JPH11502707A

JPH11502707A - クローン病および潰瘍性大腸炎の診断と治療のシステム

Info

Publication number: JPH11502707A
Application number: JP8529060A
Authority: JP
Inventors: ウェイクフィールド，アンドリュー，ジェレミー
Original assignee: ウェイクフィールド，アンドリュー，ジェレミー
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 1999-03-09
Also published as: EP0817864A1; CA2216807A1; US6309819B1; ATE219149T1; WO1996030544A1; GB2300259B; DE69621791D1; GB9506298D0; HK1002983A1; AU701316B2; EP0817864B1; AU5153196A; GB9606038D0; GB2300259A

Abstract

(57)【要約】本発明は、in situおよびin vitroの核酸の増幅を用いた、クローン病及び潰瘍性大腸炎の診断システムに関する。この検出手段ははしかウイルスに特異的であり、ウイルスの「野生株」と弱毒化株とを区別することができる。本発明は更にクローン病及び／または潰瘍性大腸炎のための医薬の製造における使用を提供するものであるが、この医薬は適切なベクターとそれが担う特定のウイルスタンパク質に対するアンチセンスＲＮＡからなり、このアンチセンスＲＮＡがその特定のウイルスプロテインが宿主中で発現されるのを阻害する。

Description

【発明の詳細な説明】クローン病および潰瘍性大腸炎の診断と治療のシステム本発明はクローン病と潰瘍性大腸炎の診断のためのシステム及びそれから派生する治療システムに関する。現在そのような診断システムで使えるものはない。最近までクローン病や潰瘍性大腸炎の発症原因ははっきりしておらず、治療はほとんどできない状態である。薬はよくても症状をいくらか軽減ことしかできない。クローン病の患者は人口１０万人あたりほぼ４人であり、英国では毎年２，２００人の新しい患者がでている。クローン病は初期の段階ではよくある腸の炎症症状を呈することが多いので、信頼性のある診断システムが必要とされている。同様に潰瘍性大腸炎にも早期治療を可能にするための早期の診断が必要とされる。本願の出願人は今回クローン病の病因がはしかウイルスであることを証明した。したがって本発明はこの発見を利用して、腸組織、腸から出るもの、又は適当な体液例えば血液やリンパ液の中にはしかウイルスが存在することを確認する診断方法を提供するものである。研究が進むにつれて、潰瘍性大腸炎の原因もはしかウイルスであるという発見の裏付けも増えてきている。本発明ははしかウイルスに対する抗ウイルス性治療システムの基礎をも提供するものである。そこで本発明の第１の態様によれば、クローン病と潰瘍性大腸炎を検出するための診断システムが提供される。このシステムははしかウイルスのＲＮＡ又はその特徴的な代謝産物を検出する手段からなる。このような手段は抗原性システム、あるいは核酸の増幅もしくはハイブリダイゼーション反応を利用したシステムである。後者の場合、本発明は特に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、又は核酸配列に基づく増幅反応すなわちリガーゼ連鎖反応を行う手段を提供するものである。このシステムは、緩衝液中にＲＮＡはしかウイルス及び／またはＲＮＡテンプレートから逆転写されたＤＮＡに特異的なプライマーを含有する。このプライマーはすべてのはしかウイルスのゲノムＲＮＡ、又はアンチゲノムＲＮＡすなわちメッセンジャーＲＮＡに特有の配列であって５’末端が修飾されたオリゴヌクレオチド配列であることができる。このプライマーには、分析を容易にするために蛍光色素のような標識又は凝集部分をつけてもよい。特徴的な代謝産物は、はしかウイルス又は関連パラミキソウイルスに特異的なヌクレオカプシドプロテイン、ホスホプロテイン、ラージプロテイン、ＲＮＡポリメラーゼ複合体、フュージョンプロテイン、又はヘマグルチニンプロテインを形成するための遺伝子配列又はその代謝産物から選択することができる。ヌクレオチドの増幅は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription polymerase chain reaction，ＲＴ−ＰＣＲ）、又は核酸配列に基づいた増幅（n ucleic acid sequence based amplification，ＮＡＳＢＡまたは３ＳＲ）であることができる。前者の場合、前述した診断試験を行うためのキットはたとえば以下のものからなる。（１）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素；（２）ランダムヘキサマー及び／またはオリゴ（Ｄｔ）_12-18；（３）上の（１）用反応緩衝液；（４）ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応用緩衝液；（５）レポーター分子をつけた５’修飾ＰＣＲ用プライマー。このようなキットは更に陽性対照としてはしかウイルスＲＮＡの濃度のわかった溶液を含んでいてもよく、また陰性対照あるいはそれを与えるための手段を含んでいることが好ましい。しかしながら、現在はＮＡＳＢＡの方がはしかウイルスの検出感度が格段にいいことがわかったので、診断方法としてはこちらの方が好ましい。本発明の別の態様によれば、クローン病又は潰瘍性大腸炎のin situでの組織分析の方法が提供される。この方法は以下のステップからなる：ａ）組織サンプルを採り、それを密閉反応容器のなかに固定する。ｂ）ＰＣＲバッファ、ＭｇＣｌ₂、ＤＮＴＰ、ランダムヘキサマーからなる試薬（１）を加え、水溶液で希釈して望ましい希釈度にする。ｃ）容器を閉じてからＭ−ＭＬＶ−ＲＴを加え、少なくとも１回の熱サイクルを行う。ｄ）洗浄バッファーで処理し、ｅ）緩衝化したＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ₂、ＤＮＴＰ類及びプライマーを予め決められた希釈で滅菌蒸留水で希釈したものを加え、少なくとも１５サイクルの加熱で、single又はnestedＰＣＲ反応を行う。ｆ）ついでこれらのステップを繰り返し、標識された産物がはしかウイルスのＲＮＡの存在を示すのを検分する。