JPH11502133A - フローエレクトロポレーションチャンバー及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、患者から血液を回収し、赤血球を分離し、任意に血漿及び修飾された赤血球を再び組合せすることにより、修飾された生物学的特徴を持つ血液を製造する、任意に自動化された、連続流動式の、自給エレクトロポレーションシステム（５）によって特徴づけられる、赤血球内に生物学的活性物質を被包させる方法及び装置に関する。本発明は、特に、ヘモグロビンのアロステリックエフェクターを被包させる用途に適しており、それによって、赤血球の酸素に対する親和性を低下させ、組織中における赤血球からの酸素の放出を改善する。血液は、供給口（１１）からシステム（５）に導入され、抗凝固剤（２７）と混合される。血液と抗凝固剤の混合物は、フィルター（１８）を通り、血液の分離洗浄槽（４４）へ送られる。血漿及び白血球は血漿貯蔵槽（８９）に送られ、一方、赤血球は洗浄槽（４４）中に保持される。分離された赤血球は、ポンプで汲み上げ、貯蔵器（５０）からのＩＨＰ溶液と、接合部（６７）で混合される。この混合物は冷却コイル（６８）によって冷却され、続いて処理のためのエレクトロポレーションチャンバー（７２）へ送られる。

Description

【発明の詳細な説明】 フローエレクトロポレーションチャンバー及び方法 技術分野 本発明は、種々の細胞集団内に生物学的活性物質を被包させる方法及び装置に 関する。さらに具体的には、本発明は、細胞内のヘモグロビンの物理的特徴を治 療に好ましいように変化させるために、エレクトロポレーション（電気穿孔法） によって赤血球内にヘモグロビンのアロステリックエフェクターを被包させる方 法及び装置に関する。 発明の背景 成人の血管系内では、血液の容量は約５〜６リットルである。この容量の約半 分は、赤血球、白血球及び血小板などの細胞によって占められている。赤血球は 、血液の細胞性成分の大部分を構成する。血液の液体部分である血漿は、約９０ ％が水であり、１０％が種々の溶質である。これらの溶質には、血漿タンパク質 、有機中間代謝物及び老廃物並びに無機化合物が含まれる。 赤血球の主要な機能は、酸素を肺から体の組織へ輸送し、二酸化炭素を組織か ら肺へ除去のために輸送することである。酸素は水溶液中にわずかしか溶解しな いことから、ほとんどの酸素は血漿によって輸送されない。血液によって運ばれ る酸素の大部分は、赤血球のヘモグロビンによって輸送される。哺乳類の赤血球 は、核、ミトコンドリアまたはあらゆる他の細胞内オルガネラを含んでおらず、 赤血球自身の代謝において酸素を使用しない。赤血球は、約３５重量％のヘモグ ロビンを含有しており、ヘモグロビンは酸素と結合しこれを輸送する。 ヘモグロビンは、約６４，５００ダルトンの分子量を有するタンパク質である 。ヘモグロビンは、４本のポリペプチド鎖と、鉄原子が２価の状態で結合する４ つのヘム補欠分子族を含有する。ヘモグロビン分子のタンパク質部分である通常 のグロビンは、２本のα鎖と２本のβ鎖から構成される。４本の鎖はそれぞれ、 鎖が折りたたまれた特徴的な３次構造を有する。その４本のポリペプチド鎖は、 お よそ四面体に配置されて一つに組合わさり、ヘモグロビンの特徴的な４次構造を 構成する。分子状酸素の一分子に可逆的に結合する能力のある一つのヘム基が、 それぞれのポリペプチド鎖に結合している。ヘモグロビンが酸素と結合すると、 オキシヘモグロビンが形成される。酸素が放出されるときには、オキシヘモグロ ビンはデオキシヘモグロビンに還元される。 組織への酸素の輸送は、血流量、赤血球数、赤血球中のヘモグロビン濃度、ヘ モグロビンの酸素親和性、及び、いくつかの種では、高及び低酸素親和性を有す る赤血球内のヘモグロビンのモル比などの、しかしこれらに制限されない、いく つかの因子に依存する。さらに、ヘモグロビンの酸素親和性は４つの因子に依存 する。即ち、（１）酸素分圧、（２）ｐＨ、（３）ヘモグロビン中のアロステリ ック効果を有する２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）の濃度、及び（４） 二酸化炭素濃度である。肺では、１００ｍｍＨｇの酸素分圧で、およそ９８％の 循環ヘモグロビンが酸素で飽和する。これは血液の総酸素輸送能力を表す。完全 に酸素が結合した場合、１００ｍｌの哺乳類全血液は、約２１ｍｌの気体の酸素 を運ぶことができる。 ヘモグロビンの酸素との結合能に対する酸素分圧及びｐＨの効果は、ヘモグロ ビンの酸素飽和曲線を調べることによって最も良く説明される。酸素飽和曲線は 、ヘモグロビン分子の溶液が気相における種々の酸素分圧と平衡状態にあるとき に、酸素分子によって占められるヘモグロビン分子の総酸素結合部位のパーセン テージをプロットする。 ヘモグロビンの酸素飽和曲線はＳ字状である。従って、酸素の第一の分子が結 合することによって、残りのヘモグロビンが他の酸素分子に結合する親和性が増 加する。酸素分圧が上昇するにつれて、各ヘモグロビン分子が飽和して上限であ る酸素４分子を含むプラトーに近づく。 ヘモグロビンと酸素との可逆的な結合は、次式に従って、プロトンの放出を伴 う。 従って、ｐＨの上昇によって平衡が右に移動し、与えられた分圧において、ヘモ グロビンはさらなる酸素と結合する。ｐＨが低下すると結合する酸素の量が減少 する。 肺において、エアスペースの酸素分圧はおよそ９０〜１００ｍｍＨｇであり、 ｐＨもまた通常の血液のｐＨ（７．６以下）よりも相対的に高い。従って、肺で は、ヘモグロビンは酸素でほとんど最大限に飽和される傾向がある。その圧力及 びｐＨでは、ヘモグロビンはおよそ９８％が酸素で飽和する。一方、末梢組織内 部の毛細管では酸素分圧は約２５〜４０ｍｍＨｇしかなく、ｐＨもまた相対的に 低い（約７．２〜７．３）。筋細胞は酸素を速いペースで消費し、酸素の局所濃 度を低下させるので、結合した酸素のいくつかが組織へ放出されやすくなる。血 液が筋肉中の毛細管を通過するにつれて、赤血球中でほとんど飽和しているヘモ グロビンから血漿、ひいては筋細胞中へ酸素が放出される。ヘモグロビンは筋肉 の毛細管を通過する際に、結合している酸素の約３分の１を放出し、その結果、 ヘモグロビンが筋肉を離れるときには、約６４％しか飽和していない。一般に、 組織を離れる静脈血中のヘモグロビンは、肺と末梢組織の間の反復回路において 酸素による飽和度は約６５％と９７％との間を反復する。従って、酸素分圧及び ｐＨは一緒に機能し、ヘモグロビンに酸素を放出させる。 ヘモグロビンの酸素化の程度を調整する第三の重要な因子は、アロステリック エフェクターである２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）である。ＤＰＧは 、哺乳類の赤血球におけるヘモグロビンの通常の生理学的エフェクターである。 ＤＰＧは肺の酸素分圧と関連して、赤血球中のヘモグロビンの酸素結合親和性を 調整する。一般に、細胞内のＤＰＧ濃度が高くなると、ヘモグロビンの酸素に対 する親和性が低くなる。 組織への酸素の輸送が慢性的に低下すると、正常な個体では赤血球中のＤＰＧ 濃度が上昇する。例えば、高度の高いところでは酸素分圧はかなり低い。これに 対応して、組織中の酸素分圧は低い。正常な被験者が高度の高いところへ移動し て数時間以内では、赤血球中のＤＰＧ値は上昇し、より多くのＤＰＧが結合し、 ヘモグロビンの酸素親和性が減少する。赤血球中のＤＰＧ値の上昇はまた、低酸 素症の患者でも起きる。この調節によって、ヘモグロビンに結合している酸素が より迅速に組織へ放出され、肺におけるヘモグロビンの酸素化の低下を補う。ヒ トが高度の高いところへ順応した後に高度の低いところへ降りると、逆の変化が 起こる。 ヘモグロビンは、血液から普通に分離された場合、かなりの量のＤＰＧを含有 する。ヘモグロビンからＤＰＧが「取り除かれる」と、ヘモグロビンの酸素に対 する親和性がより高くなる。ＤＰＧが増加すると、ヘモグロビンの酸素結合親和 性は低下する。従って、ＤＰＧのような生理学的アロステリックエフェクターは 、組織において、ヘモグロビンからの酸素の通常の放出に不可欠である。 ＤＰＧが哺乳類の赤血球において通常のヘモグロビンの生理学的エフェクター である一方、リン酸化されたイノシトールは、ある鳥類及び爬虫類の赤血球にお いて類似の役割を果たすことが発見されている。ＩＨＰは哺乳類の赤血球膜を通 過できないが、ＤＰＧの結合部位で哺乳類の赤血球のヘモグロビンと結合し、ヘ モグロビンのアロステリックコンホメーションを修飾することが可能であり、そ の効果はヘモグロビンの酸素親和性を低下させることである。例えば、ＤＰＧは イノシトール六リン酸（ＩＨＰ）と置き換えることができ、ＩＨＰはＤＰＧより 一層強力にヘモグロビンの酸素親和性を低下させる。ＩＨＰはヘモグロビンとの 親和性がＤＰＧの１０００倍であり[R．E．Benesch et al.，Biochemistry，Vol ．16，pp．2594-2597(1977)]、ｐＨ７．４及び３７℃において、ヘモグロビンの Ｐ₅₀を９６．４ｍｍＨｇまで増加させる[J．Biol．Chem.，Vol．250，pp．7093- 7098(1975)]。 哺乳類の赤血球の酸素放出能は、ヘモグロビンのいくつかのアロステリックエ フェクターを赤血球に導入することによって増強することが可能であり、それに よって、ヘモグロビンの酸素親和性は低下し、血液の酸素の効率的使用(oxygen economy)が改善される。この現象から、肺または循環器系の機能が不十分である ために組織の酸素供給が低下している個体を治療するための、様々な医学的適用 が示唆される。 これらの修飾された赤血球を使用することによって達成される、可能性のある 医学的利益のため、先行技術において種々の技術が開発され、赤血球内へのヘモ グロビンのアロステリックエフェクターの被包(encapsulation)が可能になった 。従って、被包操作を補助または簡素化するために多数の装置が設計された。こ の技術分野において知られている被包法としては、細胞の浸透圧パルス（膨張） 及び再構成、制御溶解及び再封、リポソームの取り込み、及びエレクトロポレー ションなどがある。エレクトロポレーションの現在の方法は、商業的使用に適し たスケールでは、操作が商業的に実用的ではない。 下記の文献では、ＩＨＰを封入したリポソームの相互作用による、ポリリン酸 の赤血球への取り込みが記載されている。Ｇersonde,et al.,"Ｍodification of the Ｏxygen Ａffinity of Ｉntracellular Ｈaemoglobin by Ｉncorporation of Ｐolyphosphates into Ｉntact Ｒed Ｂlood Ｃells and Ｅnhanced Ｏ2 Ｒe lease in the Ｃapillary Ｓystem",Ｂiblthca.Ｈaemat.,Ｎo.46,pp.81-92(1980 ); Ｇersonde,et al.,"Ｅnhancement of the Ｏ2 Ｒelease Ｃapacity and of t he Ｂohr-Ｅffect of Ｈuman Ｒed Ｂlood Ｃells after Ｉncorporation of Ｉ nositol Ｈexaphosphate by Ｆusion with Ｅffector-Ｃontaining Ｌipid Ｖes icles",Ｏrigins of Ｃooperative Ｂinding of Ｈemoglobin，(1982); 及びＷe iner，"Ｒight Ｓhifting of Ｈb-Ｏ₂ Ｄissociation in Ｖiable Ｒed Ｃells by Ｌiposomal Ｔechnique,"Ｂiology of the Ｃell,Ｖol.47,(1983)。 さらに、Nicolauらによる米国特許第４，１９２，８６９号、４，３２１，２ ５９号及び４，４７３，５６３号明細書には、流体を封入した脂質ベシクルを赤 血球細胞膜と融合させ、ベシクルの内容物を赤血球内に入れる方法が記載されて いる。この方法では、イノシトール六リン酸などのアロステリックエフェクター を赤血球内に輸送することが可能であり、赤血球内ではＩＨＰの結合定数がより 大きいことから、ＩＨＰはヘモグロビンにおける結合部位においてＤＰＣと置き 換わる。 リポソーム技術によれば、ＩＨＰはリン酸緩衝液中に飽和するまで溶解し、脂 質ベシクルの混合物を溶液中に懸濁させる。次にこの懸濁液を超音波処理または 注入工程に付し、次に遠心分離する。上部の懸濁液はＩＨＰを含有する小さな脂 質ベシクルを含み、次にこのベシクルを回収する。回収した懸濁液に赤血球を加 えてインキュベートし、この間にＩＨＰを含有する脂質ベシクルは赤血球膜と融 合し、ベシクルの内容物が赤血球内部に入る。次に、修飾された赤血球を洗浄し 、血漿に加えて製品を完成する。 リポソーム技術に関する欠点は、赤血球内に取り込まれるＩＨＰ濃度の再現性 が低いことと、処理後に赤血球がかなり溶血することである。さらに、操作が煩 雑でかつ複雑であることから、商業化は実際的ではない。 リポソーム技術に関する欠点を解決するための試みにおいて、赤血球を溶解し 再封する方法が開発された。この方法は、下記の発表中に記載されている。Ｎic olau，et al.，"Ｉncorporation of Ａllosteric Ｅffectors of Ｈemoglobin i n Ｒed Ｂlood Ｃells.Ｐhysiologic Ｅffects,"Ｂiblthca.Ｈaemat.,Ｎo.51,pp .92-107,(1985)。関連する、Roparsらによる米国特許第４，７５２，５８６号及 び４，６５２，４４９号明細書にもまた、ＲＢＣとリポソームの相互作用を避け て、赤血球の制御溶解及び再封による、ヒトまたは動物の赤血球内に生物学的活 性を有する物質を被包させる方法が記載されている この技術は、浸透圧パルス技術と類似した方法で機能する連続流動式透析シス テムとして、最も良く特徴づけられる。具体的には、少なくとも一つの透析要素 の第一のコンパートメントには、赤血球の水性懸濁液が連続的に供給され、一方 、透析要素の第二のコンパートメントは、赤血球懸濁液に関して低張である水溶 液を含む。この低張液は赤血球を溶解させる。赤血球の溶解産物は次に、赤血球 内に取り込ませる生物学的活性物質と接触させる。赤血球の膜を再封するために 、赤血球の溶解産物の浸透圧及び／またはコロイド浸透圧を上昇させ、再封され た赤血球の懸濁液が回収される。 関連する、Goodrichらによる米国特許第４，８７４，６９０号及び５，０４３ ，２６１号明細書には、赤血球の凍結乾燥及び再構成を包含する関連技術が開示 されている。赤血球を再構成する方法の一部として、イノシトール六リン酸を含 む種々のポリアニオンの添加が記載されている。開示された方法による赤血球の 処理によって活性が変化しない細胞が得られる。おそらく、ＩＨＰは再構成工程 の 間に細胞内に取り込まれ、それによってヘモグロビンの活性が維持される。 Francoらによる米国特許第４，４７８，８２４号及び４，９３１，２７６号明 細書には、細胞を効果的に溶解し再封することによって、イノシトール六リン酸 を含む有効な薬剤を哺乳類の赤血球内に導入する、第二の関連する方法及び装置 が記載されている。この方法は、「浸透圧パルス技術(osmotic pulse technique )」として記載されている。