JPH11505728A - 食品を汚染する可能性のある耐熱性微生物の検出方法 - Google Patents
食品を汚染する可能性のある耐熱性微生物の検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)、ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)及びジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomycesbailii)微生物類を検出するための方法で、リボゾーム単位の内部転写スペーサー（ＩＴＳ）上に含まれる塩基配列、すなわち、ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)に対して、配列番号１に対応するＩＴＳ１によって、配列番号２に対応するＩＴＳ２によって、ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)に対して、配列番号３に対応するＩＴＳ１によって、配列番号４に対応するＩＴＳ２によって、及びジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)に対して、配列番号５に対応するＩＴＳ１によって、配列番号６に対応するＩＴＳ２によって、配列をプライマーとして用いて、標的微生物類のゲノムＤＮＡを増幅することにより、検出する方法。
Description
【発明の詳細な説明】
食品を汚染する可能性のある耐熱性微生物の検出方法
本発明は、食品分野における製品、特に果物を基材にした製品を汚染する可能
性のある耐熱性真核微生物の迅速検出方法に関する。
さらに詳細には、検討される微生物は、２種の糸状菌、ビソクラミス・ニヴェ
ア(Byssochlamys nivea)及びネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischer
i)及び酵母、ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)である
。
これらの食品汚染物は、果物をベースにした製品に出現し、それらに対して、
特にビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)については、人工的なすなわ
ち防腐型の不快な傾向を与え、ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fisch
eri)の増殖は、腐敗とマイコトキシンの出現に関与しており、一方、ジゴサッカ
ロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)は、ガスの生成を引き起こす。
特にこれらの微生物類の胞子の形態は、極めて高い耐熱性を示し、食品業界で
適用されている従来の低温殺菌処理の後でさえもそれらが存続できる。
これらの微生物類を検出するための従来の試験は、糸状菌の耐熱性または安息
香酸のような当分野で従来使用されている保存剤に対する酵母の耐性を選択要因
として利用することによって、選択培地の試料を変化させることからなる。しか
し、この種の検出では培養を必要とし、さらにそれ以上にかなり長い培養、すな
わち数日から数週間の培養を要し、汚染されるかもしれない製品を極めて長期間
保存する必要があるので、食品分野において実際には使用できないことになる。
従って、これらの微生物類の極めて迅速な検出を可能とする検出試験を求めて
研究が進められており、試料採取した製品が存続できるかあるいはその後の段階
において処理できるかどうかを極めて迅速に見いだすために、前記試験は、せい
ぜい数時間内に実施できなければならない。
従って、本発明は、リボゾーム単位の内部転写スペーサー（internal transer
ibed spacers；ＩＴＳ）中に含有される１組の配列をプライマーとして用いて標
的微生物類のゲノムＤＮＡの増幅によって、ビソクラミス・ニヴェア(Byssochla
mys nivea)、ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)及びジゴサッ
カロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)の検出を可能とするプロセス
を提案する：
− ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)に対して、
−配列番号１に対応するＩＴＳ１による
−配列番号２に対応するＩＴＳ２による
ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)に対して、
−配列番号３に対応するＩＴＳ１による
−配列番号４に対応するＩＴＳ２による
ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)に対して、
−配列番号５に対応するＩＴＳ１による
−配列番号６に対応するＩＴＳ２による
ＩＴＳ１及びＩＴＳ２配列中において、さらに詳細には、
− ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)に対して、配列番号７及び８
、
− ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)に対して、配列番号９
及び１０、
− ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces balii)に対して、配列
番号１１及び１２
が選択されるであろう。
使用可能な増幅方法の中でも、いわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法が
特に使用されるであろう。
特に実施例で報告した試験法は、これらのプライマー類が完璧に識別し、かつ
所望の微生物類と極めて近接しておりかつ関連している微生物類を区別すること
が可能である。
本発明は、また、食品、特に果物をベースにした食品及び特に苺をベースにし
た食品中におけるこれらの微生物類の検出方法に関し、その胞子または細胞を遊
離させかつ濃縮するために前記果物を含有する試料を前処理し、Taqポリメラー
ゼの阻害剤の作用を低減または抑制し、さらに前記胞子または細胞からDNAを抽
出する。
さらに詳細には、固体産物を含有する試料を、それらを液状化するためにセル
ラーゼ／ヘミセルラーゼの混合物で処理し、次に、ＤＮＡを抽出できる細胞を含