本発明の更に別の態様によれば、クローン病又は潰瘍性大腸炎のサンプルをin vitroで分析する方法が提供される。この方法は組織サンプルからはしかウイルスのＲＮＡを抽出するステップと以下のａ）〜ｇ）のステップからなる：ａ）密閉反応容器中でそのＲＮＡにＤＴＴ、ＤＮＴＰ類、ＲＮａｓｅインヒビターおよび（ｄＴ）_12-18からなるバッファを加えて希望する水溶液濃度にし、ｂ）それにＭ−ＭＬＶ−ＲＴを加えてインキュベートしてｃＤＮＡを生成させ、ｃ）生成物を精製してそれにＰＣＲバッファとＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰ類と外側のブライマーを一つ加え、ｄ）ついでＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えて少なくとも１５サイクルの加熱で single又はnestedＰＣＲ反応を行うｅ）こうしてできた反応産物の一部をとり、緩衝化ＰＣＲ反応混液、内部の１対のプライマー、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼを加えて熱サイクルを少なくとも２０回行う。ｆ）できた産物を取り出し、重層用（loading）色素を加えて電気泳動にかけ、得られた産物のバンドを同定するｇ）増幅産物の配列を決定する、あるいは増幅産物を同種又は異種の特異プローブとハイブリダイズさせて、たとえばはしかウイルスのワクチン株と野生型とを識別する。本発明の更なる態様により、クローン病及び／または潰瘍性大腸炎を治療するための医薬が提供される。その方法は宿主中のはしかウイルスの発現、複製、転写、ＲＮＡプロセシング、及び／またはｍＲＮＡ輸送を阻害するものである。この医薬ははしかウイルスのゲノム又はアンチゲノムＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡ及びベクターを包含する。この医薬ははしかウイルスペプチド又は炭水化物抗原、又はそれらのモノクローナルもしくはポリクローナルアナログからなることができる。本発明ではまたはしかウイルス特異的な核酸に基づくワクチンゲノムからなることもできる。このワクチンゲノムははしかウイルス及び／またはその成分抗原に対して特異的な免疫反応を誘発するのに適している発現システム中にコードされているものである。ｍＲＮＡを含めたウイルスＲＮＡに対するアンチセンスＲＮＡを用いてはしか関連疾患を治療すれば宿主の細胞機能に対する副作用の問題が軽減される。かってはこのような処置は、ウイルスの必須タンパクに特異的な阻害剤をデザインすることがきわめて困難であったため、効果が長続きしない面があった。しかし現在は、先行技術において、トリレトロウイルス、ラウスザルコーマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス及びサル免疫不全ウイルスの遺伝子を培養細胞中で阻害するのにアンチセンスＲＮＡを用いて成功している。本発明は、はしかウイルスの適当な遺伝子、例えばヌクレオプロテイン遺伝子及び／またはヘマグルチニン遺伝子を標的とするようにデザインされたアンチセンスＲＮＡと、薬剤（例えばヒグロマイシンＢ）にたいする耐性遺伝子を運ぶように改変され、かつ感染細胞に取り込まれるのに適したベクターからなる医薬を提供するものである。この医薬の調製方法はKoschel K.らの方法（Virol．207,1 68-178(1995)）の変法である。本発明を以下の実施例中での例示のほかに付属する図を参照しながら説明する。図中：図１ａははしかウイルスに感染したベロ（Ｖｅｒｏ、ミドリザル腎臓）細胞をはしかウイルスポリクローナル１次抗体で免疫染色したものである；シンシチウムの細胞変性効果領域では細胞質が強く染色されている。Mayerのヘマトキシリンで対比染色している（元の倍率は×３５０）。図１ｂはイムノゴールド（immunogold、二次抗体結合金粒子）で標識された、はしかウイルスに感染したベロ細胞を示す。２個及びしばしばそれ以上の金粒子が集まった点が多く認められる。この集合点は直径１５−２０ｎｍの典型的な繊維状に整然と並んだヌクレオカプシドと一緒にある。酢酸ウランとReynoldのクエン酸鉛で対比染色している（元の倍率×９１，０００）。図１ｃははしか一次抗体を省いたほかは図１ａと同様な処理したはしかウイルス感染ベロ細胞を示す（元の倍率 ×３７５）。図１ｄははしかウイルス感染ベロ細胞をはしかウイルス１次抗体抜きで金をつけた二次抗体に暴露したものを示す。標識は観察されない（元の倍率 ×９１，０００）。図１ｅははしかウイルス感染ベロ細胞をオタフクカゼ一次抗体に暴露したものを示す。シグナルは全くない（イムノペルオキシダーゼ（二次抗体結合ペルオキシダーゼ）、元の倍率 ×４００）。図２ａはオタフクカゼウイルスに感染させたベロ細胞をオタフクカゼ一次抗体に暴露したものを示す。感染細胞では細胞質が染色されている（元の倍率 ×４００）。図２ｂはオタフクカゼウイルス感染ベロ細胞をオタフクカゼウイルス一次抗体を抜いて図２ａと同様に処理したものを示す（イムノペルオキシダーゼ；元の倍率 ×４００）。図２ｃと図２ｄはオタフクカゼウイルス感染ベロ細胞をはしかウイルス一次抗体で処理してイムノペルオキシダーゼで検査したもの（元の倍率 ×４００）（２ｃ）とイムノゴールドで検査したもの（２ｄ）（元の倍率 ×８２，４００）を示す。抗体の交差反応は全く認められない。図２ｄではオタフクカゼウイルスの細い繊維状の配列がはっきりとみられる。図３は、ＳＳＰＥを示す：ＳＳＰＥ（亜急性硬化性全脳炎）の脳中のはしかウイルスヌクレオカプシドの免疫染色を光学顕微鏡で観察したもの（図３ａ）（元の倍率 ×４００）および電子顕微鏡で観察したもの（図３ｂと３ｃ）。核内のヌクレオカプシドが図３ｂではみられ、しばしば対をなした金粒子がそれぞれのヌクレオカプシドに広がっている。図３ｃでは細胞質シグナルがはっきりと認められる（元の倍率３ｂ：×６２，５００、３ｃ：×９５，０００）。はしかウイルス一次抗体での処理を省いたほかは同様に処理した組織切片ではシグナルは全く認められない（図３ｄ；イムノペルオキシダーゼ、元の倍率 ×４００）。図４ははしか虫垂炎を示す：切片をはしかウイルスＮプロテインについて染色しイムノペルオキシダーゼで処理したもの。陽性のシグナルが内皮細胞シンシチウム中（赤血球を矢印で示す）（図４ａ）（元の倍率 ×１００）と、Warthin Fi nkeldey巨大細胞中（図４ｂ）（元の倍率 ×８００）に認められる。