浸透圧パルス技術を実施する際には、封入された赤 血球の供給物が、細胞の内外に迅速に拡散する化合物を含有する溶液中に懸濁さ れそしてインキュベートされ、その化合物の濃度は細胞内へ拡散させるに十分で あって、その結果細胞の内容物は高張になる。次に、少なくとも一種の、導入さ れる所望の薬剤の存在下で、高張細胞を含有する溶液を本質的に等張な水性媒質 で希釈することによって、トランスメンブランイオン勾配が生成され、それによ って、結果として細胞の膨張および細胞外膜の透過性の上昇を伴う水の細胞内へ の拡散を引き起こす。この「浸透圧パルス」は、水を細胞内に拡散させ、結果と して、所望の薬剤に対する外側の細胞膜の透過性を上昇させる、細胞の膨張を引 き起こす。膜の透過性の上昇は、少なくとも一種の薬剤を細胞内に輸送し化合物 を細胞外に拡散させるのに十分な期間のみ維持される。 浸透圧パルス技術の実施に使用され得るポリアニオンには、水溶性で、赤血球 の脂質の外側の２層膜を破壊しない、ピロリン酸塩、トリポリリン酸塩、リン酸 化イノシトール、２，３−ジホスホグリセリン酸（ＤＰＧ）、アデノシン三リン 酸、ヘパリン、及びポリカルボン酸が含まれる。 浸透圧パルス技術には、被包の収率が低いこと、再封が不完全であること、細 胞内容物の損失、及び細胞の寿命が対応して短かくなることを含むいくつかの欠 点がある。この技術は煩雑でかつ複雑であり、自動化には適さない。これらの理 由から、浸透圧パルス技術は、商業的にはほとんど成功していない。 赤血球内に種々の生物学的活性物質を被包させるもう一つの方法は、エレクト ロポレーションである。エレクトロポレーションは、Mouneimneらが記載したよ うに、ＩＨＰ赤血球を含む、種々の細胞型への異質分子の被包に用いられてきた ("Ｓtable rightward shifts of the oxyhemoglobin dissociation curve induc ed by encapsulation of inositol hexaphosphate in red blood cells using electro poration,"ＦＥＢＳ,Ｖol.275,Ｎo.1,2,pp.117-120(1990))。 エレクトロポレーションの工程は、細胞またはベシクルを含有する液体細胞懸 濁液を横切る電界パルスの適用による、細胞膜またはあらゆるベシクルにおける 孔の形成を包含する。このポレーション工程では、細胞は液体媒質中に懸濁され 、次に電界パルスに付される。この媒質は、電解質、非電解質、または電解質と 非電解質の混合物であってもよい。懸濁液に適用される電界強度及びパルスの長 さ（電界が細胞懸濁液に適用される時間）は、細胞のタイプによって変化する。 細胞の外膜に孔を形成するために、電界は、孔を形成するのに十分な長さの期間 、細胞膜を横切って特定の電位を形成するような時間的長さ及び電圧で適用しな ければならない。 エレクトロポレーションの工程では、４つの現象が役割を果たすと思われる。 第一は、絶縁破壊の現象である。絶縁破壊は、細胞膜に小さな孔または穴を形成 する高電界の能力を意味する。一度孔が形成されると、細胞に生物学的活性物質 を封入することができる。第二の現象は、誘電束効果(dielectric bunching eff ect)であり、これは均一な電界内にベシクルを配置することによって作られる相 互自己引力(mutual self attraction)を意味する。第三の現象は、ベシクルの融 合である。ベシクル融合は、生物学的ベシクルの膜の傾向を表し、この膜は絶縁 破壊によって孔が形成されており、相互の絶縁破壊部位が接近するとベシクル同 士が結合する。第四の現象は、高周波数の電界の存在下で、細胞が軸の一方向に 沿って並ぶ傾向である。このように、エレクトロポレーションは、ベシクルの回 転前整列(rotational prealignment)、ベシクル束(vesicle bunching)及び比誘 電率、またはベシクルの、細胞ベシクルを封入する目的及び封入しない目的の使 用に関する。 エレクトロポレーションは、赤血球内へヘモグロビンのアロステリックエフェ クターを取り込む目的において有効に用いられてきた。Mouneimne，Yらの論文(" Ｓtable Ｒightward Ｓhifts of Ｏxyhemoglobin Ｄisassociation Ｃonstant Ｉnduced by Ｅncapsulation of Ｉnositol Ｈexaphosphate in Ｒed Ｂlood Ｃ ells Ｕsing Ｅlectroporation",ＦＥＢＳ,Ｖol.275,Ｎo.1,2,pages 11-120(Ｎo vember 1990))にお いて、Mouneimneらは、ＩＨＰを取り込んだ、処理をした赤血球において、ヘモ グロビン−酸素の解離が右にシフトされ得ることを報告した。ＩＨＰを封入した 後２４時間及び４８時間での測定によって、赤血球の再封が永続的であることを 示す安定したＰ₅₀値が得られた。さらには、イノシトール六リン酸を封入した赤 血球の半減期が、通常の１１日間であることが示された。しかしながら、Ｍoune imneらが得た結果では、再注入された細胞の約２０％が注入後の最初の２４時間 以内に失われたことが示されている。 先行技術に開示されたエレクトロポレーション法は、大容量のサンプルの処理 や、高電荷または反復的な電荷の使用には適さない。さらには、それらの方法は 、連続的または「流動式(flow)」のエレクトロポレーションチャンバーでの使用 には適さない。入手可能なエレクトロポレーションチャンバーは、固定使用のた めだけに設計されている。即ち、バッチでのサンプルの処理である。「固定(sta tic)」チャンバーを連続使用すると、チャンバーがオーバーヒートし、細胞溶解 が増加する。さらには、既存の技術では、血液の酸素運搬能力を劇的に変化させ るのに、処理された細胞の充分なパーセンテージで充分な量のＩＨＰを取り込ま せることができない。加えて、先行技術の方法は、精巧な設備を必要とし、治療 間際の患者の赤血球を封入するのには適さない。このように、この方法は多くの 時間を必要とし、商業的スケールでの使用には適さない。 必要とされるのは、細胞の完全性及び生物学的機能を保ちながら、赤血球内に 生物学的活性物質を被包させる、簡単で効率的かつ迅速な方法である。生物学的 に変化させた血液細胞は治療に適用される可能性があることから、無傷の赤血球 内のヘモグロビンのアロステリックエフェクターを含む生物学的活性物質を被包 させる、より簡単、より有効で完全な方法の必要性が考えられる。 ヘモグロビンに結合する酸素の組織輸送を増加させる治療が有益である臨床状 態は多数存在する。例えば、今日の米国における主要な死因は心血管系疾患であ る。うっ血性心不全、心筋梗塞、卒中(stroke)、間欠性跛行、及び鎌状赤血球貧 血を含む、多様な心血管系疾患の急性症状及び病理は、組織を浸す流体中の酸素 の供給が不十分であることから起こる。同様に、出血、外傷性損傷、または手術 の後の急性の血液損失によって、生体器官への酸素供給が減少する。酸素がない と、心臓から遠い組織、及び心臓そのものまでもが、その正常な機能を維持する ために充分なエネルギーを産生することができない。酸素剥奪の結果は、組織死 及び器官不全である。 米国民は、運動、適当な食事習慣、及びアルコール消費の節制など、心疾患を 軽減するために必要とされる予防的な方法に以前から注目していたが、死亡は驚 くべき割合で発生し続けている。死亡が、組織の破壊及び／または器官不全を引 き起こす酸素剥奪によって起こるため、心疾患の生命にかかわる結果を軽減する 一つのアプローチは、急性の負荷がかかっている間、組織の酸素供給を増やすこ とである。同じアプローチは、出血や、うっ血性心不全などの慢性低酸素性疾患 を罹患する患者にも適している。 酸素の組織への輸送の増加が有効であるもう一つの状態が貧血である。相当な 割合の入院患者は、血液の赤血球またはヘモグロビンの量が不十分であることか ら、貧血や低「クリット(crit)」を経験する。このことによって組織への酸素供 給が不十分となって、合併症が発症する。典型的には、医師は患者に赤血球製剤 を数ユニット輸血することによって、この状態を一時的に補正することができる 。 血液の酸素供給を増強することによって、より多くの症例で異種輸血の数が削 減され、自己血液の輸血も可能になる。貧血の治療または血液損失の置換に用い られる現在の方法は、ヒト全血の輸血である。米国では毎年、３〜４百万人の患 者が手術または治療時に輸血を受けていると見積もられている。より時間のある 状況では、ドナーの血液すなわち異種の血液の使用を完全に回避して、代わりに 自己血液を使用するほうが有利である。 自己血液の使用は、手術に先立って採血し保存され得る血液の量によって制限 されることが多い。典型的には、手術患者は、手術前に充分な量の血液を採取す る充分な時間がない。外科医は、血液を数ユニット入手可能にしたいと考える。 血液採取にはユニット毎に数週間の間隔が必要であり、手術前２週間以内は採血 できないことから、充分量の供給血液を採血することはしばしば不可能である。 ＩＨＰで自己血液を処理することによって、必要とされる血液量は少なくなり、 異種の血液の輸血を完全に回避することが可能となる。 ＩＨＰ処置を行った赤血球は未処置の赤血球の２〜３倍量の酸素を輸送するの で、多くの場合、医師はＩＨＰ処置を行った赤血球のより少ないユニット数しか 輸血を必要としないであろう。このことは、患者の異種の血液との接触を少なく し、血液提供者由来のウイルス性疾患との接触の程度を低減し、輸血に派生する 免疫機能障害を最小限にする。より効率的な赤血球を注入する能力は、患者の血 液容量が過剰である場合においても有利である。酸素輸送が足りない、他のより 重症な症状においては、患者の組織の酸素供給を迅速に改善する能力によって生 命が救われている。 組織への酸素供給を増強する方法には医療への応用の可能性があることは明ら かであるが、現在は、ヘモグロビンに結合する酸素の組織輸送を増加させる臨床 的に利用可能な方法はない。ＤＰＧまたはＤＰＧの前駆体である化合物を使用し た実験動物において、一過性の、６〜１２時間の酸素付着の増加が報告されてい る。しかし、インビボではＤＰＧ合成が自然に調節されること及びその生物学的 半減期が相対的に短いことから、ＤＰＧ濃度及び組織ＰＯ₂の上昇期間は制限さ れ、従ってＤＰＧの治療における有用性が制限される。 必要とされるのは、赤血球を傷つけることなく、赤血球内にＩＨＰなどの生物 学的活性物質を被包させる、簡単で効率的かつ迅速な方法である。 発明の概要 本発明は、種々の細胞集団内に生物学的活性物質を被包させる方法及び装置に 関する。さらに具体的には、本発明は、赤血球内にイノシトール六リン酸などの 化合物または組成物を被包させるための、自動化された自給の流動式装置の一部 を形成し得る、エレクトロポレーションチャンバーを提供するものであって、そ れによって、ヘモグロビンの酸素に対する親和性を低下させ、赤血球による組織 への酸素の輸送を増強する。被包は好ましくはエレクトロポレーションによって 達成されるが、本発明の実施においては、被包の他の方法が用いられることも可 能であることが予想される。本発明の、エレクトロポレーションチャンバーを包 含する方法及び装置は、種々の細胞集団内に様々な生物学的活性物質を被包させ るのに同等に適している。 本発明の装置及び方法は、細胞及び脂質ベシクル内に種々の生物学的活性物質 を取り込ませるのに適している。本発明の方法、装置及びチャンバーは、製造さ れるかまたは天然に存在するベシクル中に化合物または生物学的活性物質を導入 するために使用することができる。例えば、本発明の装置、方法、及びチャンバ ーは、赤血球中にＩＨＰを導入するために使用することができる。 本発明によれば、エレクトロポレーションによる赤血球内へのイノシトール六 リン酸の被包によって、細胞の寿命、ＡＴＰ値、Ｋ＋値、または正常のレオロジ ー的能力に影響を与えることなく、酸素に対するヘモグロビンの親和性が著しく 減少する。加えて、ボーア効果は、Ｏ₂結合曲線が右にシフトする以外は変化し ない。赤血球の酸素親和性の低下によって、赤血球が結合する酸素を解離する能 力が上がり、従って組織への酸素供給が改善される。赤血球の酸素放出能の増強 によって、心拍出量の低下、動静脈差の増加、及び組織の酸素供給の改善などの 、著しい生理学的効果がもたらされる。 本発明に従って調製される、修飾された赤血球は酸素放出能が改善されており 、下記に示したような状況において使用することができる。 １．高度の高い所など、酸素分圧の低い条件下、 ２．気腫の発症など、肺の酸素交換面が減少している場合、 ３．肺炎または喘息の発症など、肺において酸素拡散に対する抵抗が増加してい る場合、 ４．赤血球減少症または貧血の発症など、赤血球の酸素輸送能が低下している場 合、または動静脈シャントを使用している場合、 ５．動脈硬化、血栓塞栓症、組織の梗塞、うっ血性心不全、心機能不全または虚 血などの、血液循環障害を治療するため、 ６．ヘモグロビンの突然変異、ヘモグロビン鎖のＮ末端アミノ酸の化学的修飾、 または赤血球の酵素欠損などの、ヘモグロビンの酸素親和性が高い状態を治療す るため、 ７．酸素供給を改善することによって、解毒過程を加速するため、 ８．保存血液の酸素親和性を低下させるため、または ９．種々のガン治療の有効性を改善するため。 本発明の方法及び装置によれば、血液中の酸素の効率的使用の改善に貢献する 、修飾された赤血球を製造することが可能である。この修飾された赤血球は、赤 血球膜のエレクトロポレーションによって、ＩＨＰなどのアロステリックエフェ クターを取り込ませることによって得られる。 赤血球内へのヘモグロビンのアロステリックエフェクターの被包を含む、本発 明の方法による細胞内への生物学的活性物質の取り込みは、自動化された、フロ ーエレクトロポレーション装置によって、体外で行われる。簡単に述べると、細 胞懸濁液を、フローエレクトロポレーション装置の分離洗浄槽チャンバーに導入 する。細胞を懸濁液から分離し、洗浄し、細胞内に導入する生物学的活性物質の 溶液中に再懸濁させる。この懸濁液をエレクトロポレーションチャンバーに導入 し、次にインキュベートする。エレクトロポレーション及びインキュベーション の後、細胞を洗浄し分離する。被包されていない生物学的活性物質が全て除去さ れていることを確認するために、不純物混入のチェックを任意に実施する。次に 、細胞を保存または患者へ再導入するために調製する。 本発明に従って、また好ましい実施態様に関して、血液を患者から採取し、採 取した血液から赤血球を分離し、アロステリックエフェクターを取り込ませるこ とによって赤血球を修飾し、そして修飾された赤血球と血漿を再構成する。この 方法では、ＩＨＰで修飾された赤血球を含有する血液を調製し保存することが可 能である。 本発明の装置は、細胞内に生物学的活性物質を被包させるための改良された方 法を提供し、自給式であり、従って無菌の装置、短縮された時間内に大容量の細 胞を処理できる装置、不純物混入の検出、冷却及びインキュベーションエレメン トが改良された装置、完全に自動化され、一度装置にサンプルを導入したら技術 者の手動のコントロールを必要としない装置を包含する。 このように、本発明の目的は、自動化された連続流動式(continuous flow)の 被包装置を提供することである。 本発明のさらなる目的は、自動化された連続流動式エレクトロポレーション装 置を提供することである。 本発明のさらなる目的は、封入された細胞またはベシクルの均一な集団を製造 する連続流動式の被包装置を提供することである。 