 감염된 고추와 건전주를 채집하여 지제부의 일부를 잘라 CSP-1과 CSP-2 프라이머를 사용하여 위에 기술한 조건으로 PCR 증폭을 실시하였다. PCR을 실시한 결과 건전 부위의 식물체와 대조구에서는 증폭결과가 나타나지 않았지만 이병주에서는 정확하게 350bp의 증폭 산물을 확인할 수 있었다(도 7). We investigated whether the detection of phytotopsora capscies can be directly detected from diseased pepper tissues of the cayenne pepper plague. Concentration gradient of the DNA of the pepper tissue with respect to the DNA between the phytophora capsai was carried out by PCR amplification using primer pairs of CSP1 and CSP2 to investigate the concentration that can be detected. The DNA of the phytoplasma capsaici was fixed at 0.1 ng, and the mixing ratio with the concentration of genomic DNA of Capsicum annuum was 1: 0, 1: 1, 1:10, 1: 100, 1: 1000, 1: 10000. , PCR was conducted to increase the ratio to 0: 1. As a result, the ratio of phytotopsora capscisai to chili pepper DNA was 1: 10,000. Specific amplification reaction could be seen (FIG. 6). In addition, in order to investigate the detection ability of the pathogen in the pepper plants infected by the phytoplasma capsaisai, peppers and whole wines weakly infected with pepper germ disease bacteria were collected from actual cultivation packages, and a part of the branch was cut and cut into CSP-1 and CSP-. PCR amplification was performed using the two primers under the conditions described above. As a result of PCR, the amplification product of the plant and the control of the healthy site did not appear, but the amplification product of 350bp was confirmed in Lee Byeongju (Fig. 7).

따라서 감염이 의심되는 고추의 조직을 소량 사용하여 본 발명의 프라이머쌍으로 PCR을 수행함으로써 파이토프쏘라 캡시사이에 의한 감염여부를 쉽게 확인할 수 있음을 알 수 있다.Therefore, by performing PCR with the primer pair of the present invention using a small amount of pepper tissue suspected of infection, it can be seen that the infection by Pytopsora capsaisai can be easily confirmed.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 고추역병균 파이토프쏘라 캡시사이(Phytophthora capsici) 동정용 DNA 표지인자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 프라이머 또는 프로브를 사용한 고추역병균의 진단방법은 포자하나의 농도인 100fg의 매우 적은 DNA 양으로도 역병균을 검출할 수 있을 정도로 매우 민감하고 특이성이 뛰어나 고추 생육 기간 중 수시로 식물체와 토양샘플을 채취해 감염여부를 확인할 수 있어 병의 확산 방지와 조기 방제가 가능한 효과가 있다. 또한 학문적으로도 형태적인 특성에 의존하고 있는 파이토프쏘라 캡시사이 종동정의 어려움을 쉽게 해결 할 수 있을 것이다. As described above, the present invention relates to a DNA marker for the identification of phytophthora capsici . The method of diagnosing pepper blight bacteria using primers or probes according to the present invention is very sensitive and specific enough to detect the blight bacterium even with a very low DNA amount of 100 fg, which is one spore. Soil samples can be collected to check for infections, which can prevent the spread of disease and control the disease early. In addition, it will be easy to solve the difficulty of identifying the phytoprovora capsisai, which also depends on morphological characteristics.

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Claims

A pepper-specific bacterium Phytopovsora capssai species-specific polynucleotide consisting of SEQ ID NO: 1.

A primer for identifying a capsicum bacterium Phytophthora capsaici consisting of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.

The polynucleotide according to claim 1, wherein the polynucleotide is used as a DNA marker for diagnosing pepper late blight of Phytophthora capsici .

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A base list sequence that specifically hybridizes to the genomic DNA of the phytotopsora capcis, which is amplified when the genomic DNA of the phytopsora capcisier is used as a template, and the PCR is performed using the primer pair of claim 2. The polynucleotide of number 4.

(1) preparing a sample for performing PCR from a part of the infected crop or the strain to be tested;

(2) performing PCR using the primer pair of claim 2;

(3) confirming the amplification of the 350bp fragment;

Containing, How to determine whether the crop is infected with the phytopeora capsi.

(1) extracting nucleic acids from a part of the infected crop or strain to be tested to prepare a sample;

(2) confirming hybridization of the polynucleotide of claim 1 or the polynucleotide of claim 5;

A detection kit comprising the primer pair of claim 2 in at least one container, for identifying whether the crop is infected with a phytophore capsaicy.

A detection kit comprising the polynucleotide of claim 5 in at least one container, for detecting whether the crop is infected with a phytophthora capsaicy.

A detection kit comprising the polynucleotide of claim 1 in at least one container, to identify whether the crop is infected with a phytophore capsaicy.