図５はクローン病を示す：肉芽腫炎症病巣中のマクロファージ様細胞の核染色は陽性（図５ａ；イムノペルオキシダーゼ；元の倍率 ×６００）。連続切片を一次抗体処理を省いたほかは同一の処理をした場合にはシグナルは認められない（図５ｂ、元の倍率 ×６００）。同一の細胞内位置がイムノゴールド標識陽性であり、特有の対をなすシグナルを示す（矢印）（図５ｃ；元の倍率 ×７１，０００）。図５ｄ（図内図）は１個のヌクレオカプシドのように見えるものの長軸に添って分布した金標識の高倍率図を示す（元の倍率 ×１３９，０００）。図５ｅは、別のクローン病患者からとった肉芽性炎病巣中のマクロファージの核染色を示す。対をなすシグナルが観察され、中でも中央部のクラスターに認められる。拡大図を図５ｆにしめすが、これは直径１７ｎｍのヌクレオカプシドの平行する配列（矢印）に金標識が広がってていることをはっきりと示す（元の倍率図５３：×９１，０００、図５ｇ：×９５，０００）。クローン病の切片をはしかウイルス一次抗体での処理を抜いて同様に処理したものでは染色は認められなかった（図５ｇ、元の倍率 ×５４，０００）。実施例１クローン病又はおそらく潰瘍性大腸炎である患者の腸のバイオアッセイで観察されたヌクレオカプシド様の粒子のウイルスの起源を確認する研究を行った。これらの粒子は正常小腸中には超微細構造的にはこれまで検出されたことがない。細胞構造ベロ（ミドリザル腎臓）細胞を標準的手法を用いて７５ｍｍフラスコ中で培養した。集密細胞単層にはしかウイルスのエドモンストン株を１ｍｌあたり１０⁷プラーク形成ユニット（ＰＦＵ）、あるいはオタフクカゼウイルス（テイラー株、PH LS colindale，UK）をＴＣＩＤ₅₀（組織培養感染性量）１０⁴を感染させた。感染しなかった細胞は陰性対照とした。＞８０％の細胞が細胞変性を示したときに、細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１％グルタルアルデヒド／１％パラホルムアルデヒドで３０分間固定した。細胞をフラスコから白金耳でかきとって、細胞をエッペンドルフチューブ中に懸濁してからベックマンマイクロフュージ（パロアルト、カリフォルニア、ＵＳＡ）で遠心してペレットとした。細胞ペレットは固定後にＰＢＳで洗浄し、５０％、７０％及び９０％のジメチルホルムアミドでそれぞれ２回ずつ順次脱水した。１回の時間はブロックの大きさにより１０−２０分間である。ついでジメチルホルムアミドとＬＲホワイトレジンの５０：５０混合物に０．５％のベンゾイン光反応開始剤（TAAB Laboratories Eq uipment Ltd，Reading．UK）を加えたものを３０−６０分間浸透させた後、１００％樹脂で１−２時間処理した。ブロックを封入できる包埋用カプセル中に新しいＬＲホワイトレジンと光反応開始剤とを用いて包埋した。重合は４℃で紫外線源を１０ｃｍの距離で用いて行った。樹脂は１−２時間で重合し、終わりまで重合しないで残った少量の樹脂は綿棒で取り除いた。パラフィンブロックから再処理した組織まず、保存してある、フォルマリン固定パラフィンで処理されたはしかウイルスの感染が確認された組織を選んだ。これらの中には亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）患者からの脳組織や急性はしかウイルス虫垂炎患者からの虫垂組織も含まれていた（EnfieldのChase Farm HospitalのH．Raid博士からの恵与）。６例の肉芽腫性クローン病には初期（つまり特異的又は免疫抑制的治療が始められる前）にとられた４例の直腸バイオプシーと２例の虫垂が含まれるように選んだ。陽性対照とクローン病組織のどちらにおいても、診断は標準の臨床的、組織病理学的基準により下された。回腸部結核（ＴＢ）の２例を肉芽腫性の対照として調べた。切片を組織のブロックから切り出し、前に述べたイムノペルオキシダーゼ法（ Wakefiedl AJ.，J．Med．Virol．1993; 39;345-353）を用いてはしかウイルスヌクレオカプシド（Ｎ）プロテインに特異的なポリクローナル抗体（CAMR,Porton Down，UKのJ．Stephenson & T Fookesから恵与された）で免疫染色した。陰性対世としては連続組織切片を一次抗体暴露を省略するか、オタフクカゼウイルス（近縁のパラミキソウイルス）に特異的なモノクローナル抗体（Seralab，Crawley ，Sussex，UK）に暴露する処理のどちらかを行った。イムノゴールド試験を行う前にはしかとオタフクカゼウイルス特異抗体間の交差反応性をこれらのウイルスに感染させたベロ細胞中で調べた。電子顕微鏡用の処理イムノゴールド分析用に適切な組織の場所を選んだ。これらの場所はイムノペルオキシダーゼによる染色ではしかウイルス陽性を与える場所と、クローン病と回腸部結核（ＴＢ）の場合は肉芽性炎の病巣を含めた。片刃の剃刀を用いてパラフィンブロックから組織の１かけを切り出した。クロロホルムでワックスを除いてから純アルコール中で濯いだ。ついで組織に樹脂を浸透させ前に述べたように包埋した。急性はしか虫垂炎についてはパラフィン切片だけが入手できたのでスライドから組織を取り出すのに新しい方法を用いた。切片はワックスを除き純アルコールに入れた。ついでアルコールとＬＲホワイトレジンの５０：５０混合物で全面をおおい、光反応開始剤を加えて更に１５分おいた。液を捨ててスライドから余分な樹脂を吸い取った。新しい樹脂を組織上に滴下しプラスチックのカバースリップ（Agar Scientific，Stansted，UK）でおおった。ついで樹脂を４℃で１時間紫外線により重合させた。カバースリップをはがし重合しなかった樹脂を取り除いた。スライドを液体窒素に数秒間浸せきしてから組織を含む樹脂を持ち上げた。形を整えてブランクの樹脂ブロック上にPermabond急速接着エポキシ樹脂（Perma bond Adhesives Ltd．Eastleigh，UK）でマウントした。超薄切片を５０−８０ｎｍ厚さで切り、上記のように免疫染色した。免疫標識７０−８０ｎｍの厚さで超薄切片を切り出し、Piliform（Agar Scientific，S tansted，UK）でコートしたニッケルグリッド（Gilder，Grantham，UK）の上に拾い上げた。