本発明の別の目的は、封入された細胞またはベシクルの均一な集団を製造する 連続流動式エレクトロポレーション装置を提供することである。 本発明の別の目的は、細胞内に生物学的活性物質を被包させる無菌的で非発熱 性の方法を提供することである。 本発明の別の目的は、エレクトロポレーションの後の、修飾された細胞または ベシクルの溶解を最小限にするために、エレクトロポレーションに続いて細胞ま たはベシクルを安定的に再封する方法及び装置を提供することである。 本発明の別の目的は、全ての外因性の被包されていない生物学的活性物質が除 去された、修飾された細胞集団を製造する、流動式の被包装置を提供することで ある。 本発明の別の目的は、全ての外因性の被包されていない生物学的活性物質が除 去された、修飾された細胞集団を製造する、エレクトロポレーション装置を提供 することである。 本発明の別の目的は、細胞またはベシクルの集団内に、生物学的活性物質を連 続的に被包させる方法及び装置を提供することである。 本発明のさらなる目的は、上記に規定した目的、特徴及び利点を１サイクルで 達成する方法及び装置を提供することである。 本発明の別の目的は、連続流動式エレクトロポレーションチャンバーを提供す ることである。 本発明の別の目的は、現在利用可能な方法よりも効率的な、細胞内に生物学的 活性物質を被包させる改良された方法を提供することである。 本発明のさらなる目的は、酸素供給の欠如または減少から生じる疾患及び／ま たは疾病状態の治療に適している組成物を提供することである。 本発明の他の目的、特徴及び利点は、図面及び添付の請求の範囲と共に、下記 の発明の好ましい実施態様の詳細な説明を読むことによって明らかになるであろ う。 図面の簡単な説明 図１は、連続流動式被包装置の第一の実施態様の概略図である。 図２は、連続流動式被包装置の第二の実施態様の概略図である。 図３は、電極を有するフローエレクトロポレーションチャンバーの第一の実施 態様の上面図である。 図４は、電極を除いたフローエレクトロポレーションチャンバーの第一の実施 態様の上面図である。 図５は、フローエレクトロポレーションチャンバーの第一の実施態様の側面図 である。 図６は、フローエレクトロポレーションチャンバーの第一の実施態様の端面図 である。 図７は、フローエレクトロポレーションチャンバーの第一の実施態様と共に使 用される電極の側面図である。 図８は、図７の電極の正面図である。 図９は、フローエレクトロポレーションチャンバーの第二の実施態様の分解斜 視図である。 図１０は、チャンバーを組み立てた、図９のフローエレクトロポレーションチ ャンバーの第二の実施態様の斜視図である。 図１１は、固定または流動の条件下で、ＩＨＰを被包した赤血球の酸素化％に 対する種々の電界強度の効果を比較したグラフである。 図１２は、固定または流動の条件下で、ＩＨＰを被包した赤血球のＰ₅₀値に対 する、種々の電界強度の効果を比較した表である。 図１３は、固定または流動の条件下で、種々の電界強度における、エレクトロ ポレーションに付された赤血球の生存率を比較した表である。 図１４は、本発明の第三の実施態様による、エレクトロポレーションチャンバ ーの支持部材の正面立面図である。 図１５は、図１４の支持部材の、線１５−１５に沿って切った断面図である。 図１６は、図１５の円１６で示された部分の拡大図である。 図１７は、第三の実施態様によるエレクトロポレーションチャンバー及びチャ ンバーが取り付けられる支持カラムの分解斜視図である。 図１８は、支持カラムに取り付けられた図１７のエレクトロポレーションチャ ンバーを示す斜視図である。 図１９は、支持カラムに取り付けられた第三の実施態様によるエレクトロポレ ーションチャンバーの正面立面図である。 図２０は、図１９のエレクトロポレーションチャンバー及び支持カラムの、カ ッタウェイ(cutaway)斜視図である。 図２１は、図１４〜２０のエレクトロポレーションチャンバーを備える自給の エレクトロポレーション装置の模式図である。 図２２は、数種のＩＨＰ溶液の抵抗を示すグラフである。 図２３は、連続流動式被包装置の第三の実施態様の概略図である。 図２４は、細胞洗浄装置のカッタウェイ図である。 図２５は、入り組んだ経路を形作る隆起部を有する細胞プレート５２６及び細 胞懸濁液の再循環を示すチューブの側面図である。 図２６は、細胞洗浄装置の第二の実施態様のカッタウェイ図である。 図２７は、エラストマーのチャンバーの、カッタウェイ側面図である。 図２８は、代表的なエレクトロポレーションの電圧を示すグラフである。 発明の詳細な説明 本発明は、赤血球などの細胞内に、イノシトール六リン酸などのアロステリッ クな化合物または組成物を被包させる、自動化された自給の流動式装置を提供す る。一つの実施態様において、本発明の装置は、プラズマフォレーシス(plasmap horesis)装置の特徴とフローエレクトロポレーション装置の特徴とを組み合わせ 、 自動化された自給のフローエレクトロポレーション装置を構成する。本発明は、 さらには、固定(static)条件よりもむしろ流動(flow)条件下でチャンバーを使用 できる新規なフローエレクトロポレーションチャンバーを含む。本発明のエレク トロポレーションチャンバーを含む方法及び装置は、多様な細胞集団内に様々な 生物学的活性物質を被包させるために使用できると考えられる。 加えて、本発明は、酸素の組織への輸送の増加を要求しそれが有益である疾患 の治療に特に有用な細胞を作る物理的性質を有する修飾された細胞集団を提供す る。本発明の方法に従って、不純物の混入を低減し、被包後に溶解する傾向を低 下させた、ＩＨＰを封入した赤血球の均一な集団を得ることができる。処理され た赤血球は、血液循環において正常な寿命を示す。本発明を用いて、治療が必要 な患者の赤血球は、迅速に封入されて患者の血液循環に戻すことができる。 １９９３年３月２３日に出願された米国特許出願番号第０３５，４６７の一部 継続出願である、１９９４年３月２３日に出願された関連する国際出願番号ＰＣ Ｔ／ＵＳ９４／０３１８９は、引用により本明細書に含める。 本発明の装置の操作方法は、装置の好ましい使用に関して、すなわち赤血球中 へのヘモグロビンのアロステリックエフェクターの被包に関して、下記に述べる 。イノシトール六リン酸は、本発明で使用される好ましいアロステリックエフェ クターである。イノシトール五リン酸、イノシトール四リン酸、イノシトール三 リン酸、イノシトール二リン酸及びジホスファチジルイノシトール二リン酸など の他の糖リン酸もまた、使用することができる。他の好適なアロステリックエフ ェクターとしては、ヌクレオチド三リン酸類、ヌクレオチド二リン酸類、ヌクレ オチド一リン酸類、及びアルコールリン酸エステル類などのポリリン酸類が含ま れる。例えば「チューリッヒ(Zurich)」ヘモグロビンなどの、ヘモグロビンのい くつかの突然変異型の場合、ポリカルボン酸類などの有機アニオン類をアロステ リックエフェクターとして使用することができる。さらに、アロステリックエフ ェクターとして、ヘキサシアノ鉄酸塩、リン酸塩または塩化物などの無機アニオ ン類を使用することが可能である。 本発明によってイノシトール六リン酸を封入した赤血球は、広範囲の疾患及び 疾病状態の治療に使用することができる。本発明によって製造されたＩＨＰを封 入した赤血球は、心臓発作の患者に投与することができ、それによって、虚血性 の心臓組織への酸素輸送を増加させ、同時に心拍出量を減少させる。本発明によ って製造されるＩＨＰを封入した赤血球は、「出血性」貧血、手術の合併症、卒 中、糖尿病、鎌状赤血球疾患、熱傷、間欠性跛行、気腫、低体温症、末梢血管疾 患、うっ血性心不全、狭心症、一過性虚血性疾患、汎発性血管内凝固症候群、成 人呼吸促進症候群（ＡＲＤＳ）及び嚢胞性線維症などの、しかしこれらに制限さ れない、あらゆる虚血疾患の治療にも使用することができる。本発明の方法に従 って調製される組成物の医療への適用の詳細な説明も、下記に示す。 連続流動式被包装置 本発明の装置の操作方法について、装置の好ましい使用について、すなわちエ レクトロポレーションによる赤血球内へのヘモグロビンのアロステリックエフェ クターの被包について下記に述べる。他の細胞集団またはベシクル、及び他の生 物学的活性物質に適応させるために、装置を改変することが可能であることが理 解される。加えて、エレクトロポレーション以外の被包方法を使用するために、 装置を改変することが可能である。 簡単に述べると、本発明に従って、連続流動式被包装置に血液サンプルを導入 する。赤血球が回収されるのであれば、血液は、患者から直接採血しても、前も って採血した血液であってもよい。初めに、血液を、赤血球、血漿及び白血球、 及び老廃物に分離する。老廃物には、遠心分離後の上澄中に残存する希釈物及び 種々の血液の溶質が含まれる。老廃物は装置内部の廃棄物貯蔵槽に蓄える。血漿 及び白血球もまた、システム内部の貯蔵槽に保持し、一方赤血球は被包される物 質と混合する。次に、赤血球の懸濁液をエレクトロポレーションに付す。エレク トロポレーションに続いて、細胞を再封する条件下で赤血球をインキュベートす る。次に、外因性の被包されていない生物学的活性物質を除くために、赤血球を 処理及び洗浄する。細胞が処理されたら、被包された物質を含有する赤血球は、 血漿及び白血球と任意に再構成することができる。次に、再構成された血液は直 接患者に戻してもよく、または後に使用するために保存することもできる。個々 の段階として述べたが、この工程は本質的に連続的である。 本発明の第一の実施態様を図１を参照して説明する。図１は本発明の連続流動 式被包装置の構造を図式的に示すものである。 本発明に従って、多量の全血をエレクトロポレーションシステム５の供給口１ １に入れる。血液サンプルは、任意に、患者からエレクトロポレーションシステ ム５に直接採血してもよく、または血液をシステム５に導入する前に採血して貯 蔵していてもよい。バルブ１２を開けて、サンプルをシステム５に入れる。同時 に、バルブ２５を開け、ポンプ２２を使用して抗凝固剤貯蔵槽２７から抗凝固剤 を加える。好適な抗凝固剤はヘパリンであるが、他の抗凝固剤を使用することも できる。好ましい抗凝固剤はＡＣＤである。バルブ１５及び３６も開けて、ポン プ４０を使用する。抗凝固剤と全血の混合物は、フィルター１８及び装置を通る 流れをモニターする圧力評価システム１９を通り、ポンプ４０が使用されると始 動する血液分離洗浄槽４４に回収される。センサーは血液分離洗浄槽４４が赤血 球で一杯になるとそれを示す。血液分離洗浄槽が一杯になると、血液の供給は停 止する。血液成分の分離を含む段階では、ヘモネティクスコーポレーション(Ｈa emonetics Ｃorporation)（米国、マサチューセッツ州、Ｂraintree）によって 製造されたプラズマフォレーシス装置などのプラズマフォレーシス装置を使用す ることができる。 上記で説明したように、ポンプ４０が時計回りに稼動すると、血液分離洗浄槽 ４４が始動し、抗凝固剤と全血の懸濁液が遠心分離されて、血漿、白血球、赤血 球、及び老廃物に分離される。バルブ８７を開けて、血漿と白血球を血漿貯蔵槽 ８９に入れる。 次に、任意に、及び装置で処理される細胞集団によって、血液分離洗浄槽４４ 内に保持される細胞を洗浄する。バルブ３３、１５及び３６を開けて、赤血球を 含有する血液分離洗浄槽４４に希釈剤貯蔵槽３０から生理食塩水緩衝液を加える 。ポンプ４０はなお稼動している。次に赤血球を洗浄し、遠心分離する。好まし い生理食塩水緩衝液は、０．９％の塩化ナトリウム溶液であるが、赤血球を希釈 ・洗浄するために他の生理学的に等張な緩衝液を使用することもできる。洗浄工 程 の間、バルブ５４を開け、不要物を廃棄物貯蔵槽５７に入れる。再び、不要物は 廃棄物貯蔵槽５７に貯蔵し、赤血球は血液洗浄分離槽４４に保持する。洗浄工程 は必要ならば繰り返し行う。 様々なパルスの長さ及び電界強度を用いて実施された実験を通して、矩形パル ス(square pulse)ではヒト赤血球中へのＩＨＰの被包効率がより小さくなること がわかっている。細胞膜に大きな孔を形成しても、細胞外のＩＨＰを赤血球中に 入れるには不十分であると考えられる。このことから、孔を形成した後、細胞内 にＩＨＰを拡散させるよりも複雑な工程が示唆される。電気パルスが２つの仕事 を遂行しなければならないことが提案される。第一には細胞膜に孔を作ることで あり、第二にはそれらの孔を通して赤血球中にＩＨＰを電気泳動的に能動的に移 動させることである。これは、高電圧の矩形パルス（２．１３ｋＶ／ｃｍ、２ｍ ｓ）と、その直後により低電圧の指数曲線型のパルス(exponential pulse)（１ ．５〜１．７５ｋＶ／ｃｍ、５ｍｓ）を使用することによって達成され、赤血球 中へのＩＨＰの被包が、通常の指数曲線型のパルスを使用するプロトコルによる 被包の５０％まで増加する。指数曲線型のパルスそれ自体は、エレクトロポレー ションのしきい値よりはるかに小さい。両方の仕事、即ち、孔の形成と電気泳動 的移動は、指数曲線型のパルスの使用で最も効率的に達成することができる。も う一つの実施態様は、細胞を最初に高電圧の矩形パルスに付し、次に、ＩＨＰを 赤血球中に進める傾向がある一連のより低電圧のパルスに付すことで、より効率 的にＩＨＰを細胞内へ封入する。使用に際して、本発明のエレクトロポレーショ ンチャンバーを通って移動する細胞は、一連のパルスの連続(pulse train)に付 される。パルスの連続は、８０〜５１２パルスであり、好ましいパルス数は３１ ２パルスである。次に極性が変化し、細胞を第二のパルスの連続に適用する。第 三のパルスの連続が適用されると、極性はもう一度変化する。エレクトロポレー ションチャンバーの長さを移動する間に、使用されるあらゆる細胞に３〜５つの パルスの連続を適用し、それぞれのパルスの連続の間に極性が反転する。 赤血球を分離した後、ポンプ４０を反転し、ポンプ２２を停止し、バルブ１２ 、１５、３３、３６、２５、８７及び５４を閉め、バルブ９７及び６４を開ける 。 ＩＨＰ貯蔵槽５０からＩＨＰ溶液をポンプでくみ出し、同時に赤血球を血液分離 洗浄槽４４からポンプでくみ出して冷却コイル６８に送る。赤血球及びＩＨＰ溶 液は、装置のチューブ内の接合部６７で混合され、次にポンプで冷却コイル６８ を通過する。本発明の好ましい実施態様において、下記に詳細を説明するように 、ＩＨＰ溶液と赤血球は、冷却コイル６８を通過する前に、分離洗浄槽４４中で 混合してもよい。 溶液中のＩＨＰの好ましい濃度は、約１０〜１００ｍＭであり、より好ましく は約２２．５〜５０ｍＭであり、最も好ましくは３５ｍＭである。ＩＨＰ溶液中 の塩化カリウムの好ましい濃度は、約１０〜５ｍＭである。塩化マグネシウムの 好ましい濃度は、約２〜０．５ｍＭである。ＩＨＰ溶液中のショ糖の好ましい濃 度は、約６７．５〜２７０ｍＭである。ショ糖の代わりに他の糖類またはポリマ ーを使用することができることは理解されるべきである。 本発明に使用される溶液は、抵抗を増加させる流体である。ＩＨＰ溶液は抵抗 率が高く、最小限の電解質を含有することが重要である。オールドリッチケミカ ルカンパニー(Ａldrich Ｃhemical Ｃompany)またはマトレアケミカルカンパニ ー(Ｍatrea Ｃhemical Ｃompany)のＩＨＰは、塩化ナトリウム及び最小限の他の 電解質を全く含まないので、溶液の抵抗率を著しく下げることはない。溶液の容 量ミリオスモル濃度(milliosmolarity)は、約３００〜５００であることが望ま しい。