有する産物を得ることが可能となる条件下で、濾過しかつ遠心分離する。
前記試料はTaqポリメラーゼの阻害剤を含有することが極めて多いので、希釈
によってまたは試料をフェノール−クロロフォルムによる処理とアルコールによ
る沈殿によって前記阻害剤の活性を低減できる段階を設けることが必要である。
本発明はさらに詳細には食品業界を目的としているが、食品業界といかなる関
係も有していない他の試料に含まれる微生物類を検出するためにも使用できるこ
とが明らかである。
最後に、本発明は、上記にも述べたようにプライマー類及び前記プライマー類
を用いた検出キット類に関する。
本発明のその他の特徴及び利点も、下記の実施例を読めば明らかであろう。
実施例１−DNA抽出及び増幅方法
Ｉ） 真菌菌糸体約５mm2、真菌胞子105または106の酵母細胞で開始し、
− ネジ栓付きミクロ試験管（１．５ｍｌのエッペンドルフ型）中に２０mM
EDTA、0.8％ SDSを含有するｐＨ8.5の５０mM Ｔｒｉｓ緩衝液２００μl中の微
生物懸濁液にガラスビーズ（直径０．２５−０．５mm）１００μlを添加する。
− 最大周波数で１分間、攪拌する。
− １００℃で１５分間（沸騰水）、混合物をインキュベーションする。
* 胞子処理のため、前記攪拌及びインキュベーションを、
−液体窒素中で凍結し、１００℃で５分間沸騰させ、
−液体窒素中で再凍結し、１００℃で１０分間沸騰させ、
− １０，０００ｇで１分間遠心分離し（実験台遠心分離）、
− 上清の回収、
− 水中で上清を１０倍希釈する
に置き換える。
この希釈上清を直接、増幅に使用する。
（II）増幅は、２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５，１６mM（NH4）2SO4，2
.5 mM MgCl2，150μg/ml牛血清アルブミン、0.2 μMの各dNTP及び各プライマー
オリゴヌクレオチド100μMを含有する最終容量２５マイクロリットル中で、実施
する。Taqポリメラーゼ（BioTaq，Bioprobe systems，フランス）２単位を反応
に使用する。増幅反応は、下記のようにしてパーキンエルマー２４００サーモサ
イクラー（Perkin Elmer Corp.，USA）中で実施する。
− ジゴサッカロマイセス(Zygosaccharomyces)，ビソクラミス(Byssochlamys
)及びネオサルトリア(Neosartoria)について、
・ ９４℃で１５秒間
・ ５８℃で１０秒間
・ ７２℃で２０秒間
このサイクルを３０回繰り返す。７２℃において５分間の末端伸張を行う。
（III）下記の組成を有する電気泳動ゲル上で泳動させた後得られた産物をＵＶ
で可視化する。１×TBE緩衝液、１μg/mlエチジウムブロマイド、０．８％アガ
ロース。
実施例２
検出する株に近接した種々の株類における本発明の方法を用いて得られた結果
は、上述のプライマー類によって良好に識別されることを示しており、下記のよ
うになる。
使用したプライマー類は、
− ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)について、配列番号７及び
８
− ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)について、配列番号
９及び１０
− ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)について、
配列番号１１及び１２
である。
A.fumigatusは、N.fischeriの無性形態であるので前記プローブに反応すると
いうことに注意されたい。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １．ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)、ネオサルトリア・フィシェ リ(Neosartorya fischeri)及びジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyc es bailii)の検出を、プライマーとしてリボゾーム単位の内部転写スペーサー（ ＩＴＳ）中に含有される配列を用いて標的微生物類のゲノムＤＮＡの増幅によっ て可能とする方法； ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)に対して、 −配列番号１に対応するＩＴＳ１による −配列番号２に対応するＩＴＳ２による ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)に対して、 −配列番号３に対応するＩＴＳ１による −配列番号４に対応するＩＴＳ２による ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)に対して、 −配列番号５に対応するＩＴＳ１による −配列番号６に対応するＩＴＳ２による。 ２．ＩＴＳ１及びＩＴＳ２配列中において、さらに詳細には、 −ビソクラミス・ニヴェア(Byssochlamys nivea)に対して、配列番号７及び８、 −ネオサルトリア・フィシェリ(Neosartorya fischeri)に対して、配列番号９及 び１０、 −ジゴサッカロマイセス・バイリ(Zygosaccharomyces bailii)に対して、配列番 号１１及び１２ が選択される請求項１に記載の方法。 ３．前記増幅がＰＣＲ法によって実施される請求項１又は２のうちの１項に記載 の方法。 ４．食品、特に果物をベースにした食品、特に苺をベースにした食品中におけ るこれらの微生物類の検出方法で、その胞子または細胞を遊離させかつ濃縮する ために前記果物を含有する試料を前処理し、Taqポリメラーゼの阻害剤の作用を 低減または抑制し、さらに前記胞子または細胞からDNAを抽出する請求項１〜３ のうちの１項に記載の方法。 ５．果物を含有する試料を、それらを液状化するためにセルラーゼ／ヘミセルラ ーゼの混合物で処理し、次に、ＤＮＡを抽出できる細胞を含有する産物を得るこ とが可能となる条件下で、濾過しかつ遠心分離する請求項４に記載の方法。 ６．配列番号１から１２までの配列から選択された配列を有するプライマー。 ７．ＤＮＡ増幅による検出と請求の範囲第３項乃至第５項のうちの１項に記載の 方法を実施するためのキットで、請求の範囲第６項に記載のプライマー類からな ることを特徴とするキット。
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