グリッドを０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中５％の正常ヤギ血清の液滴中で３０分間インキュベートし、ついで一次はしかポリクローナル抗体（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１／１００）の液滴中に移して１時間おいた。一次抗体はＰＢＳの液滴上で５分間ずつ５回洗浄することにより除去した。この際１回目は余剰の液体をグリッドから除去することなく行った。残りの４回は余剰のバッファは吸い取り紙に縁を触れさせて、グリッドが乾ききってしまわないように注意しながら除いた。ついでグリッドをＰＢＳで１００倍に希釈した金複合体（Biocell ，Cardiff，UK）の液滴に移して１時間おき、ＰＢＳの液滴で５分間ずつ２回洗浄して結合しなかった金複合体を除き、最後に蒸留水中で濯いだ。切片は酢酸ウランとレイノルドのクエン酸鉛で軽く染色し、フィリップス２０１透過型電子顕微鏡で観察した。すべての組織について一次抗体処理をしなかった切片を陰性対照として含めた。はしか感染ベロ細胞実験的にはしかウイルスに感染させたベロ細胞は、イムノペルオキシダーゼとイムノゴールド標識陽性を示した（図１ａと１ｂ）が、はしか一次抗体に暴露しないほかは全く同様に処理したはしか感染細胞や（図１ｃと１ｄ）、おたふくかぜ一次抗体に暴露したはしか感染細胞では認められなかった（図１ｅ）。超微細構造的には、ウイルスのヌクレオカプシドは特徴的な直径１５から２０ｎｍの平行する繊維状の構造を有していた。金粒子が集合し（ペアを形成することが多い）、ウイルスのヌクレオカプシドに添って断続的に結合してできた標識の特徴的なパターンが感染細胞の核と細胞質の両方に観察された（図１ｂ）。このパターンは感染細胞と感染組織の両方に一貫して認められたが、対照切片によくみられるバックグラウンドシグナル中には認められなかった。オタフクカゼウイルス感染ベロ細胞はオタフクカゼウイルス一次抗体を用いたイムノイムノペルオキシダーゼでは強く染色された（図２ａ）が、オタフクカゼ一次抗体を省いて同様に処理した細胞は、染色されなかった。オタフクカゼ感染細胞にはしか抗体をかけた場合にはシグナルは光学顕微鏡的にも電子顕微鏡的にも観察されなかった。亜急性硬化性全脳炎感染脳の組織学的切片にイムノペルオキシダーゼを使用し、超薄切片にはイムノゴールド標識を使用した。はしかウイルスに対する強いシグナルが主として感染細胞の核内に観察された。超微細構造的には、固定とパラフィン処理が最適条件ではないにもかかわらずウイルスのヌクレオカプシドはよく保存されていた。ここでもヌクレオカプシド上の二重のイムノゴールドシグナルが一貫した特徴であった。一次抗体で処理しなかった切片では、光学顕微鏡的にも（図３ｄ）超微細構造のレベルでも（不図示）、シグナルは観察されなかった。小腸組織ついでこの方法をはしか感染小腸組織−急性感染はしか虫垂炎−に適用した場合も同様な結果が得られた。内皮細胞、Ｗａｒｔｈｉｎ−Ｆｉｎｋｅｌｄｙ巨大細胞を含めたマクロファージ様細胞（これは急性はしかウイルス感染の古典的特徴である）、およびリンパ小節内に時折みられるリンパ球中でのはしかウイルス抗原の存在がイムノペルオキシダーゼ法で同定された。陰性対照切片中には染色は認められなかった。最適条件でない保存にもかかわらず、同じ細胞性病巣中にウイルスが存在することが確認された。一次抗体なしではシグナルは全く認められなかった。調べた６例のクローン病のうち全部において、形態と位置から組織球マクロファージ、内皮細胞及び時折はリンパ球と同定された細胞内にはしかウイルスが存在することがペルオキシダーゼで示された。はしか一次抗体に暴露しなかったか、オタフクカゼ一次抗体に曝した切片中ではシグナルは認められなかった。５例においては同一の細胞の場所がイムノゴールドにより陽性となりウイルス粒子はサイズ、形、上述のイムノゴールド標識において特徴的な形を示した。１例においては更にsingle crypt上皮細胞中においてもシグナルが検出された。イムノゴールド陰性であった５番目のケースでは、組織学的切片中に存在する肉芽性炎の病巣は「切り出され」ていて、超薄切片中に同定できなかった。はしか一次抗体で処理しないほかは同一の処理をしたクローン病の切片は陰性であった。調べた２例の回腸部ＴＢは、１例がイムノゴールドでマクロファージ様細胞中の核で低レベルのシグナルを示したが、どちらもイムノペルオキシダーゼでは陽性ではなかった。これははしかウイルスが小腸内にずっと存在することの初めての直接証拠である。すなわち超微細構造のレベルでのウイルスヌクレオカプシドと特異抗体の同時検出である。クローン病組織におけるはしかウイルスの細胞内位置の特定は以前に別の方法で観察された結果（Wakefield AJ.，J．Med．Viol.，1993; 39; 34 5-353；Knibbs DR，Gastroenterology，1663; 104; A726(Astract)）及び別の研究室で行われた結果（Knibbs DR，Gastroentrology，1993;104;A726(Abstract) ）と一致する。特異抗体と、サイズと形態の両方が標的ウイルスと同じである粒子が同じ位置に存在することはそのウイルスが存在することの強力な証拠である；金粒子でヌクレオカプシドを標識した場合の特徴的なパターンは更に思いがけないほどの特異性を与えた。回腸部結核の２例のうち１例においてはしかウイルスが検出されたことは、持続的に感染した免疫細胞が炎症病巣に集積した可能性を提起するものであり、肉芽腫の主要原因とは無関係である。しかしクローン病組織では、内皮細胞や上皮細胞を含む固有の小腸細胞内ではしかウイルスが検出され、持続的小腸感染が示唆される。しかしながら同一宿主内を循環する免疫細胞が持続的に感染していることもあり得る。クローン病患者の治療の主柱であるコルチコイドは、ウイルス複製を許容する可能性があり炎症を起こした小腸内での存続に対する疑問を提起する。ここでその組織を調べた患者にはコルチコイドあるいは他の免疫抑制治療を受けたものはいない。実施例２暗示されたはしかウイルスとクローン病との病因学的関連は、病気に冒された組織中の感染細胞に対する免疫応答を検出することにより裏付けられる。この実施例は、急性及び持続感染した組織の両方、特にクローン病の肉芽腫において、はしかウイルスに対するin situの免疫応答を検出し特徴づけようとしたものである。クローン病（ｎ＝１７）、結核（ｎ＝９）、急性小腸虚血（ｎ＝５）、急性はしか肺炎（ｎ＝２）、急性はしか虫垂炎（ｎ＝１）、亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ；ｎ＝１）及びはしか封入体脳炎（ＭＩＢＥ；ｎ＝１）からの連続切片を調べた。