抵抗率は、約８７〜１８５Ω・ｃｍであることが望ましい。伝導率は、約 ４〜８ｎＳ／ｃｍであることが望ましい。実用塩分(practical salinity)は、約 ４〜９ｐｐｔであることが望ましく、塩化ナトリウム当量は、約４．５〜９．０ ｐｐｔであることが望ましい。 懸濁液のヘマトクリットは、好ましくは約３０〜８０であり、最も好ましくは 約４０である。赤血球の反応から、固定セルにおいて、高電圧は８００Ｖを越え ないのが望ましいことが測定され（そのギャップは０．４ｃｍ）、これは２ｋｖ ／ｃｍに対応する。フロー（流動）セルに対しては、ギャップは０．３ｃｍであ り、セルを通過する電圧は６００Ｖ（＋／−３００Ｖ）に制限される。種々のエ レクトロポレーション流体組成物が多数試験されている。表Ａは、６例のサンプ ルとその特性を示す。Ｅの溶液は、エレクトロポレーション溶液として好ましい 。ポンプ４０は、赤血球とＩＰＨ溶液の両方をくみ上げるために設計され、冷却 コイル６８に送られる最終的なヘマトクリットを前もって測定することができる ように調整することができる。 混合した後、赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、次にポンプで冷却コイル６８に送られ る。冷却は、水浴または熱電気による冷却システムを使用して行うこともできる 。例えば、冷却コイル６８は、冷却貯蔵槽６９内の冷却浴に浸す。赤血球−ＩＨ Ｐ 懸濁液が冷却コイル６８を通過すると、懸濁液は、約１〜１２℃、好ましくは約 ４℃に冷却される。赤血球を冷却することで、エレクトロポレーション工程の間 、細胞膜に形成された孔の存続が確実になる。冷却コイルを使用することで、冷 却エレメントと接触するサンプルの表面積が増加し、冷却速度が速まる。任意に 、冷却コイルを熱電気の熱ポンプで取り囲むことができる。 いくつかの適用では、エレクトロポレーションの前に、細胞懸濁液を加熱する 必要がある。そのような場合、冷却コイル６８を加熱コイルと置き換える。赤血 球が耐えられる最高温度は約３７℃である。 熱電気の熱ポンプは、特定の領域から熱エネルギーを抽出することによって働 き、それによって温度を下げ、より高温の「ヒートシンク」領域への熱エネルギ ーを遮断する。低温の接合部では、電子がｐ型の半導体エレメントにおける低エ ネルギーレベルから、ｎ型の半導体エレメントにおけるより高いエネルギーレベ ルに移動する時に、エネルギーが電子に吸収される。電源は、電子にシステムを 通過させるためにエネルギーを供給する。高温の接合部では、電子が高エネルギ ーレベルエレメント（ｎ型）からより低いエネルギーレベルエレメント（ｐ型） へ移動する時に、エネルギーがヒートシンクに追い出される。 熱電気のエレメントは、全体として固体の状態であり、可動する機械的部品が ないか、蒸気サイクル装置(vapor-cycle device)のように作動する流体を必要と しない。しかしながら、熱電気の熱ポンプは、フレオンによる蒸気圧縮または吸 収冷蔵装置と同じ冷却機能を発揮する。熱電気の熱ポンプは、信頼性が高く、サ イズ及び容量が小さく、低コストであり、軽く、他の多くの冷却装置よりも本質 的に安全で、かつ正確な温度制御が可能である。 本発明で使用される好ましい熱電気の熱ポンプは、米国ニュージャージー州ト レントン(Trenton)のメルコールマテリアルズエレクトロニックプロダクツコー ポレーション(MELCOR Materials Electronic Products Corp.)の製品である。熱 電対は、高性能の結晶性半導体材料で作られる。半導体材料は、テルル化ビスマ ス、ビスマス、テルル、セレン及びアンチモンの四元アロイであり、不純物を添 加して処理することによって特性を有する配向した多結晶質の半導体が得られる 。 電気的に直列にかつ熱的に並列に接続した対は、モジュール内に集積される。モ ジュールはめっきしたセラミックプレートの間に入れ、圧縮において機械的強度 が高く、電気的絶縁と熱伝導が最適となる。モジュールは、熱伝達効果を高める ために並行に配置することができ、また、大きな温度差を達成するために多段階 に縦続して積み重ねることもできる。電流が熱ポンプを通ると、熱電対を横切る 最大定格７０℃以上の温度差が生じる。 冷却した後、赤血球−ＩＨＰ懸濁液を、パルスジェネレーター７５から赤血球 −ＩＨＰ懸濁液に電気パルスが与えられるエレクトロポレーションチャンバー７ ２に入れ、赤血球の細胞膜に開口部を形成する。任意に、チャンバー７２が赤血 球で一杯になるときに、パルスジェネレーター７５をオンにする自動検出装置を 設置する。チャンバー７２が被包されていない細胞で一杯になる度に、電気パル スが懸濁液に適用される。従来のエレクトロポレーションチャンバーを、装置の 操作が固定式、即ち細胞を不連続の一回のバッチで処理するときには、使用して もよい。本発明の好ましい実施態様では、フローエレクトロポレーションチャン バーを使用する。一つの実施態様では、フローエレクトロポレーションチャンバ ー７２は透明なポリ塩化ビニルで作成され、７ｍｍの間隔を置いた二本の対置す る電極を含む。電極間の距離は、流れの容量及び電界強度に依存して変化する。 好ましくは、フローエレクトロポレーションチャンバー７２は使い捨てである。 エレクトロポレーションチャンバーはまた、ポリソルフォン(polysolfone)で作 成してもよく、これはオートクレーブ滅菌などのいくつかの滅菌処理を行うのに 好ましい。フローエレクトロポレーションチャンバーの構造及び作成の詳細な説 明は下記に示す。 赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、エレクトロポレーションチャンバー７２の二つの電 極の間を通過する。未処置の細胞の懸濁液がチャンバー７２に入ると、１〜３Ｋ Ｖ／ｃｍの電界が形成され、１．８ｍｌのフローチャンバーでは１〜４ミリ秒間 、好ましくは２ミリ秒間、持続する。好ましくは、ＩＨＰ−赤血球懸濁液は、パ ルス当たり約２６００〜３２００Ｖ／ｃｍの電界強度で、容量当たり３回の高圧 パルスに付される。細胞膜を横切る電流のパルスによって、細胞膜に電気的誘電 破 壊を引き起こし、膜に孔を形成する。次にＩＨＰはそれらの孔を通って細胞内に 拡散する。 エレクトロポレーションの後、赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、インキュベーション チャンバー７８に入れ、室温で約１５〜１２０分間、好ましくは３０〜６０分間 インキュベートする。任意に、赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、約３７℃で約５分間、 そして室温で少なくとも１５分間インキュベートする。インキュベーションチャ ンバー７８は、任意に、加熱手段８０で囲んでもよい。例えば、加熱手段８０は 、水浴または熱電気の熱ポンプであってもよい。 任意に、インキュベーター７８は、赤血球の再封及び再構成を補助する再封緩 衝液を含む。再封緩衝液の好ましい組成を表Ｂに示す。 本発明の好ましい実施態様では、再封緩衝液は使用しない。 インキュベーションの後、バルブ５１を開け、ポンプ４０を稼動させ、赤血球 −ＩＨＰ懸濁液をインキュベーションチャンバー７８から血液分離洗浄槽４４に 戻す。過剰のＩＨＰ溶液は、遠心分離によって赤血球懸濁液から除去する。不要 になったＩＨＰ溶液は、廃棄物貯蔵槽５７に送る。次に、バルブ３３、１５及び ３６を開けて、多量の希釈剤を血液分離洗浄槽４４に加える。本発明において使 用することができる希釈剤を表Ｃに示す。 次に赤血球−ＩＨＰ懸濁液を遠心分離し、上澄はバルブ５４を通して廃棄物貯蔵 槽５７に捨て、赤血球は血液分離洗浄槽４４中に残す。希釈剤貯蔵槽３０から食 塩水緩衝液を上記の赤血球に加える。細胞を洗浄し、遠心分離の後、上澄を捨て る。洗浄工程は必要ならば繰り返し行う。 任意に、分離洗浄槽４４から不要物を除去する時に、廃液中の遊離のＩＨＰを 検出するために不要物を不純物混入検出器４６に通し、修飾された赤血球から外 因性の被包されていないＩＨＰが除去されたことを確認する。不純物混入検出シ ステムは、洗浄緩衝液中の光学的変化に基づくものである。修飾された赤血球を 洗浄し、遠心分離した後、上澄は廃棄物貯蔵槽５７に蓄える前に不純物混入検出 器４６に通す。もしも外因性の被包されていないＩＨＰが洗浄緩衝液中に残って いると、廃棄される溶液は濁る。濁度はＩＨＰのカルシウムとの反応によるもの であって、カルシウムは洗浄緩衝液の成分である。不純物混入検出器４６は、光 学的検出システムを使用する。好ましくは、光源はＬＥＤであり、検出器はフォ トダイオードである。フォトダイオードの電圧差が洗浄溶液中のＩＨＰの量を示 す。不純物混入検出器４６は任意である。 洗浄の後、ＩＨＰ−赤血球産物は任意に、貯蔵槽８９に保持されていた血漿及 び白血球で再構成する。処理された赤血球は、再注入バッグ内の、保存媒質また は患者の自己血漿中に回収してもよい。 得られたＩＨＰを封入した赤血球は、患者に直接投与することができ、または 、後で使用するために細胞を貯蔵することもできる。赤血球中のＩＨＰは、通常 の保存期間内では放出されない。 本発明の好ましい実施態様の一例を図２を参照して説明する。図２は本発明の 連続流動式被包装置の構造を図式的に示すものである。再び、装置の操作方法に 関し、装置の好ましい使用について、すなわちエレクトロポレーションによる赤 血球内へのヘモグロビンのアロステリックエフェクターの被包について述べる。 他の細胞集団またはベシクル、及び他の生物学的活性物質に適応させるために、 装置を改変することが可能であることが理解される。加えて、他の被包方法を包 含するために、装置を改変することが可能である。 本発明に従って、全血のサンプルをエレクトロポレーションシステム１０の供 給口１１に入れる。バルブ１２を開けて、サンプルをシステム１０に入れる。同 時に、バルブ２５を開け、ポンプ２２を使用して抗凝固剤貯蔵槽２７から抗凝固 剤を加える。バルブ１５及び３６も開けて、ポンプ４０を使用する。 抗凝固剤と全血の混合物は、フィルター１８及び圧力評価システム１９を通り 、ポンプ４０が使用されると始動する血液分離洗浄槽４４に回収される。センサ ーは血液分離洗浄槽４４が赤血球で一杯になるとそれを示す。 ポンプ４０が時計回りに稼動すると、血液分離洗浄槽４４が始動し、抗凝固剤 と全血の懸濁液が遠心分離されて、血漿、白血球、赤血球、及び老廃物に分離さ れる。バルブ８７を開けて、血漿と白血球を血漿貯蔵槽８９に入れる。 次に、任意に、分離洗浄槽４４内に保持される細胞を洗浄し、遠心分離する。 バルブ３３、３５、１５及び３６を開けて、赤血球を含有する血液分離洗浄槽４ ４に、希釈剤貯蔵槽３０から生理食塩水緩衝液を加える。バルブ１２を閉じ、ポ ンプ４０を稼動させておく。 洗浄工程の間、バルブ５４を開け、不要物を廃棄物貯蔵槽５７に入れる。再び 、不要物は廃棄物貯蔵槽５７に貯蔵し、赤血球は血液洗浄分離槽４４に保持する 。洗浄工程は必要ならば繰り返し行う。不純物混入検出システムは、洗浄工程を 制御するために、分離洗浄槽４４と廃棄物貯蔵槽５７との間に任意に取り付けて もよい。 赤血球を分離した後、ポンプ４０を反転し、ポンプ２２を停止し、バルブ１２ 、１５、３３、３５、３６、２５、８７及び５４を閉め、バルブ９７を開ける。 細胞が洗浄された場合は、ポンプ２２は前もって停止し、バルブ１２及び２５は 閉まっている。ＩＨＰ溶液は、ＩＨＰ貯蔵槽５０からポンプでくみ出し、赤血球 を含む分離洗浄槽４４に送る。そこでは赤血球とＩＨＰとを混合し懸濁液を形成 する。 溶液中のＩＨＰの好ましい濃度は、約１０〜１００ｍＭであり、より好ましく は約２３〜３５ｍＭであり、最も好ましくは３５ｍＭである。好ましいＩＨＰ溶 液は、下記の濃度の下記の化合物からなる。 ３５ｍＭ 中和ＩＨＰ（六ナトリウム塩）（マトレヤケミカルカン パニー(Matreya Chemical Company)） ５ｍＭ ＫＣｌ １．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ １３５ｍＭ ショ糖 オールドリッチケミカルカンパニー(Aldrich Chemical Company)のＩＨＰは、 塩化ナトリウム及び最小限の他の電解質を全く含まないので、溶液の抵抗率を有 意に下げることはない。インピーダンスの高い他の溶液を本発明において使用す ることができ、溶液の成分は臨界的ではないことが理解されよう。溶液の浸透圧 特性が赤血球などの細胞が損傷を受けないようなものであって、溶液の抵抗率が 高い限りは、その溶液は本発明の使用に適している。いくつかの組成物について 抵抗率を測定したが、それを図２２に示す。「ＣＢＲ液」は表Ａに示す。 懸濁液のヘマトクリットは、好ましくは約３０〜６０であり、最も好ましくは 約４０である。ポンプ４０は、赤血球とＩＰＨ溶液の両方をくみ上げるために設 計され、冷却コイル６８に送られる最終的なヘマトクリットを前もって測定する ことができるように調整することができる。 赤血球をＩＨＰ溶液と混合した後、ポンプ４０を再度反転させ、バルブ９７を 閉じてバルブ６４を開ける。次に、赤血球−ＩＨＰ懸濁液をポンプで送り、熱電 気冷却コイル６８を通す。バクスターヘルスケアコーポレーション(Ｂaxter Ｈe althcare Ｃorporation)製のフェンワル（登録商標）血液加温セット(Ｆenwal Ｂlood Ｗarming Ｓet)中の血液バッグなどの、血液加温セット中の血液バッグ は、冷却コイル６８として使用することができる。赤血球−ＩＨＰ懸濁液が冷却 貯蔵槽６９内の冷却コイル６８を通過すると、懸濁液は、約１〜１２℃、好まし くは約４℃に冷却される。流速を確実に一定にし、冷却コイル６８が一杯になる と起こる容量の変動を補うために、任意に、装置の冷却コイル６８と冷却貯蔵槽 ６９との間、及びエレクトロポレーションチャンバー７２に、ポンプを追加して もよい。 任意に、予備冷却工程を省き、赤血球−ＩＨＰ懸濁液を混合直後にエレクトロ ポレーションチャンバー７２に送ってもよい。このような例では、連続流動式被 包装置１０から、冷却コイル６８と冷却貯蔵槽６９が除かれる。エレクトロポレ ーションチャンバーの温度が細胞懸濁液を４℃に維持するのに充分冷たい場合は 、エレクトロポレーションの前に冷却しなくてもよい。 冷却した後、赤血球−ＩＨＰ懸濁液をエレクトロポレーションチャンバー７２ に入れる。チャンバー７２は約４℃の温度に維持される。赤血球−ＩＨＰ懸濁液 がフローエレクトロポレーションチャンバー７２を通過する時に、パルスジェネ レーター７５から懸濁液に電気パルスが適用され、赤血球の細胞膜に開口部を形 成する。 赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、エレクトロポレーションチャンバー７２の二つの電 極の間を通過する。図３〜１０はエレクトロポレーションチャンバーを説明する ものである。本発明の好ましい実施態様において、未処理の細胞の懸濁液がチャ ンバー７２に入ると、ＩＨＰ−赤血球懸濁液は、パルス当たり約２６００〜３２ ００Ｖ／ｃｍの電界強度で、容量当たり、約３回の高圧パルスまたはパルスの連 続に付される。ＩＨＰの血液への導入について、一回のパルスの代わりに、短い パルスの連続によって、より効率的にＩＨＰを赤血球に移送することが確認され ている。最適なパルス数は、パルスの一連続あたり約１０〜５１２パルスであり 、好ましくは３１２パルスである。パルス間、またはパルスの連続と連続の間に 、電界の極性が変化することも有利である。