単一及び二重の免疫組織化学的標識を行って、細胞傷害性リンパ球（ＣＤ８，ＴＩＡ、パーフォリン、Ｌｅｕ７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ）及びマクロファージ（ＫＰ１）の両方を同定した。これらの細胞とはしか感染細胞との関係は、抗はしかウイルスヌクレオプロテイン抗体の二重免疫標識により同定した。急性はしか虫垂炎とＳＳＰＥの両方で、ＣＤ８＋／ＴＩＡ細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）は感染細胞を標的にした。クローン病（１３／１７）を含むはしかウイルスが陽性である他の組織においては、主として肉芽腫、ＭＩＢＥ、致死性肺炎、及び１例の結核肉芽腫だけが染色され、感染細胞はＣＴＬよりはマクロファージに標的にされるように見えた。クローン肉芽腫におけるＣＴＬはＬｅｕ７ −及びパーフォリン−／ＣＤ４５ＲＯ−（naive）であった。結核とクローン肉芽肺の両方でＣＴＬは末梢分布、数及びフェノタイプが同じであった。このデータからはしか特異的ＣＴＬ応答はクローン病では急性はしか虫垂炎やＳＳＰＥに比べて弱くなっていること、次に小腸にはしかウイルスが持続的に感染することに対するマクロファージの異常な応答が肉芽性炎を引き起こす可能性を示唆する。実施例３国際的な共同研究で、クローン病（ｎ＝９５）、潰瘍性大腸炎（ｎ＝７９）、ウイルス性肝炎（ｎ＝６３）の連続的外来患者及び献血者（ｎ＝３０）について血清ＩｇＭはしか応答性をエリザ（ＥＬＩＳＡ）によりアッセイした。その結果を別の市販はしかＩｇＭアッセイ、風疹及びエプスタイン−バーウイルス特異的血清ＩｇＭ免疫応答性、全血清ＩｇＭ、リューマチ因子及びはしか特異的ＩｇＧの結果と比較した。炎症性腸疾患をもつ患者２０人を４カ月にわたって連続的に調べた。最近急性のはしかに感染したことを確認するためのエリザ”ｃｕｔ−ｏｆｆ”点には、グループ間で有意な差はなかった。しかしながら、血清はしかＩｇＭ免疫反応性の亢進（献血者の平均±２ＳＤと等しいか大きい）は、肝炎患者５／６４（８％）及び正常対照０／３０（０％）に比べて、クローン病患者３９／９５（４１％）および潰瘍性大腸炎３３／７９（４２％）の方が有意に大きかった（ｐ＜０．００１）。エリザが陽性であったものは、同じ血清サンプルに対する間接免疫蛍光でも陽性であった。血清はしかＩｇＭ免疫反応性は全ＩｇＭ，風疹あるいはエプスタイン−バーウイルスＩｇＭ（非誘導）、はしかＩｇＭ，あるいは疾患活性のどれとも相関を示さなかった。ステロイドの投与を受けていない患者ははしかＩｇＭ免疫反応性がより上昇しているようであった（ｐ＜０．０５）。リューマチ因子を検査した血清は全部陰性であった。４カ月にわたって調べた炎症性の腸疾患を有する２０人の患者のうち、５５％が追跡期間のある時期にはしかＩｇＭ免疫反応性が上昇していた。データは、クローン病と潰瘍性大腸炎の患者におけるはしかウイルスに対する免疫反応性を示唆し、炎症性腸疾患におけるはしかウイルスの潜在的病因としての役割を支持する。実施例４クローン病と以前のはしかウイルスに対する暴露との間の疫学的関連は、間接的にまたはケースコントロールデザインの研究において示されている。子宮内でのはしか暴露とクローン病の絶対的危険性評価を決定するためにウプサラの大学病院で１９４０−１９４９年の間に出産した全２５０００例の妊娠カルテを調査した。母親が妊娠中に明らかにはしかに感染した例が４例確認された。産まれた子、及び２例については母親にもインタビューし、病歴記録を見直した。ケース１、２、及び３では複数回の小腸部分切除を受けていて、そのうち２例から得られた組織を通常の組織学的方法及び、適当な陽性対照（脳；亜急性硬化性全脳炎）と陰性対照（一次抗体なし、オタフクカゼウイルス感染細胞）を用いてはしかウイルスに対するイムノゴールド−電子顕微鏡により検査した（Gut．1995; 36; 564-9）。産まれた子４人のうち３例がクローン病であった；どの例でも回帰性抗生物質耐性肺炎の後に発病した。全員が広範囲にわたる回腸及び大腸の疾患を持ち、２例が静脈内栄養供給を必要としていた。４例のうちただ１例のみが臨床的急性はしかにかかったことがあり、クローン病にはならなかった。組織をはしかウイルス抗原について調べたクローン病の２例は肉芽性及びリンパ球性炎症の病巣中にウイルス抗原が認められた。このことは、子宮中ではしかウイルスに接触することが、重い広範囲のクローン病になる主要な危険因子であることを示す。この時期での接触が持続感染につながるのか、あるいはそのため後ではしかに感染したさいの応答が変わってウイルスが存続するようになるのかもしれない。実施例５イムノゴールド−電予顕微鏡を用いて、クローン病患者と炎症性及び非炎症性疾患対照の小腸組織中でのはしかウイルスの存在を試験した。ホルマリン固定後パラフィン包埋した組織を再処理して、抗はしかウイルスヌクレオプロテイン一次抗体、ついで１０ｎｍの金粒子をつけた二次抗体で染色した。亜急性硬化性全脳炎（ＳＳＰＥ）の患者のひとりからとった脳組織を同じように処理したものを、陽性対照として用いた。全組織について２連の切片を一次抗体なしで処理した。クローン病では肉芽性炎の病巣の８／９が、非特異的炎症の病巣では０／４がはしかウイルスについて陽性であった。対照で陽性だったのは潰瘍性大腸炎組織で０／５、ＳＳＰＥ組織で１／１であった。クローン病肉芽腫とＳＳＰＥの双方で１つの核の領域あたりの金粒子の数は、クローン病の非肉芽腫領域を含めた対照より有意に大幅に多かった（ｐ＜０．０００６）；どちらの疾患でも、少数の特徴的な細胞病理を示している細胞しか染色されなかった。これらのデータはクローン病の病因としてのはしかウイルスの役割を裏付けるものである。実施例６はしかウイルス検出用キットはしかはＲＮＡウイルスである。本実施例のin situ或いはin vitroでの核酸増幅媒介検出は、逆転写−ポリメラ−ゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）或いは核酸配列に基づく増幅ＮＡＳＢＡ（３ＳＲ）のいずれかに基づいている。 in vitro或いはin situはしか検出用ＲＴ−ＰＣＲキットの主成分は以下のものである； (i)逆転写酵素、例えばＭ−ＭＬＶ逆転写酵素、 (ii)第１ストランドｃＤＮＡ合成用プライマ−、 (iii)ＲＴ用反応バッファ−、 (iv)ＰＣＲ反応バッファ−、 (v)例えば蛍光色素などのレポ−タ−分子で５’が修飾されてもよい、ＰＣＲプライマー。さらに、アミコンミクロコン３０サイズ分画カ−トリッジをin vitro増幅用第１ストランドＤＮＡ合成からの生成物の精製に使用してもよい。両キットは、例えば既知濃度での溶液として供給されるはしかウイルスＲＮＡをポジティブコントロ−ルとして有することが好ましい。これがあるとキットを使用する個々人が結果を較正できる。さらにネガティブコントロ−ルが必要である。これは分析を行う前に試料の１部分をとり３７℃で１０分間RNase Aで処理することにより達成されるのが好ましい。この操作はin situ及びin vitro適用の両者で効果的であり、さらに試料中に汚染物質として存在するかもしれないＤＮＡからの非特異的生成物を検出できる。したがってＲＮａｓｅＡをキットに追加することが望ましい。２つの基本的なプロトコ−ルをa)in situ及びb)in vitro増幅について以下に示す。実施例７ａ）in situ でのはしかウイルス検出−キット１１）実施例６で製造したような組織切片標本中に７５μｌの試薬（１）を添加する。ＰＣＴ／ＧＢ９５／００２１５中に示すような密閉反応室中でスライドをシ −ルする。これをｐＨＣ３Ｔｅｃｈｎｅサーマルサイクラ−の平なブロック上に置き、密閉反応器の中に２００ユニットのＭ−ＭＬＶＲＴを添加し、４２℃で２時間、次いで９５℃で５分、引き続き１５℃で５分間加熱して最初の加熱サイクルを完了させる。２）次いでスライドを試薬（２）で完全に洗浄する、３）続いて、組織切片標本を４３０μｌの試薬（３）で覆う。これに１．２５ユニットのＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼを添加し、この全体を９５℃で５分間加熱し、続いて５８℃で２分間、７５℃で１．５分そして９５℃で１分間加熱のサイクルを３０回繰り返す。この操作は７２℃で１０分間加熱することで完了させる。４）次いでこのスライドを試薬（２）で完全に洗浄しエピ蛍光顕微鏡で観察する。in situ はしか検出キット１用試薬試薬１（ＲＴバッファ−−プライマ−含有）１０×ＰＣＲバッファ− ＭｇＣｌ₂ ｄＮＴＰｓＲＮＡガ−ドランダムヘキサマ− ＤＥＰＣ処理水必要な最終処理濃度で試薬２（洗浄バッファ−）リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．５試薬３（ＰＣＲバッファ−−プライマ−含有）１０×ＰＣＲバッファ− ＭｇＣｌ₂ ＤＮＴＰＳプライマ−１）５’修飾されたプライマ−２）或いは＋Ｄｉｇ−ＵＴＰ滅菌２回蒸留水必要な最終処理濃度で酵素Ｍ−ＭＬＶＲＴ（例えばギブコＢＲＬ製）ＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼ（例えばギブコＢＲＬ製）実施例８ｂ）in vitro キット２増幅によるはしか核酸検出全ＲＮＡは、例えばChirgwinらのBiochemistry（１９７９年）、１８、５２９４から５２９９に記載の方法により目的とする組織から製造できるであろう。診断試験は以下の工程によりなされる：１）０．４μｇのＲＮＡに十分量の５×試薬（４）１及びＤＥＰＣ処理した滅菌２回蒸留水を２０μｌの容量になるまで添加する。２）増幅の標的として低コピ−数細胞ＵＩＡＲＮＡを使用した内部コントロ− ル逆転写ＰＣＲのために、全ＲＮＡから１部分をとる（１００ｎｇ含有）。３）はしかＲＮＡの＋鎖と−鎖の両者に対して特異的なオリゴヌクレオチドにアミノリンクした磁気ビーズを使用して、ＵＩＡポジティブＲＮＡ試料にたいしハイブリッドキャプチャ−を行う。４）磁気ビーズを分離し、５０μｌの溶出バッファ−を使用してはしかＲＮＡを溶出する。５）溶出物５μｌを、関連のポジティブ及びネガティブコントロ−ルと共にはしか逆転写ＰＣＲに使用する。６）２００ユニットのＭ−ＭＬＶＲＴを添加し、４２℃で２時間、３０分インキュベ−トする。７）得られたｃＤＮＡ生成物を取り、製造業者指示に従いアミコンミクロコン３０カートリッジを使用して精製する。８）工程３からの精製したｃＤＮＡ生成物の１０μｌを取り１０×試薬（５）及び滅菌２回蒸留水で３９μｌにする。９）１ユニットのＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼを添加し、９５℃で１０分間加熱し、続いて５８℃で１分間、７２℃で１分間、９５℃で１分間加熱のサイクルを３５回繰り返す。７２℃で５分間で１サイクル加熱することにより完了させる。１０）工程５からの反応生成物を１μｌを取り１０×試薬（６）及び滅菌２回蒸留水で２３μｌにする。１１）１ユニットのＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼを添加し、工程５のような加熱サイクルを３５サイクルではなく２５サイクル行う。１２）工程７からの生成物の１８μｌを取り、２μｌの重層用色素を添加し、１％アガロ−スゲルで電気泳動を行い所望のｋｂｐの生成物を同定する。in vitro はしか検出用キット２の試薬試薬４（ＲＴバッファ−）ＲＴバッファ− ＤＴＴｄＮＴＰｓＲＮａｓｅ阻害剤オリゴ（ｄＴ）_12-18 ５×使用時濃度試薬５（ＰＣＲバッファ−１−プライマ−含有）ＰＣＲバッファ− ＭｇＣｌ₂ Ｗ−１ｄＮＴＰｓＭＶ１）外部プライマ− ＭＶ２）１０×使用時濃度試薬６（ＰＣＲバッファ−２−プライマ−含有）ＰＣＲバッファ− ＭｇＣｌ₂ Ｗ−１ｄＮＴＰｓＭＶ４）内部プライマ− １０×使用時濃度で酵素Ｍ−ＭＬＶＲＴ（例えば、ギブコＢＲＬ製）ＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼ（例えば、ギブコＢＲＬ製）追加としてＤＥＰＣ処理した滅菌２回蒸留水アミコンミクロコン３０サイズ分画カ−トリッジ実施例９はしかウイルスＮ遺伝子配列のＮＡＳＢＡ増幅１．温かいＮＡＳＢＡバッファ−とプライマ−とを室温で混合し、無菌室で２０ μｌ反応物用マスタ−ミックスを作る。２．マスタ−ミックスをエッペンドルフ管に等分し、Cosbyら、１９８９年の方法で製造した反応物当たり１００ｎｇのテンプレ−トＲＮＡを添加する。３．この管を６５℃で５分間保持してＲＮＡを変性させ、次いで４１℃で５分間保持する。４．酵素ミックスを室温まで温め、次いで反応ミックスに添加する。５．水浴中で４１℃で９０分間インキュベ−トする。６．ノ−ザンブロッティング法で、或いは酵素−結合ゲルアッセイ（例えば、ＥＬＧＡ、ＯｒｇａｎｏｎまたはＴｅｃｈｎｉｋａ製）を使用して反応生成物を検出する。