図２８には、代表的なパルスの二つ の連続を示す。 細胞膜を横切るように形成される電荷によって、細胞膜に誘電破壊を引き起こ し、膜に孔を形成する。次にＩＨＰはそれらの孔を通って細胞内に拡散する。加 えて、下記の仮説に拘束されるものではないが、ＩＨＰが電界中の細胞内に実際 に強制的に導入されると考えられる。 エレクトロポレーションの間、１〜３ＫＶ／ｃｍの電界が形成され、１〜４ミ リ秒間持続する。好ましいパルスの長さは３〜４ミリ秒であり、最も好ましくは ２ミリ秒間である。パルスの長さまたはパルスの連続の長さは、ｌ／ｅと定義す る。流速約１０．６ｍｌ／分では、好ましいパルス数は、好ましいパルス速度０ ．２９Ｈｚで３〜５である。電界強度は、電極間の電圧と定義する。電極間の距 離はセンチメートルで測定する。好ましい電気的パラメーターは、下記の通りで ある。 パルスの長さまたはパルスの連続の長さ＝１．５〜２．５ｍｓ 電界強度＝２．７〜３ＫＶ／ｃｍ エレクトロポレーションチャンバーは、エレクトロポレーションチャンバーを 通過する細胞溶液の抵抗率がモニターされるという意味で、任意に、センサーで あってもよい。細胞溶液の抵抗率が変化するに従って、最適なエレクトロポレー ション効率を維持するために、細胞のパルス適用を調節するフィードバック回路 がある。例えば、ＩＨＰ溶液中で血液をエレクトロポレーション処理する場合、 異なる血液サンプルは異なる抵抗率を有する可能性がある。血液の抵抗率をモニ ターすることによって、抵抗率測定に基づいて最適なパルス強度及びパルスのタ イミングを適用することができる。加えて、万が一泡がエレクトロポレーション チャンバーに導入されると、抵抗率が変化するのでフィードバック回路は泡の存 在を感知し、泡がチャンバーから出るまでパルス適用を停止する。 エレクトロポレーションの後、赤血球−ＩＨＰ懸濁液をインキュベーションチ ャンバー７８に入れ、室温で約１０〜１２０分間、好ましくは３０分間インキュ ベートする。任意に、赤血球−ＩＨＰ懸濁液は、約３７℃で約５分間、そして室 温で少なくとも１５分間、インキュベートする。インキュベーションチャンバー ７８は、加熱手段８０で囲んでもよい。本発明を実施する際には、あらゆる加熱 手段８０を使用することができる。好ましい加熱手段８０は、水浴または熱電気 の熱ポンプである。 任意に、インキュベーター７８は、赤血球の再封及び再構成を補助する再封緩 衝液を含む。本発明の好ましい実施態様では、再封緩衝液は使用しない。 インキュベーションの後、バルブ５１を開け、ポンプ４０を稼動させて、赤血 球−ＩＨＰ懸濁液を血液分離洗浄槽４４に戻す。過剰のＩＨＰ溶液は、遠心分離 によって赤血球懸濁液から除去する。不要になったＩＨＰ溶液は、廃棄物貯蔵槽 ５７に送る。次に、バルブ３３、３７、１５及び３６を開けて、貯蔵槽３１から 多量の後洗浄液を血液分離洗浄槽４４に加える。本発明の好ましい実施態様では 、後洗浄液は、塩化カルシウム２．０ｍＭ及び塩化マグネシウム２．０ｍＭを含 有する９％の塩化ナトリウム溶液からなる。いずれの生理的食塩水を使用しても よい。 後洗浄液を添加した後、次に赤血球−ＩＨＰ懸濁液を遠心分離し、上澄はバル ブ５４を通して廃棄物貯蔵槽５７に捨て、赤血球は血液分離洗浄槽４４中に残す 。洗浄工程は、包被されていないＩＨＰが全て除去されるまで、繰り返し行う。 任意に、分離洗浄槽４４から不要物を除去する時に、廃液中の遊離のＩＨＰを 検出するために不要物を不純物混入検出器４６に通し、修飾された赤血球から外 因性の被包されていないＩＨＰが除去されたことを確認する。不純物混入検出器 ４６は任意である。 洗浄の後、ＩＨＰを含有する赤血球は、貯蔵槽８９に保持される血漿及び白血 球で再構成してもよい。ポンプ４０を稼動させ、バルブ８７、３６及び９２を開 ける。修飾された赤血球、及び血漿及び白血球を、貯蔵槽９６にポンプで送る。 再構成した、修飾された血液から、凝固物または他の不純物を全て除去するため に、貯蔵槽９６とバルブ９２との間にフィルターを取り付けてもよい。 本発明の方法に従って得られたＩＨＰを封入した赤血球は、患者に直接投与す ることができ、または、後で使用するために細胞を貯蔵することもできる。赤血 球中のＩＨＰは、通常の保存期間内では放出されない。 本発明の連続流動式被包装置は、他の被包方法を利用するために一部改変して もよいことが予想される。 さらには、連続流動式被包装置は、多種多様の細胞集団を処理するために改変 してもよいことが予想される。さらには、この装置を、合成ベシクル中に生物学 的活性物質を被包するのに使用してもよい。 また、本発明の連続流動式被包装置は、幅広い生物学的活性物質を被包するた めに使用してもよいことが予想される。 フローエレクトロポレーションチャンバー エレクトロポレーションの間、ＩＨＰの挿入速度は細胞に適用される電圧に直 線的に依存する。一般的には、電圧が高くなるに従ってより多くのＩＨＰが被包 されるが、細胞溶解も増加し、細胞生存率が減少する。エレクトロポレーション システムの効率は、エレクトロポレーション後の細胞生存率によって評価するこ とができる。細胞生存率がわずかである場合は効率が非常に低いことを示す。電 気パルスの振幅及び期間は、細胞膜の電気的誘電破壊に関与し、電界に並行した ポールキャップ(pole cap)中に孔を形成する。このように、エレクトロポレーシ ョンシステムを設計する際に考慮するべきファクターには、電界強度、パルスの 長さ及びパルス数が含まれる。 完全なエレクトロポレーションのターゲットは、球状であるので、その配向性 は適用される電界の効率に影響を与えない。ターゲットが球状であれば、しきい 値を超える電界強度の一回のパルスによって、ターゲットを１００％エレクトロ ポレーション（電気穿孔）することができる。赤血球は円盤状をしている。その 形状及びエレクトロポレーションチャンバーにおける配向性のために、一回のパ ルスでは、細胞の約４０％しかエレクトロポレーションされない。残る６０％を エレクトロポレーションするために、電界強度を上げることができる。このこと によって、電界に対して適切な配向性にある赤血球に対する負荷が上昇し、細胞 の生存率が低下する。 細胞溶解及び細胞死の発生率を低下させながら被包の効率を上げるために、短 期間の多数のパルスを利用するフローエレクトロポレーションチャンバーが開発 された。定常流及び定常電界電圧を用いた、多数のパルスによって、最大量のＩ ＨＰが、２時間から２４時間までの全溶解を最少にして、挿入されることが確認 された。多数パルスシステムによって、電界強度を上げることなく、細胞生存率 が増加する。多数パルスシステムを使用する場合は、シングルパルスシステムを 使用する場合よりも、細胞の配向性が臨界的ではない。より低い電界強度は、赤 血球に対してはるかに穏やかである。多数パルスシステムは、シングルパルスシ ステム程、チャンバーを通る赤血球の流速とエレクトロポレーションパルスとの 時間的調節、及び細胞の配向性が決定的ではないことから、多数パルスシステム で各細胞をエレクトロポレーションすることは、はるかに容易である。また、フ ロー多数パルスエレクトロポレーションシステムは、シングルパルス法と比較す ると、赤血球の短期及び長期生存率も上昇する。 図１１及び１３は、固定または流動の条件下で、ある範囲の酸素圧にわたって 、ＩＨＰを被包した赤血球の酸素化％に対する、即ち、ＩＨＰを被包した赤血球 のＰ₅₀値に対する（ＩＨＰ溶液の二種類の濃度を比較した）、及びエレクトロポ レ ーションを受けた赤血球の生存率に対する、様々な電界強度の効果を示すもので ある。読みとりは全てエレクトロポレーションの２４時間後に行った。これらの 結果から、相対的に低い電界強度の多数のパルスによって、最適な被包結果が得 られることが示される。 冷却したエレクトロポレーションチャンバーは、エレクトロポレーション工程 の間、赤血球を一定温度に保つのに好ましく、それによって、赤血球の生存率が 向上する。これは、エレクトロポレーション工程の間、電気パルスによって生成 された過剰な熱を除去することによって達成される。過剰な熱は、電極を冷却す るか、またはフローエレクトロポレーションチャンバー全体を冷却することによ って除去することができる。本発明の一つの実施態様では、電極自体を冷却する 。 エレクトロポレーション工程の間、エレクトロポレーションチャンバーの供給 口に血液をポンプで送り、赤血球がチャンバーを通過する時に、赤血球に一連の 電気パルスを適用する。赤血球は、チャンバーの他方の末端から出る。チャンバ ーは、セラミック、テフロン(Teflon)、プレキシグラス(Plexiglas)、ガラス、 プラスチック、シリコン、ゴムまたは他の合成材料を含むがこれらに制限されな い、あらゆるタイプの絶縁材料で作成することができる。好ましくは、チャンバ ーはガラスまたはポリスルホンからなる。チャンバーの組成が何であっても、チ ャンバーの内側表面は、チャンバーを通過する液体の乱流を低減するために、な めらかであるべきである。チャンバーのハウジングは、非伝導性で、かつ生物学 的に不活性であるべきである。商業的使用においては、チャンバーが使い捨てで あることが有利である。 本発明の好ましい実施態様の一例では、エレクトロポレーション装置の一部で ある電極は、黄銅、ステンレススチール、金めっきしたステンレススチール、金 めっきしたガラス、金めっきしたプラスチック、または金属含有プラスチックを 含むがこれらに制限されない、電気または熱伝導性の、中空で標準的なあらゆる 材料から作成することができる。好ましくは、電極の表面は金めっきされている 方がよい。金めっきによって、電極での酸化及びヘモグロビン及び他の細胞粒子 の蓄積が減少する。電極の表面はなめらかであるべきである。 電極は中空でもよく、その結果液体またはガスによって冷却され、または、中 空でなくともよく、その場合は熱電気または他のあらゆるタイプの伝導性冷却が 用いられる。また、電極を冷却するほかに、エレクトロポレーションチャンバー 自体を冷却することもできる。 好ましくは、フローエレクトロポレーションチャンバーは使い捨てである。本 発明のエレクトロポレーションチャンバーの実施態様三例について、下記で詳細 に説明する。 実施態様の一例では、フローエレクトロポレーションチャンバーは透明なポリ 塩化ビニルで作成され、約７ｍｍの間隔で対置する二本の電極を含む。エレクト ロポレーションチャンバーは、米国カリフォルニア州サンディエゴのＢＴＸエレ クトロニックカンパニー(BTX Electronic Company)製のチャンバーを一部改造し たものである。しかしながら、このエレクトロポレーションチャンバーを連続的 に使用すると、チャンバーがオーバーヒートして、装置によって処理される細胞 の生存率が時間とともに低下する。装置を連続的流動法で使用したときに生じる オーバーヒートの問題を除くために、連続流動式（連続的フロー）エレクトロポ レーションチャンバーを設計した。連続的フローエレクトロポレーションチャン バーの構造について、下記で詳細に説明する。 図３〜８は、本発明の実施態様の一例である連続的フローエレクトロポレーシ ョンチャンバー７２を示す。図３に見られるように、フローエレクトロポレーシ ョンチャンバー７２はハウジング１００を含み、このフローエレクトロポレーシ ョンチャンバー７２のハウジング１００には、その対面に二本の電極１０２がは めこまれている。ハウジング１００は、末端の一方に供給口チャネル１０４を、 他方に排出口チャネル１０６を含む。この供給口チャネル１０４及び排出口チャ ネル１０６は、それぞれコネクター１０８及び１０９を含み、好ましくはコネク ターは雄型のルアー(Luer)製品である。コネクター１０８及び１０９は中空で、 エレクトロポレーションチャンバー７２の内部への、供給口チャネル１０４及び 排出口チャネル１０６を形成する。 図４及び５に見られるように、内部チャンバー１１０は、ハウジング１００の 長さのほとんどにわたって延び、二本の電極１０２を収容する大きさに作られる 。内部チャンバー１１０は、電極１０２の内部末端を受けるために斜めに切った 面１１１を含む。このように、内部チャンバー１１０は、電極１０２の内部表面 とハウジング１００の内部表面で形成される。内部チャンバー１１０は、供給口 チャネル１０４及び排出口チャネル１０６に接続している。 図７及び８に見られるように、図３〜６のエレクトロポレーションチャンバー ７２の電極１０２は、平らで、長く伸びた、中空のシェルからなる。電極１０２ は末端に、冷却供給口１１２及び冷却排出口１１４を含む。上記したように、電 極１０２の背面、すなわち図７の左側の面は、ハウジング１００の斜めに切った 面１１１と直に接して合わさっている。 エレクトロポレーションチャンバー７２は、エレクトロポレーションに付され る細胞懸濁液が、供給口１０４を通ってエレクトロポレーションチャンバー７２ に入り、広がって、内部チャンバー１１０を満たすように設計されている。赤血 球懸濁液が内部チャンバー１１０を通って流れる時に、パルスまたは電荷が内部 チャンバー１１０の幅にわたって適用される。 エレクトロポロレーション工程の間比較的一定の温度を維持するために、冷却 液または冷却ガスを、ポンプで冷却供給口１１２に送り、冷却排出口１１４から 排出させ、その結果、電極１０２は約４℃に維持される。 図９及び１０は、第二の実施態様であるフローエレクトロポレーションチャン バー１７２を示す。図９及び１０に見られるように、フローエレクトロポレーシ ョンチャンバー１７２は、実質的に長方形の中空のハウジング２００を含む。二 本の電極２０２は、互いに真っ直ぐ向き合って、ハウジング２００の壁に直に接 触するように、ハウジング２００の内部に挿入される。さらに、フローエレクト ロポレーションチャンバー１７２は、ハウジング２００の一端に供給口チャネル ２０４、及び他端に排出口チャネル２０６を含む。この供給口チャネル２０４及 び排出口チャネル２０６は、コネクター２０８及び２０９を含み、コネクター２ ０８及び２０９は、細胞懸濁液すなわちＩＨＰ−赤血球懸濁液をエレクトロポロ レーションチャンバー１７２へ供給する細胞懸濁液供給装置へ、チューブ２１６ によって接続している。コネクター２０８及び２０９、並びに供給口チャネル２ ０４及び排出口チャネル２０６は、細胞懸濁液をハウジング２００の内へまたは 外へ送る。 図１０に見られるように、供給口チャネル２０４の一端及び排出口チャネル２ ０６の一端は、ハウジング２００の内部に延びて、内部チャンバー２１０を形成 する。このように、内部チャンバー２１０は、電極２０２の内側表面、ハウジン グ２００の内側表面、及び供給口チャネル２０４及び排出口チャネル２０６の内 側表面で形成される。 図９及び１０に見られるように、フローエレクトロポレーションチャンバー１ ７２の電極２０２は、平らで、長く伸びた、中空のシェルからなる。電極２０２ は末端に、冷却供給口２１２及び冷却排出口２１４を含み、冷却供給口２１２及 び冷却排出口２１４を通って、ガスまたは液体がポンプで送られて電極２０２を 通り、エレクトロポレーションの間、一定の温度を維持する。電極２０２は、ケ ーブル２２０によってパルスジェネレーターと接続している。 上記したチャンバーを使用して、図９及び１０のエレクトロポレーションチャ ンバー１７２は、エレクトロポレーションに付される懸濁液が、液体供給口２０ ４を通ってエレクトロポレーションチャンバー１７２に入り、広がって、内部チ ャンバー２１０を満たすように設計されている。赤血球懸濁液が内部チャンバー ２１０を通って流れる時に、パルスまたは電荷が電極２０２の間の内部チャンバ ー２１０の幅にわたって適用される。