実施例１０ＮＡＳＢＡを使用するはしかＲＮＡ抽出及び検出は以下の工程を使用して行った：１．３ｍｌの全ＲＮＡ単離試薬（Advanced Biotechnology）中で最大５００ｍｇの組織を均質化する。全ＲＮＡ抽出法はChomozynskiらのワンステップＲＮＡ単離法に基づいている。細胞を使用するならば、１ｍｌの試薬中にペレットを再懸濁させる。血液を使用するならば、５倍量の試薬と混合させる。２．全ＲＮＡを抽出し、ＤＥＰＣ処理したｄＨ₂Ｏの１００μｌ中でペレットを再懸濁させる。３．抽出したＲＮＡ溶液の光学密度を測定し、１．５％アガロ−スゲルでのゲル電気泳動によりＲＮＡの完全であるかを決定する。４．増幅のための標的としての低コピ−数細胞性Ｕ１ＡＲＮＡを使用して内部コントロールＮＡＳＢＡをおこなうため全ＲＮＡから一部分（１００ｎｇを含有する）をとる。５）はしかＲＮＡの＋鎖と−鎖の両者に対して特異的なオリゴヌクレオチドにアミノリンクした磁気ビ−ズを使用して、ＵＩＡポジティブＲＮＡ試料にたいしハイブリッドキャプチャ−を行う。６）磁気ビーズを分離し、５０μｌの溶出バッファ−を使用してはしかＲＮＡを溶出する。７）溶出物５μｌを、関連のポジティブ及びネガティブコントロ−ルと共にはしかＮＡＳＢＡに使用する。内部セイヨウワサビペルオキシダ−ゼ−標識オリゴヌクレオチドを使用し、酵素結合ゲル電気泳動で特異的なＮＡＳＢＡ生成物を検出する。はしかＮＡＳＢＡはしかＮＡＳＢＡは、はしかウイルスゲノムのヌクレオプロテイン領域に特異的なプライマ−、例えば、プライマ−ＡＢ２０及びＡＢ２２を使用して行われるべきである。特異的なＮＡＳＢＡ生成物は内部オリゴプロ−ブ、例えばＡＢ２０を使用して検出されるべきである。実施例１１はしかウイルスのin situハイブリダイゼ−ション検出はしかウイルスＲＮＡは、例えばパラフィン或いはアラルダイトで包埋したまたは凍結した組織切片標本中、in situハイブリダイゼ−ションによりin situ検出可能である。ハイブリッドの検出は、例えば蛍光或いはオ−トラジオグラフィ−により直接的に、または例えば化学発光或いは蛍光によりハイブリッドの検出を可能にするレポ−タ−分子とハイブリッドを反応させることにより間接的に行うことができる。以下に示す実施例の方法は、ビオチン化した一本鎖ＲＮＡプロ−ブを使用してついでハイブリッドの免疫検出を行って組織切片標本中のはしかウイルスＲＮＡを同定する方法である。このプロ−ブはＮ遺伝子配列から編み出されたものであり（Cosbyら、１９８９年）、１８６ｂｐの長さである。このプローブは遺伝子バンク配列デ−タベースに含まれているはしかウイルスの全てのヌクレオカプシドに特異的であるが、極めて関連性の高いモービリウイルス（イヌのジステンパ −ウイルス）とは反応しない。ハイブリダイゼ−ション１．半薄切片或いは超薄切片標本のいずれかを取り出し、パラフィンが付着していれば脱ワックス化及び（スライド上で）再水和し、２００μｌのプロテナ−ゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１５ｍｌ３７℃でインキュベ−トする。２．ＤＥＰＣ処理水で洗浄し、５分間パラホルムアルデヒドで固定する。３．ＤＥＰＣ処理水で切片標本を洗浄する。４．ハイブリダイゼ−ション化バッファ−を添加し、４２℃で１６時間インキュベートする。５．０．６％ＮａＣｌ、１０ｍＭのＨＣｌ（ｐＨ７．０）、ImmolＥＤＴＡで２５℃で５分間洗浄する。６．ＤＥＰＣ処理水で切片標本を洗浄する７．４５％ｖ／ｖホルムアミド洗浄バッファ−で切片標本を２８℃で３０分間洗浄する。８．ＤＥＰＣ処理水で切片標本を洗浄する。９．０．１×ＳＳＣで４０℃で６０分間切片標本を洗浄する１０．２５℃で５分間切片標本をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄する。溶液ハイブリダイゼ−ションバッファ−（最終濃度）ホルムアミド（５０％ｖ／ｖ）５×ＳＳＣ５×デンハルト溶液(Denhardts solution) ０．２５ｍｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ０．５ｍｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡ１０％硫酸デキストランＤＥＰＣ処理水プロ−ブＲＮＡ≦１００ｎｍｏｌ検出（Cosbyら、１９８９年及びMcQuaidら、１９９０年、から採用した）１．１：４０希釈したモノクロ−ナルマウス抗ビオチン抗体を３７℃で３０分間切片標本に供給する。２．過剰のリン酸緩衝生理食塩水で２回切片標本を洗浄する。３．１：９０希釈したビオチン化抗マウス抗体を添加し３７℃で３０分間インキュベ−トする。４．過剰のリン酸緩衝生理食塩水で切片標本を２回洗浄する。５．１：５００希釈したペルオキシダ−ゼ複合体を添加し、２５℃で３０分間インキュベ−トする。６．過剰のリン酸緩衝生理食塩水で切片標本を８分間洗浄する。７．基質３−アミノ−９−ジエチルカルバゾ−ルを添加し、２５℃で１０分間放置する。８．流水で切片標本を１０分間洗浄する。９．風乾し、顕微鏡で観察する。１０．必要なら、切片をメイヤ−ヘマトキシリンで対比染色できる。前記の技術を使用する検出キットは以下からなる：（ａ）リボプロ−ブ；（ｂ）ハイブリダイゼ−ションバッファ−；（ｃ）プロテイナ−ゼＫ；（ｄ）ＲＮａｓｅＡ；及び（ｅ）抗体及び検出試薬。ポジティブ及びネガティブコントロ−ルも包含し、ネガティブコントロ−ルはハイブリダイゼ−ション及び検出前に、任意の２連試料をＲＮａｓｅＡで３７ ℃で１時間前処理することにより作成できる。キット用のポジティブコントロ− ルはプラスミドに入れた転写テンプレ−トの試料であり、切片標本の検出のためにはこのコントロ−ルは既知のＳＳＰＥ感染組織の試料でもよい。本願発明に従うキットは、腸の生検からの組織試料から、血液及びリンパのような体液から、便抽出物からも、クロ−ン病の指標であるはしかＲＮＡを確認する。従って、本願発明はクロ−ン病及び潰瘍性大腸炎の検出用診断システム、該システムを利用する検定キット、及びそれから派生する治療システムに関する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．腸組織、腸の産生物、或いは体液中のはしかウイルスＲＮＡ又はその特有な代謝産物を検出する手段からなる、クロ−ン病及び／又は潰瘍性大腸炎の検出用診断システム。２．ウイルスＲＮＡ検出用該手段がin situ或いはin vitroで核酸に基づく試験を実行する手段からなる請求項１記載のシステム。