エレクトロポレーション工程の間比較的一 定の温度を維持するために、冷却液または冷却ガスをポンプで送り、コネクター ２０８及び２０９を通る電極２０２の冷却供給口２１２に送り、冷却排出口２１ ４から排出させ、その結果、電極２０２は約４℃に維持される。また、供給口チ ャネル２０４、排出口チャネル２０６、並びにコネクター２０８及び２０９は、 別々の構成部分としてよりもむしろ、一体の完全に統合されたガラス製部品とし て製造することができる。 エレクトロポレーションチャンバー１７２は、機械引き板ガラス(drawn glass )または高度に磨いた他のあらゆる材料から作成できることが予想される。エレ ク トロポレーションチャンバー１７２の内側表面は、表面の乱流の発生を低減する ためにできる限りなめらかであることが好ましい。機械引き板ガラスの構成部分 は、表面の仕上がりがほぼ理想的である。さらには、機械引き板ガラスの構成部 分は安定で、血液成分に不活性である。また、比較的安価で、使い捨てのエレク トロポレーションチャンバーとして望ましい。 電極もまた、コロイド金で電気めっきした、機械引き板ガラスで構成してもよ い。また、電極の表面は、高度に磨かれ、伝導性が高く、しかし生物学的に不活 性であるべきである。金の電気めっきは耐久性があり、高価ではない。流体の結 合は、通常入手できる部品を用いて行うことができる。 フローエレクトロポレーションチャンバーは、全体の流動式被包装置の一部と して、または、単一の装置として作成することができる。次にフローエレクトロ ポレーション装置は、特定の細胞集団を被包するため、商業的に入手可能なプラ ズマフォレーシス機械に接続してもよい。例えば、フローエレクトロポレーショ ンチャンバーは、電子的または中継的な(translational)ハードウェアまたはソ フトウェアによって、商業的に入手可能なプラズマフォレーシス装置に接続して もよい。任意に、パーソナルコンピュータプログラムによって操作されるピンチ バルブ配列及びコントローラーもまた、フローエレクトロポレーション装置を制 御するために使用することができる。同様に、電源から、フローエレクトロポレ ーションチャンバーまたは流動式被包装置を稼動するのに必要な電力レベルを確 立することができる。 連続的フローエレクトロポレーションチャンバーの第三の実施態様を、図１４ 〜２０を参照して説明する。初めに図１４〜１６を参照するが、支持部材３００ は、可撓性シリコーンラバーからなる。支持部材３００は本質的にダイヤモンド 型をしており、上部末端３０１と下部末端３０２を含む。支持部材３００の主要 部分は、支持部材３００の上に形成された格子状の「ワッフル」パターンを有し 、より厚いリブ部分３０３及びリブ３０３の中間の薄い部分３０４からなる。支 持部材３００のへりに沿って、多数のつまみ３０５があり、それぞれはつまみ３ ０５を通して形成された穴３０６を有する。 チャネル３０８は、支持構造の上部末端３０１と下部末端３０２との間に延び 、支持構造３００の主軸に沿っている。チャネル３０８は、底部３１４によって 接続する対置するチャネル壁３１０、３１２からなる。支持部材３００の上部末 端３０１において、チャネル３０８は円形のくぼみ３１８に開口する。穴３２０ を円形のくぼみ３１８の中央に形成する。排出口の開口３２２を円形のくぼみ３ １８の上部末端に形成する。同様に、チャネル３０８の下部末端は、支持部材３ ００の下部末端３０２に形成された円形のくぼみ３２４に開口する。穴３２６を くぼみ３２４の中央の支持構造を通して形成し、供給口の開口３２８を円形のく ぼみ３２４の下部末端に形成する。 伝導性の金属テープまたは薄片からなる一対の連続バンド電極３３０Ａ、３３ ０Ｂは、支持構造３００上に位置する。電極３３０Ａ、３３０Ｂはそれぞれ、チ ャネル３０８内に配置され、実質的にチャネル３０８の全体の長さも延びる部分 を有する。おそらく図１６において最も良く示されるように、チャネル３０８の 側壁３１０、３１２に形成される対置する凹部３３２は、電極３３０Ａ、３３０ Ｂを収容する。チャネル３０８の上部及び下部末端に隣接して、連続バンド電極 ３３０Ａ、３３０Ｂはそれぞれ、チャネル壁３０８内に形成された、ぴったりし たスリットを通ってチャネル３０８を出る。次に、連続バンド電極３３０Ａ、３ ３０Ｂは外へ曲がり、実質的に支持部材３００の外縁と平行に、そしてそこから 内側に間隔をおいて延びる。下記の目的のために、支持構造３００の正中線に沿 って、及びその外側の縁に隣接して、連続バンド電極３３０Ａ、３３０Ｂのそれ ぞれに、たるみ部分３３４が形成される。 チャネル３０８のそれぞれの側に、及びそれに隣接して、大体長方形の穴３４ ０が多数形成される。下記により詳しく説明するように、穴３４０は、冷却する 目的で、任意にペルティア(Peltier)の熱電気エレメントを適合させるために配 置される。チャネル３０８のそれぞれの側に、その上部及び下部末端に隣接して 、円形の穴３４２が、図示されるように、連続バンド電極３３０Ａ、３３０Ｂを ぴんと張るためのキャプスタンを収容するように適合させて形成される。支持構 造３００の正中線に沿って、及びその外側の縁に隣接して、下記により詳しく説 明 するように、電極３３０Ａ、３３０Ｂに荷電するために通る電気的接触子を収容 するように適合させた、一対の穴３４４が形成される。 今度は図１７を参照するが、支持部材３００は、透明なポリカーボネートのフ レーム３５０上にのせる。フレーム３５０は、平らな正面壁３５２を有する。内 側面壁３５４は、平らな正面壁３５２の横の端から後方へ延びる。後方の開口チ ャネル３５６は、二枚の内側面壁３５４の間に形成される。内側面壁３５４の後 方の端から、一対の背面壁３５８が外側に延びる。一対の外側面壁３６０は、背 面壁３５８の外側の端から前方に延びる。前方の開口チャネル３６２は、外側面 壁３６０と内側面壁３５４との間に形成される。それぞれの前方の開口チャネル ３６２内に除去できるように設置される棒３６３は、チャネル内に液体貯蔵バッ グをつるすのに便利な手段である。 支持構造３００は、ポリカーボネートのフレーム３５０の正面壁３５２の背表 面に配置される。支持構造３００はフレーム３５０に粘着して結合し、フレーム ３５０の正面壁３５２は支持構造３００の前面に形成されたチャネル３０８の開 口した上部末端に封をする。チャネル３０８はこのように取り囲まれて、液体の 通路すなわち「フローセル」３６４を画定する。加えて、支持構造３００とフレ ーム３５０の関連する部分は、エレクトロポレーションチャンバー３６６を画定 する。 図１７を参照すると、支持カラム３７０は、おおよそ長方形の横断向を有する 。支持カラム３７０の正面３７１には、支持構造３００の形状及び奥行に適合す るくぼみ３７２が形成される。くぼみ３７２のそれぞれの側部に接し間隔をおい て、またくぼみ３７２の主軸に沿って、多数のテルル化ビスマスのペルティエ(P eltier)熱電気エレメント３７４がくぼみに固定され、くぼみ３７２の底部から 前方に出っ張る。ペルティエ熱電気エレメント３７４は、支持カラム３７０の内 側に設置されるヒートシンク３７５と熱的に連絡している。支持カラム３７０の 隣接部分に配置される電気ファン３７６は、カラムを通る空気の流れを作り、ヒ ートシンク３７５から熱を除去する。 くぼみ３７２の上部及び下部末端に隣接し、中心線の両側へ間隔をおいて、キ ャプスタン３７７がある。くぼみ３７２の外側の縁に隣接し、くぼみの主軸に沿 って位置する、一対の電極接触子３７８がある。くぼみ３７２の周囲のちょうど 内側に、８個のロケーターピン３７９が配置され、ロケーターピン３７９の２個 はダイヤ型のくぼみの４面の壁のそれぞれに沿って位置する。くぼみ３７２の上 部及び下部末端には、くぼみの主軸上に、一対の中空で、多孔性の、重合体のシ リンダー３８０が配置される。シリンダー３８０は、好ましくは、気体は通過で きるが液体は通過できないサイズの孔を有する、不活性な発泡ポリエチレン（ポ レックス(Porex)など）で形成される。以下により詳しく説明するように、これ らの気体透過性で液体非透過性のシリンダーは、そこを流れる液体から泡を除去 する手段として機能する。 ポリカーボネートのフレーム３５０の容積は、支持カラム３７０がフレームの 後方の開口チャネル３５６内にぴったり収容されるようなものである。フレーム ３５０が支持カラム３７０上に位置するので、フレーム３５０の正面壁３５２の 背表面に配置される支持構造３００は、支持カラム３７０の正面３７１に形成さ れるくぼみ３７２内に適合する。シェルフ３８１は、くぼみ３７２の直下の支持 カラム３７０の正面３７１上に配置され、ポリカーボネートのフレーム３５０の 下部の縁を支持する。 このように支持カラム３７０に配置されるフレーム３５０を用いて、くぼみ３ ７２及び支持カラム３７０に関連する種々のエレメントは協力的に、図１９に示 されるように支持構造３００を固定する。特に、熱電気の冷却エレメント３７４ は、支持構造３００の穴３４０を通って突き出て、チャネル３０８の壁と接触す る。キャプスタン３７７は、支持構造３００の上部及び下部末端の穴３４２を通 って延びる。電極接触子３７８は、支持構造３００の穴３４４を通って突き出る 。ロケーターピン３７９は、支持部材３００のつまみ３０５における対応する穴 ３０６内におさまる。そして、気体透過性で液体非透過性のシリンダー３８０は 、支持構造３００の上部及び下部末端３０１、３０２で、くぼみ３１８、３２４ 内の穴３２０、３２６を通って延びる。 今度は図２０を参照するが、電極３３０Ａ、３３０Ｂをそれぞれ支持する少な くとも一つのキャプスタン３７７は、引っ張り手段３８２などによってぴんと張 られ、連続バンド電極をぴんと張った状態に維持する。図２０にも見られるよう に、それぞれの電極接触子３７８には、その正面に溝３８３が形成され、この溝 に、関連する連続バンド電極３３０Ａまたは３３０Ｂのたるみ部分３３４は、こ の溝を通る。それぞれの電極接触子３７８と嵌合して駆動するモーター３８４は 、電極接触子を回転させるように操作することができ、それによって、接触子部 分に電極３３０Ａまたは３３０Ｂを巻き付け、たるんだ部分がぴんと張られる。 この巻き付け操作は、電極接触子３７８と関連する電極３３０Ａまたは３３０Ｂ との間の接触面を増やすために、付加的に機能し、それによって電極の電気的連 結を増強する。 フローセル３６４の上部及び下部末端の（図２０では上部のみ示す）、気体透 過性で液体非透過性のシリンダー３８０は、継ぎ手３８８及びチューブ３９０に よって真空源と流体の連絡がある。また図２０で示される、ヒートシンク３７５ は、熱電気冷却エレメント３７４によって集められた熱を除去する。 フローセル３６４の内外への適切な流路に沿う流体の流れは、支持カラム３５ ０に配置される蠕動ポンプ手段３９２及びソレノイドで稼動されるピンチバルブ ３９４によって制御される。ポンプ手段３９２及びピンチバルブ３９４は、それ らに操作できるように接続されるコンピュータ手段（図示せず）の適切なアルゴ リズムの制御下で機能する。 冷却されたプレート３９６は、支持カラム３７０の側面に配置される。フレー ム３５０のチャネル３６２内に保持される冷却バッグ３９８は、このプレート３ ９６と密着して、エレクトロポレーションに続いて処理される液体を冷却する。 周囲環境及び処理される生物学的物質に依存して、バッグ３９８の内容物を周囲 の温度以上の予め決められた温度に維持するために、プレート３９６を任意に加 熱してもよい。 図２１は、自給のエレクトロポレーション装置４００を示す。装置４００は、 ハウジング及び支持構造としてはたらくカート４０２を備える。エレクトロポレ ーションチャンバー３６６を有する支持カラム３７０はカートに配置され、そこ から上に延びる。カート４０２は車台構造４０４を有し、車台構造は、カート４ ０２の位置の移動を容易にするための車輪４０６を有する。車台構造４０４には 、電源蓄電器４０８が配置される。電源ヒートシンク４１０は、電源蓄電器４０ ８と熱的に連絡し、電源蓄電器によって産生される熱を除去する。 回路基盤計算手段４１２もまた車台構造４０４内に配置される。回路基盤計算 手段４１２は、回路基盤計算手段に隣接した車台構造４０４内に配置された電源 回路基盤４１４によって、電力が供給される。電源回路基盤４１４と熱的に連絡 している電源ヒートシンク４１６は、電源回路基盤によって産生される熱を除去 する。車台構造４０４の正面パネル４２０の下部末端に配置される冷却ファン４ １８は、車台構造を通って空気を吸い込み、ヒートシンク装置４１０、４１６か ら熱を除去する。 回路基盤計算手段４１２と動作的に関連するシステム状態表示装置４２２は、 カート４０２の正面パネル４２０に配置される。回路基盤計算手段４１２の様々 なパラメータを設定する制御スイッチ４２４は、カート４０２の正面パネル４２ ０の、システム状態表示装置４２２の下に配置される。 カート４０２の頂部パネル４２８内には、遠心分離槽４３０が配置される。車 台構造４０４内部に配置される遠心分離駆動モーター４３２は、遠心分離槽４３ ０とかみ合って稼動する。遠心分離槽４３０は、ロータリーコネクター４３４を 含み、ロータリーコネクターを通って血液が遠心分離槽へ供給される。 第三の実施態様であるエレクトロポレーションチャンバー３６６を含む自給の エレクトロポレーション装置４００における、生物学的粒子の処理について、図 ２１を参照して説明する。血液供給バッグ４５０は、フレーム３５０のチャネル ３６２の一つの内部の棒３６３につり下げられる。チューブ４５２は、血液を遠 心分離槽４３０に送り、そこで、血液はロータリーコネクター４３４を通って遠 心分離槽に導入される。血液を遠心分離して、血漿、白血球、及び老廃物から赤 血球を分離する。次に、赤血球を被包される物質と混合する。混合物は、チュー ブ４５４を通って送られ、セル３６４の下部末端で供給口の開口３２８に導入す る。混合物は、電極３３０Ａ、３３０Ｂの間のフローセル３６４を通って、上向 きに流す。電極は、第二の実施態様に関して上述したように、パルスで荷電する 。電気分解で発生する混合物中の気体は、セルの上部及び下部末端の、気体透過 性で液体非透過性のシリンダー３８０によって除去する。処理された混合物は、 セルの上部末端の、排出口の開口３２４を出て、排出口チューブ４５６は、処理 された混合物を、フレーム３５０の別のチャンバー３６２の内部の棒３６３につ るされ、冷却されたプレート３９６に接触している冷却バッグ４６０に送る。次 に、液体は、冷却バッグ４６０の隣の、棒３６３につるした処理後の冷却及び貯 蔵バッグ４６２に運ばれる。 ポンプ速度（以下、流速）、バルブ操作、遠心分離操作、ペルティエ熱電気エ レメントの操作、及び電極のパルス荷電は、全て回路基盤計算手段４１２によっ て制御する。理想的には、遠心分離槽４３０の処理速度は、フローセル３６４の 流速に合わせる。しかしながら、ずれを全て適応させるために、任意に貯蔵槽を 遠心分離槽４３０とフローセル３６４の間に設置してもよい。このようにして、 遠心分離槽４３０が、フローセル３６４の血液処理速度よりも速く、血液を処理 する場合には、フローセルが「追いつく」まで、貯蔵槽は過剰な混合物を全て保 持する。同様に、遠心分離槽４３０が、フローセル３６４の血液処理速度よりも 、血液処理が遅い場合には、初めに回路基盤計算手段４１２が混合物を貯蔵槽４ １２に蓄積する。次に、遠心分離槽４３０が充分な量の血液を処理すると、混合 物が貯蔵槽からフローセル３６４に送られる。貯蔵槽内の混合物の容量が使い果 たされるまでには、遠心分離槽は、所望の量の血液の処理が完了している。 上述したエレクトロポレーション装備４００の任意の特徴は、フローセル３６ ４に沿ったある地点の冷却エレメント３７４が、フローセル３６４に沿った他の 地点の他の冷却エレメント３７４よりも冷却程度を大きく、あるいは小さくする ことができるように、一連のペルティエ熱電気冷却エレメント３７４が個々に制 御可能であることである。生物学的粒子はフローセル３６４に沿って移動するに 従って加熱されるので、供給口末端に隣接するところよりも、フローセル３６４ の排出末端により近い方をより冷却する必要があるかもしれない。種々の熱電気 冷却エレメント３７４を個々に制御することで、これらの変動を適合させられる 。 種々の熱電気冷却エレメント３７４は、フローセルに沿った様々の地点に熱セン サーを設置し、センサーで検出された温度を回路基盤計算手段４１２にインプッ トし、そしてセンサーで検出された温度に対応して種々の熱電気冷却エレメント を制御することによって、制御することができる。または、種々の熱電気冷却エ レメント３７４は、生物学的粒子について前もって測定した、フローセルに沿っ た「平均の」温度分散に従って、制御することができる。当業者は、種々の熱電 気冷却エレメント３７４を制御する他の方法を思いつくであろう。 当業者によって評価されることであるが、エレクトロポレーションセルの再使 用が好ましくない理由がいくつかある。第一に、感染性の成分が他の患者に伝達 される可能性がある。さらに、電極表面の電気的性能が、電極表面を横切る高電 圧のために低下し、それによってアーク電位が上昇する可能性がある。これらの 、及び他の問題を防ぐために、この三番目に開示された実施態様の特徴は、セル が再使用されないことを確実にする手段を提供するものである。処理の最後に、 フレーム３５０が支持カラム３７０から除かれる前に、電極接触子３７８とかみ 合って稼動するモーター３８４は、自動的に稼動して過回転し、電極の引張強度 を超えて電極３３０Ａ、３３０Ｂを引っ張り、電極を破断する。このように電極 ３３０Ａ、３３０Ｂが破断されることによって、セルの再使用は不可能である。 エレクトロポレーション装置に関連して知られているリスクは、電気分解によ って意図しない気体が産生されることである。そのような望まない気体の発生に よる過剰の圧力によって、爆発的現象(explosive expression)が起こることが知 られている。この可能性を最小限にするため、本発明では、ソフトシリコンラバ ーによる三側面で画定したフローセル３６４を使用する。一時的に圧力が過剰に なった場合、支持構造３００の弾性がフローセル３６４の膨張に適応し、それに よって爆発の可能性を低くする。加えて、フローセル３６４は、支持カラム３７ ０とポリカーボネートのフレーム３５０の間にしっかりとはさまれ、あらゆる爆 発的現象の可能性に対して、さらに保護する。 この発明について、開示した実施態様に関して特に詳細に説明したが、多様な 変更及び改変は添付の請求の範囲に記載される発明の趣旨及び範囲内でなされ得 ることが理解される。 細胞洗浄装置 図２４は、濾過透析、好ましくは向流濾過透析を利用する細胞洗浄装置５００ のカッタウェイ模式図である。完全な装置は頂部及び側面を有し、装置の内部の 構成部分を完全に包含する。本発明のもう一つの要旨は、ＩＨＰ溶液、及び、通 常の生理食塩水などの、しかしこれに制限されない、赤血球と適合する溶液であ る代替品を除去する多孔性の膜を通した向流透析を利用する細胞洗浄装置である 。図２４に示されるように、細胞洗浄装置５００は、エレクトロポレーションさ れた細胞を含む第一の貯蔵槽５０５からなる。ＩＨＰの存在下でエレクトロポレ ーションされた細胞の場合、これらの細胞は、エレクトロポレーションチャンバ ー７２を通過し、過剰のＩＨＰを含有する溶液中に存在する。次に、エレクトロ ポレーションされた細胞は、ポンプ５１０によってチューブ５１５を通って矢印 の方向に送られる。細胞懸濁液は、細胞洗浄装置のハウジング５２３内に位置す るチューブ入口５２０から細胞洗浄装置５００に導入される。装置５００の内部 の細胞の流路は、細胞懸濁液が通過する入り組んだ経路(labyrinth)を形作る隆 起部５２５を有する細胞プレート５２６によって画定される。 好ましい入り組んだ経路を図２５に示すが、図２５は、入り組んだ経路を形作 るプレート上の隆起部を有する細胞プレート５２６の側面図を示す。セルプレー ト５２６は、隆起部５２５によって形作られる入り組んだ通路に沿って細胞を押 し入れるに充分な強さで、半透膜５７５の第一の側面５７７に押しつけられる。 隆起部５２５によって形作られる入り組んだ経路は、細胞懸濁液が半透膜５７５ と接触している限り、いずれの形状であってもよいことが理解される。従って細 胞懸濁液は、細胞洗浄装置５００を通過する間、半透膜５７５と接触している。 半透膜５７５は、溶液及び溶液のあらゆる成分が膜を通過でき、溶液中の細胞 は通過できない大きさの孔を有する。半透膜は、細胞懸濁液中の細胞と適合する いずれの物質であってもよい。本発明の細胞洗浄装置に使用することができる半 透膜は、ポリプロピレン（トラベノールラボラトリーズ(Ｔravenol Ｌaboratori es)）、二酢酸セルロース（旭メディカル）、ポリビニルアルコール（クラレ） 、ポリメ チルメタクリレート（東レ）、及びポリ塩化ビニル（コーブラボラトリーズ(Ｃo be Ｌaboratories)）を含むが、これらに限定されるものではない。赤血球に対 しては、半透膜の孔は、直径１ミクロン以下でなければならいが、よりずっと小 さくてもよい。細胞懸濁液が出口チューブ５３０で装置５００を出るまで、細胞 は隆起部５２５によって形作られる入り組んだ経路に沿って移動する。ＩＨＰを 有する細胞懸濁液に関しては、細胞懸濁液は次にポンプで貯蔵槽５００に戻され 、洗浄液中のＩＨＰ値が許容される値に落ちるまで、装置５００中を再循環する 。 半透膜５７５のもう一方の側面には、細胞プレート５２６上の隆起部と全く一 致した隆起部５５５を有する、同一の生理食塩水プレート５３６がある。生理食 塩水プレートは、半透膜５７５の第二の側面に押しつけられ、それによって、隆 起部５２５によって形作られる入り組んだ経路と左右対称の入り組んだ経路を形 作る。例えば生理食塩水など、細胞との生体適合性のある洗浄液は、生体適合性 のある液体を含む貯蔵槽５４０から、チューブ５６７を通り、細胞洗浄装置５０ ０の洗浄液出口５５０へ、ポンプ５６５によって送られる。 洗浄液は、洗浄される細胞と生体適合性のあるいずれの溶液であってもよいこ とが理解される。このような洗浄液には、等張生理食塩水、高張生理食塩水、低 張生理食塩水、クレブズ−リンゲル重炭酸塩緩衝液、アールの平衡塩類、ハンク スの平衡塩類、ＢＥＳ、ＢＥＳ−トリス、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、及び トリシンが含まれるが、これらに限定されるものではない。細胞培養の培地は、 洗浄液として使用することができ、１９９培地、ダルベッコの改変イーグル培地 、ＣＭＲＬ−１０６６、最少必須培地（ＭＥＭ）、及びＰＲＭＩ−１６４０が含 まれるが、これらに限定されるものではない。加えて、ここで定義される再封溶 液は、洗浄液として使用することができる。さらに、上記の溶液のあらゆる混合 物を洗浄液として使用することができる。 生体適合性のある溶液は、出口５６０から細胞洗浄装置５００を出るまで、隆 起部５５５によって形作られる入り組んだ経路に従って、ポンプ５６５によって 装置を通過する。生体適合性のある溶液は次に、配水管５７０を通って廃棄され る。生体適合性のある溶液が細胞を含有する溶液と反対方向にポンプで送られる 場合に、装置５００の効率が最も良いことは、重要である。しかしながら、生体 適合性のある溶液を、細胞を含有する溶液と同じ方向にポンプで送ることができ ることは、本発明において予想される。 一例として、エレクトロポレーションされた細胞から得たＩＨＰを含有する細 胞懸濁液を使用する場合、両溶液を細胞洗浄装置５００にポンプで送るに従って 、ＩＨＰを含有する細胞懸濁溶液は半透膜５７５を通って拡散し、同時に、生体 適合性のある溶液は半透膜５７５を通って反対方向に拡散する。この拡散が継続 するに従って、細胞懸濁溶液は徐々に希釈され、ＩＨＰ値が許容される値になる まで、生体適合性のある溶液で置換される。 細胞洗浄装置５００は、任意に、細胞プレート５２６の外側及び洗浄液プレー ト５３６の外側に熱電気エレメント５８０を取り付けることができる。熱電気エ レメント５８０は、プレート５２６及び５３６の一方または両方に取り付けるこ とができることが理解される。熱電気エレメント５８０は、洗浄サイクルの間、 溶液を冷却するため、または加温するために使用することができる。このように 、細胞洗浄装置がそれに取り付けられる熱電気エレメントと共に使用される場合 には、細胞はインキュベーターとしてはたらく細胞洗浄装置中で加温されると再 封されることから、インキュベーター７８は必要とされないことが理解される。 生体適合性のある洗浄液は、再封緩衝液となり得る。温度は水浴などの他の方法 によって制御することができることが理解される。 細胞洗浄装置５００の形状は、円形容器の内側部分が細胞懸濁液を含み、半透 膜５７５によって円形容器の外側部分と分離されている円形容器を含む、いかな る形状であってよい。円形容器５００は、細胞を含有する溶液を半透膜５７５に 通過させ、それによって混入している不純物を除去する一助として、ゆっくりと 回転させることができる。 細胞洗浄装置は、装置で洗浄される細胞と生体適合性のあるあらゆる物質から 構成されることができる。細胞プレート５２６及び洗浄プレート５３６は、弾性 のシリコーンラバーで製造することができる。 エレクトロポレーションした細胞を洗浄するための遠心分離の代替として使用 できる、細胞洗浄装置のもう一つの実施態様を、図２６に示す。細胞洗浄装置の 第二の実施態様である細胞洗浄装置６００において、細胞洗浄装置の中心的な特 徴は、シリコーンラバーなどのエラストマー材料から作られるエラストマーセル ６０５である。次に図２７に関して、エラストマーセル６０５は、エラストマー セル６０５の中心部に半透膜６１０を有する成型部品である。半透膜６１０の両 側には、入り組んだ経路を形成し、エラストマーセルの長さ全体にわたる水平の 刻み目６１５がある。 図２６に示されるように、エラストマーセル６０５は、洗浄液を導入するため の供給口６２５と、洗浄液を除去するための排出口６３０と、エレクトロポレー ション液と共に細胞を導入する供給口６３５と、エレクトロポレーション液と共 に細胞を除去する排出口６４０とを有する。このように、洗浄液はエラストマー セル６０５内の半透膜６１０の片側に導入され、入り組んだ経路を通って循環し 、排出口６４０から出る。エレクトロポレーションした細胞を含有するエレクト ロポレーション液は、半透膜６１０の反対側に導入され、入り組んだ経路を通っ て循環し、排出口６４０から出る。 半透膜６１０は両側を完全に分離し、両側の間の全ての連絡手段は半透膜６１ ０を通過することが理解される。半透膜は、溶液は膜６１０を通過するが、半透 膜６１０を通過する細胞のような粒子は通過しない孔を有する。半透膜は、細胞 懸濁液中の細胞と生体適合性のある、いかなる物質であってもよい。本発明の細 胞洗浄装置に使用することができる半透膜は、ポリプロピレン（トラベノールラ ボラトリーズ(Travenol Laboratories)）、二酢酸セルロース（旭メディカル） 、ポリビニルアルコール（クラレ）、ポリメチルメタクリレート（東レ）、及び ポリ塩化ビニル（コーブラボラトリーズ(Cobe Laboratories)）を含むが、これ らに限定されるものではない。赤血球に対しては、半透膜の孔は、直径１ミクロ ン以下でなければならないが、よりずっと小さくてもよい。 エラストマーセルはフレーム６５５の中に配置することができ、また、側部６ ６０が側部６６５に対向してエラストマーセル６０５を保持し、それによってエ ラストマーセルを側部６６０と側部６６５との間にしっかり固定するように、側 部６６０はちょうつがい６６５及び６６６上で回転することができる。側部６６ ０は、エラストマーセル６１０を加熱または冷却することができる、熱電気エレ メントである。側部６６５は、ベルト６７５上を動き、続いて、ローラーがベル ト６７５の周りを動くに従ってエラストマーセルを締め付けることができ、続い て、側部６６５の高さに垂直に動く弾性の棒６７７に対して圧力をかけるローラ ー６７０を有する、脈動機構である。 操作において、エラストマーセルは、フレーム６５５の中に配置され、側部６ ６０（熱電気エレメント）はエラストマーセル６０５上に接触する。勿論、側部 ６６０は熱電気エレメントのないプレートであってもよい。第一の側面６１５上 で、供給口は、洗浄液貯蔵槽（図示せず）に取り付けられる洗浄液チューブに取 り付けられる。排出口６３０は、排出管（図示せず）に接続する。エラストマー セルの反対側では、供給口６３５が細胞及びエレクトロポレーション液を含む貯 蔵槽（図示せず）に接続する。排出口６４０は、細胞及びエレクトロポレーショ ン液を細胞貯蔵槽に戻すチューブに接続する。 操作において、蠕動アクティベーター６７０は、洗浄液側を柔らかくポンプで 押し、それによって溶液を供給口から排出口へ進める。任意に、細胞洗浄装置５ ００で示した方法と同様に、二つの溶液を外部ポンプによって二つの入り組んだ 経路を通過させることができる。蠕動アクティベーターはエラストマーセルを押 しているので、大量移動作用(mass transfer action)によってより多くの液体が 半透膜６５０を通って移動する。この作用は、エレクトロポレーション液が洗浄 液で実質的に置換されるまで継続する。 ＩＨＰ処理した赤血球の適用 本発明は、赤血球の酸素運搬能力を高める新規な方法を提供する。本発明の方 法に従って、ＩＨＰは安定な方法でヘモグロビンと結合し、ヘモグロビンの酸素 放出能力をシフトさせる。ＩＨＰ−ヘモグロビンを有する赤血球は、ヘモグロビ ンのみに比べ、一分子当たりより多くの酸素を放出することができ、従って循環 する血液の各ユニット当たり、組織へ拡散する酸素がより多く得られるようにな る。通常の環境下では、ＩＨＰには毒性があり、薬剤として使用することはでき ない。しかしながら、この新規な方法でＩＨＰをヘモグロビンに結びつけるとＩ ＨＰの毒性が中和される。重篤な慢性の血液損失がなければ、本発明の方法に従 って調製される組成物を用いた治療によって、有益な効果を約９０日間持続させ ることも可能であろう。 ＩＨＰ処理した赤血球のもう一つの利点は、貯蔵してもボーア効果が損なわれ ないことである。従来の方法で貯蔵された普通の赤血球では、その最大酸素輸送 能力が約２４時間回復しない。この原因は、普通の赤血球中のＤＰＧが、貯蔵す る間にヘモグロビン分子から離散し、注入後、体内で置換されなければならない からである。対照的に、本発明によって処理された赤血球は、貯蔵する間最大酸 素運搬能力が保持され、従ってヒトまたは動物に注入された直後から最大量の酸 素を組織に運ぶことができる。 