３．該試験がポリメラ−ゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）または核酸に基づく増幅反応（ＮＡＳＢＡ）から選択された、ヌクレオチド増幅或いはハイブリダイゼ− ション反応からなる請求項２記載のシステム。４．ａ）はしかＲＮＡを抽出し、ＮＡＳＢＡを使用して検出する；ｂ）特異的なはしかウイルスＲＮＡ／ｍＲＮＡを増やす；及びｃ）ＮＡＳＢＡ及び／又はＲＴ−ＰＣＲを繰り返す、工程からなる請求項３記載のシステム。５．プライマ−がＲＮＡはしかウイルスから逆転写されたＤＮＡに特有なオリゴヌクレオチド配列で５’が修飾されたものからなる、緩衝されたプライマ−を含有する請求項２から４のいずれかに記載のシステム。６．ＲＮＡはしかウイルスに特有なＲＮＡテンプレ−トからなる請求項２から４のいずれかに記載のシステム。７．プライマ−にＤＮＡの増幅後検出を可能にするレポ−タ−分子が付いている請求項２から５のいずれかに記載のシステム。８．レポ−タ−部分が蛍光色素性のものである請求項７記載のシステム。９．以下の試薬：（１）Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素；（２）ランダムヘキサマ−及び／又はオリゴ（ｄＴ）_12-18；（３）前記（１）用の反応バッファ−；（４）ＰＣＲ反応バッファ−；及び（５）レポ−タ−分子を有する５’修飾されたＰＣＲプライマ− からなる請求項５記載のシステム。１０．さらに、既知濃度の溶液中のはしかウイルスＲＮＡからなるポジティブコントロ−ル、及びネガティブコントロ−ル或いは両者を提供する手段からなる前記した請求項のいずれかに記載のシステム。１１．ｍＲＮＡ、蛋白質又は抗原を含む特有な代謝産物が、野生型か或いは弱毒化ワクチンはしかウイルスに特有のものである前記した請求項のいずれかに記載のシステム。１２．該特有な代謝産物がヌクレオカプシドプロテイン、ホスホプロテイン、ラ −ジプロテイン、マトリックスプロテイン、ＲＮＡポリメラ−ゼコンプレックス、ヘマグルチニンプロテイン、フュ−ジョンプロテイン、及び／又は免疫学的方法で検出可能なそれらの特徴的な産物を形成するための遺伝子配列又はその代謝産物から選択される、請求項１１記載のシステム。１３．該免疫学的検出法が、免疫組織化学又はエリザ法、放射性同位元素標識免疫測定或いは酵素結合ゲル法で達成される請求項１２記載のシステム。１４．（ａ）組織試料を得て、密閉反応器に固定する；（ｂ）ＰＣＲバッファ−、ＭｇＣｌ₂、ＤＮＴＰ、ランダムヘキサマ−からなる試薬を添加し、所望の希釈率まで水で希釈する；（ｃ）次いで密閉反応器を閉じ、Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴを添加し、少なくとも１サイクルの加熱サイクルを行わせる；（ｄ）洗浄バッファ−で処理する；（ｅ）緩衝したＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼ、ＭｇＣｌ₂、ＤＮＴＰ及びプライマ−を予め規定した希釈率で添加し、次いで少なくとも２５サイクルの加熱サイクルを行う；及び（ｆ）引き続き、工程（ｄ）を繰り返し、はしかウイルスＲＮＡの存在を同定するために標識された生成物を目視する工程からなるクロ−ン病及び／又は潰瘍性大腸炎の分析方法１５．Ｄｉｇ−１１又は蛍光標識した塩基プライマ−を使用する請求項１４記載の方法。１６．適当な組織からはしかウイルスＲＮＡを取り出し、（ａ）密閉反応器中でこれにＤＴＴ、ＤＮＴＰ類、ＲＮａｓｅ阻害剤及びオリゴ（Ｄｔ）_12-18からなるバッファ−を添加して水性濃度を低下させ；（ｂ）Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴを添加し、ｃＤＮＡ生成物を与えるためにインキュベ−トする；（ｃ）生成物を精製し、ＭｇＣｌ₂、ｄＮＴＰ及び外部プライマ−と共にＰＣＲバッファ−を添加する；（ｄ）引き続きＴａｇＤＮＡポリメラ−ゼを添加し、少なくとも１５サイクル加熱する；（ｅ）このように形成された反応生成物の一部を回収し、内部プライマ− を有する緩衝されたＰＣＲ及びさらにＴａｇＤＮＡポリメラーゼを添加し、少なくとも１５サイクル再サイクルさせる；及び（ｆ）このように形成された生成物を取り出し、重層用色素を添加し、染色された生成物を電気泳動にかけて、選んだ生成物バンドを同定する；（ｇ）増幅した生成物の配列を決定する、或いは同種又は異種の特異的ブロ−ブと増幅した生成物をハイブリダイズさせて「野生」型はしかウイルスからワクチン株はしかウイルスを識別する、ことからなるクロ−ン病及び／又は潰瘍性大腸炎の試料のin vitro分析方法。１７．適当な組織からはしかウイルスＲＮＡを取り出し、（ａ）これにさらに室温まで温めたＵＴＰとバッファ−とプライマー混合物からなるバッファを添加し；（ｂ）それをテンプレートＲＮＡからなる反応ミックスに分注して混合物を６５℃で５分間、ついで４１℃で５分間加熱し；（ｃ）ＲＮＡポリメラーゼからなる酵素ミックスを更に加え；（ｄ）水浴中４１℃で９０分間インキュベートし；（ｅ）反応産物をノーザンブロット又は酵素連結ゲル法により検出し；（ｆ）増幅した生成物の配列を決定する、或いは同種又は異種の特異的プロ−ブと増幅した生成物をハイブリダイズさせて「野生」型はしかウイルスからワクチン株はしかウイルスを識別することからなるクロ−ン病及び／又は潰瘍性大腸炎の試料のin vitro分析方法。１８．増幅反応中のアニーリングの温度が４０℃と６５℃の間である、前記請求項のいずれかに記載のシステム。１９．方法が弱毒化はしかウイルスワクチンと野生型ウイルスとを識別できるものである、前記請求項のいずれかに記載のシステム。２０．in vivoでのはしかウイルスの発現、複製、転写、ＲＮＡプロセシング、及び／またはｍＲＮＡ輸送、あるいはそのいずれかの組合せを阻害する手段からなる、クローン病及び／または潰瘍性大腸炎の治療のための医薬。２１．ゲノム又はアンチゲノムＲＮＡのいずれかに対するはしかウイルスアンチセンスＲＮＡとそのベクターからなる請求項１９記載の医薬。２２．医薬がはしかウイルスペプチド又は炭水化物抗原又はそのモノクローナルもしくはポリクローナルアナログである、請求項１９記載の医薬。２３．はしかウイルス及び／またはその成分タンパク質抗原に対する特異的免疫応答を誘導できるように改変され発現システムに組み込まれた一部又は全部のはしかウイルスゲノムからなるはしかワクチン。