ＩＨＰ処理した赤血球（ＲＢＣ）の使用は、多くの急性及び慢性疾患の治療を 包含して非常に広範囲に及び、そのような疾患には、入院患者、心血管系手術、 慢性貧血、大手術後の貧血、冠血管梗塞及び関連する問題、慢性肺疾患、心血管 系患者、封入した赤血球注入の増強としての自己注入（出血、外傷性傷害、また は手術）、うっ血性心不全、心筋梗塞（心臓発作）、卒中、末梢血管性疾患、間 欠性跛行、循環系ショック、出血性ショック、貧血と慢性低酸素症、呼吸性アル カリ血症、代謝性アルカローシス、鎌状赤血球貧血、肺炎による肺容量低下、手 術、肺炎、外傷、胸部穿刺、壊そ、嫌気性菌感染、糖尿病等の血管疾患、高圧チ ャンバーを用いた治療の代替または補助、手術中の赤血球回収、心不全、慢性適 応症に派生する無酸素症、組織移植、一酸化炭素、酸化窒素、及びシアン化物中 毒が含まれ、しかしそれらに限定されるものではない。 上記の疾病状態を一つ以上罹患するヒトまたは動物は、本発明に従って調製し たＩＨＰ処理血液を約０．５〜６ユニット（１ユニット＝５００ｍｌ）注入する ことによって治療される。いくつかの場合には、患者の本来の血液全てをＩＨＰ 処理血液で、実質的に完全に置換することもできる。ヒトまたは動物に投与され るＩＨＰ処理赤血球の容量は治療する適応症に依存する。加えて、ＩＨＰ処理赤 血球の容量は赤血球懸濁液中のＩＨＰ処理赤血球の濃度にも依存する。患者に投 与されるＩＨＰ赤血球の量は、臨界的ではなく、幅広く変えることができ、なお 有効であることが理解される。 ＩＨＰ封入処理をした赤血球（ＲＢＣ）は、ユニットあたり２〜３倍の酸素を 組織に輸送することができる以外は、通常の赤血球と同様である。従って医師は 、通常の赤血球２ユニットよりむしろ、ＩＨＰ封入処理した赤血球１ユニットを 投与することを選択するであろう。ＩＨＰ封入処理した赤血球は、ＩＨＰを細胞 中に被包する処理工程を除いて、現在の血液処理方法と同様に血液処理センター で調製されるであろう。 この発明については、開示した実施態様に関して特に詳細に説明したが、多様 な変更及び変形は添付の請求の範囲に記載される発明の趣旨及び範囲内で有効で あることが理解される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年５月５日 【補正内容】 請求の範囲 １．流体流路を形作る壁と、 電極をパルス電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み、それ によって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付される 、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と を備える、生物学的粒子の穿孔装置であって、 前記装置は、弾性的に変形可能である、前記流体流路を形作る前記壁の少なく とも一つ、及び、実質的に剛性である、前記流体流路を形作る前記壁の少なくと ももう一つを特徴とし、 それによって、前記流体流路内の一時的な圧力の増加が、前記壁の前記弾性材 料により、少なくとも部分的に吸収される、生物学的粒子の穿孔装置。 ２．変形可能な弾性材料からなる、前記流体流路を形作る前記壁の少なくとも一 つが、変形可能な弾性材料からなる二つの前記壁からなる請求の範囲第１項に記 載の装置。 ３．前記電極が連続バンド電極を備えてなる請求の範囲第１項に記載の装置。 ４．支持部材に取り外しできるように取り付けられる生物学的粒子の穿孔装置で あって、 流体流路を形作る壁と、 電極をパルス電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み、それ によって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付される 、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 支持部材に取り付けられたときに前記電極と接続され、前記装置が前記支持部 材から取り外される前に前記電極を破壊する手段とを備え、 それによって前記装置が再使用され得ない、生物学的粒子の穿孔装置。 ５．前記電極をエネルギー源と電気的に連絡して配置する前記手段がスピンドル からなり、前記電極は関係するスピンドルの表面の少なくとも一部に巻き付けら れ、 前記電極を破壊する前記手段が、前記電極をその張力の限界を超えて延ばすよ うに前記スピンドルを回転させる手段からなり、それによって前記電極を破断さ せ、電気的に作動不可能にする、 請求の範囲第４項に記載の装置。 ６．流体流路を形作る壁と、 電極をパルス電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み、それ によって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付される 、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 前記流体流路に沿って前記生物学的粒子を移動させるポンプ手段と、 前記ポンプが前記流体流路に沿って前記生物学的粒子を移動させる速度に応答 して、前記高圧電気エネルギーのパルスの間隔を制御する制御手段とを備え、 それによって前記流体流路に沿って移動する前記生物学的粒子が、前記電極間 でパルスに付される間、所定の数のパルスに付される、 生物学的粒子の穿孔装置。 ７．ａ．流体流路を形作る壁、及び、前記流体流路の対置する面に沿って配置さ れる電極からなり、前記電極は電気エネルギー源と電気的に連絡して前記電極を 配置する手段を含む、生物学的粒子の穿孔のための装置に、溶液中の生物学的粒 子を供給し、 ｂ．生物学的粒子をエネルギーの最初の電気パルスに付し、 ｃ．生物学的粒子を、エネルギーの最初の電気パルスよりも低電圧の一連の 電気パルスからなる、より低電圧の電気パルスの連続に付すこと を含む、生物学的粒子のエレクトロポレーション方法。 ８．最初の電気パルスが、約１，０００〜３，２００Ｖ／ｃｍであり、より低電 圧の電気パルスの連続が、それぞれ約１，０００〜１，７５０Ｖ／ｃｍの電気パ ルスの約１０〜５１２個の連続からなる、請求の範囲第７項に記載の方法。 ９．最初の電気パルスが、約２ミリ秒間の約２，１３０ｋＶ／ｃｍであり、より 低電圧の電気パルスの連続が、それぞれ約５ミリ秒間の約１，０００〜１，７５ ０Ｖ／ｃｍの電気パルスの約３１２個の連続である、請求の範囲第７項に記載の 方法。 １０．さらに生物学的粒子を、反対の極性及びエネルギーの最初の電気パルスよ りも低い電圧を有する電気パルスの第二の連続に付すことからなる、請求の範囲 第７項に記載の方法。 １１．生物学的粒子を、反対の極性をそれぞれ連続して有するパルスの連続に３ 〜５回付す、請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．溶液が生物学的粒子内に被包される生物学的活性物質を含む、請求の範囲 第７項に記載の方法。 １３．溶液が約８７Ω．ｃｍ〜１８５Ω．ｃｍの抵抗率を有するイノシトール六 リン酸溶液からなる、請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４．溶液が約３００ｍＭ〜５００ｍＭのミリオスモラリティー(milliosmolari -ty)のイノシトール六リン酸、約４〜８ｎＳ／ｃｍの伝導率、及び約４〜９ｐｐ ｔの実用塩分を有する、請求の範囲第１３項に記載の方法。 １５．溶液が約１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度のイノシトール六リン酸を含む、請 求の範囲第１２項に記載の方法。 １６．溶液が約２２．５ｍＭ〜５０ｍＭの濃度のイノシトール六リン酸を含む、 請求の範囲第１２項に記載の方法。 １７．溶液が約３５ｍＭの濃度のイノシトール六リン酸を含む、請求の範囲第１ ２項に記載の方法。 １８．溶液が約１０ｍＭ〜１ｍＭの濃度のＫＣｌ、約２ｍＭ〜０．５ｍＭの濃度 のＭｇＣｌ₂、及び約６７．５〜２７０ｍＭの濃度のショ糖を含む、請求の範囲 第１２項に記載の方法。 １９．さらに生物学的粒子をインキュベーションチャンバーに送る、後の工程を 含む、請求の範囲第７項に記載の方法。 ２０．インキュベーションチャンバーが、約１５０ｍＭの塩化ナトリウム、８ｍ Ｍの塩化カリウム、６ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、１ ０ｍＭのグルコース、１ｍＭのアデニン、及び１ｍＭのイノシンを含む再封緩衝 液を含む、請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２１．さらに生物学的粒子を細胞洗浄装置に送る、後の工程を含む、請求の範囲 第７項に記載の方法。 ２２．細胞洗浄装置が、約０．９％の塩化ナトリウム、２ｍＭの塩化マグネシウ ム、２ｍＭの塩化カルシウム、２ｍＭの硫酸マグネシウム、及び１０ｍＭのグル コースを含む洗浄希釈剤を含む、請求の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．ａ．外側面、及び生物学的粒子が通る通路の入口及び出口を有する生物学 的粒子の入り組んだ経路をその上に形作る隆起部を有する内側面からなる生物学 的粒子プレートと、 ｂ．外側面、及び洗浄液が通る通路の入口及び出口を有する、生物学的粒子の 入り組んだ経路に対応する、洗浄液の入り組んだ経路をその上に形作る隆起部を 有する内側面からなる洗浄液プレートと、 ｃ．生物学的粒子と同じ大きさのまたはそれより大きい粒子の通過を防ぐ、生 物学的粒子の入り組んだ経路と洗浄液の入り組んだ経路との間に配置される半透 膜と を備える、生物学的粒子の洗浄装置。 ２４．生物学的粒子の入口が、洗浄液の入り組んだ経路の出口に対応する生物学 的粒子の入り組んだ経路の末端に位置し、生物学的粒子の出口が、洗浄液の入り 組んだ経路の入口に対応する生物学的粒子の入り組んだ経路の末端に位置する、 請求の範囲第２３項に記載の装置。 ２５．さらに、生物学的粒子の温度を調節するための、生物学的粒子プレートの 外側面に隣接した熱伝導エレメントを含む、請求の範囲第２３項に記載の装置。 ２６．さらに、洗浄液の温度を調節するための、洗浄液プレートの外側面に隣接 した熱伝導エレメントを含む、請求の範囲第２３項に記載の装置。 ２７．生物学的粒子プレート及び洗浄液プレートがそれらの間に配置される半透 膜を有する円の中に形成され、その結果、生物学的粒子の入り組んだ経路及び対 応する洗浄液の入り組んだ経路が円の外周を横断する、請求の範囲第２６項記載 の装置。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アッカー，ジェセ エル. アメリカ合衆国，07866 ニュージャージ ー，ロックアウェイ，オスウィーゴ アベ ニュー ８番地 【要約の続き】 バー（７２）へ送られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．流体流路を形作る壁と、 電極を高圧パルスの電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み 、それによって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付 される、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と を備える、生物学的粒子の穿孔装置であって、 前記装置は、変形可能な弾性材料からなる、前記流体流路を形作る前記壁の少 なくとも一つを特徴とし、 それによって、前記流体流路内の一時的な圧力の増加が、前記壁の前記弾性材 料により、少なくとも部分的に吸収される、生物学的粒子の穿孔装置。 ２．変形可能な弾性材料からなる、前記流体流路を形作る前記壁の少なくとも一 つが、変形可能な弾性材料からなる二つの前記壁からなる請求の範囲第１項に記 載の装置。 ３．前記電極が連続バンド電極を備えてなる請求の範囲第１項に記載の装置。 ４．流体流路を形作る壁と、 電極を高圧パルスの電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み 、それによって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付 される、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 前記粒子が前記流体流路に沿って移動するときに前記生物学的粒子を冷却する 、前記流体流路と熱的に連絡して配置される冷却手段と、 前記流体流路に沿って移動する前記生物学的粒子の温度を測定するための感知 手段と、 前記冷却手段を制御し、前記粒子が前記流体流路に沿って移動するときに前記 生物学的粒子が冷却される程度を調節する、前記測定された温度に応答する制御 手段と を備える、生物学的粒子の穿孔装置。 ５．前記冷却手段が、前記流体流路と熱的に連絡する多数の熱電気冷却エレメン トを備える請求の範囲第４項に記載の装置。 ６．前記熱電気冷却エレメントが、前記流体流路を形作る前記壁に接触している 請求の範囲第５項に記載の装置。 ７．流体流路を形作る壁と、 電極を高圧パルスの電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み 、それによって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付 される、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子を冷却する、前記流体流路と熱的 に連絡して配置される熱電気冷却エレメントの配列と を備える、生物学的粒子の穿孔装置。 ８．前記流体流路と熱的に連絡して配置される前記熱電気冷却エレメントの配列 が、前記流体流路を形作る前記壁に接触している熱電気冷却エレメントの配列を 備えてなる請求の範囲第７項に記載の装置。 ９．支持部材に取り外しできるように取り付けられる生物学的粒子の穿孔装置で あって、 流体流路を形作る壁と、 電極を高圧パルスの電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み 、それによって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付 される、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 前記装置が前記支持部材から取り外される前に前記電極を破壊する、前記電極 と作用的に関係する手段とを備え、 それによって前記装置が再使用され得ない、生物学的粒子の穿孔装置。 １０．前記電極をエネルギー源と電気的に連絡して配置する前記手段がスピンド ルからなり、前記電極は関係するスピンドルの表面の少なくとも一部に巻き付け られ、 前記電極を破壊する前記手段が、前記電極をその張力の限界を超えて延ばすよ うに前記スピンドルを回転させる手段からなり、それによって前記電極を破断さ せ、電気的に作動不可能にする、 請求の範囲第９項に記載の装置。 １１．流体流路を形作る壁と、 電極を高圧パルスの電気エネルギー源と電気的に連絡して配置する手段を含み 、それによって、前記流体流路に沿って移動する生物学的粒子がパルス電界に付 される、前記流体流路の対置する面に沿って配置される電極と、 前記流体流路に沿って前記生物学的粒子を移動させるポンプ手段と、 前記ポンプが前記流体流路に沿って前記生物学的粒子を移動させる速度に応答 して、前記高圧電気エネルギーのパルスの間隔を制御する制御手段とを備え、 それによって前記流体流路に沿って移動する前記生物学的粒子が、前記電極間 でパルスに付される間、所定の数のパルスに付される、 生物学的粒子の穿孔装置。